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Die
vorliegende Anmeldung richtet sich auf neue Proteasen sowie deren
Herstellung und deren Verwendung. Sie betrifft außerdem
Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese
Proteasen, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie Verwendungen
der Proteasen, insbesondere zu Wasch- und Reinigungszwecken.
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Proteasen
gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt.
Für Wasch- und Reinigungsmittel sind sie die am längsten
etablierten und in praktisch allen modernen, leistungsfähigen
Wasch- und Reinigungsmitteln enthaltenen Enzyme. Sie bewirken den
Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Hierunter
sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen,
EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch
wirksamen Aminosäuren Serin-Proteasen sind. Sie wirken
als unspezifische Endopeptidasen und hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen,
die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum
liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über
diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases:
Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75–95
in „Subtilisin enzymes", herausgegeben von R.
Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise
von Mikroorganismen gebildet. Hierunter sind insbesondere die von
Bacillus-Spezies gebildeten und sezernierten Subtilisine als bedeutendste
Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.
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Beispiele
für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten
Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg,
die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Protease aus
Bacillus lentus, insbesonder aus Bacillus lentus DSM 5483, Subtilisin
DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im
engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und
die Proteasen TW3 und TW7. Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise
die unter den Handelsnamen Durazym®,
Relase®, Everlase®,
Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von
der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP,
Purafect® Prime und Properase® von der Firma Genencor, das unter
dem Handelsnamen Protosol® von
der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem
Handelsnamen Wuxi® von der Firma
Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von
der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter
der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo,
Japan, erhältlichen Enzyme.
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In
Wasch- und Reinigungsmitteln werden Proteasen häufig zur
Verbesserung der Waschbeziehungsweise Reinigungsleistung zusammen
mit weiteren Enzymen, insbesondere Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen,
Mannanasen, β-Glucosidasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder
Lipasen eingesetzt. Ebenso ist der Einsatz von Proteasen in Waschmitteln
in Kombination mit anderen Wirkstoffen wie etwa Bleichmitteln oder Soil-Release-Wirkstoffen
dem Fachmann bekannt. Es ist ferner bekannt, dass einige für
den Einsatz in Waschmitteln etablierte Proteasen auch für
kosmetische Zwecke oder für die organisch-chemische Synthese
geeignet sind.
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Unterschiedliche
technische Einsatzgebiete erfordern Proteasen mit unterschiedlichen
Eigenschaften, was beispielsweise die Reaktionsbedingungen, die
Stabilität oder die Substratspezifität angeht.
Ferner hängen die Einsatzmöglichkeiten einer Protease,
beispielsweise in einem Wasch- oder Reinigungsmittel, ab von weiteren
Faktoren wie der Stabilität des Enzyms, insbesondere gegenüber
hohen oder niedrigen Temperaturen, oxidierenden Agentien oder Tensiden,
von Faltungseffekten oder von erwünschten Synergien mit
anderen Inhaltsstoffen.
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Es
besteht weiterhin ein hoher Bedarf an neuen technisch einsetzbaren
Proteasen. Das klassische Vorgehen zur Gewinnung neuer Enzyme besteht
darin, Mikroorganismen-haltige Proben aus natürlichen Habitaten
zu entnehmen und unter den als geeignet angesehenen Bedingungen – zum
Beispiel in alkalischem Milieu – zu kultivieren. Auf diese
Weise werden Anreicherungskulturen von Mikroorganismen erhalten,
die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch Enzyme, darunter
Proteasen enthalten, welche unter den jeweiligen Bedingungen aktiv
sind. Hieraus werden dann beispielsweise über Ausplattieren
auf proteinhaltigen Agarplatten und Ausmessen der gebildeten Lysehöfe
die Mikroorganismen mit den leistungsfähigsten Enzymen
ausgewählt und aufgereinigt beziehungsweise die jeweiligen
Gene kloniert. Solch ein Vorgehen wird beispielsweise in dem Lehrbuch „Alkalophilic
Mikroorganisms. A new microbial world" von K. Horikoshi
und T. Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag,
New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, Kapitel 2, Seiten
9–26 beschrieben.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, weitere, bislang noch nicht bekannte Proteasen
bereitzustellen, die eine proteolytische Aktivität aufweisen.
