DE102010050140A1 - Recovery Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers - Google Patents

Recovery Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers Download PDF

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Dr. Strohner Pavel
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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers, Therapieaptamers oder Therapiefusionsproteins (Recovery Immunoassay). Der erfindungsgemäße Immunoassay umfasst – einen an einer Oberfläche gebundenen gegebenenfalls markierten Fängerantikörper, Fängeraptamer oder Fängerfusionsprotein – einen markierten Therapieantikörper, ein markiertes Fusionsprotein, ein markiertes Aptamer oder markierten Antikörper, der das gleiche Bindungsepitop, bzw. die gleiche Bindungsdomain wie der Therapieantikörper, bzw. das zur Therapie eingesetzte Fusionsprotein oder das Aptamer aufweist, im Gemisch mit einem Überschuss des unmarkierten Therapieantikörpers, Fusionsproteins oder Aptamers – ein Antigen, das mit dem Fängerantikörper, Fängerfusionsprotein oder Fängeraptamer und dem Therapieantikörper, Therapieaptamer oder Therapiefusionsprotein an verschiedenen Epitopen bindet und dadurch einen immunochemischen Sandwich bildet, – eine Lösung des unmarkierten Therapieantikörpers, Therapieaptamers oder Therapiefusionsproteins bekannter Konzentration und eine Antigenlösung zur Aufstockung der Proben. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers (Recovery Immunoassay). Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.
  • In EP 1957980 ist ein Recovery Immunoassay beschrieben worden.
  • Dieser Assay geht von einem gewöhnlichen Sandwich-Immunoassay aus.
  • In einem richtig bestimmenden Sandwich-Immunoassay, bei dem der Therapieantikörper oder ein Antikörper, der am gleichen Bindungsepitop bindet, in markierter Form als Nachweisantikörper oder Fängerantikörper verwendet wird, bewirkt die Anwesenheit des Therapieantikörpers in Proben eine systematische Verringerung der Wiederfindung des zu bestimmenden Antigens, die mit der Konzentration des Therapieantikörpers korreliert. Diese Korrelation wird zur Bestimmung der unbekannten Konzentration des Therapieantikörpers und zur Bestimmung der freien und totalen Antigenkonzentration genutzt.
  • Der Recovery Immunoassay gemäß EP 1957980 hat den Nachteil, dass bei hohen Therapieantikörpergehalten in den Seren behandelter Patienten hohe Serumverdünnungen (≥ 1:100) durchgeführt werden müssen. Diese hohen Serumverdünnungen führen zur Ungenauigkeit und erschweren den Nachweis des freien Antigens.
  • Die Erfindung besteht nunmehr auch darin, dass es sich bei den im Sandwich-Immunoassay verwendeten Fängern und Nachweiskonjugaten nicht nur um Antikörper handelt, sondern dass der Assay ebenso mit Antikörperderivaten und -analoga wie z. B. Fusionsproteinen oder Aptameren funktioniert.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Recovery Immunoassay zu entwickeln, entwickeln, der auch bei hohen Therapieantikörpergehalten, bzw. Therapieaptamergehalten oder Therapiefusionsproteingehalten in den Seren zu verlässlichen Werten führt.
  • Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert, in folgenden einzelnen Schritten.
    • 1. Erfindungsgemäß wird der als Nachweiskonjugat verwendete markierte Therapieantikörper bzw. deren Analoga (z. B. markiert mit POD) vor seiner Verwendung mit einem großen Überschuss des gleichen, aber unmarkiertem Therapiemoleküls versetzt (verschnitten). Dieses so verschnittene markierte Molekül wird als neues Nachweiskonjugat verwendet.
    • 2. Der Recovery Immunoassay wird ausgeführt, wie in der EP 1957980 vom 06.01.2010 beschrieben. Die Seren der mit therapeutischen Antikörpern behandelten Patienten können nun unverdünnt bzw. in Verdünnungen 1:2 bis 1:20 im Assay als Proben eingesetzt werden.
    • 3. Mit Hilfe der ermittelten Wiederfindefunktion werden die in der verdünnten Probe bestimmten freien Antigenkonzentrationen auf die unverdünnten Proben umgerechnet.
