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Die Erfindung betrifft ein integriertes Greif- und Zuführsystem für Anwendungen in der Mikro- und Nanotechnik zur Manipulation von Mikro- und Nano-Objekten, vorzugsweise zur Mikromanipulation von Zellen.
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Auf dem Gebiet der biologischen, medizinischen und gentechnische Forschung ist die künstliche Manipulation Mikro- und Nano-Objekten, wie beispielsweise von Genen, Zellen, Zellkernen, Geweben und ähnlichem bekannt. Das Einbringen von Substanzen in lebende Zellen durch Mikromanipulation ist dabei von besonderer Bedeutung.
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Herkömmliche Verfahren für die künstliche Manipulation sind apparativ sehr aufwendig und verlangen hohe Anforderungen an die Präzision einer Vorrichtung und eines Nutzers. In der Gentechnik ist z. B. die höchstgenaue räumliche Positionierung einer Miniaturkanüle zum Zellkernaustausch ein entscheidendes Anliegen.
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In der Medizin-, Bio- und Gentechnik wurde der Mensch mit seiner Sensorik und Manipulationsfähigkeit in vielen Bereichen eingesetzt. Inzwischen werden dabei Positioniersysteme in Form von Manipulatoren, Handhabegeräten und spezifisch ausgelegte Miniroboter unterstützend verwendet.
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Beispielsweise läuft die Manipulationen an Zellen bisher im Wesentlichen in folgenden Schritten ab:
- • Bereitstellung einer ersten Mikrokapillare, die mittels eines Vakuums eine Zelle fixiert,
- • Bereitstellung einer zweiten Mikrokapillare, in die einige Nanoliter Lösung aufgezogen oder abgegeben wird,
- • Bereitstellung eines Mikroinjektors, der mittels eines präzisen Luftstosses die Lösung aus der Spitze der Kapillare presst,
- • Bereitstellung von zwei Mikromanipulatoren, wobei ein Mikromanipulator zur Justierung der Injektionskapillare und der andere zur Justierung der Mikrokapillare dient, welche mittels des Vakuums die Zelle fixiert,
- • Bereitstellung eines hochwertigen Inversmikroskops, über welches der Nutzer eine visuelle Kontrolle ausübt.
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Eine auf einen Kern gerichtete Mikromanipulation oder Immobilisierung einer Eizelle erfolgt beispielweise mit Hilfe einer Glaskapillaren, die über einen ersten Mikromanipulator geführt wird, ist aus (http://aet-d.de/mikromanipulation.htm, http://www.gvsolas.de/publ/buch/06kapitel.pdf bekannt. Diese Glaskapillare läßt sich mit Hilfe des ersten Mikromanipulators in drei Achsen gezielt zu der auf dem Tisch eines Mikroskops befindlichen Eizelle positioneren. Die Eizelle besitzt einen Polkörper. In der Nähe dieses Polkörpers ist der Kern der Eizelle angeordnet. Zuerst muss die Glaskapillare zum Festhalten der Zelle grob in das Bildfeld des Objektivs gebracht werden. Anschließend wird die Spitze der Glaskapillare durch eine dreidimensionale Bewegung (x-, y- und z-Richtung) des ersten Mikromanipulators über der interessierenden Zelle positioniert und mittels eines Vakuums fixiert. Mit einem zweiten Mikromanipulator wird die Injektionskapillare grob in das Bildfeld des Objektivs gebracht und die Injektionskapillare in z-Richtung zunächst einmal so justiert, dass eine Bewegung der Injektionskapillare innerhalb des Tiefenschärfenbereiches des Mikroskops zu einem Einstechen in die Zelle führt. Für das Einstechen ist es notwendig, die Position des Kerns zu lokalisieren und mit der Injektionskapillare die Ausrichtung der Zelle durch Berühren oder Rollen zu fixieren.
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Eine Injektionsnadel zur Mikromanipulation ist aus
JP63222680 bekannt. Diese Vorrichtung weist eine fixierte Nadel „fixed by using plural guides 8” auf, so dass hierbei keine Bewegung der Nadel möglich ist, sondern die Zelle wird mittels Vakuum in Richtung der Injektionsnadel angesaugt. Dadurch besteht die Gefahr, dass die Zelle ausgesaugt bzw. zerstört wird. Zudem erfolgt keine definierte Eindringtiefe in die Zelle.
