DE102010055566A1

DE102010055566A1 - Neue Antibiotika bestehend aus einer Gyrase-Hemmer- und einer Catechol-Struktureinheit zur verbesserten Aufnahme mittels Siderophor-Transporter in die Zelle, das Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel

Info

Publication number: DE102010055566A1
Application number: DE102010055566A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Heide Lutz; Silke Alt
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2012-06-21

Abstract

Die Erfindung betrifft Konjugate der Gyrase-Hemmer, die insbesondere zur Aminocoumarin-Antibiotika gehören, mit Catechol-Struktureinheiten, das Verfahren zu ihrer Herstellung, sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln. Diese Verbindungen weisen die allgemeine Strukturformel I auf:wobei die Reste R1bis R5in der Beschreibung und in den Ansprüchen definiert sind. Diese Substanzen wirken antibakteriell, wobei ihre Aufnahme in die bakterielle Zelle aktivüber Eisen-Siderophor-Transportproteine erfolgt. Dadurch weisen die neuen Catechol-Konjugate eine bessere antibakterielle Wirkung auf als die herkömmlichen Antibiotika der Gyrase-Hemmer-Klasse. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einem enzymatischen Verfahren synthetisiert werden. Dabei werden im ersten Schritt der Aminocoumarinring und die Catechol-Struktureinheiten mit einer Amidsynthetase, z. B. der Amidsynthetase CloL, zu einer Aminocoumarinsäure umgesetzt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate zwischen Gyrase-Hemmer, die insbesondere zur Aminocoumarin-Antibiotika gehören, und einer Catechol-Struktureinheit, das Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre pharmazeutische Verwendung. Diese Verbindungen wirken antibakteriell, wobei ihre Aufnahme in die bakterielle Zelle aktiv über Eisen-Siderophor-Transportproteine erfolgt. Dadurch weisen die neuen Catechol-Konjugate eine bessere antibakterielle Wirkung auf als die herkömmlichen Antibiotika der Gyrase-Hemmer-Klasse.
Gyrase-Hemmer sind chemische Verbindungen, die die Aktivität von Gyrase-Enzymen verhindern, und damit die lebensnotwendige Replikation der bakteriellen DNA beeinträchtigen. Die bakterielle Gyrase stellt eine geeignete Zielstruktur dar, an der Antibiotika angreifen können, da dieses Target in eukaryotischen Zellen fehlt.
Aminocoumarine, wie z. B. Novobiocin und Clorobiocin ( ), bilden eine Gruppe von Gyrase-Hemmern, die von verschiedenen Stämmen der Gattung Streptomyces synthetisiert werden. Im Gegensatz zu Chinolon-Antibiotika, die an der A-Untereinheit der bakteriellen Gyrase angreifen, ist das zelluläre Traget der Aminocoumarine ihre B-Untereinheit [1]. Das therapeutische Potential der Aminocoumarine liegt in ihrer hohen Affinität zur bakteriellen Gyrase mit Inhibierungskonzentrationen im 10 nm Bereich; d. h. die Hemmkonzentrationen sind erheblich geringer als die der Chinolone [1, 2].
Obwohl Clorobiocin der potentere Wirkstoff gegen die bakterielle Gyrase ist, ist aus der Klasse der Aminocoumarine einzig Novobiocin in den USA als humantherapeutisches Antiinfektivum unter dem Handelsnamen Albamycin^® (Pharmacia & Upjohn) [3] zugelassen und wird zur Behandlung multiresistenter Gram-positiver Pathogene wie Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis eingesetzt. Wegen der schlechten Löslichkeit in Wasser und der geringen Aktivität gegen Gram-negative Bakterien wird Novobiocin nur als Reserveantibiotikum verwendet.
Bestimmte Catechole spielen in den natürlich vorkommenden Siderophoren bei der Eisenaufnahme in die Bakterienzelle eine wichtige Rolle. Siderophore (z. B. Enterobactin von Escherichia coli oder Petrobactin von Bacillus anthracis) werden von Bakterien ins umgebende Medium ausgeschieden, um lebensnotwendige Eisenionen mit Hilfe der benachbarten Hydroxylgruppen der Catechol-Verbindung zu komplexieren [4]. Über spezifische Siderophor-Rezeptor- bzw. Siderophor-Transportproteine in der Membran [5, 6], denen die Catechol-Struktur als Erkennungsmerkmal dient, werden die Siderophore wieder in die Bakterienzelle aufgenommen.
