DE102010016598A1

DE102010016598A1 - Verfahren zum Untersuchen einer fluoreszierende Farbstoffe enthaltenden Probe mit Hilfe eines Mikroskops

Info

Publication number: DE102010016598A1
Application number: DE102010016598A
Authority: DE
Inventors: Dr. Seyfried Volker; Dr. Knebel Werner
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2011-10-27
Also published as: EP2561393A1; WO2011131401A1; JP5661173B2; US20130034913A1; JP2013525770A

Abstract

Zum Untersuchen einer Probe (30) mit Hilfe eines Mikroskops (20) werden mit Hilfe eines ersten Beleuchtungslichtstrahls (24) Farbstoffpartikel (40, 42) in der Probe (30) zum Fluoreszieren angeregt. Von der Probe (30) ausgehendes Fluoreszenzlicht wird über eine optische Anordnung (34) auf einen Flächensensor (36) gerichtet, wobei die optische Anordnung (34) so auf das Fluoreszenzlicht wirkt, dass Teilstrahlen des Fluoreszenzlichts mit sich selbst interferieren, so dass aufgrund der Interferenz entstehende Interferenzmuster auf einer sensitiven Oberfläche des Flächensensors (36) abgebildet und von diesem erfasst werden. Abhängig von den Interferenzmustern werden Positionen der Farbstoffpartikel (40, 42) innerhalb der Probe (30) ermittelt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen einer fluoreszierende Farbstoffe enthaltenden Probe mit Hilfe eines Mikroskops. Mit Hilfe eines ersten Beleuchtungslichtstrahls des Mikroskops werden Farbstoffpartikel in der Probe zum Fluoreszieren angeregt. Von der Probe ausgehendes Fluoreszenzlicht wird über eine optische Anordnung auf einen Flächensensor gerichtet.
Innerhalb einer Probe können dreidimensionale Strukturen auf unterschiedliche Weisen dargestellt werden. Beispielsweise kann mit einem Scanmikroskop ein zweidimensionaler Bereich, insbesondere eine Ebene, auf oder in der Probe abgetastet werden. Senkrecht zu der Ebene können die Strukturen aufgelöst werden, indem beispielsweise ein Probentisch oder Teile der Optik des Mikroskops parallel zu den zu detektierenden Strahlen, im Folgenden Detektionsstrahlen genannt, bewegt werden. Das mechanische Verstellen dieser Komponenten nimmt jedoch relativ viel Zeit in Anspruch und erfordert eine besonders präzise und daher aufwendige Konstruktion des verwendeten Mikroskops.
Alternativ dazu ist es bekannt, Strukturen in der Probe entlang einer Richtung parallel zu den Detektionsstrahlen aufzulösen, indem im Detektionsstrahlengang eine optische Anordnung angeordnet wird, die bewirkt, dass die Detektionsstrahlen, mit sich selbst interferieren. Die derart interferierenden Lichtstrahlen werden nachfolgend auf einen Flächensensor gerichtet. Auf dem Flächensensor bilden sich aufgrund der interferierenden Strahlung Interferenzmuster ab. Die Interferenzmuster umfassen bei Punktlichtquellen im Wesentlichen Ringmuster. Anhand der Interferenzmuster kann nun die Lage der Lichtquellen innerhalb einer Ebene und senkrecht zu der Ebene ermittelt werden, so dass eine dreidimensionale Auflösung der Strukturen in der Probe möglich ist, ohne dass mechanische Komponenten des Mikroskops bewegt werden müssen. Ein entsprechendes Verfahren ist beispielsweise FINCH.
Außerdem ist es bekannt, Strukturen in einer Probe darzustellen, beispielsweise in einer Gewebeprobe oder einer lebenden Zelle, indem fluoreszierende Farbstoffpartikel in die Probe eingebracht werden. Die Farbstoffpartikel in der Probe werden dann zum Fluoreszieren angeregt und das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht wird detektiert. Die fluoreszierenden Farbstoffpartikel können auf unterschiedliche Arten und Weisen an Transportvorgängen der Probe teilnehmen oder sich an Strukturen innerhalb der Probe heften, so dass die Transportvorgänge bzw. die Strukturen anhand des emittierten Fluoreszenzlichts untersuchbar sind. Als Farbstoffpartikel eignen sich Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise organische Farbstoffe, insbesondere fluoreszierende Proteine und/oder Tandem-Moleküle, oder anorganische Farbstoffe wie Nanokristalle, die mit Biomarkern gekoppelt sind.
