DE102011105372A1

DE102011105372A1 - Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Lösung oder Dispersion und Verfahren zur Herstellung von Form-oder Flächengebilden, Imprägnierungen oder Beschichtungen aus der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion sowie deren Verwendung

Info

Publication number: DE102011105372A1
Application number: DE201110105372
Authority: DE
Inventors: Dr. Voigt Wiebke; Dr. Scharfenberger Gunter; Dr. Herrlich Ulrike; Artem Davidenko
Original assignee: Carl Freudenberg KG
Current assignee: Carl Freudenberg KG
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2012-12-20
Also published as: WO2012175153A2; WO2012175153A3

Abstract

Es soll eine gesundheitlich unbedenkliche und/oder eine besonders umweltfreundliche und besonders stabile sowie hochkonzentrierte Lösung oder Dispersion aus zumindest einem selbstassemblierenden Protein bereitgestellt werden, die eine effiziente bzw. verbesserte Herstellung von reinen Protein-Formgebilden oder -Flächengebilden, Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen mit einem breiten Anwendungsfeld ermöglicht. Erfindungsgemäß umfasst die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion in einer wässrigen Lösung oder Dispersion wenigstens ein physikalisch stabilisiertes selbstassemblierendes Protein mit einer Proteinkonzentration von 5 Gew.-% bis 35 Gew.-%, bevorzugt von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt von 5 Gew.-% bis 25 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Lösung oder Dispersion, insbesondere mit einer Stabilität von mindestens 5 Stunden, bevorzugt von mehr als 12 Stunden, besonders bevorzugt von mehr als 20 Stunden oder sogar von mehr als 48 Stunden. Ein chemischer Stabilisatorzusatz ist gerade nicht vorgesehen bzw. nicht erforderlich.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile, wässrige Lösung oder eine stabile, wässrige Dispersion mit zumindest einem selbstassemblierenden Protein. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, ein Verfahren zur Elektro- oder Rotorverspinnung von selbstassemblierendem Protein unter Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden, von Imprägnierungen oder von Beschichtungen aus der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion sowie die Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bzw. der daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, Imprägnierungen oder Beschichtungen.
Unter Form- oder Flächengebilden werden hier insbesondere Fasern, Fasergebilde, Gele, Folien, Filme, Schäume oder Kombinationen daraus verstanden.
Unter einem Fasergebilde wird hier insbesondere eine geordnete oder ungeordnete ein- oder mehrlagige Zusammenlagerung einer Vielzahl von Fasern verstanden oder auch dreidimensionale Anordnungen der Fasern oder eine Kombination mit Trägern. Bevorzugte Fasergebilde sind hier Vliesstoffe.
Die selbstassemblierenden Proteine sind aus Polypeptiden aufgebaut. Diese setzen sich aus Aminosäuren, insbesondere aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, zusammen. Die Aminosäuren können dabei modifiziert sein, zum Beispiel acetyliert sein. Die selbstassemblierenden Proteine sind insbesondere intrinsisch entfaltete Proteine oder Microbead-bildende Proteine. Beispielhafte Proteine sind seidenähnliche Proteine, Seidenproteine oder Spinnenseidenproteine. Die Proteine können natürlichen Ursprungs oder synthetisch, zum Beispiel durch rekombinante Herstellung, sein.
Die selbstassemblierenden Proteine besitzen die Eigenschaft, dass sie in konzentrierten, wässrigen Lösungen oder Dispersionen instabil sind. Durch die hydrophoben Anteile fällt das Protein aus oder die Lösung geliert. Dadurch lassen sich die Proteine aus wässriger Lösung oder Dispersion normalerweise nicht zu Fasern verarbeiten.
Stand der Technik
Aus dem Patent US 6110590 ist das Elektrospinnen von synthetisch hergestellter Seide aus Hexafluoroisopropanol bekannt.
In der JP 2010 270426 A wird ein Verfahren beschrieben, in denen Seidenproteine aus konzentrierter Ameisensäure, aus Hexafluoroacetonhydrat oder aus Hexafluoroisopropanol, versponnen werden. Das Elektrospinnen erfolgt dabei bei erhöhter Temperatur, um das Gelieren der Spinnlösung zu verhindern. Dies kann allerdings bei längerer, kontinuierlicher Verarbeitung eine Schädigung des Proteins bedingen.
Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln ist aus Aspekten des Arbeitsschutzes und/oder des Umweltschutzes ebenfalls häufig nicht wünschenswert.
Die JP 2010-150712 beschreibt das Elektrospinnen einer wässrigen, Seidenproteinlösung der Seidenraupe unter Zusatz eines nichtionischen Tensids und eines wasserlöslichen Polymers. Der Zusatz von nichtionischem Tensid kann jedoch im Hinblick auf Anwendungen im medizinischen Bereich gesundheitlich bedenklich sein.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine gesundheitlich unbedenkliche und/oder eine besonders umweltfreundliche und besonders stabile sowie hochkonzentrierte Lösung oder Dispersion aus zumindest einem selbstassemblierenden Protein anzugeben bzw. herzustellen, die eine effiziente bzw. verbesserte Herstellung von reinen Protein-Formgebilden oder -Flächengebilden, Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen mit einem breiten Anwendungsfeld ermöglicht.
