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Die vorliegende Erfindung betrifft einen schnelldrehenden Klinostat zur Schwerelosigkeitssimulation sowie ein Verfahren zur Untersuchung von Organismen in simulierter Schwerelosigkeit.
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Klinostaten sind zur Simulation von Schwerelosigkeit bei lebenden Organismen, insbesondere bei Pflanzen, bekannt. Zur Simulation der Schwerelosigkeit wird die Pflanze in eine Rotation versetzt. Pflanzen weisen sedimentierbare Partikel auf, sogenannte Statolithen, die durch die Schwerkraft sedimentieren. Die Statolithen sind in speziellen Zellen, den Statocythen, angeordnet, die eine Sedimentation der Statolithen registrieren. Über Statocythen bzw. Statolithen kann somit die Schwerkraft von der Pflanze wahrgenommen werden, so dass das Pflanzenwachstum an die Schwerkraft angepasst werden kann und die Wurzeln einer Pflanze beispielsweise in Richtung Erdmittelpunkt wachsen.
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Mit Hilfe eines Klinostaten kann die Pflanze in eine sogenannte Klinorotation versetzt werden, so dass die Sedimentation der Statolithen verhindert wird und diese dauerhaft in der Schwebe sind. Dadurch kann der Pflanze eine Schwerelosigkeit simuliert werden.
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Insbesondere die Beobachtung von Einzellern, Einzelzellen oder kleinen Pflanzen, die beispielsweise eine Größe im Mikrometer- bis Millimeterbereich aufweisen, ist jedoch in einem Klinostaten aufgrund der Größe der zu beobachtenden Organismen und der stetigen Rotationsbewegung des Klinostaten äußerst schwierig.
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Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Klinostaten zur Verfügung zu stellen, der die Untersuchung der in den Klinostaten eingesetzten Organismen vereinfacht. Es ist ferner die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein vereinfachtes Verfahren zur Untersuchung von Organismen in simulierter Schwerelosigkeit bereitzustellen.
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Der erfindungsgemäße Klinostat zur Schwerelosigkeitssimulation ist durch den Patentanspruch 1 definiert. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung von Organismen in simulierter Schwerelosigkeit ist durch den Patentanspruch 12 definiert.
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Der erfindungsgemäße schnelldrehende Klinostat zur Schwerelosigkeitssimulation weist ein um eine Achse rotierend angetriebenes Aufnahmebehältnis zur Aufnahme von Organismen oder Substanzen auf. Es ist gekennzeichnet durch einen Strahlungserzeuger zum Erzeugen von optischer Strahlung und eine Strahlungsempfängervorrichtung zur Detektion und/oder Sensierung von optischer Strahlung.
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Neben dem erfindungsgemäßen schnelldrehenden Klinostaten können Organismen oder Substanzen in vorteilhafter Weise beobachtet werden, indem diesen beispielsweise eine lumineszierende Substanz zugefügt wird. Die lumineszierende Substanz wird während der Drehung des Aufnahmebehältnisses mit optischer Strahlung des Strahlungserzeugers bestrahlt. Über eine Untersuchung oder Auswertung der mittels der Strahlungsempfängervorrichtung detektierten oder sensierten optischen Lumineszenzstrahlung der lumineszierenden Substanz können dann Aussagen über physiologische Stati oder Kinetiken der Organismen oder Substanzen getroffen werden. Der erfindungsgemäße Klinostat hat den Vorteil, dass durch das Vorsehen von Strahlungserzeuger und Strahlungsempfängervorrichtung mittels der lumineszierenden Substanzen auf Verhalten des Organismus oder der Substanz geschlossen werden kann und dass der Organismus oder die Substanz direkt beobachtet werden muss, indem mittels der Lumineszenztechnik die Veränderungen an dem Organismus oder der Substanz sichtbar gemacht werden.
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Unter optischer Strahlung im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die elektromagnetische Strahlung im ultravioletten, sichtbaren und infraroten Spektrum verstanden.