Vorteilhafterweise sollte sich die Protease dadurch auszeichnen,
dass ihr Beitrag zur Leistung eines Mittels, welches die Protease
enthält, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel,
dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen
Enzym zur Leistung des Mittels zumindest nahe kommt und idealerweise übertrifft.
Als Beitrag zur Leistung ist diesbezüglich insbesondere
der Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels
von Bedeutung.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Proteasen, insbesondere vom
Subtilisin-Typ, bereitzustellen, die gegenüber dem Stand
der Technik eine verbesserte Stabilität gegenüber
Temperatureinflüssen, insbesondere hohen oder niedrigen
Temperaturen, sauren oder alkalischen Bedingungen oder pH-Wert-Änderungen,
denaturierenden oder oxidierenden Agentien, proteolytischem Abbau,
oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse
aufweisen. Weitere Aufgaben können in einer verringerten
Immunogenität und/oder verringerten allergenen Wirkung
gesehen werden.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Proteasen bereitzustellen,
die bei niedrigeren Temperaturen, insbesondere zwischen 10°C
und 40°C und zunehmend bevorzugt zwischen 10°C
und 30°C und zwischen 10°C und 25°C,
insbesondere bei 20°C, eine verbesserte Reinigungsleistung
im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Proteasen, insbesondere
denjenigen vom Subtilisin-Typ, aufweisen, wobei die verbesserte Reinigungsleistung
an zumindest einer Anschmutzung, vorzugsweise an mehreren Anschmutzungen,
vorliegt. Vorteilhafterweise wird die Reinigungsleistung in einer
Waschflotte erbracht, die von einer nicht festen Waschmittelformulierung
gebildet wurde.
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Gegenstand
der Erfindung ist eine Protease umfassend eine Aminosäuresequenz,
die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
- a) der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz,
und
- b) der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz.
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Hiermit
sind als weitere Erfindungsgegenstände für erfindungsgemäße
Proteasen codierende Nukleinsäuren, erfindungsgemäße
Proteasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht menschliche
Wirtszellen, Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer
Proteasen sowie erfindungsgemäße Proteasen umfassende
Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren,
und über erfindungsgemäßen Proteasen
definierte Verwendungen verbunden.
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Die
der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende, natürlicherweise
gebildete Protease ist, wie anhand der Beispiele nachvollzogen werden
kann, aus dem Kulturüberstand eines Bacillus halodurans
Stammes erhältlich. Die diesen Stamm enthaltende Bodenprobe
stammt aus der Volksrepublik China aus der Umgebung eines alkalischen
Sees in der Inneren Mongolei.
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Eine
erfindungsgemäße Protease weist eine proteolytische
Aktivität auf, das heißt, sie ist zur Hydrolyse
von Peptidbindungen eines Polypeptids bzw. Proteins befähigt,
insbesondere in einem Wasch- oder Reinigungsmittel. Eine erfindungsgemäße
Protease ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen
katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu
spalten. Eine erfindungsgemäße Protease ist insbesondere
ein Subtilisin.