Ferner ist es bekannt, aktivierbare Farbstoffpartikel in die Probe einzubringen, welche nur zu Fluoreszenz angeregt werden können, wenn diese aktiv sind. Beispielsweise kann eine Teilmenge der Farbstoffpartikel in der Probe aktiviert werden und nachfolgend kann diese Teilmenge aktivierter Farbstoffpartikel zum Fluoreszieren angeregt werden. Die nicht aktivierten Farbstoffpartikel reagieren nicht merklich auf die auf die Anregung und emittieren kein Fluoreszenzlicht. Auf diesen Vorgängen basierende Verfahren heißen beispielsweise PALM oder STORM. Alternativ dazu kann eine Teilmenge aktiver Farbstoffpartikel deaktiviert werden, sodass die verbleibenden aktiven Farbstoffpartikeln zum Fluoreszieren angeregt werden können, was beispielsweise FPALM oder GIST genannt wird.
Weitere bekannte Mikroskopieverfahren sind SPIM, bei dem lediglich die Ebene senkrecht zu den Detektionsstrahlen beleuchtet wird, FLIM, bei dem die Lebensdauer der angeregten Zustände der fluoreszierenden Farbstoffpartikel untersucht wird und daraus Rückschlüsse auf die Umgebung der Farbstoffpartikel gezogen werden, FCS, bei dem Diffusionszeiten von gebundenen und ungebunden Farbstoffpartikeln miteinander verglichen werden, und MP, also Multi-Photonen-Anregung, bei der einzelne Farbstoffpartikel innerhalb eines sehr kleinen Fokus mit Hilfe von je zwei nahezu gleichzeitig absorbierten Photonen zur Fluoreszenz angeregt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Untersuchen einer fluoreszierende Farbstoffe enthaltenden Probe mit Hilfe eines Mikroskops zu schaffen, das auf einfache Weise ermöglicht, dreidimensionale Strukturen innerhalb der Probe aufzulösen.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale des unabhängigen Anspruchs 1. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen eingegeben.
Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass die optische Anordnung so auf das Fluoreszenzlicht wirkt, dass Teilstrahlen des Fluoreszenzlichts mit sich selbst interferieren, so dass aufgrund der Interferenz entstehende Interferenzmuster auf einer sensitiven Oberfläche des Flächensensors abgebildet und von diesem erfasst werden. Abhängig von den Interferenzmustern werden die Positionen der Farbstoffpartikeln innerhalb der Probe ermittelt.
Das Auswerten der durch die Farbstoffpartikel erzeugten Interferenzmuster ermöglicht, die genaue Lage der Farbstoffpartikel in einem dreidimensionalen Volumen innerhalb der Probe zu bestimmen, ohne dass ein Verstellen mechanischer Komponenten des Mikroskops nötig ist. Dies trägt dazu bei, dass bei hoher dreidimensionaler Auflösung das Mikroskop auf einfache Weise auszubilden ist und Wartungsintervalle verlängert werden können.
Eine ausreichend gute Auflösung und damit Unterscheidung der einzelnen Farbstoffpartikel wird vorzugsweise dadurch erreicht, dass lediglich eine Untermenge der Farbstoffpartikel innerhalb eines vorgegebenen Bereichs zum Fluoreszieren angeregt wird. Die Untermenge, insbesondere die Anzahl der Farbstoffpartikel der Untermenge, wird in Abhängigkeit von voneinander unterscheidbaren Interferenzmustern bestimmt. In anderen Worten werden als Untermenge maximal so viele Farbstoffpartikel innerhalb eines vorgegebenen Volumens zum Fluoreszieren angeregt, dass deren Interferenzmuster mit Hilfe des Flächensensors voneinander unterschieden und ausgewertet werden können. Dabei können aktivierbare Farbstoffpartikel verwendet werden, von denen beispielsweise zunächst nur eine Untermenge aktiviert wird, die dann zum Fluoreszieren angeregt wird, oder bei denen zunächst alle Farbstoffpartikel aktiviert werden, dann ein Teil der Farbstoffpartikel deaktiviert wird und die verbleibende Untermenge an aktivierten Farbstoffpartikeln zum Fluoreszieren angeregt wird.
Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Untermenge der Farbstoffpartikel bestimmt werden, indem lediglich Farbstoffpartikel innerhalb eines Teilbereichs der Probe zum Fluoreszieren angeregt werden. Als Teilbereich kann beispielsweise eine Ebene innerhalb der Probe gewählt werden. Die Ebene kann so angeordnet sein, dass der Beleuchtungslichtstrahl des Mikroskops darauf senkrecht steht, parallel zu der Ebene verläuft oder einen vorgegebenen Winkel zwischen 0 und 90° mit der Ebene einschließt.
Alternativ dazu kann der Beleuchtungslichtstrahl lediglich auf einzelne Segmente der Probe gerichtet werden, so dass nur kleine Teilbereiche der Probe beleuchtet werden, in denen die Farbstoffpartikel zum Fluoreszieren angeregt werden. Eine weitere Möglichkeit zum Anregen der Farbstoffpartikel innerhalb der Ebene kann mit Hilfe einer Multi-Photonen-Anregung erfolgen.
Die Interferenzmuster können über einen vorgegebenen Zeitraum erfasst werden, so dass eine Veränderung der Interferenzmuster beobachtbar ist. Anhand dieser Veränderung können dann Rückschlüsse auf Bewegungen der Farbstoffpartikel innerhalb der Probe erfolgen. Davon abhängig können Rückschlüsse auf bewegte Vorgänge innerhalb der Probe gezogen werden.
Die zum Fluoreszieren angeregten Farbstoffpartikel haben grundsätzlich eine Leucht-Lebensdauer. Die Leucht-Lebensdauer ist repräsentativ dafür, wie lange der entsprechende angeregte Farbstoffpartikel im Durchschnitt im angeregten Zustand verbleibt, bevor er durch Emission eines Photons in den angeregten Zustand übergeht. Die angeregten Farbstoffpartikel in der Probe können Energie auf umgebende Strukturen übertragen. Dadurch verkürzt sich die Leucht-Lebensdauer des entsprechenden Farbstoffpartikels. Ein Beobachten der Leucht-Lebensdauer der Farbstoffpartikel innerhalb der Probe kann nun dazu beitragen, Rückschlüsse auf die den Farbstoffpartikel umgebenden Strukturen zu ziehen.
Zusätzlich zu dem Beobachten von Farbstoffpartikeln eines Farbstoffs können auch noch Farbstoffpartikel zweier oder mehrerer weiterer Farbstoffe beobachtet werden.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind nachfolgend anhand von schematischen Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
1 eine erste Ausführungsform eines Mikroskops,
2 eine Funktionsprinzipsskizze des Mikroskops,
3 eine zweite Ausführungsform des Mikroskops,
4 eine Beleuchtungsmatrix des Mikroskops,
5 ein Ablaufdiagramm eines Programms zum Betreiben des Mikroskops.
Elemente gleicher Konstruktion oder Funktion sind figurenübergreifend mit den gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet.
1 zeigt ein Mikroskop 20. Das Mikroskop 20 ist ein konfokales Scanmikroskop. Das Mikroskop 20 ist insbesondere ein Fluoreszenzmikroskop. Das Mikroskop 20 umfasst eine erste Beleuchtungslichtquelle 22. Die erste Beleuchtungslichtquelle 22 erzeugt einen ersten Beleuchtungslichtstrahl 24, der über einen Farbfilter 26 auf einen Strahlteiler 28 gerichtet ist. Der Strahlteiler 28 reflektiert den ersten Beleuchtungslichtstrahl 24 hin zu einer Probe 30. Die Probe 30 umfasst mehrere Farbstoffpartikel, die zum Fluoreszieren angeregt werden. Von der Probe 30 ausgehendes Fluoreszenzlicht, im Folgenden Detektionslicht genannt, durchdringt den Strahlteiler 28, der das Detektionslicht von dem ersten Beleuchtungslichtstrahl 24 trennt, wobei der dadurch entstehende Detektionslichtstrahl 32 über eine optische Anordnung 34 auf einen Flächensensor 36 gerichtet ist.
