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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur dreidimensionalen Darstellung und Bestimmung der Dicke von Objekten mit Hilfe eines Licht-Mikroskops.
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Die dreidimensionale Bildgebung von Objekten spielt in der Mikroskopie eine zunehmend wichtige Rolle. Insbesondere für in vivo Zelluntersuchungen können dreidimensionale Darstellungen wichtige Informationen liefern. Sie geben z. B. Aufschluss über Prozesse der Zellmigration und das Zellvolumen, welches zur Bestimmung der Wachstumsphase einer Zelle eingesetzt werden kann.
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Zur dreidimensionalen Bildgebung in herkömmlichen Mikroskopen wird der eingeschränkte Schärfentiefebereich bei großen Vergrößerungen genutzt und ein Schnittbildstapel des dreidimensionalen Objektes erzeugt. Dieser Bildstapel wird mit den Fokuspositionen korreliert und daraus ein Bild errechnet. Dieses Verfahren funktioniert nicht für kleine und transparente Objekte wie z. B. lebende Zellen.
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Eine Methode zur dreidimensionalen Bildgebung von kleinen Objekten ist die Rasterkraftmikroskopie. Bei diesem Verfahren wird die Oberfläche mit einer nanoskopisch kleinen Nadel mechanisch abgetastet. Dieses Verfahren ist nicht geeignet für Objekte, die sich in Lösung befinden, beweglich sind oder weich sind, wie dieses z. B. bei lebenden Zellen der Fall ist.
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Mit der Weitfeld-optischen Kohärenztomographie und der digitalen Holographie sind weitere Verfahren bekannt, welche eine Dickenbestimmung von Objekten ermöglichen. Nachteil dieser Verfahren ist der vergleichsweise hohe apparative und rechnerische Aufwand.
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In der
US2008/0278722 A1 (Cunningham et al.) wird eine Vorrichtung beschrieben, welche es in der Fluorezenzmikroskopie ermöglicht, die Fluoreszenz von Objekte durch den Einsatz von photonischen Kristallen zu verstärken. Die Resonanzmoden des photonischen Kristalls werden dabei zur Anregung eines Fluoreszenzfarbstoffs verwendet.
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In der
DE 10 2010 005 860 A1 der Erfinder wird ein Mikroskop beschrieben, welches es durch seinen Aufbau und den Einsatz von Photonischen Kristallen ermöglicht, mit Photonischen Kristallen, die mit dem Objekt in Kontakt gebracht sind, den Kontrast von Objekten im sichtbaren Bereich des Spektrums zu erhöhen. Allerdings wird hier nur die Darstellung beschrieben.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu linden, dass die Bestimmung auch von Objektdicken insbesondere von lebenden Zellen ermöglicht. Weiter ist es Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu finden, dass die Bestimmung von Objektdicken insbesondere von lebenden Zellen auf einfachem Wege unter Einsatz von Lichtmikroskopen ermöglicht.
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Desweiteren ist es Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zu finden, dass die Bestimmung von Objektdicken, insbesondere von lebenden Zellen auf kostengünstigem Wege, unter Einsatz von Lichtmikroskopen ermöglicht.
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Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu finden, dass die Bestimmung von Objektdicken auch bei Vorhandensein mehrerer Objekte insbesondere bei Zellkolonien ermöglicht.
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Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren, dass die folgenden Schritte umfasst: In-Kontakt-Bringen eines Objektes oder mehrerer Objekte mit einem Photonischen Kristall als Objektträger, Nutzen von gekreuzten Polarisationsfiltern in dem Strahlengang vor und nach dem Objekt oder den Objekten, Beleuchten der Objekte, Aufnahme eines Intensitätsbildes des Photonischen Kristalls zur Bestimmung der Moden-Intensität und erstellen zunächst einer Kalibrierungskurve durch Verwendung vorbekannter Schichtdicken in einer Anzahl von Messungen, und Zuordnung der Moden-Intensitäten zu Dicken von Objekten. Dabei können einzelne Objekte vorbekannter Dicke zu Untersuchung herangezogen werden, oder es können Nachuntersuchungen empirisch vorgenommen werden. Durch Abgleich der Kalibrierungskurven und der gemessenen Modenintensitäten des Intensitätsbildes gelingt dann durch Zuordnung die Ermittlung der Objektdicke.
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Optional kann als weiterer Schritt noch die Darstellung eines dreidimensionalen Bildes erfolgen. Ebenfalls optional kann die Berechnung der Volumina des Objektes oder der Objekte erfolgen, wobei eine Darstellung der Breiten und Längen des Objektes mit herkömmlichen mikroskopischen Mittel erfolgt.