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Die Erfindung kann in vorteilhafter Weise vorsehen, dass der Strahlungserzeuger und die Strahlungsempfängervorrichtung auf das Aufnahmebehältnis ausgerichtet ist. Auf diese Weise können besonders genaue Auswertungen erfolgen, da mittels der Strahlungserzeuger die in dem Aufnahmebehältnis enthaltenen Organismen oder Substanzen sowie die lumineszierende Substanz direkt und gerichtet bestrahlt werden kann. Durch die Ausrichtung der Strahlungsempfängervorrichtung auf das Aufnahmebehältnis wird ermöglicht, dass die Lumineszenzstrahlung direkt detektiert oder sensiert werden kann, so dass bereits kleine Strahlungsmengen auswertbar sind.
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Die Erfindung sieht in vorteilhafter Weise vor, dass der Strahlungserzeuger regelbar ist, wobei eine optische Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge erzeugbar ist oder dass der Strahlungserzeuger mehrere Strahlungsquellen zur Erzeugung von optischer Strahlung mit unterschiedlichen Wellenlängen aufweist.
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Durch das Vorsehen eines Strahlungserzeugers, der Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge erzeugen kann bzw. der mehrere Strahlungsquellen zur Erzeugung optischer Strahlung mit unterschiedlicher Wellenlänge aufweist, kann das Aufnahmebehältnis während eines Versuchs mit optischer Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge bestrahlt werden, so dass unterschiedliche Untersuchungen erfolgen können, in denen beispielsweise verschiedene lumineszierende Substanzen verwendet werden. Dadurch ist der erfindungsgemäße schnelldrehende Klinostat flexibel für unterschiedliche Untersuchungen einsetzbar.
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Bei dem erfindungsgemäßen Klinostaten kann der Strahlungserzeuger eine Lichtquelle sein. Diese kann beispielsweise als eine oder mehrere Hochleistungsdioden ausgebildet sein.
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In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist vorgesehen, dass die Strahlungsempfängervorrichtung ein Photomultipliersystem aufweist. Über ein Photomultipliersystem ist die Detektion der Lumineszenzstrahlung auf besonders einfache Art und Weise möglich, wobei gleichzeitig das Ergebnis digital gespeichert werden kann. Dabei werden die Photonen der Lumineszenzstrahlung als Impulse gemessen, so dass eine quantitative Auswertung der Lumineszenzstrahlung erfolgen kann.
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Es kann vorgesehen sein, dass das Photomultipliersystem eine Filtervorrichtung zur Filterung von Licht aufweist. Dabei kann die Filtervorrichtung ein Filterwechsler mit mehreren Filtern aufweisen. Durch die Filtervorrichtung kann die optische Strahlung dahingehend gefiltert werden, dass nur Licht in einem bestimmten Wellenlängenbereich, das beispielsweise im Bereich der zu erwartenden Lumineszenzstrahlung liegt, von dem Photomultipliersystem empfangen wird. Dadurch kann der erfindungsgemäße Klinostat mit unterschiedlichen lumineszierenden Substanzen verwendet werden, wobei über die Filtervorrichtung eine Anpassung an die zu erwartende Lumineszenzstrahlung erfolgen kann. Durch das Vorsehen von mehreren Photomultipliersystemen mit jeweils einer Filtervorrichtung können darüber hinaus gleichzeitig die Lumineszenzstrahlung in zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen gemessen werden.
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Die Strahlungsempfängervorrichtung kann auch eine Aufnahmeoptik, beispielsweise ein Mikroskop, sein. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Aufnahmeoptik ein Fluoreszenzmikroskop ist. Über das Vorsehen einer Aufnahmeoptik kann neben der quantitativen Auswertung auch eine qualitative Auswertung erfolgen, indem beispielsweise die Lumineszenzstrahlung über eine Kamera aufgenommen und ausgewertet wird.