Die optische Anordnung umfasst ein diffraktives optisches Element 34. Das diffraktive optische Element 34 umfasst einen Spatial Light Modulator (SLM). Alternativ dazu umfasst das optische Element 34 beispielsweise ein Microdisplay oder einen LCOS-Phasenmodulator, insbesondere eine Fresnel-Zonenplatte oder eine Fresnel-Linse. Der Flächensensor 36 umfasst lichtempfindliche CMOS-Bausteine. Alternativ oder zusätzlich kann der Flächensensor 36 CCD-Bausteine umfassen. Die erste Beleuchtungslichtquelle 22 umfasst einen Laser. Der Laser ist vorzugsweise ein breitbandiger Laser, insbesondere ein Weißlichtlaser. Alternativ dazu umfasst die erste Beleuchtungslichtquelle 22 eine Quecksilberlichtquelle, eine Xenonlichtquelle oder LED's.
2 zeigt eine Funktionsprinzipsskizze des Mikroskops 20. Ein erster Farbstoffpartikel 40 und ein zweiter Farbstoffpartikel 42, die in der Probe 30 enthalten sind, strahlen Fluoreszenzlicht in Richtung hin zu der optischen Anordnung 34 ab. Die optische Anordnung 34 wirkt derart auf die Fluoreszenzlichtstrahlen, dass diese mit sich selbst interferieren. Von den Farbstoffpartikeln 40, 42 aus gesehen hinter der optischen Anordnung 34 entstehen Interferenzmuster, die auf den Flächensensor 36 abgebildet werden. Insbesondere ruft der erste Farbstoffpartikel 40 ein erstes Ringmuster 44 und der zweite Farbstoffpartikel 42 ein zweites Ringmuster 46 auf der sensitiven Oberfläche des Flächendetektors 36 hervor. Ein virtueller Raum 38, der in 2 lediglich zur Erläuterung dargestellt ist, ist real nicht vorhanden und dient zum Darstellen eines Abbildes 50 des ersten Farbstoffpartikels 40 und eines Abbildes 52 des zweiten Farbstoffpartikels 42. Die Lage der Abbilder 50, 52 innerhalb des virtuellen Raums 38 und damit die tatsächliche dreidimensionale Lage der beiden Farbstoffpartikel 40, 42 innerhalb der Probe 30 wird von einer Recheneinheit des Mikroskops 20 ermittelt.
3 zeigt eine alternative Ausführungsform des Mikroskops 20. Dieses Ausführungsbeispiel des Mikroskops 20 stimmt weitgehend mit dem ersten Ausführungsbeispiel des Mikroskops 20 überein, wobei lediglich auf den Farbfilter 26 verzichtet wurde und zusätzlich zu der ersten Beleuchtungslichtquelle 22 eine zweite Beleuchtungslichtquelle 53 hinzugefügt wurde. Die zweite Beleuchtungslichtquelle 53 erzeugt einen zweiten Beleuchtungslichtstrahl 54. Der zweite Beleuchtungslichtstrahl 54 beleuchtet die Probe 30 von der Seite und insbesondere in einem 90° Winkel zu dem ersten Beleuchtungslichtstrahl 24. Die zweite Beleuchtungslichtquelle 53 eignet sich besonders gut dazu, eine Ebene innerhalb der Probe 30 zu beleuchten und so Farbstoffpartikel innerhalb der Ebene zu aktivieren und/oder anzuregen.
Das Mikroskop 20 gemäß 3 kann nun auf unterschiedliche Arten betrieben werden. Beispielsweise kann ausschließlich der zweite Beleuchtungslichtstrahl 54 zum Beleuchten der Probe 30 verwendet werden, wobei dann auf die erste Beleuchtungslichtquelle 22 verzichtet werden kann. Alternativ dazu können aktivierbare Farbstoffpartikel innerhalb der Probe 30 mit einem der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24, 54 aktiviert und mit einem anderen der beiden Beleuchtungslichtstrahlen 24, 54 angeregt werden.
4 zeigt eine Beleuchtungsmatrix 56 des Mikroskops 20. Die Beleuchtungsmatrix 56 hat einzelne Zellen, die selektiv mit Hilfe des ersten Beleuchtungslichtstrahls 24 beleuchtet werden können. Beispielsweise kann die Probe 30 ausschließlich in den schwarz gefärbten Bereichen beleuchtet werden. Dies wird mit Hilfe des Scannmikroskops erzielt, indem der erste Beleuchtungslichtstrahl 24 über die Probe 30 gescannt wird und der erste Beleuchtungslichtstrahl 24 außerhalb der schwarz gefärbten Zellen abgeschattet wird.