  • Mit der Formel: Au = Av/Wv·Wu·f (Formel Au) kann die Konzentration an freiem Antigen in den unverdünnten Proben berechnet werden, dabei sind:
    Au: freie Antigenkonzentration in unverdünnter Probe;
    Av: freie Antigenkonzentration in verdünnter Probe;
    Wu: Wiederfindung in unverdünnter Probe;
    Wv: Wiederfindung in verdünnter Probe;
    f: Verdünnungsfaktor.
  • Durch die Erfindung ist ein Recovery Immunoassay in unverdünnten bzw. niedrig verdünnten Seren (z. B. 1:10 bzw. 1:20) ausführbar, der bei der Berücksichtigung der Wiederfindefunktion eine verlässliche Bestimmung des freien Antigens in unverdünnten Seren zulässt.
  • Nachfolgendes Beispiel soll das Verfahren näher erläutern:
  • Beispiel:
  • Auswirkung des Verschnitts aus POD-Omalizumab und dem Therapieantikörper Omalizumab als Nachweiskonjugat auf den IgE/Omalizumab–Recovery-ELISA
  • Material:
    • 1. Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten, Beschichtungsverfahren der Fa. BioTeZ Berlin-Buch GmbH für Standard-Biotin-Bindungskapazität (SC-Beschichtung)
    • 2. Fängerantikörper, immobilisiert an Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten, biotinylierter Antikörper B 216, anti-human IgE
    • 3. IgE-Standard: IgE (Fa. OEM), s. Versuchsaufbau
    • 4. POD-markierter Nachweisantikörper (Omalizumab, Fa. Novartis) Versuch 1: POD-mAk ohne Zusatz von Omalizumab Versuch 2. POD-mAk mit 10-fachem Zusatz von Omalizumab
    • 5. Humanisierter monoklonaler Therapieantikörper (Omalizumab, Fa. Novartis) s. Versuchsaufbau
    • 6. Beschichtungspuffer (PBS 0,05 M, pH = 7,2 mit 0,1% RSA)
    • 7. Reaktionspuffer (PBS/0,33% Casein + 0,0125% Tween 20)
    • 8. Waschlösung (0,9% NaCl/0,1% Tween 20)
    • 9. Enzymsubstrat: TMB (Tetramethylbenzidin)
  • Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte:
  • Versuch 1: POD-mAk ohne Zusatz von Omalizumab
    Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml]: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    IgE-Standard [ng/ml] IgE-Aufstockung [ng/ml] Proben Verdünnung
    0 50 150 300 0 50 100 200
    A B 0 Probe 1 1·100
    Probe 2 1:100
    C D 0,1 Probe 3 1 100
    Probe 4 1 100
    E F 0,3 Kontrollprobe
    Probe 5 1.100
    G H 0,9 Probe 6 1·100
    Probe 7 1:100
    Versuch 2: POD-mAk mit Zusatz von Omalizumab
    Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml]: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    IgE-Standard [IU/ml] IgE-Aufstockung [IU/ml] Proben Verdünnung
    0 30 60 120 0 30 60 90
    A B 0 Probe 1 1 20
    Probe 2 1 20
    C D 0,45 Probe 3 1 20
    Probe 4 1.20
    E F 1,8 Kontrollprobe
    Probe 5 1 20
    G H 7,2 Probe 6 1.20
    Probe 7 1:20
    (Zur Umrechnung 1 IU IgE = 2,4 ng IgE)
  • Ergebnisse:
  • a) Standard- und Wiederfindekurven
  • Versuch 1 (s. Fig. 1)
    Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml]: Y = Extinktion
    X = IgE [ng/ml]
    0 50 150 300
    Bezugskurve: 0,0 0,033 0,764 1,662 2,185
    0,1 0,036 0,324 0,658 0,986
    0,3 0,040 0,199 0,352 0,469
    0,9 0,042 0,111 0,248 0,255
    Auswertefunktion für die Bezugskurve: Y = 3,421·X/(173,086 + X) (Funktion 1)
    Bestimmtheitsmaß. 0,999
    Umkehrfunktion zur Probenberechnung. X = 173,086·Y/(3,421 – Y) (Funktion 1a) Versuch 2 (s. Fig. 2)
    Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml]: Y = Extinktion
    X = IgE [IU/ml]
    0 30 60 120
    Bezugskurve: 0,0 0,029 1,253 1,852 2,436
    0,45 0,026 0,765 1,255 1,772
    1,8 0,025 0,359 0,648 1,054
    7,2 0,024 0,144 0,260 0,461