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Überraschenderweise zeigte sich, dass nur durch Betrachtung der Intensität der Resonanzmoden eines photonischen Kristalls sich die Dicke von Objekten, welche direkt mit dem photonischen Kristall in Kontakt stehen, bestimmen lässt. Bisher war die Beobachtung der Wellenlängenverschiebung zentrales notwendiges Kriterium (unveröffentlichter Stand der Technik).
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Photonische Kristalle verfügen über periodisch angeordnete Hohlräume, die mit einem Fluidum d. h. einem Gas, insbesondere Luft, oder einer Flüssigkeit, insbesondere einer wässrigen Lösung gefüllt sind und somit über eine periodische Nanostruktur des Brechungsindex, welche durch Beugung und Interferenz die Ausbreitung von Photonen beeinflussen.
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In photonischen Kristallen können sich in Abhängigkeit von geometrischen und Materialparameter Resonanzen bilden. Diese Resonanzen sind mit einer Transmissionsmessung messbar, jedoch mit einem störenden Anteil der Lichtquelle überlagert. Platziert man zwei in ihrer Polarisationsrichtung gekreuzte Polarisationsfilter vor und hinter dem photonischen Kristall im Strahlengang, werden nur die Resonanzen transmittiert.
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Das transmittierte Licht ist somit ein „Fingerabdruck” des photonischen Kristalls. Ändern sich nun Parameter des Kristalls, wie z. B. der Brechungsindex an der Oberfläche (durch Vorhandensein von Objekten), ändert sich auch dieser Fingerabdruck.
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Eine besondere Kategorie der photonischen Kristalle stellen die planaren photonischen Kristalle sogenannte ,photonic crystal slabs' (PCS) dar. Diese bestehen in der Regel aus einer dünnen Schicht eines Dielektrikums, in das die Nanostrukturierung eingebracht ist und welches von Materialien mit niedrigerem Brechungsindex umgeben ist.
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Derartige planare photonische Kristalle (PCS) lassen sich z. B. mittels Heißprägen auf eine sehr kostengünstige Art herstellen. Dabei wird ein Stempel mit der gewünschten Nanostrukturierung unter Druck und Hitze auf ein geeignetes Substratmaterial gepresst.
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Es hat sich dabei als vorteilhaft erwiesen, wenn der Unterschied des Brechungsindex zwischen Substrat und photonischem Kristall mindestens 0.01 beträgt.
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In den PCS bilden sich in der Ebene optische Moden aus. Das Maximum der Feldstärke dieser Moden befindet sich im hochbrechenden Dielektrikum quasi-guided modes (QGM). Außerhalb des Dielektrikums zeigt die Mode eine evaneszente Eigenschaft und ihre Feldstärke nimmt exponentiell ab. Dieser evaneszente Teil der Mode kann geometrische Änderungen auf der Oberfläche des PCS abtasten. In einer Transmissions- oder Reflektionsmessung ist die optische Mode als eine Resonanz zu beobachten, diese wird im englischen als Guided-Mode Resonance (GMR) bezeichnet.
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Es zeigt sich nun, dass durch die Dicke der mit dem photonischen Kristall in Kontakt stehenden Objekte im Wesentlichen zwei Eigenschaften der GMR beeinflusst werden. Zum einen ändert sich die spektrale Position der GMR mit der Dicke des Objektes. Zum andern wird die Güte der Mode, welche antiproportional zu der Halbwertsbreite der Resonanz ist, durch den effektiven Brechungsindex des Objektes auf der Oberfläche beeinflusst. Der effektive Brechungsindex der Mode ist dabei immer eine Funktion der Objektdicke.
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Der Zusammenhang zwischen der Dicke der Objekte und der spektralen Postion (Wellenlänge) der GMR und des ,quality factor' (Halbwertsbreite der GMR) ist in zu erkennen.
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Die Schichtdicken der photonischen Kristalle liegen bevorzugt zwischen 20 nm und 1 μm. Desweiteren sind Photonische Kristalle bevorzugt, die eine ein- oder zweidimensionale Periodizität aufweisen, welche eine Periode von 200 nm bis 1 μm hat.
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Die Oberfläche des Photonischen Kristalls kann wahlweise mit einer optisch inaktiven Schicht versehen werden, was eine glatte Oberfläche zur Folge hat.