Zudem sollen die konzentrierten, wässrigen Protein-Lösungen oder Protein-Dispersionen ohne zusätzliche Additive, die das Protein in wässriger Lösung oder Dispersion stabilisieren, hergestellt werden können. Der Zusatz von Additiven zur Stabilisierung der Proteine in wässriger Lösung kann problematisch für die spätere Verwendung, zum Beispiel im medizinischen Bereich sein, da die Additive selbst toxikologisch unbedenklich sein müssen.
Die konzentrierte Protein-Lösung oder Protein-Dispersion soll sich ferner durch eine besonders hohe Konzentration und besonders hohe Stabilität auszeichnen. So soll insbesondere die Herstellung von Protein-Fasern oder -Fasergebilden, insbesondere von Vliesstoffen, mittels Elektro- oder Rotorspinnverfahren ermöglicht bzw. verbessert werden. Gleiches gilt auch für die Herstellung von reinen Protein-Schäumen, -Gelen, -Filmen, -Folien oder von reinen Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen.
Des Weiteren soll die stabile Protein-Lösung oder -Dispersion bzw. sollen die daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, Beschichtungen oder Imprägnierungen besonders geeignet für den medizinischen Bereich sein, bevorzugt für oder als Wundauflagen, Operationsnahtmaterialien oder als biokompatible Beschichtung von Oberflächen, insbesondere Fasern, Fasergebilden, wie Garnen oder Vliesstoffen, Gewebekonstruktionen bzw. Gewebezüchtungen (Tissue Engineering Scaffolds), medizinische Textilien, Schläuche, Implantate oder Schäume, als hypoallergene Oberflächen, für Kosmetikprodukte, für Hygieneprodukte, für Haushaltsprodukte und/oder für Filteranwendungen, zum Beispiel Tabak- und Motorenfilter.
Erfindungsgemäß umfasst die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion in einer wässrigen Lösung oder Dispersion wenigstens ein physikalisch stabilisiertes selbstassemblierendes Protein mit einer Proteinkonzentration von 5 Gew.-% bis 35 Gew.-%, bevorzugt von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt von 5 Gew.-% bis 25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Lösung oder Dispersion.
Unter der erfindungsgemäßen stabilen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion wird hier eine Stabilität von mindestens 5 Stunden, bevorzugt von mehr als 12 Stunden, besonders bevorzugt von mehr als 20 Stunden oder sogar von mehr als 48 Stunden verstanden. Ein chemischer Stabilisatorzusatz ist gerade nicht vorgesehen bzw. nicht erforderlich.
Durch die Wasserbasis liegt eine besonders umweltfreundliche Lösung vor. Durch die Verwendung von Wasser als Basis beispielsweise für die Spinnlösung kann auf den Einsatz von organischen Lösungsmitteln verzichtet werden. Dies stellt aus Sicht der Arbeitssicherheit und der Umweltfreundlichkeit, insbesondere im Hinblick auf die Vermeidung von bedenklichen Abfall- oder Nebenprodukten, einen besonderen Vorteil dar.
Stark hydrophobe Proteine weisen in wässriger Lösung eine sehr schlechte Löslichkeit auf. Ohne Stabilisierung können nur verdünnte, wässrige Protein-Lösungen hergestellt werden. Durch die geringe Konzentration lassen sich diese Lösungen oder Dispersionen beispielsweise nicht ohne weitere Zusätze, zum Beispiel von Polymeren, zu Fasern verarbeiten. Zudem werden in diesen verdünnten Lösungen größere Mengen an Zusätzen benötigt.
Durch die Erfindung können hingegen auch reine, wässrige Protein-Lösungen oder -Dispersionen in sehr hoher Konzentration und mit hoher Stabilität hergestellt werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion wird das selbstassemblierende Protein in einer wässrigen Lösung oder Dispersion physikalisch stabilisiert, insbesondere durch mechanische Bewegung und Erwärmung über Raumtemperatur, d. h. insbesondere über 20°C, bevorzugt zwischen 30°C und 90°C, besonders bevorzugt zwischen 30°C und 50°C.
Überraschend wird bereits bei ca. 30°C eine für die Verarbeitung der Proteinlösung oder Protein-Dispersion ausreichende Stabilisierung, das heißt ohne Ausfall des Proteins, erreicht. Überraschend ist weiterhin, dass es bevorzugt ausreicht, die Dialyse für 3 bis 4 Stunden bei 30°C durchzuführen und anschließend bei Raumtemperatur. Damit ist ein besonders Proteinschonendes Verfahren realisiert.
Allein durch die physikalische Stabilisierung können ohne chemischen Stabilisatorzusatz reine, wässrige Protein-Lösungen oder Protein-Dispersionen in sehr hoher Konzentration und mit hoher Stabilität hergestellt werden. Diese können mittels Spinnverfahren zu Fasern oder Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen, verarbeitet werden, insbesondere mittels Elektro- oder Rotorspinnen.
