DE102012102163A1 - System und Verfahren für Superheating und / oder Supercooling von Flüssigkeiten sowie Verwendung des Systems und / oder Verfahrens - Google Patents
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Abstract
System und Verfahren für Superheating und/oder Supercooling von Flüssigkeiten sowie Verwendung des Systems und/oder Verfahrens, wobei sich die Flüssigkeit in einer Kapillare befindet, wobei mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung zum Erwärmen der Flüssigkeit über den Siedepunkt der Flüssigkeit bei Umgebungsdruck oder Kühlen der Flüssigkeit unter den Gefrierpunkt der Flüssigkeit bei Umgebungsdruck, wobei die mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung in einem Bereich in thermischem Kontakt mit der Kapillare ist, wobei sich in dem Bereich Flüssigkeit in der Kapillare befindet, und wobei die Kapillare frei von Kratzern an der inneren Oberfläche ist.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein System und ein Verfahren für Superheating und/oder Supercooling von Flüssigkeiten sowie eine Verwendung des Systems und/oder Verfahrens.
- Superheating (Siedeverzug) bedeutet: Erhöhung der Flüssigkeitstemperatur oberhalb der Siedetemperatur bei einem bestimmten Druck (hier: der Umgebungsdruck), ohne Verdampfen der Flüssigkeit. Supercooling (Gefrierverzug) bedeutet: Erniedrigung der Flüssigkeitstemperatur unter die Gefriertemperatur bei einem bestimmten Druck, wobei die Flüssigkeit in der flüssigen Phase ohne Änderung der Phase gehalten wird.
- Schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methoden zur z. B. Proteinidentifikation und Analyse von posttranslationalen Modifikationen sind wichtig, da Proteine als Mittel, Wirkorte und Therapeutika verwendet werden.
- Massenspektrometrie (MS) von Proteinen ist eine bekannte und verbreitete Technik für z. B. Protein-Identifizierung. Jedoch ist für die Massenspektrometrie(MS)-basierte Identifizierung von Proteinen mittels Peptid-Mass-Fingerprinting (PMF) oder Peptidfragment-Fingerprinting ein Vorbehandlungsschritt erforderlich, um die Proteine in Peptide zu brechen.
- Normalerweise wird eine enzymatische Reaktion mittels Proteasen wie Trypsin verwendet. Neben der enzymatischen Reaktion verwenden Forscher auch chemische Abbaumethoden. Beide Verfahren sind zeitaufwendig und teuer.
- Als allgemeinere Anwendung als die Enzym-basierte Zielmolekülhydrolyse kann die Energie-basierte Zerstörung von Peptid-Bindungen innerhalb der Proteine durchgeführt werden.
- Wie aus MS-Fragmentierungsreaktionen bekannt ist, führen steigende Mengen an Energie zu vermehrten unspezifischen Fragmentierungen und schließlich zur kompletten Atomisierung des ursprünglichen Moleküls.
- Die Rate der Protein-Fragmentierung ist sehr energieabhängig, wobei mit zunehmender Temperatur die Reaktionsgeschwindigkeit drastisch erhöht wird. Jedoch ist die maximal erreichbare Temperatur durch den Siedepunkt des Lösungsmittels begrenzt. Im Falle, dass Wasser als Lösungsmittel verwendet wird, ist der Siedepunkt des Lösungsmittels bei Umgebungsdruck bei 100°C, vorausgesetzt Nukleationskeime sind innerhalb des Reaktionsgefäßes reichlich vorhanden.
- Wenn jedoch keine Nukleationskeime vorhanden sind, kann die Wassertemperatur auch über die Siedetemperatur des Wassers bei Umgebungsdruck erhöht werden. Dieses Wasser, welches nicht siedet, aber eine Temperatur oberhalb seines Siedepunktes aufweist, wird als „Superheated Water” bezeichnet.
- Es wäre daher von großem Nutzen, wenn es ein System gäbe, das in der Lage ist, Superheating oder Supercooling von Flüssigkeiten zu ermöglichen, sodass Energie-basierte Dissoziation von Molekülen in Flüssigkeiten erreicht werden kann.
- Es ist die daher Aufgabe der Erfindung, ein System bereitzustellen, dass Superheating oder Supercooling von Flüssigkeiten in Kapillaren ermöglicht.
- Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 durch ein offenes System für Superheating und/oder Supercooling von Flüssigkeiten gelöst, wobei sich die Flüssigkeit in einer Kapillare befindet, wobei das System mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung zum Erwärmen der Flüssigkeit über den Siedepunkt der Flüssigkeit bei Umgebungsdruck oder Kühlen der Flüssigkeit unter den Schmelzpunkt der Flüssigkeit bei Umgebungsdruck aufweist, wobei die mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung in einem Bereich, in welchem sich Flüssigkeit in der Kapillare befindet, in thermischem Kontakt mit der Kapillare ist und wobei die Kapillare zumindest nahezu frei von Nukleationskeimen an der inneren Oberfläche ist.
- Die Bedeutung von ”mindestens nahezu frei von Nukleationskeimen” bedeutet, dass die innere Oberfläche zumindest nahezu frei von Kratzern, Verunreinigungen oder anderen Mängeln an der inneren Oberfläche ist.
- Offenes System bedeutet, dass die Oberfläche der Flüssigkeit, welche nicht in Kontakt mit der Oberfläche der Kapillare ist, in Kontakt mit dem Umgebungsdruck ist.
- Obwohl der wichtigste Anwendungsbereich des Superheatings und/oder Supercoolings unter Bezugnahme auf die Behandlung von Proteinen, Peptiden und Biomolekülen beschrieben wird, versteht es sich, dass die Erfindung für Superheating und/oder Supercooling von Flüssigkeiten auch für andere Anwendungen verwendet werden kann.
- Kapillare bedeutet vorzugsweise einen zylindrischen Körper, wobei die Flüssigkeit in diesem Körper ist. Es sind jedoch auch Kapillarröhrchen mit anderen inneren geometrischen Formen denkbar. Es ist von Bedeutung, dass die Innenfläche der Kapillare frei von Nukleationskeimen (z. B. Kratzer oder Verunreinigungen) ist.
- Die Heiz- oder Kühlmittel sind in thermischem Kontakt mit der äußeren Oberfläche der Kapillare. Hierdurch wird erreicht, dass das innere Volumen der Kapillare erwärmt oder gekühlt werden kann. Daher ist es vorteilhaft, wenn das Material der Kapillare eine hohe thermische Leitfähigkeit aufweist.
- Die Kapillare kann aus Glas, thermostabilem Kunststoff oder Metall hergestellt werden. Die innere Oberfläche dieses Rohres sollte zumindest nahezu frei von Nukleationskeimen sein. Dies bedeutet, dass die innere Oberfläche frei von Kratzern und auch frei von Verunreinigungen sein sollte.
- Glas kann so behandelt werden wie es z. B. aus dem Bereich für fortgeschrittene optische Systeme bekannt ist, um eine Oberfläche zu erhalten, die zumindest nahezu frei von Nukleationskeimen ist. Es ist auch vorgesehen, dass eine Glaskapillare auf der inneren Oberfläche mit z. B. Silanen, Silan-basierten Oberflächenmodifikationen, Tensiden oder Polymeren, wie beispielsweise Polyelektrolyte beschichtet (chemisch modifiziert) wird.
- Die innere Oberfläche einer Metallkapillare kann auf Hochglanz poliert oder gegebenenfalls auch, wie oben für Glas beschrieben, beschichtet werden.
- Die Kapillare kann aus thermostabilen Kunstoffen wie, jedoch nicht auf diese beschränkt, PFA, PSA, PTFE, PE, PP, hergestellt werden.
- Es ist weiterhin vorstellbar eine weitere Flüssigkeit in das Rohr einzubringen, wobei diese weitere Flüssigkeit phobisch in Bezug auf die zu erhitzende Flüssigkeit ist. Dies bedeutet, dass die beiden Flüssigkeiten getrennt gehalten sind und eine scharfe Grenze zwischen den beiden Flüssigkeiten besteht. Die weitere Flüssigkeit bildet einen dünnen Film auf der inneren Oberfläche der Kapillare. Dies führt zu einer ”polierten” inneren Oberfläche, die aufgrund der Oberflächenspannung der weiteren Flüssigkeit, zumindest nahezu frei von Nukleationskeimen ist.
- Es ist zu der Erfindung gehörig, dass der Innendurchmesser der Kapillare innerhalb eines Bereiches zwischen 1 μm und 250 μm liegt. Hierbei ist anzumerken, dass bisher Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 5, 50, 100 und 150 μm erfolgreich für das erfindungsgemäße System verwendet wurden.