5 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Programms zum Untersuchen der fluoreszierende Farbstoffe enthaltenden Probe 30 mit Hilfe des Mikroskops 20. Das Programm dient dazu, eine dreidimensionale Position der einzelnen Farbstoffpartikel 40, 42 innerhalb der Probe 30, insbesondere ohne Verstellen mechanischer Komponenten des Mikroskops, zu erreichen.
Das Programm wird in einem Schritt S1 gestartet, in dem gegebenenfalls Variablen initialisiert werden.
Ein Schritt S2 wird abgearbeitet, falls sich innerhalb eines vorgegebenen Bereichs der Probe 30 derart viele Farbstoffpartikel befinden, dass deren Interferenzmuster nicht mehr differenzierbar sind. Der Schritt 52 dient dazu, lediglich eine Untermenge der innerhalb eines vorgegebenen Bereichs vorhandenen Farbstoffpartikel anzuregen. In dem Schritt S2 wird, falls aktivierbare Farbstoffpartikel 40, 42 verwendet werden, eine Untermenge der aktivierbaren Farbstoffpartikel aktiviert oder es können aktive Farbstoffpartikel deaktiviert werden, so dass nachfolgend die verbleibende Untermenge aktiver Farbstoffpartikel angeregt werden kann.
In einem Schritt S3 werden die aktiven Farbstoffpartikel 40, 42 und damit anregbaren Farbstoffpartikel 40, 42 zum Fluoreszieren angeregt.
Alternativ oder zusätzlich kann die Untermenge der Farbstoffpartikel angeregt werden, indem lediglich Farbstoffpartikel innerhalb einer Ebene in der Probe 30 aktiviert und/oder angeregt werden. Beispielsweise kann mit Hilfe der ersten Beleuchtungslichtquelle 22 eine Multi-Photonen-Anregung realisiert werden, so dass lediglich innerhalb der Ebene die Anregungswahrscheinlichkeit hoch genug ist, um dort eine relevante Anregung zu erzielen. Alternativ dazu können beispielsweise mit Hilfe der zweiten Beleuchtungslichtquelle 53 lediglich Farbstoffpartikel innerhalb eines kleinen Teilbereichs, insbesondere der Ebene, innerhalb der Probe 30 angeregt werden. Alternativ dazu kann mit einer hochenergetischen Strahlung ein ganzer Bereich der Probe 30 gebleicht werden, so dass alle fluoreszierenden Farbstoffpartikel 40, 42 innerhalb des Bereichs deaktiviert oder zerstört sind. Aufgrund von Transportbewegungen innerhalb der Probe 30 werden aktive bzw. aktivierte Farbstoffpartikel in den gebleichten Bereich transportiert und können dort angeregt werden. Diese Transportvorgänge können durch das Beobachten der Interferenzmuster über einen längeren Zeitraum beobachtet werden. Alternativ oder zusätzlich kann die Probe 30 selektiv beleuchtet werden, beispielsweise können ausschließlich einzelne Zellen der Beleuchtungsmatrix 56 beleuchtet werden. Die selektive Beleuchtung kann beispielsweise mit Hilfe eines Scanners, einzeln schaltbaren LED's oder einer schaltbaren optischen Anordnung, beispielsweise einem schaltbaren SLM erfolgen. Dabei können dann nur die Daten ausgelesen werden, die aus beleuchteten Bereichen stammen, was die Ausleserate erhöht. Dabei können dann die Daten unterschiedlicher beleuchteter Bereiche zusammen ausgewertet werden (FCS).
In einem Schritt S4 wird das von der Probe 30 emittierte Fluoreszenzlicht so mit sich selbst überlagert, dass die einzelnen Fluoreszenzlichtstrahlen 32 mit sich selbst interferieren.
In einem Schritt S5 werden die auf der sensitiven Oberfläche des Flächensensors 36 abgebildeten Interferenzmuster erfasst.