Das selbstassemblierende Protein der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion kann natürlichen Ursprungs oder synthetisch sein, insbesondere durch rekombinante Herstellung, aufgebaut aus repetitiven Einheiten eines Strukturproteins, insbesondere eines Insektenproteins, bevorzugt Resilin, und/oder eines Spinnenseidenproteins oder eines ähnlichen oder davon abgeleiteten Proteins, insbesondere mit Insertion oder Anhängung von Oligoaminosäure-Blöcken und/oder ein intrinsisch entfaltetes Protein oder ein Microbead-bildendes Protein.
Das Protein kann somit auch eine Kombination aus den Sequenzen von natürlichen Strukturproteinen abgeleiteten Proteinen sein, insbesondere eine Kombination aus der Sequenz von einem Protein mit der Sequenz eines anderen Strukturproteins, besonders bevorzugt eine Kombination aus der Sequenz einer Spinnenseide mit der Sequenz des Resilins.
Das selbstassemblierende Protein der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion ist bevorzugt ein R16-, R16Arg₈- (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block mit 8 Aminosäuren), S16- oder C16-Protein oder das natürliche Seidenprotein der Seidenraupe Bombyx mori oder ein von den vorgenannten Proteinen abgeleitetes natürliches oder synthetisches Protein.
Die selbstassemblierenden Proteine mit der Bezeichnung R16 und S16 und deren Herstellung sind beispielsweise ausführlich in der WO 2008/155304 beschrieben. Das Protein und dessen Herstellung mit der Bezeichnung C16 sind beispielsweise ausführlich in der WO 2007/082936 beschrieben.
Durch die physikalische Stabilisierung ist zwar kein Zusatz von Additiven zur Stabilisierung der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion erforderlich. Selbstverständlich können jedoch der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion optional auch Additive zugesetzt werden.
Die stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion umfasst dabei vorzugsweise zumindest ein Additiv, ausgewählt aus

– Mitteln zur Einstellung der Viskosität, insbesondere wasserunlösliche Polymere, zum Beispiel in Form von Dispersionen, oder bevorzugt wasserlösliche Polymere, wie Polyalkylenoxide, wie Polyethylenoxide, Polyethylenglykole oder Polypropylenglykole, Polyvinylalkohole, Polyethylenimine, Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylamine, Polyvinylacetate, Palyacrylate, Polyalkylacrylate, wie Polymethacrylate, Polyhydroxyalkylacrylate, wie Poly(2-hydroxymethacrylate) oder Poly(2-hydroxyethacrylate), Polyvinyformamide, Polyacrylamide, Polycarbonsäuren, wie Polyacrylsäuren oder Polymethacrylsäuren, natürliche Polymere, wie Galaktomannan, Chitosan, Kollagen, Albumin, Xanthan, Alginate, Gelatine, Cellulose oder Stärke, insbesondere deren wasserlösliche Derivate, wie zum Beispiel Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylstärke, oxidierte Stärke, Carboxymethylcellulose,
– Träger-bildenden Polymeren, bevorzugt Kombinationen aus zwei oder mehreren Polymeren, Homo- und Copolymeren,
– Verarbeitungshilfsmitteln, wie Spinnhilfsmitteln, bevorzugt organische Lösungsmittel, wie Alkohole, zum Beispiel Ethanol oder Butanol, und/oder oberflächenaktive Agentien, wie Tenside zur Einstellung der Oberflächenspannung bzw. des Dampfdruckes der Lösung oder Leitsalze zur Einstellung der Leitfähigkeit,
– Vernetzungsmitteln, beispielsweise als Zugabe zur Spinnlösung oder zur nachträglichen Vernetzung von Fasern,
– pharmakologischen Wirkstoffen oder Medikamenten, wie Antibiotika, Antiinfektiva, Analgetika oder antivirale Additve, Antiseptika, entzündungshemmende Mittel, wundheilungsfördernde Mittel, blutstillende Mittel, Proteine, Proteinfragmente, Peptide und/oder Peptidsequenzen, Polysaccharide, zum Beispiel Chitosan, Wachstumsfaktoren, wie Purine oder Pyrimidine, lebende Zellen, β-Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, insbesondere speziell Hydroxyapatitnanopartikel, antimikrobielle Agentien, Aminosäuren, Enzyme, Vitamine, Antioxidantien,
– Haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen, zum Beispiel Effektpigmente, und/oder
– geruchsadsorbierenden Additiven, wie Aktivkohle oder Cyclodextrine, Kronenether, biologisch aktive Metalle oder Metalllegierungen, proteinadsorptionsvermeidende Substanzen, wie zum Beispiel Polyethylenoxid.

Die oben genannten Polymere können dabei als Homopolymere, als Copolymere, zum Beispiel als Blockcopolymere, Pfropfcopolymere, Kamm- oder Bürstencopolymere, Sternpolymere, statistische oder alternierende Systeme, oder in jeglicher Mischung untereinander eingesetzt werden.