- Gemäß Anspruch 2 ist es zu der Erfindung gehörig, dass sich der mit Flüssigkeit gefüllte Bereich der Kapillare auf beiden Seiten über den Bereich der Kapillare erstreckt, in dem die Heiz- und/oder Kühleinrichtung in thermischem Kontakt mit der Kapillare ist.
- Dies ist vorteilhaft, da ein Temperaturgradient in der Flüssigkeit über den Bereich hinaus vorliegt, in dem die Heiz- oder Kühlmittel angeordnet sind. Durch diese Anordnung gibt es keine Änderung der Phase in der Flüssigkeit, wie es vorkommen kann, wenn die äußere Oberfläche der Flüssigkeit im Bereich der Kapillare wäre, die direkt erhitzt wird.
- Daher ist gemäß Anspruch 3 weiterhin vorteilhaft, dass das offene System in einem Durchfluss-Modus betrieben wird.
- Es ist vorteilhaft, das System im Durchfluss-Modus für Proben (Flüssigkeiten) zu betreiben, für welche nur eine kurze Expositionsdauer/Expositionszeit benötigt wird. Es ist auch von Bedeutung, dass durch den Betrieb des Systems im Durchfluss-Modus keine manuelle Handhabung der Proben erforderlich ist. Durch die Vermeidung einer manuellen Handhabung der Proben kann die Kontaminationsgefahr der Probe reduziert werden. Es ist jedoch im Rahmen der Erfindung, dass das System an andere Durchfluss-Verarbeitungssysteme, wie beispielsweise Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), angeschlossen werden kann.
- Gemäß Anspruch 4 ist es vorteilhaft, dass der Durchfluss-Modus durch den Betrieb mindestens einer Förderschnecke oder Pumpe zum Fördern der Flüssigkeit durch den Bereich der Kapillare erfolgt, in dem die mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung in thermischem Kontakt mit der Kapillare ist.
- Es liegt im Rahmen der Erfindung, dass die Förderschnecke oder Pumpe mit einer definierten Geschwindigkeit betrieben werden kann, sodass ein genaues Volumen der Flüssigkeit mit einer definierten Durchflussrate gefördert wird durch den Bereich der Kapillare, in dem die mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung in thermischem Kontakt mit dem Kapillarrohr ist. Die Pumpe kann eine Spritzenpumpe oder eine Kapillarpumpe oder eine andere Pumpe sein, die die Förderung von Flüssigkeiten ermöglicht.
- Es ist auch vorstellbar, dass der Betrieb der Förderschnecke oder Pumpe durch einen Computer oder dergleichen ermöglicht wird, der die Programmierung der Förderschnecke oder Pumpe mit einer definierten Folge von langsamen und schnellen Flussraten ermöglicht. Dies kann als Steuerung oder Regelung realisiert sein. Dadurch wird ermöglicht, dass die Flüssigkeit für eine bestimmte Zeit in dem Bereich gehalten wird, in dem die Flüssigkeit erwärmt wird. Somit ist es ebenfalls möglich, eine definierte Wärmemenge in die Flüssigkeit einzubringen.
- Wie für Anspruch 5 beschrieben, ist es ebenfalls zu der Erfindung gehörig, dass das offene System in einem Batch-Modus betrieben wird.
- Dies ist vorteilhaft für den Fall, dass außergewöhnlich stabile Moleküle eine lange Expositionsdauer für die Dissoziation verlangen. Für diese Moleküle könnte es möglicherweise nicht möglich sein, die lange Expositionsdauer in einem Durchfluss-Modus, auch bei sehr niedrigen Durchflussgeschwindigkeiten, zu realisieren.
- Anspruch 6 bezieht sich auf eine bevorzugte Verwendung eines der oben genannten Systeme oder Verfahren. Es ist daher eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, dass die Flüssigkeit Wasser oder ein organisches Lösungsmittel ist.
- Viele Substanzen sind in Wasser lösbar und es wird allgemein als das universelle Lösungsmittel bezeichnet.
- Wie in Anspruch 7 beschrieben, ist es im Rahmen der Erfindung, dass die Flüssigkeit Biomoleküle enthält, wobei diese Biomoleküle durch Superheating oder Supercooling und dadurch bedingtem Einwirken durch die Temperatur der Flüssigkeit dissoziiert werden.