In einem Schritt S6 werden mit Hilfe der Recheneinheit die Signale des Flächensensors 36 ausgelesen und abhängig von der Intensitätsverteilung, die durch die Ringmuster 46 und 44 repräsentiert ist, ausgewertet. Dabei wird insbesondere in einem ersten Teilschritt ein Zentrum, auch Schwerpunkt genannt, der Ringmuster ermittelt. Nachfolgend wird anhand der Radien der Ringmuster und anhand des Zentrums die dreidimensionale Lage der Farbstoffpartikel innerhalb der Probe 30 ermittelt. Signale aus einer Ebene können dadurch erkannt werden, dass deren Ringmuster übereinstimmen. Dies berücksichtigend kann eine Ebene in der Probe 30 stabilisiert werden und es können Daten ausschließlich aus dieser Ebene gewonnen werden. Ferner kann die Datendarstellung mit Hilfe einer Merkmalserkennung oder einer Objekterkennung beschleunigt werden.
In einem Schritt S7 können die Interferenzmuster über einen längeren Zeitraum beobachtet werden. Das Beobachten über den längeren Zeitraum ermöglicht, sich bewegende Farbstoffpartikel 40, 42 innerhalb der Probe 30 zu verfolgen und somit bewegte Vorgänge innerhalb der Probe 30 darzustellen. Alternativ oder zusätzlich kann abhängig von sich verändernden Intensitäten eines der Interferenzmuster eine Leucht-Lebensdauer der fluoreszierenden Farbstoffpartikel 40, 42 ermittelt werden, welche Ausschluss über Strukturen gibt, die die beobachteten Farbstoffpartikel umgibt. Insbesondere wird dabei die Probe 30 mit gepulsten Laser kurzer Pulsdauer beleuchtet. Ein zu beobachtender Abklingprozess ist charakteristisch für die einzelnen Farbstoffpartikel und verändert sich in Abhängigkeit von Strukturen, an die sich der Farbstoffpartikel heftet. Anhand des Abklingprozesses können dann Rückschlüsse auf die Nachbarschaft der einzelnen Marker gezogen werden.
In einem Schritt S8 kann das Programm beendet werden. Vorzugsweise wird das Programm jedoch regelmäßig während des Betriebs des Mikroskops 20 abgearbeitet.
Das Beobachten der Farbstoffpartikel in allen drei Raumrichtungen über einen vorgegebenen Zeitraum kann für ein Objekttracking und somit eine Verfolgung der Farbstoffpartikel innerhalb der Probe 30 mit Autofokusfunktion genutzt werden. Ferner dazu kann ausschließlich eine Autofokusfunktion realisiert werden. Ferner ist das Auslesen von 3D Datenspeichern möglich.
Die Erfindung ist nicht auf die angegebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. Die Erfindung eignet sich für jegliches Mikroskop, mit dem eine derart kleine Auswahl an fluoreszierenden Farbstoffpartikeln anregbar ist, dass die entstehenden Interferenzmuster auf der sensitiven Oberfläche des Flächensensors 36 noch derart differenzierbar sind, dass die Auswertung Rückschlüsse über die genaue Position der einzelnen Farbstoffpartikel in der Probe 30 erlaubt. Ferner kann das optische Element 34 über einen Strahlteiler realisiert sein, der das Fluoreszenzlicht in zwei Teilstrahlen aufteilt, wobei dann über eine weitere Strahlführung oder weitere optische Elemente ein Gangunterschied zwischen den beiden Teilstrahlen erreicht wird. Nachfolgend werden die Teilstrahlen wieder zusammengeführt, so dass diese mit sich selbst interferieren. Ferner können auch Farbstoffpartikel unterschiedlicher Farbe gleichzeitig beobachtet werden.