Die oben genannten Additive können in reiner Form, in jeglicher Mischung untereinander und/oder in verkapselter Form zugesetzt bzw. adsorbiert werden.
Besonders bevorzugt als Mittel zur Einstellung der Viskosität sind Polyethylenoxid, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und/oder Polyvinylpyrrolidon, die als wasserlösliche Polymere direkt in der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion gelöst werden und toxikologisch unbedenklich sind. Ferner sind im Hinblick auf eine Verwendung im medizinischen Bereich als Additive vorzugsweise Medikamente sowie wundheilungsfördernde oder blutstillende Mittel eingesetzt.
Vorteilhafterweise liegen die Additive in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 40 Gew.-% vor, bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 30 Gew.-% und besonders bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von 2 Gew.-% bis 25 Gew.-%.
Die als Additive eingesetzten pharmakologischen Wirkstoffe oder Medikamente werden abhängig von der Applikation bevorzugt auch in geringeren Konzentrationen als den oben genannten eingesetzt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion wird das wenigstens eine selbstassemblierende Protein bevorzugt in einer geringen Konzentration von ca. 0,5 Gew.-% bis 4 Gew.-% in einem chaotropen Salz gelöst, unter Bewegung, insbesondere durch Rühren, gegen einen wässrigen Puffer dialysiert oder ultrafiltriert, gelfiltriert oder durch andere osmotische Verfahren behandelt oder das chaotrope Salz wird durch Fällung abgetrennt, und die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion wird unter Bewegung, insbesondere durch Rühren, aufkonzentriert durch Erwärmen auf ca. 30°C bis 90°C, bevorzugt auf ca. 50°C bis 80°C.
Die Dialyse erfolgt zur Entfernung des chaotropen Salzes aus der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bevorzugt gegen einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 14, besonders bevorzugt im pH-Bereich von 6 bis 14 und ganz besonders bevorzugt im pH-Bereich von 7 bis 12.
Alternativ zu dem vorgenannten Verfahren wird das wenigstens eine selbstassemblierende Protein bevorzugt in einer hohen Konzentration von ca. 7 Gew.-% bis 35 Gew.-%, besonders bevorzugt von 7 Gew.-% bis 30 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von 7 Gew.-% bis 25 Gew.-%, in einem chaotropen Salz gelöst, unter Bewegung, insbesondere durch Rühren, gegen einen über Raumtemperatur, insbesondere auf ca. 30°C bis 50°C, erwärmten, wässrigen Puffer, der optional gegen destilliertes Wasser ausgetauscht wird, dialysiert oder ultrafiltriert, gelfiltriert oder durch andere osmotische Verfahren behandelt, oder das chaotrope Salz wird durch Fällung abgetrennt.
Durch den optionalen Austausch der Pufferlösung durch destilliertes Wasser wird der pH-Wert der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion vom bevorzugt alkalischen Puffer (größer pH 7) auf ein neutrales Niveau (ca. pH 6–7) herabgesenkt, was besonders schonend für das Protein ist.
Für das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion wird als chaotropes Salz vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat, Calciumchlorid, Lithiumbromid, Harnstoff oder eine ionische Flüssigkeit als Lösungsvermittler eingesetzt.
Bei der Dialyse wird das chaoptrope Salz, zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat, aus der wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nahezu vollständig entfernt. Dadurch erhält man eine reine, wässrige Lösung aus Protein und Wasser. Das Salz, zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat, könnte einen anschließenden Spinnprozess stören, insbesondere das Elektrospinnen wegen seines Einflusses auf die Leitfähigkeit der Spinnlösung, und könnte toxisch für die Zellen sein, insbesondere bei der Anwendung in Wundauflagen. Das Salz könnte auch die Ausbildung und Verfestigung der Fasern beim Spinnprozess stören.
Als Alternative zur Dialyse der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion kommt auch eine Gelfiltration, eine Ultrafiltration oder ein anderes osmotisches Verfahren in Betracht. Zur Aufkonzentrierung der Protein-Lösung in größerem Maßstab ist eine Ultrafiltration besonders geeignet.
Die erfindungsgemäße wässrige, hochkonzentrierte Protein-Lösung oder Protein-Dispersion weist eine sehr hohe Stabilität auf, insbesondere eine Stabilität von mindestens 5 Stunden, bevorzugt von mehr als 12 Stunden, besonders bevorzugt von mehr als 20 Stunden oder sogar von mehr als 48 Stunden.
Aus der erfindungsgemäßen stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bzw. der erfindungsgemäß hergestellten stabilen, wässrigen Protein-Lösung können ohne oder auf einen Form- oder Flächengebilde-Träger direkt besonders reine Protein-Form- oder Flächengebilde, das heißt Protein-Fasern, -Fasergebilde, insbesondere -Vliesstoffe, -Gele, -Folien, -Filme oder -Schäume, oder besonders reine Protein-Imprägnierungen oder Protein-Beschichtungen hergestellt werden.