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Aus
DE 33 90 499 C2 ist beispielsweise ein Verfahren zur Durchführung Mikrooperationen an Zellen und eine Einrichtung zur Durchführung dieser Manipulation bekannt. Dabei ist eine starre Verbindung zwischen dem beweglichen Glied
20 des Schrittmotors und des Mikroinstruments
1 vorgesehen, so dass hierdurch ebenfalls nur eine translatorische Bewegung des Mikroinstruments
1 möglich ist.
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Die zuvor beschriebenen Verfahren zur Mikroinjektion von Zellen erfordern mehrere, präzise hintereinander durchzuführende Einzelschritte. Hierbei ist einige Erfahrung notwendig, um die Zellen an der richtigen Stelle zu treffen und insbesondere, um die Kapillare nicht zu weit abzusenken und damit abzubrechen. Außerdem erfolgt der Einstich in die Zellen nicht in Achsrichtung der Kapillare, so dass die Zellmembran durch den Injektionsvorgang relativ stark verletzt werden kann.
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Zudem sind Manipulationen in Form von Mikroinjektionen in Zellen mit einer ”harten” Zellwand oder einer elastischen Zellmembran, die der Injektionskapillare nacheben, mit konventionellen Systemen nur bedingt möglich und führen in vielen Fällen zur Beschädigung der Zellmembran.
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Die ganzheitliche Systemintegration aller funktionalen Bestandteile des Systems stellt hohe Anforderungen an diese Ansteuerung und Regelung dar. Ein weiterer Aspekt dieser funktionalen Elemente ergibt sich aus den Forderungen an eine Baugrößen- und Massenreduzierung, die wiederum hohe Anforderungen an den Werkstoffeinsatz und die Fertigungstechnologien stellt. Zudem ist man bestrebt, diesen Systemen eine hohe Langzeitstabilität zu verleihen.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, mit einfachen Mitteln ein möglichst leicht handhabbares System zur künstliche Manipulation von Mikro- und Nano-Objekten, wie beispielsweise Genen, Zellen, Zellkernen, Geweben und ähnlichem zur Verfügung zu stellen.
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Diese Aufgabe wird mit einem integrierten Greif- und Zuführsystem zur Manipulation von Mikro- und Nano-Objekten, vorzugsweise von Zellen mit den Merkmalen des Anspruchs 1, mit einem Verfahren zur Durchführung von Mikromanipulationen gemäß Anspruch 6 sowie einem Mikropositioniersystem nach Anspruch 7 gelöst.
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Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert. Die darin enthaltenen Merkmale sind jedoch auch mit anderen Merkmalen aus der nachfolgenden Beschreibung zu weiteren Ausgestaltungen verknüpfbar und nicht allein auf die jeweilige beanspruchte Weiterbildung beschränkt.
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Dieses integrierte Greif- und Zuführsystem erweist sich als stabiles, leicht bedienbares und präzise positionierbares Gerät, welches zudem durch einen geringen Herstellungsaufwand gekennzeichnet ist.
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Es wird ein integriertes Greif- und Zuführsystem zur Mikromanipulation von Mikro- und Nano-Objekten, vorzugsweise von Zellen vorgeschlagen, welches zumindest folgende Bestandteile umfasst:
- • eine Injektionskapillare, die in einer Mikrokapillare angeordnet ist,
- • ein Gestell mit einem ersten Teil und einem zweiten Teil, an dessen einem Ende die Mikrokapillare angeordnet ist,
- • einen Universalkapillarenhalter, der zum überwiegenden Teil in dem Gestell angeordnet ist und zur Aufnahme der Injektionskapillare dient,
- • eine erste Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit, die mittels Verbindungselementen mit dem Gestell in Verbindung steht und
- • eine zweite Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit zur räumlichen Positionierung des Universalkapillarenhalters, derart dass die erste und die zweite Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit in ihrer Länge veränderlich sind.
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Eine Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass das Greif- und Zuführsystem zumindest eine zweite Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit zur räumlichen Positionierung des Universalkapillarenhalters aufweist, welche in Form einer elektrischen und/oder magnetischen, vorzugsweise jedoch als eine piezoelektro- oder magnetostriktive Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit ausgebildet ist.