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In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die Strahlungsempfängervorrichtung um die Achse rotierend antreibbar ist. Alternativ kann vorgesehen sein, dass die Strahlungsemfängervorrichtung feststehend angeordnet ist.
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Durch die um die Achse rotierend antreibbare Anordnung der Strahlungsempfängervorrichtung kann somit die Strahlungsempfängervorrichtung in gleicher Weise wie das Aufnahmebehältnis rotierend angetrieben werden. Die von der Emfängervorrichtung empfangene lumineszierende Strahlung kann dann als im Wesentlichen stillstehendes Bild empfangen werden, so dass eine Veränderung der in dem Aufnahmebehältnis aufgenommenen Organismen oder Substanzen in vorteilhafter Weise untersucht werden können.
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Die Erfindung sieht in vorteilhafter Weise vor, dass das Aufnahmebehältnis, der Strahlungserzeuger und die Strahlungsempfängervorrichtung in einer lichtdichten Kammer angeordnet sind. Dadurch kann das Eindringen von Umgebungslicht bei der Untersuchung der Organismen oder der Substanzen verhindert werden, da weder die lumineszierende Substanz in dem Aufnahmebehältnis durch von außen eindringendes Licht angeregt wird, noch die von der Strahlungsempfängervorrichtung empfangene Lumineszenzstrahlung durch das Umgebungslicht beeinflusst wird.
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Die Erfindung kann vorsehen, dass das Aufnahmebehältnis ein Objektträger oder eine Kapillare, beispielsweise eine sterile Einwegkapillare, ist. Die Verwendung eines Objektträgers ist insbesondere bei der Verwendung einer rotierende antreibbaren Aufnahmeoptik vorteilhaft. Die Verwendung von Kapillaren eignet sich insbesondere bei einer feststehend angeordneten Strahlungsempfängervorrichtung.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung von Organismen in simulierter Schwerelosigkeit, wobei ein Organismus zur Simulation von Schwerelosigkeit rotiert wird, sieht vor, dass der Organismus mit einer lumineszierenden Substanz versetzt wird, der Organismus und die lumineszierende Substanz während der Simulation der Schwerelosigkeit mit einer optischen Strahlung bestrahlt werden und dass die von der lumineszierenden Substanz emittierte Lumineszenzstrahlung detektiert oder sensiert wird.
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Dabei kann vorgesehen sein, dass die Lumineszenzstrahlung über einen Photomultiplier quantitativ ausgewertet wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch vorsehen, dass die Lumineszenzstrahlung über ein Mikroskop quantitativ und/oder qualitativ ausgewertet wird.
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In einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die lumineszierende Substanz ein Fluoreszenzfarbstoff ist. Fluoreszenzfarbstoffe sind in unterschiedlichsten Ausführungen verfügbar und in besonders vorteilhafter Weise über eine optische Strahlung anregbar. Dabei kann vorgesehen sein, dass der Fluoreszenzfarbstoff ein fluoreszierendes Protein ist. Als fluoreszierendes Protein kann beispielsweise ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), ein cyan fluoreszierendes Protein (CFP) oder ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) verwendet werden. Es können auch die sogenannten anhanced Varianten von Proteinen zum Einsatz kommen, wie beispielsweise eGFP oder eYFP. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ins besonders vorteilhafter Weise anwendbar, wenn die lumineszierende Substanz ein sogenannter Lebendfarbstoff ist, der nicht toxisch für den zu untersuchenden Organismus ist.