- Dissoziation bedeutet: Jede Art von Zerstörung von Biomolekülen, einschließlich Energie-basierte Hydrolyse, Fragmentierung, Degradierung, aber auch die Behandlung mit Chemikalien, Enzymen oder Metallen für die Fragmentierung.
- Daher ist die Erfindung von entscheidender Bedeutung für die Biomolekülaufbereitung für wissenschaftliche Anwendungen.
- Die Expositionsdauer für die Dissoziation der Biomoleküle ist erheblich von den Eigenschaften des Moleküls (z. B. Aminosäuresequenz für die Proteine und Peptide) beeinflusst. Es ist jedoch für die Verwendung der Erfindung vorgesehen, dass die Dauer der Exposition im Bereich von Sekunden bis zu einigen Minuten ist.
- Gemäß Anspruch 8 ist weiterhin vorgesehen, dass die Biomoleküle Biopolymere sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten und Lipiden.
- Gemäß Anspruch 9 ist eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung, dass die Biomoleküle Proteine oder Peptide sind.
- Durch Superheating induzierte Dissoziation von Proteinen und Peptiden kann mittels Massenspektrometrie überwacht werden. Optimierung der Superheating-Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur und Einwirkzeit, könnte zu einer partiellen Hydrolyse von Probenmolekülen führen.
- Einfache Proben, wie Di- und Tri-Peptide wurden bereits verwendet, um die Durchführbarkeit des Verfahrens zu demonstrieren. Dementsprechend kann eine Reihe von kurzen Oligo-Peptiden unter Superheating-Bedingungen fragmentiert werden. Die Verwendung kleiner Moleküle wie Di- und Tri-Peptide kann eine Grundlage für die Berechnung der Massen aller möglichen Reaktionsprodukte bilden. Diese Produkte könnten von der ursprünglichen Peptid-Fragmentierung, Adduktbildung oder Eliminierung stammen.
- Partielle Hydrolyse könnte eine Grundlage darstellen für die Identifizierung von Sequenz-spezifischen Schwachstellen in der Peptidstruktur.
- Im Idealfall kann die Erfindung für die Steigerung des Wissens und der Erfahrung für den Wirkmechanismus von Superheating-induziertem Zerfall von Molekülen verwendet werden.
- Ferner ist es möglich, Hydrolyse-Produkte vorherzusagen.
- Schließlich kann es möglich sein, Superheating-zerstörte Proteine durch Peptid-Bildungsmuster in einer PMF-ähnlichen Messung zu identifizieren.
- Hier konnten Superheating-induzierte Hydrolyseprodukte einfach durch Produktmasse und Fragmentierungsverhalten in Tandem-Massenspektrometrie-Analyse nachgewiesen werden. Daher können die verfügbaren MS-Systeme, wie Elektrospray-Ionisation (ESI), Quadrupol-Ionenfalle/Matrix-assistierte Laser Desorption Ionisation-Tandem-Flugzeit (MALDI-TOF2), in der Massenanalyse und Strukturaufklärung (de novo Sequenzierung) der durch Superheating resultierenden Fragmente helfen.
- Weiterhin könnte die Superheating-Technik den tryptischen Verdau von Proteinen ersetzen. Diese würde die Reaktionszeiten, die derzeit durch enzymatische Verfahren benötigt werden, von ein paar Stunden auf Sekunden, drastisch verkürzen. Dementsprechend könnte die Peptidanalyse durch Massenspektrometrie die gleiche Menge an Informationen (PMF) in dem ”Mikrofluidik-trifft-Proteomik”-Ansatz ergeben wie der im Vergleich viel langsamere und teurere proteolytische Verdau.
- Neben der Identifizierung von Proteinen müssen andere wichtige Faktoren analysiert werden, um z. B. die Aktivität, die subzelluläre Lokalisierung und die Strukturveränderung des Moleküls festzustellen. Viele verschiedene posttranslationale-Modifikationen (PTM), die Einfluss auf diese Parameter haben, sind bekannt. Einige dieser Gruppen sind schwer zu analysieren wegen der Unmöglichkeit gezielter Manipulationen. Bei der Glykosylierung kann die Massendifferenz vor und nach der enzymatischen Abspaltung von Glykanen verwendet werden, um die chemische Formel der Zuckermoleküle zu berechnen. Vergleichbar zu dem Hoch-Energietransfer zu solchen Molekülen (z. B. durch MSMS-Reaktionen) sollte Superheating ebenfalls zufällige Fragmentierungsmuster der Aminosäure-Seitenketten, Protein- und Peptid-Modifikationen liefern. Noch sind viele Hydrolyse- oder Manipulations-Enzyme für die PTMs unbekannt. Superheating könnte diese Lücke, verschiedene Schritte der Abbauprozesse in den Protein-modifizierende Gruppen zu identifizieren, schließen und endlich für eine detaillierte Analyse solcher Strukturen sorgen. Superheating könnte ein Verfahren sein, um die Vielzahl von PTMs zu behandeln.