Bezugszeichenliste

20: Mikroskop
22: erste Beleuchtungslichtquelle
24: erster Beleuchtungslichtstrahl
26: Farbfilter
28: Strahlteiler
30: Probe
32: Fluoreszenzlichtstrahl
34: optische Anordnung
36: Flächensensor
38: virtueller Raum
40: erster Farbpartikel
42: zweiter Farbpartikel
44: erstes Ringmuster
46: zweites Ringmuster
50: Abbildung erster Farbstoffpartikel
52: Abbildung zweiter Farbstoffpartikel
54: zweiter Beleuchtungslichtstrahl
56: Beleuchtungsmatrix
START: Programmstart
END: Programmende
S1–S8: Schritte eins bis acht

Claims

Verfahren zum Untersuchen einer fluoreszierende Farbstoffe enthaltenden Probe (30) mit Hilfe eines Mikroskops (20), bei dem mit Hilfe eines ersten Beleuchtungslichtstrahls (24) Farbstoffpartikel (40, 42) in der Probe (30) zum Fluoreszieren angeregt werden, von der Probe (30) ausgehendes Fluoreszenzlicht über eine optische Anordnung (34) auf einen Flächensensor (36) gerichtet wird, wobei die optische Anordnung (34) so auf das Fluoreszenzlicht wirkt, dass Teilstrahlen des Fluoreszenzlichts mit sich selbst interferieren, so dass aufgrund der Interferenz entstehende Interferenzmuster auf einer sensitiven Oberfläche des Flächensensors (36) abgebildet und von diesem erfasst werden, und bei dem abhängig von den Interferenzmustern Positionen der Farbstoffpartikel (40, 42) innerhalb der Probe (30) ermittelt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem lediglich eine Auswahl der Farbstoffpartikel (40, 42) zum Fluoreszieren angeregt werden und bei dem die Auswahl in Abhängigkeit der voneinander unterscheidbaren Interferenzmuster getroffen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Farbstoffpartikel (40, 42) nur dann zum Fluoreszieren angeregt werden können, wenn diese zuvor aktiviert werden, und bei dem die vorgegebene Auswahl der Farbstoffpartikel (40, 42) angeregt wird, indem lediglich eine Untermenge der Farbstoffpartikel (40, 42) aktiviert wird, und dann die aktivierten Farbstoffpartikel (40, 42) mit Hilfe des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24) zum Fluoreszieren angeregt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Farbstoffpartikel (40, 42) nicht mehr zum Fluoreszieren angeregt werden können, wenn diese zuvor deaktiviert werden, und bei dem die vorgegebene Auswahl der Farbstoffpartikel (40, 42) angeregt wird, indem lediglich eine Untermenge der Farbstoffpartikel (40, 42) deaktiviert wird, und dann die verbleibenden aktivierten Farbstoffpartikel (40, 42) mit Hilfe des ersten Beleuchtungslichtstrahls (24) zum Fluoreszieren angeregt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei dem die vorgegebene Auswahl der Farbstoffpartikel (40, 42) angeregt wird, indem lediglich Farbstoffpartikel (40, 42) innerhalb eines Teilbereichs der Probe (30) zum Fluoreszieren angeregt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem als Teilbereich eine Ebene innerhalb der Probe (30) beleuchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der erste Beleuchtungslichtstrahl (24) senkrecht auf der Ebene steht.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der erste Beleuchtungslichtstrahl (24) parallel zu der Ebene ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der erste Beleuchtungslichtstrahl (24) einen vorgegebenen Winkel zwischen null und neunzig Grad mit der Ebene einschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, bei dem zum Aktivieren oder Deaktivieren der Farbstoffpartikel (40, 42) ein Aktivierungslichtstrahl erzeugt und auf die Probe (30) gerichtet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, bei dem die Farbstoffpartikel (40, 42) in der Ebene mit Hilfe einer Mehrphotonen-Anregung zum Fluoreszieren angeregt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem eine Veränderung der Interferenzmuster erfasst und ausgewertet wird und bei dem abhängig von der Veränderung der Interferenzmuster eine Bewegung der fluoreszierenden Farbstoffpartikel (40, 42) innerhalb der Probe (30) ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem ein Teilbereich der Probe (30) gebleicht wird und bei dem eine Regeneration des Teilbereichs, bei der ungebleichte Farbstoffpartikel (40, 42) von außerhalb des Teilbereichs in den Teilbereich gelangen, anhand der dadurch entstehenden und sich verändernden Interferenzmuster beobachtet wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem gleichzeitig Farbstoffpartikel (40, 42) zweier oder mehrer unterschiedlicher Farbstoffe zum Fluoreszieren angeregt und beobachtet werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem ein Abklingprozess des fluoreszierenden Verhaltens der Farbstoffpartikel (40, 42) beobachtet wird, anhand des Abklingprozesses Fluoreszenzdauern einzelner Farbstoffpartikel (40, 42) ermittelt werden und bei dem abhängig von den Fluoreszenzdauern Eigenschaften der Umgebung der entsprechenden Farbstoffpartikel (40, 42) ermittelt werden.