    Auswertefunktion für die Bezugskurve Y = 3,55·X/(56,965 + X) (Funktion 2)
    Bestimmtheitsmaß 0,99999
    Umkehrfunktion zur Probenberechnung: X = 56,965·Y/(3,55 – Y) (Funktion 2a)
  • Auf der Grundlage der Standardkurve ohne Omalizumab-Zusatz als Bezugskurve werden die Antigen (IgE)-Konzentrationen aus den Extinktionen der Standardkurven mit Omalizumab mittels der jeweiligen Umkehrfunktion (Funktionen 1a und 2a) berechnet. Die ermittelten IgE-Werte der zu bestimmenden Proben werden durch die bei gleicher Therapieantikörper-Konzentration ermittelten IgE-Werte aus den Aufstockungen geteilt. Der Mittelwert dieser Quotienten ist die Wiederfindung. Die Auftragung der so ermittelten Wiederfindungen gegen die Therapieantikörper-Konzentrationen (Omalizumab) ergeben nachstehende Wiederfindekurven: Versuch 1: (s. Fig. 3)
    Therapieantikörper [μg/ml] 0 0,1 0,3 0,9
    Wiederfindung 0,990 0,268 0,127 0,066
    Auswertefunktion für die Wiederfindekurve: Y = 1/(1 + 27,462·X) + 0,009 (Funktion 3)
    Bestimmtheitsmaß: 0,9997, W = Y – 0,009
    Umkehrfunktion zur Probenberechnung: X = (1 – W)/W/27,462 (Funktion 3a) Versuch 2: (s. Fig. 4)
    Therapieantikörper [μg/ml] 0 0,45 1,8 7,2
    Wiederfindung 1,000 0,485 0,196 0,065
    Auswertefunktion für die Wiederfindekurve: Y = 1/(1 + 2,384·X) + 0,005 (Funktion 4)
    Bestimmtheitsmaß: 0,9997, W = Y – 0,005
    Umkehrfunktion zur Probenberechnung: X = (1 – W)/W/2,384 (Funktion 4a)
  • Bei Versuch 1 liegt der Arbeitsbereich zum Nachweis von Omalizumab in der Wiederfindekurve nur zwischen 0 und 1 μg/ml für die verdünnten Seren. Durch die Verwendung des verschnittenen Nachweiskonjugates in Versuch 2 kann dieser von 0 bis 10 μg/ml Omalizumab ausgeweitet werden.
  • b) Proben
  • Versuch 1: Alle Patientenseren sind 1:100 mit Assaypuffer verdünnt. Messwerte
    IgE-Aufstockung [ng/ml]: Proben Verdünnung
    0 50 100 200
    Messwerte (Extinktion bei 450 nm)
    0,172 0,981 1,313 1,831 Probe 1 1.100
    0,077 0,366 0,497 0,820 Probe 2 1 100
    0,051 0,154 0,227 0,321 Probe 3 1·100
    0,304 0,802 1,295 1,929 Probe 4 1 100
    0,024 0,685 1,229 2,007 Kontrollprobe
    0,144 0,399 0,541 0,862 Probe 5 1 100
    0,087 0,184 0,263 0,388 Probe 6 1100
    0,028 0,155 0,255 0,327 Probe 7 1:100
  • Unter Verwendung von Funktion 1a (Umkehrfunktion der Bezugskurve) werden aus den Messwerten (Extinktionen) die Konzentrationen an freiem Antigen (IgE) ermittelt:
    IgE-Aufstockung [ng/ml]: Wiederfindung Bestimmtheitsmaß Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml] Proben
    0 50 100 200
    Freies IgE [ng/ml]
    7,33 66,40 103,48 191,86 0,903 0,9943 0,00 Probe 1
    2,28 18,70 27,19 51,76 0,241 0,9914 0,12 Probe 2
    0,94 6,35 10,41 15,91 0,073 0,9725 0,53 Probe 3
    14,92 50,23 101,24 215,19 1,019 0,9914 0,00 Probe 4
    –0,45 40,76 93,04 236,12 1,199 0,9852 –0,01 Kontrollprobe
    5,83 20,74 30,18 55,36 0,243 0,9962 0,12 Probe 5
    2,80 7,99 12,50 20,07 0,085 0,9941 0,44 Probe 6
    –0,23 6,40 12,04 16,27 0,081 0,9238 0,47 Probe 7
  • Unter Verwendung von Funktion 3a (Umkehrfunktion der Wiederfindekurve) werden aus den Wiederfindewerten die Omalizumab-Konzentrationen bestimmt. Die ermittelten Konzentrationswerte für IgE und Omalizumab gelten für 1:100 verdünnte Serumproben. Diese sind auf unverdünnte Serumproben umzurechnen. Im Falle des Therapieantikörpers Omalizumab ist lediglich mit dem Verdünnungsfaktor zu multiplizieren. Im Falle des freien IgE muss die erhöhte Therapieantikörper-Konzentration in den unverdünnten Proben berücksichtigt werden.