Verschiedene Catechol-Verbindungen wurden bereits mit Antibiotika verknüpft, z. B. mit β-Laktamen, wodurch eine erhebliche Steigerung der antibakteriellen Wirksamkeit der Antibiotika erreicht wurde, die durch eine verbesserte Aufnahme über bakterielle Eisentransportwege in die Zelle zustande kommt (Arisawa, M., Sekine, Y., Shimizu, S., Takano, H., Angehrn, P., Then, R. L., Antimicrob. Agents Chemother. 32 (1991), 653; DE10111160 ). Konjugate von Gyrase-Hemmern mit Catechol-Struktureinheiten sind in der Literatur bisher nicht beschrieben.
In den letzten Jahren kam es zu einer rasanten Resistenzentwicklung bei pathogenen Bakterien z. B. multiresistenten Staphylococcus aureus Stämmen (MRSA). Deshalb wächst die dringende Notwendigkeit, neue Antibiotika mit verbesserten Eigenschaften zu finden und herzustellen. Die Verbindungsgruppe der Gyrase-Hemmer, insbesondere die Substanzklasse der Aminocoumarine, bietet hierfür einen guten Ansatzpunkt für die Herstellung neuer Derivate mit interessanten antimikrobiellen Eigenschaften.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Gyrase-hemmende Antibiotika mit einer verbesserten Wirksamkeit als die herkömmlichen Antibiotika dieser Substanzklasse bereitzustellen und in Hinblick auf Ihre Verwendung als pharmazeutische Wirkstoffe zu charakterisieren. Hierzu soll außerdem ein Verfahren entwickelt werden, mit dem die neuen Substanzen herstellbar sind.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem neue Antibiotika-Konjugate von Gyrase-Hemmern und Catecholverbindungen bereitgestellt werden.
Insbesondere handelt es sich bei der Erfindung um Konjugate von Aminocoumarinen und Catechol-Verbindungen, welche die allgemeine Formel I aufweisen:
wobei zwei benachbarte Reste R₁ und R₂, oder R₂ und R₃ gleichzeitig für je eine OH-Gruppe und der übrige Rest für ein Wasserstoffatom stehen,
R₄ für H, Cl oder CH₃ steht,
und R₅ für H,
steht.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung weisen die Verbindungen die allgemeine Formel II auf:
wobei die Reste R₁ bis R₄ die o. g. Bedeutungen annehmen können und einer der Reste R₆ oder R₇ für eine der Gruppen
während der andere Rest für H steht.
Da die Catechol-Struktureinheit der erfindungsgemäßen Verbindungen eine Siderophor-Struktur imitiert, bieten diese Substanzen die Möglichkeit, den lebensnotwendigen Mechanismus der bakteriellen Eisenaufnahme zu nutzen, um Membran-assoziierte Resistenzmechanismen von Bakterien zu überwinden. Einige der erfindungsgemäßen Konjugate zeigen deswegen stärkere Wirksamkeit gegen Bakterien als die herkömmlichen Antibiotika ( und Ausführungsbeispiele).
Ein weiterer Vorteil dieser Verbindungen ist, dass die erfindungsgemäß eingeführte Catechol-Einheit, welche die Erkennungsstruktur für die Siderophor-Transporter darstellt, einen Teil der ursprünglichen Aminocoumarin-Struktur ersetzt und direkt ohne einen zusätzlichen Linker an die restliche Antibiotika-Struktureinheit gekoppelt ist. Die chemische Struktur wird dadurch nicht vergrößert und die erfindungsgemäßen Verbindungen büssen somit nicht ihre antibiotische Wirkung ein, wohingegen eine Vergrößerung der Struktur oftmals erheblich die Aktivität des Antibiotikums beeinträchtigen kann [7].