Die Fasern oder Fasergebilde, insbesondere Vliesstoffe, werden dabei bevorzugt hergestellt durch das Verspinnen der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß hergestellten stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion ohne oder auf einen Form- oder Flächengebilde-Träger zu den entsprechenden Protein-Fasern oder -Fasergebilden, insbesondere -Vliesstoffen.
Unter den Form- oder Flächengebilde-Trägern werden hier Träger oder Oberflächen aus Fasern oder Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen, verstanden oder aus Gelen, Folien, Filmen oder Schäumen.
Das Verspinnen der stabilen, wässrigen Lösung mit selbstassemblierendem Protein erfolgt vorteilhafterweise durch Elektro- oder Rotorspinnen.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Stabilisierung der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion vor dem Spinnen mit einem gesundheitlich unbedenklichen und/oder einem Protein-schonenden Stabilisierungsverfahren erfolgen. Ein nachfolgendes Spinnen ist bevorzugt bei Raumtemperatur in einem kontinuierlichen Prozess über einen längeren Zeitraum möglich, ohne dass die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion ausfällt bzw. geliert oder einem schädlichen Temperatureinfluss ausgesetzt ist.
Die elektroversponnenen Fasern weisen bevorzugt einen Faserdurchmesser von 1 nm bis zu mehreren Mikrometern auf, bevorzugt von 10 nm bis 2000 nm, besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 1000 nm und ganz besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 800 nm.
Die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte Protein-Lösung oder -Dispersion kann auch als Imprägnierung oder Beschichtung, insbesondere durch Sprüh-, Tauch- oder Rotationsbeschichtung (spincoating), ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger eingesetzt werden, beispielsweise von Fasern oder Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen.
Ferner kann die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte stabile, wässrige Protein-Lösung oder -Dispersion ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger vorzugsweise als Beschichtung in Gel-, Folien- oder Filmform oder in Form von Mustern, wie zum Beispiel Punkt- oder Streifenmustern, insbesondere durch einen Druck-, Rakel-, Walzen- oder Gießprozess, eingesetzt oder verarbeitet werden.
Ein spezieller Anwendungsfall stellt beispielsweise die Beschichtung medizinischer Schläuche mit der Protein-Lösung oder -Dispersion dar.
Des Weiteren kann die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte Protein-Lösung ohne oder auf einen Form- oder Flächengebilde-Träger zu Protein-Schäumen verarbeitet werden.
Die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion kann somit direkt auf einen Träger, insbesondere auf ein Form- oder Flächengebilde, beispielsweise auf einen Vliesstoff oder ein sonstiges Fasergebilde, welcher bzw. welches beispielsweise in Wundabdeckungssystemen eingesetzt werden kann, auf einen Film, eine Folie oder auf einen Schaum, zum Beispiel im Falle der Anwendung in Wundauflagen auf einen Polyurethan-Schaum, versponnen werden.
Es ist kein Einsatz von weiteren Stoffen, zum Beispiel von Stabilisatoren zur Stabilisierung der Proteine in der Protein-Lösung notwendig. Es liegt erfindungsgemäß eine stabile, reine, wässrige, hochkonzentrierte Protein-Lösung oder Protein-Dispersion vor, die sich durch die hohe Protein-Konzentration auch ohne die Verwendung von Spinnhilfsmitteln, wie zum Beispiel von Viskositätserhöhern, verspinnen lässt.
Unabhängig davon, können in dem Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden, Imprägnierungen oder Beschichtungen aus der erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß hergestellten stabilen, wässrigen Protein-Lösung jedoch selbstverständlich auch die oben genannten Additive, beispielsweise ausgewählt aus Mitteln zur Einstellung der Viskosität, Träger-bildenden Polymeren, Spinnhilfsmitteln, Vernetzungsmitteln, Beschichtungshilfsmitteln, oberflächenaktiven Agentien, pharmakologischen Wirkstoffen, Medikamenten, wundheilungsfördernden Mitteln, Haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen und/oder geruchsadsorbierenden Additiven, vor dem Verspinnen oder Weiterverarbeiten, zugesetzt werden.
Des Weiteren findet die erfindungsgemäße stabile, wässrige Protein-Lösung oder -Dispersion bzw. finden die daraus hergestellten Flächengebilde, Imprägnierungen oder Beschichtungen vorteilhafterweise Verwendung für Kosmetikprodukte, beispielsweise für Cremes, Schwämme, Pads, Strips oder Masken, für Hygieneprodukte, wie Damenhygiene, Inkontinenzprodukte, Windeln, für Haushaltsprodukte, wie Reinigungsutensilien, insbesondere Tücher oder Schwämme und/oder für Filteranwendungen, wie zum Beispiel für Tabakfilter oder Motorenfilter.
Eine besonders bevorzugte Verwendung findet die erfindungsgemäße stabile, wässrige Protein-Losung oder Protein-Dispersion bzw. finden die daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, Imprägnierungen oder Beschichtungen für medizinische Produkte, vorzugsweise für oder als Wundauflagen, andere Textilen, Schläuche, Gewebekonstruktionen bzw. Gewebezüchtungen (Tissue Engineering Scaffolds) oder Implantate.