- Superheating kann eine Reihe von Hydrolyseenzymen ersetzen, die derzeit in täglichen Laborprozessen verwendet werden, einschließlich der Verdauung von DNA, Fettsäuren, Isoprenoiden und Polyketiden. Insbesondere Lantibiotika, aufgrund der Nicht-Existenz von hydrolysierenden Enzymen für eine Mehrheit von diesen, sind von besonderem Interesse.
- Daher ist es zu der Erfindung gehörig, dass die Biomoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus sekundären Metaboliten, Zuckern, polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, Phospholipiden, Glycolipiden, Sterolen, Glycerolipiden, Vitaminen, Hormonen, Neurotransmittern, Fettsäuren, Isoprenoiden, Lantibiotika und Polyketiden.
- Gemäß Anspruch 11 ist es auch zu der Erfindung gehörig, dass die Flüssigkeit Prokaryoten, Eukaryoten oder Viren enthält.
- Dabei ist vorgesehen, dass das System für z. B. schnelle DNA- oder RNA-Extraktion verwendet werden kann, ohne dass Extraktionslösungen zugegeben werden. Das erfindungsgemäße System ermöglicht eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode zur Vorbereitung von z. B. genomischer DNA für PCR-Amplifikation, Genotypisierung, genetischen Studien, menschlicher Identitätstests, viralen/mikrobiellen Screenings oder anderen Anwendungen.
- Es ist zudem vorgesehen, dass das System als ein einzigartiges Instrument für die Fragmentierung von wasserunlöslichen Molekülen verwendet werden kann.
Claims (11)
- Offenes System für Superheating und/oder Supercooling von Flüssigkeiten, wobei sich die Flüssigkeit in einer Kapillare befindet, wobei das System mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung zum Erwärmen der Flüssigkeit über den Siedepunkt der Flüssigkeit bei Umgebungsdruck oder Kühlen der Flüssigkeit unter den Schmelzpunkt der Flüssigkeit bei Umgebungsdruck aufweist, wobei die mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung in einem Bereich, in welchem sich Flüssigkeit in der Kapillare befindet, in thermischem Kontakt mit der Kapillare ist und wobei die Kapillare zumindest nahezu frei von Nukleationskeimen an der inneren Oberfläche ist.
- Offenens System gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich der mit Flüssigkeit gefüllte Bereich der Kapillare auf beiden Seiten über den Bereich der Kapillare erstreckt, in dem die Heiz- und/oder Kühleinrichtung in thermischem Kontakt mit der Kapillare ist.
- Verfahren für Superheating und/oder Supercooling von Flüssigkeiten unter Verwendung eines offenen Systems gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das offene System in einem Durchfluss-Modus betrieben wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchfluss-Modus durch den Betrieb mindestens einer Förderschnecke oder Pumpe zum Fördern der Flüssigkeit durch den Bereich der Kapillare erfolgt, in dem die mindestens eine Heiz- und/oder Kühleinrichtung in thermischem Kontakt mit der Kapillare ist.
- Verfahren für Superheating und/oder Supercooling von Flüssigkeiten unter Verwendung eines offenen Systems gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das offene System in einem Batch-Modus betrieben wird.
- Verwendung eines offenen Systems und/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit Wasser oder ein organisches Lösungsmittel ist.
- Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit Biomoleküle enthält, wobei diese Biomoleküle durch Superheating oder Supercooling und dadurch bedingtem Einwirken durch die Temperatur der Flüssigkeit dissoziiert werden.
- Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle Biopolymere sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten und Lipiden.
- Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle Proteine oder Peptide sind.
- Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus sekundären Metaboliten, Zuckern, polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, Phospholipiden, Glycolipiden, Sterolen, Glycerolipiden, Vitaminen, Hormonen, Neurotransmittern, Fettsäuren, Isoprenoiden, Lantibiotika und Polyketiden.
- Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit Prokaryoten, Eukaryoten oder Viren enthält.
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