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere in einem enzymatischen Verfahren synthetisiert werden. In einem speziell dafür entwickelten Verfahren werden natürliche und synthetische Gene aus unterschiedlichen Grampositiver und Gram-negativen Mikroorganismen in vivo eingesetzt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden der Aminocoumarinring und die Catechol-Struktureinheiten (z. B. 2,3-Dihydroxybenzoesäure oder 3,4-Dihydroxybenzoesäure) mit einer Amidsynthetase, insbesondere der Amidsynthetase CloL, in einem Reaktionsschritt zu einer Aminocoumarinsäure umgesetzt ( ). In mehreren anschließenden Reaktionsschritten wird die Deoxyzuckereinheit mit Hilfe einer Glycosyltransferase auf die Aminocoumarinsäure übertragen. Im Fall von Novobiocin findet eine anschließende Carbamoylierung statt, bei Clorobiocin wird indessen ein 5-Methylpyrrol-2-carboxylteil angehängt.
Des Weiteren umfasst die Erfindung die pharmazeutische Verwendung der neuen Konjugate. Die erfindungsgemäßen Verbindungen eigenen sich aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften zur Verwendung als Arzneimittel bei bakteriellen Infektionen. Die Verbindungen können entweder allein oder mit physiologisch verträglichen Hilfs- oder Trägerstoffen verwendet werden. Dabei sind prinzipiell alle üblichen pharmakologischen Anwendungsformen und physiologisch verträglichen Dosierungen möglich.
In der vorliegenden Erfindung ist es zum ersten Mal gelungen, Konjugate der Gyrase-hemmenden Aminocoumarin-Antibiotika und Catechol-Struktureinheiten herzustellen. Durch die gezielte aktive Aufnahme der Substanzen in die bakterielle Zelle mittels Siderophor-Transporter wird ein neuer Aufnahmemechanismus in die Zelle bereitgestellt und die Gyrase-hemmenden Eigenschaften können effektiver genutzt werden.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der unten beschriebenen Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Figuren beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:
: Chemische Strukturen der aus dem Stand der Technik bekannten Aminocoumarine Novobiocin und Clorobiocin;
: Beispiel für die chemische Struktur eines erfindungsgemäßen Aminocoumarin-Antibiotikums mit Catechol-Struktur;
: Nukleotidsequenz des synthetischen ubiC/pobA-DNA Fragments. Die unterstrichenen Buchstaben zeigen die flankierenden HindIII und SpeI Restriktionsschnittstellen. Die hervorgehobenen Buchstaben representieren Start- und Stop-Codons der synthetischen Gene ubiC und pobA. Die Gene sind translational gekoppelt, wobei das Stop-Codon von ubiC mit dem Start-Codon von pobA überlappt;
: Beispiel für das Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Clorobiocin-Derivates mit 3,4-Dihydroxybenzoesäure (Novclobiocin 401) anstelle des natürlichen Ring A;
: Massenspektrometrische Fragmentierung der erfindungsgemäßen Verbindung Novclobiocin 401. LC-ESI-MS Massen-Scans wurden im Negativ-Modus für m/z 643 durchgeführt. Das Fragmentierungsmuster der erfindungsgemäßen Verbindung Novclobiocin 401 ist dargestellt;
: Agardiffusionstests zur Bestimmung der antibakteriellen Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung Novclobiocin 401 im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen Clorobiocin, Novobiocin in E. coli Mutanten mit aktiven und inaktivierten TonB.
Ausführungsbeispiele
1) Herstellungsverfahren
Herstellung von Novclobiocin 401, ein Clorobiocin-Derivat mit Catechol-Struktureinheit 3,4-Dihydroxybenzoesäure (3,4-DHBS) anstelle des natürlichen Ring A
Um einen alternativen bzw. zusätzlichen Aufnahmemechanismus von Aminocoumarinen durch die äußere Membran bereitzustellen, wurde am Beispiel von Novclobiocin 401 eine Teilstruktur (Ring A) von Clorobiocin durch eine Catechol-Struktur (3,4-Dihydroxybenzoesäure) ersetzt ( und ). Die Catechol-Struktur des neuen Derivates wird von E. coli Siderophor-Transportern der äußeren Membran erkannt und das Derivat aktiv in die Bakterienzelle aufgenommen.