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Vorteilhaft ist es, wenn die zuvor genannte zweite Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit des Greif- und Zuführsystems als ein Piezoaktor oder ein Terfenolaktor ausgebildet ist.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist in dem Greif- und Zuführsystem die Injektionskapillare in dem Universalkapillarenhalter räumlich bewegbar angeordnet, indem mindestens zwei Aktor-Einheiten oder Aktor-Sensor-Einheiten vorgesehen sind.
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Eine Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass die Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit, die einen Teil des Gestells bildet, durch äußere Anregung eine definierte Längenänderung des Gestells bewirkt. Dabei ist die maximale Längenänderung von der Anzahl und Länge der Aktoren abhängig. Die Länge Änderung der Aktoren kann zwischen 1 nm–200 μm, vorzugsweise zwischen 1 μm–30 μm, besonders bevorzugt zwischen 110 μm–140 μm
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Die Injektionskapillare kann Außendurchmesser zwischen 0,5 μm–200 μm aufweisen, vorzugsweise zwischen 1 μm–30 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,7 μm–10 μm.
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Der Innendurchmesser der Mikropipette kann zwischen 2 μm–205 μm liegen, vorzugsweise zwischen 2 μm–40 μm, besonders bevorzugt zwischen 2 μm–12 μm.
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Der Universalkapillarenhalter kann in einer Länge zwischen 5 mm–60 mm ausgebildet sein, vorzugsweise zwischen 20 mm–40 mm, besonders bevorzugt zwischen 15 mm–30 mm Verwendete Materialien/Materialkombinationen für Bestandteile Glas, Metall, Keramik, Thermoplaste und neue Materialien (wie UV härtendes Sol-Gel, siehe zum Beispiel Multi Jet Modeling)
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Das Greif- und Zuführsystem kann in der Medizintechnik, der Gentechnik, der Biotechnik, eingesetzt werden und zur Manipulation von Mikro- und Nano-Objekten, vorzugsweise von Zellen, beispielsweise zum Injizieren oder zur Entnahme von festen und/oder flüssigen Bestandteilen, vorzugsweise zur Übertragung oder zum Austausch von Zellkernen verwendet werden.
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Vorzugsweise wird das Greif- und Zuführsystem zur 3D-Mikrofertigung beispielsweise im Bereich Mikrofräsen, Schleifen, Schinden, Gravieren eingesetzt. Daneben sind Anwendungen im Bereich der 3D-Mikromontage vorgesehen, beispielsweise zur Fertigung oder Montage von zum Beispiel Mikrokomponenten wie Linsen oder Elektro-Chips.
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In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Durchführung von Manipulationen an Mikro- und Nano-Objekten, vorzugsweise an Zellen zur Verfügung gestellt, bei dem das zuvor beschriebene integrierte Greif- und Zuführsystem genutzt wird.
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Das Verfahren umfasst zumindest folgende Schritte:
- • Bereitstellung eines zu manipulierenden Mikro- und Nano-Objektes, vorzugsweise einer Zelle,
- • räumliche Positionierung der Mikrokapillare relativ zur Zelle durch Veränderung der Länge der zweiten Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit,
- • Positionierung und Fixierung der Zelle an der Mikrokapillaren, beispielsweise mittels Vakuum,
- • Betätigung der ersten Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit zur Bewegung der Injektionskapillare und Manipulation der Zelle.
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Durch das Zusammenwirken der ersten und zweiten Aktor-Einheit oder Aktor-Sensor-Einheit kann ein Mikro- oder Nano-Objekt derart vorbereitet werden, dass es gerollt und/oder orientiert und/oder positioniert wird, um manipuliert werden zu können.
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Über die Wahl des Aktors, beispielsweise eines Piezo-Aktors und/oder die äußere Anregung kann die Länge des Austritts der Injektionsnadel aus der Injektionskapillare definiert eingestellt werden.
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Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass ein Mikropositioniersystem zur Verfügung gestellt wird, welches zumindest ein integriertes Greif- und Zuführsystem der zuvor beschriebenen Art umfasst.