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Eine
erfindungsgemäße Protease ist auf Grund ihrer
proteolytischen Aktivität und ihrer weiteren Eigenschaften,
insbesondere betreffend ihre Stabilität gegenüber
Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder ihr Temperaturprofil und/oder
ihr pH-Profil, für die Anwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln
geeignet. Überraschenderweise leistet sie bereits in ihrer
Wildtyp-Form einen so guten Beitrag zur Reinigungsleistung eines Wasch-
oder Reinigungsmittels, welches die Protease enthält, der
dem Beitrag von einem für diesen Zweck etablierten proteolytischen
Enzym zur Reinigungleistung des Mittels nahe kommt und ihn an unterschiedlichen Anschmutzungen
sogar übertrifft. Sie ermöglicht daher eine verbesserte
Entfernung von mindestens einer, bevorzugt von mehreren protease-sensitiven
Anschmutzungen auf Textilien und/oder harten Oberfächen,
beispielsweise Geschirr. Besonders vorteilhafte Reinigungsleistungen
zeigen erfindungsgemäße Proteasen beispielsweise
an Blut und/oder Milch und/oder Gras enthaltenden Anschmutzungen,
beispielsweise den Anschmutzungen Blut-Milch/Tusche auf Baumwolle:
Produkt Nr. C-05 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials)
B. V. Vlaardingen, Niederlande, Schokoladenmilch/Ruß auf
Baumwolle: Produkt Nr. C-03 erhältlich von CFT (Center
For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande, und/oder Gras
auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma
Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA)
Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz. Diesbezüglich
zeigen sich die vorteilhaften Reinigungsleistungen einer erfindungsgemäßen
Protease an Blut und/oder Milch besonders im Rahmen flüssiger
Wasch- oder Reinigungsmittelrezepturen, und die vorteilhafte Reinigungsleistung
einer erfindungsgemäßen Protease an Gras enthaltenden
Anschmutzungen im Rahmen flüssiger und/oder fester Wasch-
oder Reinigungsmittelrezepturen. Weiter überraschend wurde
festgestellt, dass solche vorteilhaften Reinigungsleistungen auch
bei niedrigen Temperaturen zwischen 10°C und 40°C,
zwischen 10°C und 30°C und zwischen 10°C
und 25°C, beispielsweise bei 20°C, erzielt werden.
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Unter
Reinigungsleistung wird erfindungsgemäß die Aufhellungsleistung
eines Wasch- oder Reinigungsmittels an Anschmutzungen, insbesondere
an Protease-sensitiven Anschmutzungen und hierunter insbesondere
an Protease-sensitiven Wäscheanschmutzungen, verstanden.
Die Reinigungsleistung wird bevorzugt ermittelt wie weiter unten
angegeben.
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Aufgrund
der zur Verfügung gestellten erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren ist eine zusätzliche Optimierung
dieser Protease, beispielsweise durch Substitutionen, Insertionen
oder Deletionen von einer oder mehreren Aminosäuren, oder
weiteren Sequenzveränderungen, möglich. Ferner
können erfindungsgemäße Nukleinsäuren
in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung
völlig neuartiger Proteasen oder anderer Polypeptide genutzt
werden.
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Zahlreiche
Proteasen und insbesondere Subtilisine werden als sogenannte Präproteine,
also zusammen mit einem Propeptid und einem Signalpeptid gebildet,
wobei die Funktion des Signalpeptids üblicherweise dann
besteht, die Ausschleusung der Protease aus der sie produzierenden
Zelle in das Periplasma oder das die Zelle umgebende Medium zu gewährleisten,
und das Propeptid üblicherweise für die korrekte
Faltung der Protease nötig ist. Das Signalpeptid und das
Propeptid sind in der Regel der N-terminale Teil des Präproteins. Das
Signalpeptid wird unter natürlichen Bedigungen durch eine
Signalpeptidase von der übrigen Protease abgespalten. Anschließend
erfolgt die durch das Propeptid unterstützte korrekte endgültige
Faltung der Protease. Die Protease ist dann in ihrer aktiven Form
und spaltet das Propeptid selbst ab. Nach der Abspaltung des Propeptids übt
die dann reife (mature) Protease, insbesondere Subtilisin, ihre
katalytische Aktivität ohne die ursprünglich vorhandenen
N-terminalen Aminosäuren aus.
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Eine
erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
ist unter SEQ ID NO. 1 angegeben. Diese Nukleinsäure codiert
für eine Protease, welche eine für Subtilisine
typische Einteilung in Signalpeptid, Propeptid und reife (mature)
Protease aufweist. Das Gesamtlängenprotein ist unter SEQ
ID NO. 2 und die reife (mature) Protease unter SEQ ID NO. 3 angegeben.
Hiermit ist das tatsächlich aktive reife Protein gemeint,
weil dieses die technisch relevante proteolytische Funktion ausübt.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind daher
die reifen, aktiven Proteasen. Diese weisen ein Molekulargewicht
zwischen 25 und 30 kD (Kilodalton) auf, insbesondere 27 kD, ermittelt
durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
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Für
die Protease gemäß SEQ ID NO. 3 bzw. SEQ ID NO.