Allgemeine Methoden
Escherichia coli XL1 Blue MRF' (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), BW25113 [8] und ET12567 [9] wurden für die Klonierungen benutzt. Standardmethoden für DNA Isolation und Manipulation wurden nach Sambrook et al. [10] und Kieser et al. [11] durchgeführt. Die RED/ET-vermittelte Rekombination zur Inaktivierung von Genen wurde wie bei Gust et al. [12] beschrieben durchgeführt.
Synthese der Catechol-Struktureinheit 3,4-DHBS
3,4-DHBS kann unter Katalyse von zwei Enzymen, der 4-Hydroxybenzoe-3-Hydroxylase PobA (GenBank AB210281) [13] aus Gram-positivem Bakterium Corynebacterium cyclohexanicum und der Chorismate-Pyruvate-Lyase UbiC (GenBank NC_008253) [14, 15] aus Gram-negativem Bakterium Escherichia coli gebildet werden. Das Edukt von PobA, die 4-Hydroxybenzoesäure, kann weder C. cyclohexanicum noch Streptomyces sp. in einer in vivo Biosynthese herstellen; E. coli hingegen besitzt das Enzym UbiC, das Chorisminsäure zu 4-Hydroxybenzoesäure in vivo katalysiert. Da der GC-Gehalt (insbesondere von ubiC) dieser Gene viel geringer als der durchschnittliche Gehalt in Genen der Gattung Streptomyces ist [16], wurden die Nukleotidsequenzen von ubiC und pobA and die Codon Preferenz von S. coelicolor, dem heterologen Wirtsstamm, angepasst (Gen Designer Software; DNA2.0 company, Menlo Park, California, USA). Außerdem wurden die Gene translational gekoppelt, um eine Co-Regulation zu gewährleisten. Die Nukleotidsequenz des synthetischen ubiC/pobA-Konstruktes ist in aufgeführt.
Konstruktion des Plasmids pSA11
Nach der Herstellung bei der DNA2.0 Company (California, USA) wurde das synthetische DNA-Fragment über die beiden HindIII und SpeI Restriktionsschnittstellen in den Streptomyceten Expressionsvector pUWL201 unter den konstitutiven Promotor ermE* kloniert [17]. Das resultierende Plasmid pSA11 wurde mittels Protoplasten-Transformation in den heterologen Wirtsstamm Streptomyces coelicolor M512 (clo-SA2) mit integriertem Clorobiocin Biosynthesegencluster (siehe unten) transformiert, resultierend in Stamm S. coelicolor M512 (clo-SA2)/pSA11.
Herstellung des heterologen Wirtsstamms Streptomyces coelicolor M512 (clo-SA2): Inaktivierung von cloQ im Cosmid clo-BG1 und heterologe Expression in S. coelicolor M512
Für die Herstellung wurde als Erstes eine Ring A-Deletionsmutante des heterologen Clorobiocin-Produzenten durch RED/ET-vermittelte Rekombination bereitgestellt. Durch Inaktivierung des Gens cloQ bleibt die Bildung von Ring A aus [18]; dies gewährleistet, dass einzig das neue Derivat mit Catechol-Struktur und nicht das natürliche Clorobiocin gebildet wird.
Im Cosmid clo-BG1 [19] wurde das Gen cloQ durch eine Apramycin-Resistenzkassette (aac(3)IV), flankiert durch XbaI und SpeI Restriktionsstellen, mittels RED/ET-vermittelte Rekombination ersetzt. Zum Ersetzen von cloQ wurde die Apramycin-Resistenzkassette durch PCR Amplifikation mit pUG019 als Template und den Primern cloQ_f(5'-GGC GCG CCC ATT GCT CAC CGT CTT ACC GAC ACC GTC CTT ATT CCG GGG ATC TCT AGA TC-3') and cloQ_r (5'-TCC CAT GGT CGA TTC CGT GTG TTG GTG AAG TGC GCG CAG ACT AGT CTG GAG CTG CTT C-3') hergestellt [20]. Die unterstrichenen Buchstaben kennzeichnen die XbaI und SpeI Restriktionsschnittstellen.
