DE10200978A1

DE10200978A1 - Preparation of medium components comprises the mechanical, thermal, enzymatic and/or chemical cell decomposition without further treatment of micoorganisms and cell cultures

Info

Publication number: DE10200978A1
Application number: DE2002100978
Authority: DE
Inventors: Karl Friehs; Erwin Flaschel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-01-12
Filing date: 2002-01-12
Publication date: 2003-07-24

Abstract

Process for the use of biomasses from micoorganisms and cell cultures for the preparation of medium components comprises the mechanical, thermal, enzymatic and/or chemical cell decomposition without further treatment of micoorganisms and cell cultures.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1. The invention relates to methods according to the preamble of claim 1.

Die Kultivierung von Mikroorganismen bzw. Zellen erfordert die Bereitstellung von geeigneten Nährstoffen die in einem Medium vorgelegt werden. Bei bestimmten Verfahren wird das Medium sterilisiert. Ziel einer Kultivierung ist meist die Produktion von Biomasse und damit verbunden eines biotechnologischen Produktes z. B. Antibiotika, Enzyme oder einer speziellen biokatalytischen Leistung der Biomasse z. B. gereinigte Abwässer. Abgesehen von den Verfahren, bei denen die Biomasse selbst das Produkt darstellt, z. B. Backhefeherstellung, fällt bei biotechnologischen Verfahren eine mehr oder weniger große Menge an Biomasse an. Ein Teil dieser Biomasse wird bei bestimmten Verfahren, z. B. der biologischen Abwasserbehandlung im Prozess rezykliert z. B. als Klärschlamm. Andere Verfahren erlauben es Biomasse als Nebenprodukt zu vermarkten z. B. Bierhefe. Bei einigen Verfahren, wo Biomasse z. B. im Tonnenmaßstab anfällt, z. B. bei der Enzymproduktion mit Organismen der Gattung Bacillus muss die produzierte Biomasse als Abfall entsorgt werden. The cultivation of microorganisms or cells requires the provision of suitable nutrients that are presented in a medium. With certain The medium is sterilized. The goal of cultivation is usually production of biomass and a biotechnological product z. B. Antibiotics, enzymes or a special biocatalytic performance of the biomass z. B. purified wastewater. Aside from the processes in which the biomass itself represents the product, e.g. B. baking yeast, falls in biotechnological Process a more or less large amount of biomass. Part of this Biomass is used in certain processes, e.g. B. the biological Waste water treatment in the process recycles e.g. B. as sewage sludge. Other procedures allow biomass to be marketed as a by-product e.g. B. brewer's yeast. With some Process where biomass e.g. B. accrues on a ton scale, e.g. B. at the Enzyme production with organisms of the genus Bacillus must be the one produced Biomass to be disposed of as waste.

Biomasse besteht aus den Elementen, die zur Produktion von Biomasse gebraucht werden. Verfahren, die es erlauben, Biomasse als Bestandteile für Medien zur Kultivierung einsetzen zu können wären deshalb von großem Interesse. Biomass consists of the elements needed to produce biomass become. Processes that allow biomass to be used as components for media It would therefore be of great interest to be able to use cultivation.

Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Verwertung von Organismen zu schaffen, und diese teilweise oder vollständig in einem Kultivierungsprozess einzusetzen. Diese Aufgabe wird durch die Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs I gelöst. The object of the invention is to provide methods for recycling organisms create, and this partially or completely in a cultivation process use. This task is accomplished through the procedures with the characteristics of Claim I solved.

Die Vorteile der Erfindung sind:
einfache Wiederverwertung durch Zellaufschluss mit anschließender Abtrennung der Feststoffe und Einsatz des so erhaltenen Klarlysats ohne weitere Behandlung
einfache Wiederverwertung durch Zellaufschluss und Einsatz des gesamten Zellaufschlusses ohne vorherige Abtrennung der Feststoffe und ohne weitere Behandlung. The advantages of the invention are:
simple recycling by cell disruption with subsequent separation of the solids and use of the clear lysate obtained in this way without further treatment
simple recycling through cell disruption and use of the entire cell disruption without prior separation of the solids and without further treatment.