  • Die zu erwartende Wiederfindung (Wu) an freiem IgE in den unverdünnten Proben kann mittels Funktion 3 (Wiederfindefunktion) aus den Therapieantikörper-Konzentrationen der unverdünnten Proben ermittelt werden. Mit der o. g. Formel: Au = Av/Wv·Wu·f (Formel Au) kann die Konzentration an freiem IgE in den unverdünnten Proben berechnet werden, dabei sind:
    • Au:
    freie Antigenkonzentration in unverdünnter Probe;
    Av:
    freie Antigenkonzentration in verdünnter Probe;
    Wu:
    Wiederfindung in unverdünnter Probe;
    Wv:
    Wiederfindung in verdünnter Probe;
    f:
    Verdünnungsfaktor (hier 100).
  • Für Versuch 1 ergeben sich so folgende Werte in den unverdünnten Proben:
    Proben Freies IgE [ng/ml] Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml] Wiederfindung
    Probe 1 812 0,0 100,00%
    Probe 2 3 12,1 0,30%
    Probe 3 1 53,2 0,07%
    Probe 4 1465 0,0 100,00%
    Kontrollprobe 0 0,0 100,00%
    Probe 5 7 11,9 0,30%
    Probe 6 3 44,0 0,08%
    Probe 7 0 47,3 0,08%
  • Bei Therapieantikörper-Gehalten > 8 μg/ml liegen die Wiederfindewerte beim Assay-Ansatz von Versuch 1 (unverschnittenes Nachweiskonjugat) unter 0,5%. Damit ist eine verlässliche Bestimmung der freien Antigengehalte bei der zu erwartenden Therapieantikörperdosierung nicht mehr möglich. Versuch 2: Alle Patientenseren sind 1:20 mit Assaypuffer verdünnt. Messwerte
    IgE-Aufstockung [IU/ml]: Proben Verdünnung
    0 30 60 90
    Messwerte (Extinktion bei 450 nm)
    1,568 1,897 2,151 2,202 Probe 1 1:20
    0,324 0,882 1,289 1,550 Probe 2 1 20
    1,281 1,396 1,520 1,572 Probe 3 1.20
    1,467 1,742 1,983 2,158 Probe 4 1·20
    0,015 1,194 1,811 2,126 Kontrollprobe
    1,470 1,760 1,932 2,099 Probe 5 1 20
    1,062 1,786 2,218 2,479 Probe 6 1 20
    1,358 1,872 2,297 2,438 Probe 7 1·20
  • Unter Verwendung von Funktion 2a (Umkehrfunktion der Bezugskurve) werden aus den Messwerten (Extinktionen) die Konzentrationen an freiem Antigen (IgE) ermittelt:
    IgE-Aufstockung [IU/ml]: Wiederfindung Bestimmtheitsmaß Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml] Proben
    0 30 60 90
    Freies IgE [IU/ml]
    43,6 63,3 84,6 89,9 0,534 0,9501 0.37 Probe 1
    5,2 18,0 31,3 42,7 0,420 0,9989 0.59 Probe 2
    31,0 35,6 41,2 43,8 0,146 0,9808 2 55 Probe 3
    38,8 53,1 69,7 85,3 0,521 0,9992 0.39 Probe 4
    –0,2 27,8 57,4 82,1 0,922 0,9988 0.04 Kontrollprobe
    38,9 54,2 65,8 79,6 0,446 0,9976 0.53 Probe 5
    23,4 55,8 91,6 126,8 1,153 0,9996 –0.05 Probe 6
    34,1 61,5 100,7 120,2 0,992 0,9855 001 Probe 7
  • Unter Verwendung von Funktion 4a (Umkehrfunktion der Wiederfindekurve) werden aus den Wiederfindewerten die Omalizumab-Konzentrationen bestimmt. Die ermittelten Konzentrationswerte für IgE und Omalizumab gelten für 1:20 verdünnte Serumproben. Diese sind auf unverdünnte Serumproben umzurechnen. Im Falle des Therapieantikörpers Omalizumab ist mit dem Verdünnungsfaktor zu multiplizieren. Im Falle des freien IgE muss die erhöhte Therapieantikörper-Konzentration in den unverdünnten Proben berücksichtigt werden.