Die PCR-Amplifikation wurde in 50 μl Volumen mit 100 ng Template, 0,25 mM dNTPs, 50 pmol jedes Primers und 5% (v/v) DMSO mit dem Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals) durchgeführt: Denaturierung bei 94°C für 2 min, 10 Zyklen mit Denaturierung bei 94°C für 45 s, Annealing bei 50°C für 45 s und Elongation bei 72°C für 90 s, gefolgt von 15 Zyklen mit Annealing bei 55°C für 45 s, und dem letzten Elongationsschritt bei 72°C für 5 min. Das PCR-Produkt wurde durch Elektroporation in E. coli BW25113/plJ790 eingebracht, der das Cosmid clo-BG1 beinhaltete. Das modifizierte Cosmid wurde isoliert und zur Entfernung der Apramycin-Resistenzkassette in E. coli ET12567 eingebracht. Nach anschließender Isolation wurde es mit XbaI und SpeI verdaut und religiert, resultierend in Cosmid clo-SA2.
Das aus E. coli ET12567 isolierte Cosmid clo-SA2 wurde in S. coelicolor M512 durch PEG-vermittelte Protoplasten-Transformation eingebracht, resultierend in Stamm S. coelicolor M512 (clo-SA2).
Eine Herstellung durch Mutasynthese, wie bereits für Aminocoumarin-Antibiotika beschrieben [21, 22], ist für die Herstellung catecholierter Verbindungen nicht möglich, da gefütterte Catechole schnell im Medium oxidiert oder als Kohlenstoffquelle metabolisiert werden [23]. Aus diesem Grund wurde eine kontinuierliche in vivo Biosynthese der Catecholsäuren bereitgestellt, um sie konstant der Aminocoumarin Biosynthese zur Verfügung zu stellen.
Eine Zusammenfassung des Herstellungsprozesses von Novclobiocin 401 ist in dargestellt.
Produktion, Extraktion und Isolation von Novclobiocin 401
Die Pre-Kultivierung von S. coelicolor M512(clo-SA2)/pSA11 wurde in TSB-Medium (BD Bioscience) mit 50 μg/ml Thiostrepton für 3 Tage bei 30°C und 210 rpm durchgeführt, gefolgt von einer Kultivierung im CDM-Produktionsmedium [24] (50 ml je Erlenmayerkolben) für 5 Tage unter den genannten Bedingungen. Für die Extraktion wurden insgesamt 2 l Kultur auf pH 4,0 mit Salzsäure eingestellt und zweimal mit dem gleichen Volumen Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde bis zur Trockenheit einrotiert und der Rückstand in Methanol aufgenommen.
Der Methanolextrakt wurde mittels preparativer HPLC (Agilent, USA) mit einer Multosphere Säule 120 RP18-5 (250 × 20 mm, 5 μm; C&S Chromatographie Service Düren, Germany) unter einer Flußrate von 2 ml/min aufgetrennt. Für die Isolation von Novclobiocin 401 wurde ein linearer Gradient von 70% zu 100% Fließmittel B (Fließmittel A: H₂O/HCOOH 99:1; Fließmittel B: Methanol: HCOOH 99:1) über 36 min verwendet. Novclobiocin 401 eluiert bei ca. 12,5 min Retentionszeit. Die UV-Detektion wurde bei 280 nm durchgeführt.
Strukturaufklärung von Novclobiocin 401 mittels LC-MS, ¹H NMR und ¹³C NMR
Die Struktur von Novclobiocin 401 wurde durch eine LC-MS Analyse, sowie ¹H NMR und ¹³C NMR Spektroskopie nachgewiesen.
LC-MS Analyse:
Für die LC-MS Analyse wurde ein ESI Massenspektrometer (LC/MSD Ultra Trap System XCT 6330; Agilent Technology) verwendet. Der Methanolextrakt wurde über eine Nucleosil 100-C18 Säule (100 × 2 mm, 3 μm) mit einer Temperatur von 40°C und einer Flußrate von 400 μl/min analysiert. Ein linearer Gradient von 60% zu 100% Fließmittel D (Fließmittel C: H₂O/HCOOH 99.9:0.1; Fließmittel D: Methanol/HCOOH 99.94:0.06) über 20 min wurde benutzt. Die UV-Detektion wurde bei 280 nm durchgeführt. Die Elektrospray Ionisation wurde im Negativ-Modus vollzogen ( ).