Dadurch können auf zweierlei Arten Kosten eingespart werden: erstens Kosten für die Entsorgung und zweitens Kosten für andere Nährstoffe, die teilweise oder ganz ersetzt werden können. This can save costs in two ways: first, costs for the disposal and secondly costs for other nutrients, some or all can be replaced.

Ein anders Verfahren, das ebenfalls zum Patent angemeldet wurde, (Friehs K., Flaschel E., Risse J. M.: Verfahren zur Behandlung von Biomasse aus biologischen Prozessen und Verwertung der so entstandenen Produkte. Patent DE 198 05 664 A1) befasst sich mit der Herstellung von Extrakten aus Biomasse. Beim neuen Verfahren handelt es sich nicht um die Herstellung von Extrakten, sondern um die Verwendung von Zellaufschlüssen oder Teilen davon, ohne weitere Behandlung als Mediumsbestandteile. Darin unterscheiden sich beide Verfahren. Wider Erwarten hat sich die direkte Verwendung eines Zellaufschluss ohne vorherige Klärung, d. h. Entfernung der Zellbruchstücke als besonders geeignet erwiesen, was an einem Beispiel gezeigt wird. Another method, which was also applied for a patent (Friehs K., Flaschel E., Risse J. M .: Process for the treatment of biomass from biological Processes and recycling of the resulting products. patent DE 198 05 664 A1) deals with the production of extracts from biomass. The new process is not the production of extracts, but about the use of cell disruption or parts thereof, without further Treatment as medium components. The two procedures differ in this. Contrary to expectations, the direct use of a cell disruption without prior Clarification, d. H. Removal of the cell debris has proven to be particularly suitable for what is shown using an example.

Example description of a patent application

Die Produktion von Stoffen mit Hilfe von Mikroorganismen oder Zellkulturen bedarf der Anzucht von Zellen. Dazu werden Medien benötigt, die die notwendigen Nährstoffe für das Wachstum der Mikroorganismen oder Zellkulturen enthalten. Bei der Satzkultivierung wird ein Medium vorgelegt und die Kultivierung durchgeführt. Bei kontinuierlichen, halbkontinuierlichen oder periodischen Zulauf-Kultivierungen werden Medien während der Verfahren zugegeben. The production of substances with the help of microorganisms or cell cultures is required the cultivation of cells. This requires media that have the necessary Contain nutrients for the growth of microorganisms or cell cultures. at A medium is presented to the sentence cultivation and the cultivation is carried out. at continuous, semi-continuous or periodic feed cultivations media are added during the procedures.

Nach der Anzucht werden die Zellen von dem Medium getrennt. Befindet sich das Produkt im Medium, so bleibt die gesamte Biomasse als Rest. Befindet sich das Produkt in den Zellen, so müssen die Zellen aufgebrochen und das Produkt isoliert werden. Dann bilden die Zellbruchstücke und der restliche Zellinhalt (Restlysat) den Rest. In beiden Fällen muss der Rest entsorgt werden. Die Restmengen betragen Tausende von Tonnen jährlich. After culturing, the cells are separated from the medium. Is that Product in the medium, the entire biomass remains as a residue Product in the cells, the cells must be broken up and the product isolated become. Then the cell fragments and the remaining cell content (residual lysate) form the Rest. In both cases, the rest must be disposed of. The remaining amounts are Thousands of tons annually.

Der Rest besteht jedoch im Prinzip aus genau den Elementen, aus denen die Zellen aufgebaut sind. Daher macht es Sinn, Verfahren zu entwickeln, die es erlauben, den Rest so aufzubereiten, dass er biotechnologischen Verfahren als Nährstoff wieder zugeführt werden kann. The rest, however, basically consists of exactly the elements that make up the cells are set up. Therefore, it makes sense to develop procedures that allow the Prepare rest so that it uses biotechnological processes as a nutrient again can be supplied.