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Das Intensitätsbild des photonischen Kristalls (Schritt 3) wird als sogenanntes Graustufenbild aufgenommen. Hierfür können alle Arten von Bildsensoren genutzt werden, welche dem Fachmann aus der Literatur bekannt sind. Beispiele für Bildsensoren im sichtbaren Bereich und im nahen Infrarot sind Siliziumsensoren, (CCD)-Bildsensoren oder auch CMOS-Sensoren (auch Active Pixel Sensoren).
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Da die Evaneszente Mode exponentiell abnimmt, besteht ein nicht-linearer Zusammenhang zwischen der Objektdicke und der Resonanzgüte. Um nun von der Resonanzgüte auf die Objektdicke zurückzuschließen zu können, bedarf es einer Kalibrierungskurve. (Schritt 4). Diese kann sowohl a) Experimentell wie auch b) Simulativ bestimmt werden.
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Im Falle der experimentellen Kalibrierungskurvenbestimmung, müssen auf dem Photonischen Kristall unterschiedliche aber definierte Schichtdicken aufgebracht werden, um dann die Resonanzgüte zu bestimmen. Für eine Kalibrierungskurvenbestimmung auf simulative Weise kann eine Simulationssoftware, welche Photonische Kristall Resonanzen berechnen kann, verwendet werden. Ein Beispiel ist hier die FDTD (Finite-difference time-domain). Es werden Resonanzen bei definierten Schichtdicken berechnet und die Gute extrahiert.
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Im nächsten Verfahrensschritt wird die Kalibrierungskurve eingesetzt, um die Graustufen in Höheninformation zu transferieren. Dies ist möglich, da das Graustufenbild eine über das ganze sichtbare Spektrum integrierte Intensität darstellt und somit proportional zu den Gütefaktoren aller Resonanzen im Photonischen Kristall ist.
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Optional kann durch Darstellung eines dreidimensionalen Bildes, wie es dem Fachmann durch bekannte Software ermöglicht ist, direkt das Volumen auch mehrerer Objekte sofort angegeben werden.
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Als Software kommt hier beispielsweise MATLAB, Freemat, Scilab/Xcos, Maple und Mathematica in Frage.
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In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der Erfindung durch eine Vorrichtung gelöst bestehend aus einem Lichtmikroskop mit einer Linsenoptik, einer in die Linsenoptik Licht einstrahlenden Lichtquelle, einem zwischen Lichtquelle und Linsenoptik angeordneten Objekttisch zur Aufnahme eines zu mikroskopierenden Objekts oder mehrerer Objekte, einem zwischen der Lichtquelle und dem Objekttisch angeordneten ersten Polarisationsfilter, einem zwischen dem Objekttisch und der Linsenoptik angeordneten zum ersten Polarisationsfilter um 90° gedrehten zweiten Polarisationsfilter und einem im Strahlengang angeordneten direkt mit dem zu mikroskopierenden Objekt oder den Objekten in Kontakt stehenden photonischen Kristall, einem Detektor zur Bestimmung der integralen spektralen Intensität der GMR.
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Es wird mit dem photonischen Kristall in den optischen Strahlengang ein Element eingeführt, das aus einer nanostrukturierten Oberfläche, welche zwischen zwei gekreuzten Polarisationsfiltern angeordnet ist, besteht, dabei muss erfindungsgemäß ein direkter Kontakt der zur untersuchenden Probe mit der nanostrukturierten Oberfläche hergestellt werden.
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In planaren photonischen Kristallen können sich in Abhängigkeit von geometrischen und Materialparametern Resonanzen bilden. Die GMR sind mit einer Transmissionsmessung messbar, jedoch mit einem störenden Anteil der Lichtquelle überlagert. Platziert man zwei gekreuzte Polarisationsfilter vor und nach dem photonischen Kristall, werden nur die GMR transmittiert.
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Als Materialien für planare photonische Kristalle kommen alle transparenten Materialien in Frage, wie zum Beispiel Metalloxide, Halbleiter, Gläser oder Polymere. Als Substrat für solche Strukturen können Materialien eingesetzt werden, die einen niedrigeren Brechungsindex als der photonische Kristall aufweisen.
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Als Polarisationsfilter kommen dabei alle optisch transparenten Medien, welche nur elektromagnetische Wellen einer bestimmten Polarisation durchlassen in Frage. Es können beispielsweise Polarisationsfolien oder höherwertigere Polarisatoren in Glas verwendet werden. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform können die photonischen Kristalle direkt auf den zur Mikroskopie verwendeten Objektträger oder Deckglas aufgebracht sein.
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Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass sehr schnell auch große Mengen an Objektdicken bestimmt werden können. Die Methode eignet sich insbesondere für „Hochdurchsatz”-Bestimmungen, wie sie bei der Vermessung von Zellkolonien gefordert sind.