  • Die zu erwartende Wiederfindung (Wu) an freiem IgE in den unverdünnten Proben kann mittels Funktion 4 (Wiederfindefunktion) aus den Therapieantikörper-Konzentrationen der unverdünnten Proben ermittelt werden. Mit der o. g. Formel: Au = Av/Wv·Wu·f (Formel Au) kann die Konzentration an freiem IgE in den unverdünnten Proben berechnet werden, dabei sind:
    • Au:
    freie Antigenkonzentration in unverdünnter Probe;
    Av:
    freie Antigenkonzentration in verdünnter Probe;
    Wu:
    Wiederfindung in unverdünnter Probe;
    Wv:
    Wiederfindung in verdünnter Probe;
    f:
    Verdünnungsfaktor (hier 20).
  • Für Versuch 2 ergeben sich so folgende Werte in den unverdünnten Proben:
    Proben Freies IgE [IU/ml] Therapieantikörper Omalizumab [μg/ml] Wiederfindung
    Probe 1 87 7.5 5,32%
    Probe 2 8 11.8 3,43%
    Probe 3 35 51.1 0,81%
    Probe 4 75 7.9 5,06%
    Kontrollprobe –2 0.0 100,00%
    Probe 5 66 10.6 3,80%
    Probe 6 467 0.0 100,00%
    Probe 7 681 0.0 100,00%
  • Erst bei Therapieantikörper-Gehalten > 83 μg/ml liegen die Wiederfindewerte beim Assay-Ansatz von Versuch 2 (verschnittenes Nachweiskonjugat) unter 0,5%. Damit ist eine verlässliche Bestimmung der freien Antigengehalte über einen weiten Bereich im Rahmen der zu erwartenden Therapieantikörper-Dosierung möglich.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • EP 1957980 [0002, 0005, 0008]

Claims (2)

  1. Recovery Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers oder Fusionsproteins oder Aptamers umfassen die nachstehenden Komponenten – einen an einer Oberfläche gebundenen gegebenenfalls markierten Fängerantikörper, Fängeraptamer oder Fängerfusionsprotein – einen markierten Therapieantikörper, ein markiertes Fusionsprotein, ein markiertes Aptamer oder markierten Antikörper, der das gleiche Bindungsepitop, bzw. die gleiche Bindungsdomaine wie der Therapieantikörper, bzw. das zur Therapie eingesetzte Fusionsprotein oder das Aptamer aufweist, im Gemisch mit einem Überschuss des unmarkierten Therapieantikörpers, Fusionsproteins oder Aptamers – ein Antigen, das mit dem Fängerantikörper, Fängerfusionsprotein oder Fängeraptamer und dem Therapieantikörper, Therapieaptamer oder Therapiefusionsprotein an verschiedenen Epitopen bindet und dadurch einen immunochemischen Sandwich bildet, – eine Lösung des unmarkierten Therapieantikörpers, Therapieaptamer oder Therapiefusionsprotein bekannter Konzentration und eine Antigenlösung zur Aufstockung der Proben,
  2. Recovery Immunoassay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von markierten Therapieantikörpern, Therapieaptamer oder Therapiefusionsprotein zu unmarkierten Therapieantikörpern, Therapieaptamer oder Therapiefusionsprotein im Gemisch 1:2 bis 1:20, vorzugsweise 1:10, beträgt
DE201010050140 2010-11-03 2010-11-03 Recovery Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers Withdrawn DE102010050140A1 (de)

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EP1957980A2 (de) 2005-12-02 2008-08-20 Pavel Strohner Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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