2 wurde eine Sequenzanalyse sowie ein Sequenzvergleich mit bekannten
Proteinsequenzen aus den allgemein zugänglichen Datenbanken
UniProtKB und/oder Swiss-Prot (vgl. UniProtKB, EMBL Gutstation – European
Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge CB10 ISD, United Kingdom; http://www.uniprot.org)
und/oder GenBank (National Center for Biotechnology Information
NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) durchgeführt,
um die Proteine mit der größten Ähnlichkeit
zu ermitteln. Für die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID
NO. 1 wurde entsprechend ein Sequenzvergleich mit bekannten Nukleinsäuresequenzen
durchgeführt.
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Dieser
Sequenzvergleich erfolgte basierend auf dem im Stand der Technik
etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus
(vgl. beispielsweise
Altschul, S. F., Gish, W., Miller,
W., Myers, E. W. & Lipman,
D. J. (1990) "Basic local alignment search tool." J.
Mol. Biol. 215: 403–410, und
Altschul,
Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang,
Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped
BLAST and PSI-BLAST: a new generation of Protein database search
programs"; Nucleic Acids Res., 25, S. 3389–3402)
und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen
von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure-
bzw. Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine
tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment
bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer
Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments),
insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen
erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie
(vgl. beispielsweise
Chenna et al. (2003): Multiple sequence
alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research
31, 3497–3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise
Notredame
et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments.
J. Mol. Biol. 302, 205–217) oder Programme, die
auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. In der vorliegenden
Patentanmeldung wurden alle Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem
Computer-Programm Vector NTI
® Suite
10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifomien,
USA) mit den vorgegebenen Standardparametern erstellt, dessen AlignX-Modul
für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert.
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Solch
ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit
der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise
in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der
identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben
bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben.
Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen
konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit
ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer
Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche
chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit
der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit
angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über
ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche
getroffen werden. Homologe bzw. identische Bereiche von verschiedenen
Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher
durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche
Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können
klein sein und nur wenige Nukleotide bzw. Aminosäuren umfassen.
Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität
des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll
sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls
kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen
sich Identitäts- bzw. Homologieangaben in der vorliegenden
Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen
Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.
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Durch
einen solchen Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise
in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind,
lässt sich für eine Aminosäuresequenz
ferner deren enzymatische Aktivität folgern.
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Für
die reife (mature) Protease gemäß SEQ ID NO. 3
wurde auf Aminosäureebene über die Gesamtlänge
von SEQ ID NO. 3 als nächstähnliches Protein identifiziert:
AprM Serinprotease aus Bacillus sp. mit einer Abweichung in einer
Aminosäureposition (UNIPROT-Datenbankeintrag Q45521 (Q45521_BACSP);
vgl. Masui, A. et al. (1994): Stabilization and rational
design of serine protease AprM under highly alkaline and high-temperature
conditions. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3579–3584).
Diese Sequenz ist angegeben als SEQ ID NO. 5.
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Für
die gesamte Protease gemäß SEQ ID NO. 2 wurde
auf Aminosäureebene über die Gesamtlänge von
SEQ ID NO. 2 mit einer Abweichung in einer Aminosäurepositionen
ebenfalls die genannte AprM Serinprotease aus Bacillus sp. als nächstähnliches
Protein identifiziert.
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Somit
handelt es sich bei der gefundenen Protease um ein neues Enzym.
Zu der im Stand der Technik etablierten Protease aus Bacillus lentus
(SEQ ID NO. 4, vgl. auch
WO
97/21760 A1 ) ergibt sich eine Identität von 64,7%
bezogen auf jeweils das reife Enzym. Eine erfindungsgemäße
reife Protease ist demnach ausgehend von SEQ ID NO. 5 und in der
Zählung von SEQ ID NO. 5 eine Variante mit der Aminosäuresubstitution T127A.