So können die medizinischen Produkte beispielsweise zumindest eine Wundkontaktschicht, hergestellt nach einem beschriebenen Verfahren, aufweisen, die den Wundheilungsprozess positiv beeinflusst, oder als biokompatible oder hypoallergene Beschichtung von Oberflächen ausgestaltet ist. Möglicherweise kann sich die Wundkontaktschicht in Kontakt mit der Wunde vom Körper resorbiert und abgebaut werden. Zudem könnte sie ein Verkleben mit der Wunde verhindern. Dadurch werden schmerzhafte Verbandwechsel vermieden und die neu ausgebildeten Gewebeschichten in der Wunde werden durch den Wechsel nicht zerstört.
Durch die oben genannten Additive wird für die Form- oder Flächengebilde, insbesondere die Fasern, Fasergebilde, insbesondere Vliesstoffe, wie beispielsweise auch 3D-modellierte Vliesstoffe, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder für die Imprägnierungen oder Beschichtungen, die nach einem der beschriebenen Verfahren hergestellt sind, somit ein besonders vielfältiger Anwendungsbereich eröffnet.
Dabei liegt zur Herstellung ein umweltfreundliches auf Wasser basierendes und durch die erhöhte Konzentration ein effektives Verfahren zugrunde.
Zur Stabilisierung gegenüber wässrigen Lösungen können die hergestellten Protein-Formgebilde oder -Flächengebilde nachbehandelt werden, beispielsweise durch Tauchen in Ethanol oder Methanol bzw. in Kaliumhydrogenphosphat-Puffer und Waschen mit destilliertem Wasser sowie anschließendes Trocknen.
Ausführung der Erfindung
Der Gegenstand der Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.
Es werden folgende Materialien verwendet:

– R16-Protein als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein gemäß der WO 2008/155304
– R16Arg₈-Protein (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block mit 8 Aminosäuren)
– Natriumhydrogencarbonat-Puffer (10 mM; pH 10 bis 12)
– Guanidiniumthiocyanat-Lösung (6 M); GuaSCN als chaotropes Salz
– Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität
– Poly-N-vinylpyrrolidon (MG 90000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität
– Dialyseschlauch (regenerierte Cellulose: MWCO (Molecular Weight Cut Off) von 10000–12000)
– Dialyseschlauchklammern

Beispiele zur Herstellung von Fasern aus rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen mittels Elektrospinnen
Beispiel 1
R16-Protein (2 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (98 g 6 M GuaSCN), unter Rühren gelöst.
In einem Becherglas werden 10 l Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird verschlossen in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch herausgenommen, in ein tariertes Becherglas gegeben und abgewogen.
Die Protein-Lösung wird im offenen Becherglas unter Rühren bei ca. 70°C so lange eingedampft bis eine gewünschte Konzentration von 7 Gew.-% bis 35 Gew.-% R16-Protein erreicht ist.
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgt durch Abwiegen.
Die Protein-Lösung wird mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 2
Die Protein-Lösung wird wie in Beispiel 1 hergestellt und dialysiert.
Anschließend wird die Protein-Lösung im offenen Becherglas unter Rühren bei 70°C so lange eingedampft bis eine gewünschte Konzentration von 15 Gew.-% bis 20 Gew.-% R16-Protein erreicht ist. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgt durch Abwiegen.
0,5 Gew.-% bis 3 Gew.-% Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität werden zugegeben und unter Rühren gelöst.
Die Protein-Lösung wird mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 3
R16Arg₈-Protein (450 mg) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (3 ml 6 M GuaSCN, 15% m/v), unter Rühren gelöst.
In einem Becherglas werden 1,8 l Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und auf ca. 50°C erwärmt. Die Temperatur wird während der Dialyse gehalten.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird verschlossen in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht, um einen größeren Verdünnungsfaktor zu erreichen.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch herausgenommen. Die Konzentration des R16-Proteins liegt bei 7 Gew.-% bis 35 Gew.-%.
Die Protein-Lösung wird mit oder ohne viskositätserhöhende Mittel mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 4
Die Protein-Lösung wird wie in Beispiel 3 hergestellt.
In einem Becherglas werden 1,8 l Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und auf ca. 50°C temperiert. Die Temperatur wird während der Dialyse gehalten.
Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird verschlossen in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 4 bis 7 Stunden laufen gelassen, der Puffer wird ausgetauscht durch 1,8 l destilliertes Wasser (pH 6 bis 7), danach wird bevorzugt für 4 bis 7 Stunden weiter dialysiert.
Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch herausgenommen. Die Konzentration des R16-Proteins liegt bei 7 Gew.-% bis 35 Gew.-%.
Die Protein-Lösung wird mit oder ohne viskositätserhöhende Mittel mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).
Beispiel 5
Die Protein-Lösung wird wie in Beispiel 3 oder 4 hergestellt, dialysiert und mittels Elektrospinnen zu Fasern verarbeitet. Überraschend wird bereits bei 30°C eine für die Verarbeitung der Protein-Lösung ausreichende Stabilisierung, das heißt ohne Ausfall des Proteins, erreicht.