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Die Erfindung führt durch die Integration von Greif- und Zuführsystemen und der Kombination von aktorischen und Funktionselementen zu einem System, das sowohl als Antriebsplattform zur Positionierung von einer Mikrokapillare und einer Injektionskapillare dienen kann, als auch durch eine entsprechend konstruktive Gestaltung von Aktoren, Gestellen und Injektionskapillaren und deren Zusammenwirken die Injektionskapillare räumlich und translatorisch beweglich ausgerüstet sein kann.
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Das System ist spielfrei gestaltet. Die Funktionalkräfte werden in Richtung der Bewegungsabläufe in das System eingebracht.
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Das System kann für mehrere Aktoren oder Aktor-Sensor-Einheiten ausgelegt sein. Durch das Zusammenwirkung des Bewegungserzeugungs- bzw. Greif- und Zuführsystems mit dem Antrieb in Form eines oder mehrerer Aktoren oder Aktor-Sensor-Einheiten stellt es eine integrierte Einheit zur translatorischen Kraft- und Bewegungsgenerierung dar, erzeugt durch in der Länge veränderliche Aktoren oder Aktor-Sensor-Einheiten, wobei elektrische, magnetische, elektro- oder magnetostriktive Aktoren, beispielsweise Piezo- oder Terfenolaktoren oder auch konventionelle Aktoren zum Einsatz kommen können.
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Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen und Merkmale werden anhand der nachfolgenden Figuren jeweils näher erläutert. Die dort dargestellten Bespiele sind jedoch nicht beschränkend auszulegen, sondern beispielhaft. Die nachfolgend beschriebenen Merkmale sind jeweils auch mit Merkmalen aus den anderen Figuren sowie mit Merkmalen der oben beschriebenen Offenbarung zu weiteren Ausgestaltungen verknüpfbar. Es zeigen:
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1 eine schematische Darstellung eines Greif- und Zuführsystems in Form eines Mikrogreifers und einer Zuführeinrichtung,
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2 eine schematische Schnittdarstellung A-A eines Greif- und Zuführsystems mit einem Universalkapillarenhalter und mit einer Injektionskapillare
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1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Greif- und Zuführsystems 1 in Form eines multifunktionalen Mikrogreifers und einer Zuführeinrichtung. Dabei wird die Realisierung einer Integration eines Greif- und Zuführsystems für die Führung von Kanülen in der Zellbiologie für den Zellkernaustausch demonstriert. Derartige Manipulationen werden in Abhängigkeit von dem zu manipulierenden Objekt bei Temperaturen zwischen –20°C–60°C, vorzugsweise zwischen 4°C–45°C, besonders bevorzugt zwischen 18°C–26°C durchgeführt.
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Das integrierte System für die Zelleninjektion 1 besteht aus einer Mikrokapillare 3 zum Fixieren eines Mikro- und Nano-Objektes, einer Aktor-Einheit bzw. Kombination Aktor-Sensor-Einheit 6, die mittels Verbindungselementen 7 mit einem Gestell 4, umfassend ein erstes Teil 4a und ein zweites Teil 4b in Verbindung steht und einem Universalkapillarenhalter 5, an dessen einem Ende sich eine Injektionskapillare 2 befindet. In der Mikrokapillare 3, die an dem zweiten Gestellteil 4b angeordnet ist, wird zur Aufnahme der Zellen ein Vakuum erzeugt. Der als Antrieb dienende Aktor 6 ist verantwortlich für die translatorische Bewegung der Mikrokapillare 3. Dieser Antrieb 6 ist von einer Seite mit der Mikrokapillare 3 und von der anderen Seite mit einer Vakuum-/Druck-Ressource (in 1 nicht gezeigt), beispielsweise in Form einer Röhre, durch Verbindungselemente 7, die in Verbindung mit dem ersten Teil 4a und dem zweiten Teil 4b des Gestells 4 stehen, gekoppelt. Zudem kann eine zweite Vakuum-/Druck-Ressource mit dem Universalkapillarenhalter 5 gekoppelt sein (nicht in 1 dargestellt).
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2 zeigt eine Schnittdarstellung des in 1 dargestellten Universalkapillarenhalters 5 mit einer Injektionskapillare 2.