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Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen hat den großen Vorteil, dass derartige Proteine zumeist gentechnisch mit Proteinen des zu untersuchenden Organismus fusioniert werden können. Daher beinhaltet dann der zu untersuchende Organismus das fluoreszierende Protein, so dass die von dem fluoreszierenden Protein emittierte Fluoreszenzstrahlung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Lumineszenzstrahlung bildet, in vorteilhafter Weise untersucht werden kann, wobei von der Fluoreszenzstrahlung direkt auf eine Veränderung des zu untersuchenden Organismus geschlossen werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorsehen, dass der Organismus und die lumineszierende Substanz während der Simulation der Schwerelosigkeit mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge bestrahlt wird, wobei die Strahlung mit dem Licht unterschiedlicher Wellenlänge gleichzeitig oder alternierend erfolgen kann. Dadurch können unterschiedliche Untersuchungen an dem Organismus vorgenommen werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch vorsehen, dass die Lumineszenzstrahlung vor der Auswertung gefiltert wird, so dass nur Lumineszenzstrahlung einer bestimmten Wellenlänge oder in einem bestimmten Wellenlängenbereich der Auswertung zugeführt wird.
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Als fluoreszierende Proteine können auch fluoreszierende Proteine von Korallen, die beispielsweise unter dem Namen zoanFP oder ein unter dem Handelsnamen DsRed bekannte fluoreszierende Proteine verwendet werden. Diese Proteine haben den Vorteil, dass sich die Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung mit der Zeit verändert, so dass darüber eine Altersbestimmung ermöglicht werden kann. Die Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise zur Calciummessung eingesetzt werden, indem über den Fluoreszenzfarbstoff in einer Zelle die Veränderung von cytosolischen Calcium angezeigt wird. Auch ist es möglich, über Fluoreszenzfarbstoffe eine Messung von freien Sauerstoffradikalen vorzunehmen.
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Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren die Erfindung näher erläutert. Es zeigen:
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1 ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen schnelldrehenden Klinostaten und
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2 ein zweites Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen schnelldrehenden Klinostaten.
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In 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen schnelldrehenden Klinostaten 1 schematisch dargestellt. Der schnelldrehende Klinostat 1 weist eine lichtdichte Kammer 3 auf, in der ein Aufnahmebehältnis 5 um eine Achse 7 rotierend antreibbar gelagert ist. Zum Antreiben des Aufnahmebehältnisses 5 weist der Klinostat 1 einen Motor 9 auf, der beispielsweise als Servomotor ausgebildet sein kann.
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In dem Aufnahmebehältnis 5, das in dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel als Einwegkapillare ausgebildet ist, die beispielsweise ein Volumen von 100 μl aufnehmen kann, sind mehrere Organismen 11, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt sind, angeordnet. Der Motor 9 setzt das Aufnahmebehältnis 5 in eine rotierende Bewegung, wobei die rotierende Bewegung beispielsweise eine Drehzahl von maximal 90 U/min aufweist. Die Geschwindigkeit der rotierenden Bewegung des Aufnahmebehältnisses 5 ist dabei derart zu wählen, dass eine Schwerelosigkeit simuliert wird. Eine derartige Rotation nennt man auch Klinorotation. Die Rotation bewirkt dabei, dass sedimentierbare Partikel in den Organismen nicht sedimentieren, sondern eine Bewegung auf einer Kreisbahn ausführen, so dass der durch diese sedimentierbare Partikel erzeugte Schwerereiz in dem Organismus nicht erzeugt wird, da die sedimentierbaren Partikel dauerhaft in der Schwebe sind. Bei einer zu schnellen Rotation würden die sedimentierbaren Partikel aufgrund der Zentrifugenwirkung einen dauerhaften Schwerereiz ausüben.
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Der erfindungsgemäße Klinostat 1 weist darüber hinaus einen Strahlungserzeuger zum Erzeugen von optischer Strahlung auf. In dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel weist der Strahlungserzeuger 13 zwei Hochleistungsdioden 15 auf, die optische Strahlung in einem unterschiedlichen Wellenlängenbereich erzeugen. Der Strahlungserzeuger 13 ist auf das Aufnahmebehältnis 5 ausgerichtet, so dass die von dem Strahlungserzeuger 13 erzeugte optische Strahlung direkt auf die in dem Aufnahmebehältnis 5 enthaltenen Organismen 11 und den Fluoreszenzfarbstoff gestrahlt wird.