Wichtig dabei ist jedoch, möglichst einfache und kostengünstige Verfahren zu entwickeln, um einen Einsatz attraktiv zu machen. Essentieller Bestandteil ist ein Zellaufschluss. Dafür gibt es eine Reihe von technischen Verfahren wie etwa die Hochdruckhomogenisation. Prinzipiell sind alle bekannten mechanischen, thermischen, enzymatischen, chemischen oder kombinierten Verfahren einsetzbar. Das Ergebnis dieser Verfahren sind mehr oder weniger aufgeschlossene Zellen die im folgenden als Zellaufschluss bezeichnet werden. Anschließend können die Zellbruchstücke z. B. durch Zentrifugation, Mikrofiltration oder andere Verfahren abgetrennt werden und Klarlysat wird gewonnen. Möglicherweise wird nun ein Produkt aus dem Klarlysat isoliert, dabei entsteht Restlysat, das nun je nach Isolierungsverfahren zusätzliche Stoffe wie z. B. Salze, die bei der Aussalzung von Proteinen beigefügt werden, enthalten kann. Bei anderen Verfahren, wie z. B. Chromatographie, wird das Restlysat verdünnt anfallen. However, it is important to use simple and inexpensive methods develop to make a job attractive. An essential component is a Cell disruption. There are a number of technical processes for this, such as the High pressure homogenization. In principle, all known mechanical, thermal, enzymatic, chemical or combined processes can be used. The result of these processes are the more or less disrupted cells hereinafter referred to as cell disruption. Then you can Cell fragments e.g. B. by centrifugation, microfiltration or other methods be separated and clear lysate is obtained. You may now see a Product isolated from the clear lysate, resulting in residual lysate, which now depends on Isolation procedures additional substances such. B. salts which are used in the salting out of Proteins can be added. In other processes, such as. B. Chromatography, the residual lysate is obtained diluted.

Es erfolgt die Beschreibung eines Beispiels An example is described

Production and use of cell disruption, clear lysates, Cell fragments and residual lysates from biomass from Escherichia coli and their recovery

Der Stamm Escherichia coli JM83 wird in Luria-Bertani-Medium (10 g L^-1 Pepton, 5 g L^-1 Hefeextrakt, 5 g L^-1 NaCl) angezüchtet. Die Zellen werden über Mikrofiltration angereichert und mittels Zentrifugation geerntet. Die gewonnene Biomasse wird mittels Hochdruckhomogenisation aufgeschlossen. Dies ergibt ein Gemisch, das als Zellaufschluss (ZA) bezeichnet wird. Ein Teil des Zellaufschlusses wird zentrifugiert. Der Überstand wird als Klarlysat (KL) bezeichnet. Das Pellet der Zentrifugation wird in Wasser aufgeschlemmt und dann als Zellbruch (ZB) benannt. Ein Teil des Klarlysats wird zur Simulation eines chromatographischen Schrittes mit 0,9% NaCl- Lösung 1 : 1 verdünnt. Dies ergibt das so benannte Restlysat (RL). The Escherichia coli JM83 strain is grown in Luria Bertani medium (10 g L ^-1 peptone, 5 g L ^-1 yeast extract, 5 g L ^-1 NaCl). The cells are enriched by microfiltration and harvested by centrifugation. The biomass obtained is digested using high-pressure homogenization. This results in a mixture called cell disruption (ZA). Part of the cell disruption is centrifuged. The supernatant is called clear lysate (KL). The centrifugation pellet is suspended in water and then named cell break (ZB). Part of the clear lysate is diluted 1: 1 with 0.9% NaCl solution to simulate a chromatographic step. This results in the so-called residual lysate (RL).