Beispiel 6
Die Protein-Lösung wird wie in Beispiel 3, 4 oder 5 hergestellt. Überraschend wird wie bei Beispiel 5 bereits bei 30°C eine für die Verarbeitung der Protein-Lösung ausreichende Stabilisierung, das heißt ohne Ausfall des Proteins, erreicht. Die Temperatur wird für 3 Stunden gehalten und danach bei Raumtemperatur weiter dialysiert.
Anschließend wird die Protein-Lösung wie in den vorgenannten Beispielen mit oder ohne viskositätserhöhende Mittel mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern weiter verarbeitet.
Beispiel 7
R16-Protein (300 mg) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (3 ml 6 M GuaSCN, 10% m/v), unter Rühren gelöst.
Überraschend wird bereits bei 30°C eine für die Verarbeitung der Protein-Lösung ausreichende Stabilisierung, das heißt ohne Ausfall des Proteins, erreicht.
Anschließend wird die Protein-Lösung wie in Beispiel 5 dialysiert und wie in den vorgenannten Beispielen mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern weiter verarbeitet.
Die elektroversponnenen R16-Fasern der Beispiele weisen bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 2000 nm auf, besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 1000 nm und ganz besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 800 nm.
Beispiele zur Herstellung von Fasern aus rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen mittels Rotorspinnen
Beispiel 8
Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt mit Zugabe von 4 Gew.-% Polyethylenoxid als Additiv zur Einstellung der Viskosität. Alternativ wird die Protein-Lösung wie in Beispiel 2 hergestellt, dialysiert, aufkonzentriert und mit 4 Gew.-% Polyethylenoxid als Additiv zur Einstellung der Viskosität versehen.
Danach wird die stabile Protein-Lösung mittels Rotorspinnen zu Fasern verarbeitet.
Beispiel 9
Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 3, 5 oder 6 durchgeführt mit Zugabe von 15 Gew.-% Polyvinylpyrrolidon als Additiv zur Einstellung der Viskosität.
Danach wird die Protein-Lösung mittels Rotorspinnen zu Fasern verarbeitet
Beispiele zur Film- oder Folienherstellung aus rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen
Beispiel 10
Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt mit optionaler Zugabe von Additiven oder viskositätssteigernden Mitteln. Danach wird der Film oder die Folie aus der Protein-Lösung zum Beispiel durch Rotationsbeschichtung (spin coating) oder durch Rakeln hergestellt.
Beispiel 11
Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 3, 5 oder 6 durchgeführt mit optionaler Zugabe von Additiven, insbesondere viskositätssteigernden Mitteln.
Danach wird der Film aus der Protein-Lösung zum Beispiel durch Rotationsbeschichtung (spin coating) oder durch Rakeln hergestellt.
Beispiele zur Herstellung von mit rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen sprühbeschichteten Vliesstoffen
Beispiel 12
Die Protein-Lösung wird wie in Beispiel 1 hergestellt und dialysiert.
Die Protein-Lösung wird im offenen Becherglas unter Rühren bei 70°C so lange eingedampft bis eine gewünschte Konzentration von 5 Gew.-% bis 20 Gew.-% R16-Protein erreicht ist. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgt durch Abwiegen.
Die Protein-Lösung wird auf einen Viskose-Vliesstoff gleichmäßig aufgesprüht, beispielsweise mittels einer Sprühpistole mit Druckluft. Anschließend wird der Vliesstoff bei Raumtemperatur getrocknet.
Beispiele zur Herstellung von mit rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen tauchbeschichteten Vliesstoffen
Beispiel 13
Die Protein-Lösung wird wie in Beispiel 12 hergestellt, dialysiert und aufkonzentriert. Ein Viskose-Vliesstoff wird in die stabile, konzentrierte Protein-Lösung getaucht und anschließend bei Raumtemperatur getrocknet.
Alle Versuche können mit R16-Protein oder R16Arg₈-Protein (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block) durchgeführt werden. Dem R16Arg₈-Protein werden bezüglich der Wundheilung besondere Eigenschaften zugeschrieben.
Alternativ kann auch das S16-Protein oder das C16-Protein eingesetzt werden.
Optionale Nachbehandlung der hergestellten Protein-Fasern, Protein-Filme, Protein-Folien oder Protein-Beschichtungen zur Stabilisierung gegenüber wässrigen Lösungen
1. Nachbehandlungsvariante
Die Protein-Fasern, -Filme, -Folien oder -Beschichtungen werden für ca. 0,5 bis 1 Minute in Ethanol oder Methanol getaucht und danach bei Raumtemperatur und zur Entfernung der Lösungsmittelreste im Vakuumschrank getrocknet.