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Die Erfindung wird nachfolgend an konkreten Beispielen anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert. Dabei zeigt:
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1: den schematische Darstellung der Verhältnisse zwischen der Dicke der Objekte und der spektralen Position (Wellenlänge) der GMR und der Halbwertsbreite (dem sog. quality factor) der GMR.
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2A: das Graustufenbild einer fixierten Zellen auf dem Photonischen Kristall
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2B: zeigt die dreidimensionale Darstellung dieser Zelle, und
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3: die dreidimensionale Darstellung und die Zellvolumen von mehreren fixierten Zellen.
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Als Verfahrensschritte werden also die folgenden vorgeschlagen, um die Dicke von Objekten mit Hilfe eines Licht-Mikroskops zu bestimmen:
- – Erstellen einer Kalibrierungskurve die vorbekannte Höhenwerte von Bildpunkten in einer Lichtmikroskop-Aufnahme einer bestimmten Graustufe zuordnen,
- – Kontaktieren des zu untersuchenden Objektes oder mehrerer Objekte mit einem Photonischen Kristall,
- – Erfassen eines Intensitätsbildes des Objekts an dem Photonischen Kristall mit dem Lichtmikroskop,
- – wobei das Objekt zwischen im Strahlengang angeordneten gekreuzten Polarisationsfiltern vor und nach dem Objekt angeordnet ist zur Bestimmung einer Moden-Intensität für jeden Bildpunkt, und
- – Abgleich erfasster Intensitätswerte der gemessenen Modenintensitäten in dem Intensitätsbild mit den als Graustufe definierten und in Kalibrierungskurven abgespeicherten Höhenwerten zur Ermittlung der Objektdicke an wenigstens einem Beobachtungspunkt innerhalb des zu untersuchenden Objekts.
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Dabei können ohne weiteres Mittelungen über mehrere Dickenwerte zu einem Objekt oder auch mehrere Objekte in einem Intensitätsbild untersucht werden.
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Die Erfassung der zu einem im Intensitätsbild definierten Objekt gehörigen Objektabmessung normal zur Beobachtungsebene und der in den Objektabmessungen bestimmten Dickenwerte in dem Intensitätsbild erlaubt dabei die nachfolgenden rechnerische Bestimmung eines Objektvolumens.
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Die Allgemeinheit der Lehre nicht einschränkend soll die Erfindung im Folgenden anhand zweier Beispiele erläutert werden.
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zeigt eine fixierte embryonale Rattenzelle auf einem photonischen Kristall. Der photonische Kristall besteht in diesem Fall aus einer ITO (Indiumzinnoxid) Schicht (135 nm) auf einem konventionellen Objektträger aus Glas mit einer linearen periodischen Nanostruktur, welche eine Periodizität von 350 nm hat. Das Graustufenbild wurde unter gekreuzten Polarisationsfiltern mit einer CMOS-Kamera aufgenommen. Dafür wurde ein Lichtmikroskop im Durchlicht-Modus verwendet. Die Lichtquelle war hier eine 100 W Halogenlampe, welcher mit einem Kondensor auf die Probe gelenkt wurde. Für diese Aufnahme wurden eine Objektive mit einer 20× Vergrößerung genutzt.
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Für die Bestimmung der Kalibrierungskurve auf simulative Art und Weise wurde die Software FDTD (finite-difference time-domain) benutzt. Hier wurden Reflektionssimulationen durchgeführt und dabei definierte aber unterschiedliche Schichtdicken von 0 nm bis 400 nm benutzt. Es wurde weiterhin für jede Simulation die spektral integrierte Intensität bestimmt und zu einer Kalibrierungskurve zusammengefasst. Nun konnte aus dem Graustufenbild die Höheninformation der Zelle errechnet werden. Die Höheninformation der vermessenen Zellen ist der zu entnehmen.
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Die sehr schnelle Vermessung mehrerer Objekte ist in demonstriert. Hier wurden auf die gleiche Art und Weise wie im oberen Beispiel mehrere Rattenzellen vermessen. Dafür wurde ein Objektiv mit einer 4× Vergrößerung genutzt. Die dreidimensionale Darstellung ermöglicht darüber hinaus die Bestimmung des Volumens der einzelnen Zellen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Objekt
- 2
- Photonischer Kristall
- 3
- Substrat
- 4
- QGM
- 5
- GMR
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 2008/0278722 A1 [0006]
- DE 102010005860 A1 [0007]