NMR-Spektroskopie:

Für die NMR Analyse wurden 3 mg Novclobiocin 401 in CD₃OD gelöst und an einem Varian Inova Spektrometer vermessen. ¹H NMR Spektren wurden mit 600 MHz and ¹³C NMR Spektren mit 125.7 MHz aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen in CD₃OD sind als δ-Werte aufgelistet (Tabelle 1):

Position	¹H-NMR (150.8 MHz, CD₃OD), δ_H [ppm], Intensität, m, J [Hz]	¹³C-NMR (125.7 MHz, CD₃OD), δ_C [ppm]
1		125.6
2	7.42, 1H, br s	116.1
3		146.2
4		150.8
5	6.80, 1H, d (6.9)	115.8
6	7.39, 1H, d (6.9)	121.7
7 in 1, 12 in 2		169.6
2'		161.8
3'		102.5
4'		161.7
5'	7.82, 1H, d (7.1)	124.1
6'	7.22, 1H, d (7.1)	111.9
7'		150.0
8'		110.2
9'		156.1
10'		110.5
1''	5.72, 1H, d (2.0)	100.2
2''	4.38, 1H, br m	71.0
3''	5.70, 1H, dd (11.1, 2.0)	71.6
4''	3.72, 1H, d (11.1)	82.7
5''		80.4
6''	1.17, 3H, s	22.9
7''	1.35, 3H, s	29.3
8''	3.52, 3H, s	62.0
2'''		121.5
3'''	6.89, 1H, d (3.4)	118.2
4'''	5.93, 1H, d (3.4)	109.7
5'''		136.1
6'''	2.29, 3H, s	13.0
7'''		161.8

Tabelle 1: ¹H NMR und ¹³C NMR Spektroskopie Daten von Novclobiocin 401. Chemische Verschiebungen sind als δ-Werte dargestellt; CD₃OD wurde als Lösungsmittel und interner Standard verwendet.

2) Testung
Testung der inhibitorischen Aktivität von Novclobiocin 401 in Gyrase-Aktivitäts-Assays
Novclobiocin 401 wurde in vitro unter Verwendung des Gyrase Supercoiling-Assay auf seine inhibitorische Aktivität auf E. coli und S. aureus Gyrase im Vergleich zu Clorobiocin und Novobiocin getestet. Die Enzyme und Komponenten des Supercoiling-Assay wurde von Inspiralis (Norwich, UK) bezogen und die Assays mit der auf der Inspiralis Hompage beschriebenen Methode unter Zusätzlicher Zugabe von 700 mM Ka-Glutamat (Roth) durchgeführt (www.inspiralis.com).
Die Inhibierungs Konzentrationen (IC₅₀s) von Novclobiocin 401 wurden mit 0,006 μM für S. aureus Gyrase und 0,03 μM für E. coli Gyrase bestimmt. Diese Hemmkonzentration entsprechen denen von Clorobiocin und sind geringer als die, die für Novobiocin gegenüber beiden Gyrasen beobachtet wurden (Inhibierungs-Konzentrationen: 0,01 μM bzw. 0,08 μM). Dies beweist, dass die Ersetzung des natürlichen Ring A mit 3,4-Dihydroxybenzoesäure die Aktivität der Verbindung als Gyrase-Inhibitor nicht herabsetzt bzw. sogar erhöht.
Testung der antibakteriellen Aktivität in Agardiffusions-Tests
Wie eben beschrieben hemmt Novclobiocin 401 mit der gleichen Konzentration wie Clorobiocin die Gyrase von E. coli. Ein Unterschied in der antibakteriellen Aktivität dieser beiden Verbindungen kann demnach an einem verstärktem Influx oder einem verringertem Efflux liegen. Um Unterschiede im Influxverhalten der beiden Verbindungen bestimmen zu können, wurde das Gen tolC, codierend für einen wesentlichen Teil der AcrABTolC-Effluxpumpe, inaktiviert [25].