2. Nachbehandlungsvariante
Die Protein-Fasern, -Filme, -Folien oder -Beschichtungen werden für ca. 2 Stunden in Kaliumhydrogenphosphat-Puffer getaucht und danach mit destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 6110590 [0006]
JP 2010270426 A [0007]
JP 2010-150712 [0009]
WO 2008/155304 [0025, 0061]
WO 2007/082936 [0025]

Claims

Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, umfassend in einer wässrigen Lösung oder Dispersion wenigstens ein physikalisch stabilisiertes selbstassemblierendes Protein mit einer Proteinkonzentration von 5 Gew.-% bis 35 Gew.-%, bevorzugt von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt von 5 Gew.-% bis 25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Lösung.
Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 1, wobei das selbstassemblierende Protein natürlichen Ursprungs oder synthetisch ist, insbesondere durch rekombinante Herstellung, aufgebaut aus repetitiven Einheiten eines Strukturproteins, insbesondere eines Insektenproteins und/oder eines Spinnenseidenproteins oder eines ähnlichen oder davon abgeleiteten Proteins, insbesondere mit Insertion oder Anhängung von Oligoaminosäure-Blöcken und/oder ein intrinsisch entfaltetes Protein oder ein Microbead-bildendes Protein.
Stabile, wässrige Protein-Losung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 1 oder 2, wobei das selbstassemblierende Protein ein R16-, R16Arg₈-, S16- oder C16-Protein oder ein davon abgeleitetes Protein ist.
Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend zumindest ein Additiv, ausgewählt aus Mitteln zur Einstellung der Viskosität, Träger-bildenden Polymeren, Spinnhilfsmitteln, Vernetzungsmitteln, oberflächenaktiven Agentien, pharmakologischen Wirkstoffen, Medikamenten, wundheilungsfördernden Mitteln, Haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen und/oder geruchsadsorbierenden Additiven.
Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 4, wobei das Additiv bzw. die Additive in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 40 Gew.-% vorliegt bzw. vorliegen, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2 Gew.-% bis 25 Gew.-%.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wenigstens eine selbstassemblierende Protein in einer wässrigen Lösung oder Dispersion über Raumtemperatur erwärmt und mechanisch bewegt wird.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 6, wobei das wenigstens eine selbstassemblierende Protein in einer Konzentration von 0,5 Gew.-% bis 4 Gew.-% in einem chaotropen Salz gelöst wird, unter Bewegung gegen einen wässrigen Puffer dialysiert, ultrafiltriert oder gelfiltriert wird oder durch andere osmotische Verfahren behandelt wird oder das chaotrope Salz durch Fällung abgetrennt wird, und die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion aufkonzentriert wird durch Erwärmen auf ca. 30°C bis 90°C unter Bewegung.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 6, wobei das wenigstens eine selbstassemblierende Protein in einer Konzentration von 7 Gew.-% bis 35 Gew.-% in einem chaotropen Salz gelöst wird, unter Bewegung gegen einen auf ca. 30°C bis 50°C erwärmten, wässrigen Puffer dialysiert, ultrafiltriert oder gelfiltriert wird oder durch andere osmotische Verfahren behandelt wird oder das chaotrope Salz durch Fällung abgetrennt wird.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 7 oder 8, wobei als chaotropes Salz Guanidiniumthiocyanat, Calciumchlorid, Lithiumbromid, Harnstoff oder eine ionische Flüssigkeit eingesetzt wird.
Verfahren zur Herstellung von Fasern oder Fasergebilden, insbesondere von Vliesstoffen, wobei eine stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 5 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion zu Protein-Fasern oder -Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen, versponnen wird.
Verfahren zur Elektro- oder Rotorverspinnung von selbstassemblierendem Protein, wobei eine stabile, wässrige Lösung oder Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 5 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion elektro- oder rotorversponnen wird.
Verfahren zur Herstellung von Imprägnierungen, Beschichtungen, Gelen, Folien oder Filmen, wobei eine stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 5 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion als Protein-Imprägnierung oder Protein-Beschichtung, insbesondere durch Sprüh-, Tauch- oder Rotationsbeschichtung, von Form- oder Flächengebilde-Trägern eingesetzt wird oder als Protein-Beschichtung in Gel-, Folien- oder Filmform, insbesondere durch einen Druck-, Rakel-, Walzen- oder Gießprozess, von Form- oder Flächengebilde-Trägern verarbeitet wird.
Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden, insbesondere Fasern, Fasergebilden, Gelen, Folien, Filmen oder Schäumen, oder von Imprägnierungen oder von Beschichtungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion vor dem Verspinnen oder Verarbeiten zumindest ein Additiv nach Anspruch 4 oder 5 zugesetzt wird.
Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bzw. der daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, insbesondere Fasern, Fasergebilde, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder der daraus hergestellten Imprägnierungen oder Beschichtungen nach einem vorhergehenden Ansprüche für medizinische Produkte, bevorzugt für oder als Wundauflagen, Schläuche, Gewebekonstruktionen bzw. Gewebezüchtungen (Tissue Engineering) oder Implantate, für Kosmetikprodukte, für Hygieneprodukte, für Haushaltsprodukte und/oder für Filteranwendungen.
Form- oder Flächengebilde, insbesondere Fasern, Fasergebilde, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder Imprägnierungen oder Beschichtungen, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 13.