Nun wurden jeweils 25 mL des Zellaufschlusses, des Zellbruchs, des Klarlysats und des Restlysats zu je 25 mL LB-Medien, LB-Medien mit der halben Menge an Hefeextrakt und LB-Medien ohne Hefeextrakt zugegeben, durchmischt und diese Nährlösungen nach autoklavieren mit Escherichia Coli beimpft. Durch Messung des Feststoffgehalts vor dem Beimpfen, unmittelbar nach dem Beimpfen und nach 24 h Kultivierung wurde die Veränderung an Biomasse bestimmt. Das Ergebnis ist in Tab. 1 dargestellt. Tabelle 1 Biomasseänderung [g L^-1] nach 24-stündiger Kultivierung in verschiedenen Medien

25 mL each of the cell disruption, the cell rupture, the clear lysate and the residual lysate were each added to 25 mL LB media, LB media with half the amount of yeast extract and LB media without yeast extract, mixed, and these nutrient solutions after autoclaving with Escherichia Coli inoculated. The change in biomass was determined by measuring the solids content before inoculation, immediately after inoculation and after 24 h of cultivation. The result is shown in Tab. 1. Table 1 Biomass change [g L ^-1 ] after 24-hour cultivation in various media

Daraus ergeben sich folgende Schlüsse:
Die Zugabe von Zellaufschluss, Klarlysat, Zellbruchstücken oder Restlysat vermindert die Zunahme an Biomasse in LB-Medium nicht, was darauf schließen lässt, dass keine Hemmung des Wachstums stattfindet. Bei allen Ansätzen, konnte verglichen mit der Kultivierung in LB-Medium, eine höhere Zunahme an Biomasse festgestellt werden. This leads to the following conclusions:
The addition of cell disruption, clear lysate, cell fragments or residual lysate does not reduce the increase in biomass in LB medium, which suggests that growth is not inhibited. In all approaches, a higher increase in biomass was found compared to cultivation in LB medium.

Auch bei den Versuchen mit verringertem oder gar keinem Hefeextrakt konnte durch Zugabe der Recyclingfraktionen eine deutlich höhere Biomassezunahme erzielt werden, als mit den gleichen Medien ohne Recyclingfraktionen. Im Falle der Kultivierung ohne Hefeextrakt konnte gezeigt werden, dass Recyclingfraktionen Hefeextrakt ersetzen können. Even in experiments with reduced or no yeast extract, Adding the recycling fractions achieved a significantly higher increase in biomass than with the same media without recycling fractions. In case of Cultivation without yeast extract could be shown to be recycling fractions Can replace yeast extract.

Claims

1. A method for recycling biomasses of microorganisms and cell cultures for the production of medium components, characterized in that mechanical, thermal, enzymatic, chemical or combined cell disruption are used without further treatment as medium components for the cultivation of microorganisms or cell cultures.

2. The method according to claim 1, characterized in that cell fragments after mechanical, thermal, enzymatic, chemical or combined Cell digestions are separated and the resulting clear lysates without further treatment as medium components for the cultivation of Microorganisms or cell cultures can be used.

3. The method according to claim 2, characterized in that cell fragments after mechanical, thermal, enzymatic, chemical or combined Cell disruptions are separated and the resulting cell fragments without further treatment as medium components for the cultivation of Microorganisms or cell cultures can be used.

4. The method according to claim 1 and 2 and 3, characterized in that Klarlysate are processed first to win a product and this resulting lysate without further treatment as medium components for the Cultivation of microorganisms or cell cultures is used.

5. The method according to claim 1, 2, 3 and 4, characterized in that Cell disruptions and / or clear lysates and / or residual lysates and / or cell fragments be sterilized in the manufacture of sterile media or media parts.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that sterile or non-sterile cell disruption and / or clear lysates and / or residual lysates and / or cell fragments are added during cultivation as in continuous or semi-continuous processes and processes with periodic inflow.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that Waste quantities of biomass can be reduced.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that Nutrients to be replaced.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that Cell disruptions and / or clear lysates and / or residual lysates and / or cell fragments can be used as additives in any combination.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that Cell disruptions and / or clear lysates and / or residual lysates and / or cell fragments of one kind as additives in any combination for the cultivation of others Species or genera can be used.