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Der Klinostat 1 weist ferner eine Strahlungsempfängervorrichtung 17 auf, die in dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel aus zwei Photomultipliern 19 besteht. Die von dem Fluoreszenzfarbstoff imitierte Fluoreszenzstrahlung wird von den Photomultipliern 19 aufgenommen und detektiert. Dazu können die Photomultiplier 19 jeweils eine Filtervorrichtung 21 aufweisen, die als Filterwechsel ausgebildet sein können. Über die Filtervorrichtung 21 kann die aufgenommene Strahlung gefiltert werden, so dass beispielsweise nur die Fluoreszenzstrahlung von den Photomultipliern 19 empfangen wird.
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Der Strahlungserzeuger 13 kann ferner in 1 nicht dargestellte austauschbare Kühlkörper aufweisen, so dass die Hochleistungsdioden 15 im Betrieb gekühlt werden.
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In 2 ist ein zweites Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen schnelldrehenden Klinostaten 1 schematisch gezeigt. Der Klinostat 1 weist ein um eine Achse 7 rotierend angetriebenes Aufnahmebehältnis 5 auf, das in dem in 2 dargestellten Ausführungsbeispiel als Objektträger ausgebildet ist. Auf dem Objektträger sind zu untersuchende Organismen angeordnet, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt sind. Das Aufnahmebehältnis 5 wird von einem Motor 9 rotierend angetrieben.
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Das Aufnahmebehältnis 5, die Strahlungsempfängervorrichtung 17 und der Strahlungserzeuger 13 sind in einer lichtdichten Kammer 3 angeordnet.
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Der Klinostat 1 weist darüber hinaus eine Strahlungsempfängervorrichtung 17 auf, die in dem in 2 dargestellten Ausführungsbeispiel als Aufnahmeoptik 23 ausgebildet ist. Die Aufnahmeoptik 23 kann beispielsweise ein Fluoreszenzmikroskop mit Kamera sein. Die Strahlungsempfängervorrichtung 17 wird ebenfalls von dem Motor 9 um die Achse 7 rotierend angetrieben. Dadurch werden das Aufnahmebehältnis 5 und die Strahlungsempfängervorrichtung 17 mit der gleichen Geschwindigkeit angetrieben, so dass ein von der Aufnahmeoptik 23 aufgenommenes Bild im Wesentlichen unbewegt erscheint.
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Über einen Strahlungserzeuger 13, der in dem in 2 dargestellten Ausführungsbeispiel aus zwei Strahlungserzeugereinheiten 13a, 13b mit jeweils einer Hochleistungsdiode 15 besteht, wird eine optische Strahlung auf das Aufnahmebehältnis 5 gestrahlt, so dass durch die optische Strahlung Fluoreszenzfarbstoffe angeregt werden.
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Mit dem in 1 dargestellten Klinostaten lässt sich über die Photomultiplier eine quantitative Auswertung der Fluoreszenzstrahlung vornehmen.
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Mit dem in 2 dargestellten Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Klinostaten 1 lässt sich mit Hilfe der Aufnahmeoptik eine quantitative und qualitative Auswertung der Fluoreszenzstrahlung vornehmen, indem nicht nur die Strahlungsmenge an Fluoreszenzstrahlung, sondern auch der Entstehungsort der Fluoreszenzstrahlung bzw. die Organismen direkt beobachtet werden.
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Der erfindungsgemäße Klinostat ist in vorteilhafter Weise bei der Untersuchung von Organismen wie Zellen, Einzellern und kleinen Pflanzen einsetzbar. Selbstverständlich ist der erfindungsgemäße Klinostat auch bei der Untersuchung von Substanzen, die zur Sedimentation tendieren, einsetzbar, indem die Sedimentation durch die Rotation verhindert wird.