E. coli besitzt drei äußere Membran-Transporter für den aktiven Transport von Siderophoren des Catecholat-Typs (Fiu, Cir oder FepA) [26]. Alle drei Transporter beziehen ihre Energie vom periplasmatischen Bindeprotein TonB. Die Expression dieser Proteine wird unter Eisen-Mangel-Bedingungen aktiviert, wie sie auch im menschlichen Körper während einer bakteriellen Infektion vorherrschen [27]. Um diese Bedingungen nachzuempfinden, wurde dem Medium der Eisenchelator 2,2'-Bipyridyl zugesetzt [5, 28], sowie das Gen entC inaktiviert, um die Bildung der E. coli eigenen Siderophore Enterobactin zu verhindern [29].
Für die Untersuchungen zur aktiven Aufnahme der neuen Verbindung durch Siderophortransporter, wurde eine E. coli ΔtolClΔentC sowie eine E. coli ΔtonBlΔtolClΔentC Mutante durch RED/ET-vermittelte Rekombination hergestellt (basierend auf E. coli Mutanten der Keio-Kollektion [30]).
Die antibakterielle Aktivität von Novclobiocin 401 im Vergleich zu Clorobiocin und Novobiocin wurde in Agardiffusionstests mit den genannten E. coli Mutanten bestimmt.
Bei der Mutante mit intaktem TonB zeigt Novclobiocin 401 ca. 2-fach bessere Aktivität als Clorobiocin und 4-fach bessere Aktivität als Novobiocin. Im Gegensatz hierzu zeigt Novclobiocin 401 bei der Mutante mit inaktiviertem TonB ca. 10-fach weniger Aktivität als Clorobiocin ( ). Diese Ergebnisse zeigen, dass der TonB-abhängige Transport eine entscheidende Rolle in der antibakteriellen Aktivität von Novclobiocin 401, hingegen aber nicht von Clorobiocin oder Novobiocin spielt. Die Bestimmungen der Minimalen Hemmkonzentration in Flüssigkultur zeigen übereinstimmende Ergebnisse zu den Agardiffusionstests.
Für die Agardiffusionstests wurden 40 ml Müller-Hinton-Agar (Roth) mit 1 ml Übernacht-Kultur (OD₆₀₀ 1,2) der jeweiligen E. coli Mutante und 50 μM 2,2'-Bipyridyl versetzt. Filterplättchen wurden mit 15 μl der methanolischen Antibiotikalösungen getränkt und auf dem Agar platziert. Nach 16 h Inkubation bei 37°C wurden die lebenden Zellen durch Überschichtung mit einer wässrigen 0.5%igen 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid-Lösung (Roth) angefärbt und die Hemmzonen ausgewertet.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 10111160 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

(Arisawa, M., Sekine, Y., Shimizu, S., Takano, H., Angehrn, P., Then, R. L., Antimicrob. Agents Chemother. 32 (1991), 653 [0006]
Sambrook et al. [0026]
Kieser et al. [0026]
Gust et al. [0026]

Claims

Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie Konjugate der Gyrasehemmenden Substanzen mit Catechol-Struktureinheiten darstellen.
Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Konjugate der Aminocoumarine mit Catechol-Struktureinheiten darstellen.
Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, mit der Strukturformel (I):
wobei zwei benachbarte Reste R₁ und R₂, oder R₂ und R₃ gleichzeitig für je eine OH-Gruppe und der übrige Rest für ein Wasserstoffatom stehen, R₄ für H, Cl oder CH₃ steht, und R₅ für H,
steht.
Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, mit der Strukturformel (II):
wobei die Reste R₁ bis R₄ die Bedeutungen gemäß Anspruch 3 haben und einer der Reste R₆ oder R₇ für eine der Gruppen
während der andere Rest für H steht.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Catechol-Struktureinheiten an einen Aminocoumarinring mittels einer Amidsynthetase gekoppelt wird, so dass eine Aminocoumarinsäure entsteht.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Amidsynthetase die Amidsynthetase CloL ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die an einen Aminocoumarinring zu koppelnde Catechol-Struktureinheiten eine 2,3-Dihydroxybenzoesäure oder eine 3,4-Dihydroxybenzoesäure ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Deoxyzucker-Einheit mittels einer Glycosyltransferase auf die Aminocoumarinsäure übertragen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Carbamoyl-Rest oder mindestens ein 5-Methylpyrrol-2-carboxyl-Rest an die Deoxyzucker-Einheit angehängt wird.
Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 als biologisch wirksame Stoffe.
Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von bakteriellen Infektionen.