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Die Injektionskapillare 2 ist mit ihrem Universalkapillarenhalter 5 innerhalb des Gestells 4 angeordnet. Mit den Aktoren 8 erfolgt eine räumliche Bewegung der Injektionskapillare 2 und damit die Positionierung der Zelle. Nach der sachgemäßen Manipulation der Zellen und deren Ansaugen in der Mikrokapillare 3, wird der Aktor 6, der als Röhren-Aktor ausgebildet ist, aktiviert und zieht dabei die Mikrokapillare 3 zusammen mit der Zelle rückwärts ein. Im Ergebnis wird die Injektionskapillare 2 die Membran der Zelle definiert durchstechen, wodurch die gewünschten Substanzen dann an einer genau festgelegten Position und Tiefe in die Zelle injiziert werden können.
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Dieser Ansatz verspricht eine höhere Genauigkeit, eine geringere Baugrößen und damit ein geringeres Gewicht der Vorrichtung. Zudem sind der Montageaufwand und die damit verbundenen Kosten geringer. Gleichzeitig wird hierbei ein Verfahren mit einer höheren Arbeitsgeschwindigkeit zur Verfügung gestellt.
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Die Kombination verschiedener Greif- und Zuführtechnologien erlaubt die Manipulation von Mikro- und Nano-Objekten, vorzugsweise von Zellen in einem breiten Größen-, Kraft- und Genauigkeitsbereich. Die Art der Anordnung und des Zusammenwirkens von lokalen Sensoren, Aktoren, Mechanismen zur Steuer- und Regelung sichert einen sehr robusten Betrieb der Greif- und Zuführeinrichtungen.
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Durch die Integration von Greif- und Zuführsystemen sowie die Anordnung von mehreren Aktoren, beispielsweise ausgebildet als magneto-, elektrostriktive Aktoren oder Aktoren konventioneller Art und Sensoren wird ein komplettes Manipulationssystem für Mikro- und Nano-Objekte, vorzugsweise für Zellen in einer einfachen und kompakten Baueinheit mit wenigen Bauteilen bei gleichzeitig geringen geometrischen Abmessungen zur Verfügung gestellt.
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Das System ist in Bezug auf eine gewünschte translatorische und räumliche Bewegung frei skalierbar und deshalb für verschiedenste Anwendungen einsetzbar. Alle verfügbaren Energiewandler in Form von Aktoren konventioneller und alternativer Bauart können als Antrieb eingesetzt werden. Bei alternativen Aktoren, vorrangig Piezoaktoren, sind einfachste kostengünstige Elemente einsetzbar, die sowohl als Aktor als auch als Sensor genutzt werden können.
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Das integrierte Greif- und Zuführsystemen weist insbesondere die im Folgenden genannten Vorteile auf:
- • Die Immobilisierung der Zellen kann ohne eine zweite Pipette realisiert werden,
- • die Orientierung der Zelle ist unkritisch,
- • durch lokale Messungen lassen sich die Position und die betätigte Kraft der Pipette und dem Injektor überwachen,
- • es lassen sich höhere Genauigkeiten, geringere Baugrößen und Gewichte realisieren,
- • die Kontrolle über den Prozess kann semiautomatisch oder vollautomatisch durchgeführt werden,
- • das System stellt aufgrund seiner sehr hohen Penetrationsgeschwindigkeit und einer exakten axialen Vorwärtsbewegung der Injektionskapillare ein effizientes Hilfsmittel für die Manipulation von Mikro- und Nano-Objekten, vorzugsweise zur Mikromanipulation von Zellen dar. Dadurch wir eine Verformung oder Zerstörung der Zelle vermieden. Eine getrennt von der Vorwärtsbewegung einstellbare Rückwärtsbewegung des Kapillarenhalters ermöglicht zudem ein schnelles Zurückziehen der Kapillare und verhindert ein Anhaften penetrierter Zellen an der Kapillarenspitze.
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Anwendungsgebiete liegen vorzugsweise im Bereich der Zellmanipulation wie Mikroinjektion, Übertragung von Zellkernen etc. Ein weiteres Anwendungsfeld stellen die 3D-Mikrofertigung und 3D-Mikromontage dar. Arbeitsschritte wie Zuführen, Positionieren, Orientieren des der zu manipulierenden Objekte werden bezüglich Ausführgeschwindigkeit und Genauigkeit deutlich verbessert.