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Eine
erfindungsgemäße Gesamtlängen-Protease
ist demnach ausgehend von SEQ ID NO. 6 und in der Zählung
von SEQ ID NO. 6 eine Variante mit der Aminosäuresubstitution
T127A, wobei sich negative Werte auf Positionen im Signal- bzw.
Propeptid beziehen, d. h. Aminosäureposition eins ist wiederum
der Beginn der reifen Protease.
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Für
die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition
betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention
angewendet: zunächst wird die natürlicherweise
vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen
Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition
und schließlich die eingefügte Aminosäure.
Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch
Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind
nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren
benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch
ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt.
Beispielsweise beschreibt A95G die Substitution von Alanin an Position
95 durch Glycin, A95AG die Insertion von Glycin nach der Aminosäure
Alanin an Position 95 und A95* die Deletion von Alanin an Position
95. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie
bekannt.
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Aufgrund
der zu erkennenden Übereinstimmungen und der Verwandtschaft
zu bekannten Subtilisinen ist eine erfindungsgemäße
Protease ein Subtilisin.
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In
einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Protease
dadurch gekennzeichnet, dass ihre Reinigungsleistung mindestens
derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, die der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz
entspricht, und/oder mindestens derjenigen einer Protease entspricht,
die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO.
5 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, und/oder mindestens
derjenigen einer Protease gemäß
WO 03/057713 entspricht, wobei die
Reinigungsleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel
in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte
sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden
Proteasen aktivitätsgleich eingesetzt sind und die Reinigungsleistung
gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen Blut-Milch/Tusche
auf Baumwolle, Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle, Erdnuss Öl-Pigment/Tusche
auf Polyester/Baumwolle und Gras auf Baumwolle, insbesondere gegenüber
einer oder mehrerer der Anschmutzungen
- – Blut-Milch/Tusche
auf Baumwolle: Produkt Nr. C-05 erhältlich von CFT (Center
For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- – Schokoladenmilch/Ruß auf Baumwolle: Produkt
Nr. C-03 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials)
B. V. Vlaardingen, Niederlande
- – Erdnuss Öl-Pigment/Tusche auf Polyester/Baumwolle:
Produkt Nr. PC-10 erhältlich von CFT (Center For Testmaterials)
B. V. Vlaardingen, Niederlande
- – Gras auf Baumwolle: Produkt Nr. 164 erhältlich
von der Firma Eidgenössische Material- und Prüfanstalt (EMPA)
Testmaterialien AG, St. Gallen, Schweiz,
bestimmt wird
durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien,
der Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60
Minuten, bei einer Temperatur von 20°C erfolgt und das
Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche
Härte) aufweist.
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Ein
bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches
Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent):
0,3–0,5% Xanthan Gum, 0,2–0,4% Anti-Schaummittel,
6–7% Glycerin, 0,3–0,5% Ethanol, 4–7%
FAEOS (Fettalkoholethersulfat), 24–28% nichtionische Tenside,
1% Borsäure, 1–2% Natriumcitrat (Dihydrat), 2–4%
Soda, 14–16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1,1-di-phosphonsäure)),
0–0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0–0,05% optischer
Aufheller, 0–0,001% Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser.
Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen
Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise
4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen
in einem pH-Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen
pH 8 und pH 9.
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Ein
bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein
solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben
in Gewichts-Prozent): 10% lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz),
1,5% C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0% C12-C18-Fettalkohol
mit 7 EO, 20% Natriumcarbonat, 6,5% Natriumhydrogencarbonat, 4,0%
amorphes Natriumdisilikat, 17% Natriumcarbonat-peroxohydrat, 4,0%
TAED, 3,0% Polyacrylat, 1,0% Carboxymethylcellulose, 1,0% Phosphonat,
25% Natriumsulfat, Rest: optional Schauminhibitoren, optischer Aufheller,
Duftstoffe und ggfs. Wasser ad 100%. Bevorzugt beträgt
die Dosierung des pulverförmigen Waschmittels zwischen
5,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 5,6, 5,9 oder
6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem
pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 11.
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Im
Rahmen der Erfindung erfolgt die Bestimmung die Reinigungsleistung
bevorzugt bei 20°C unter Verwendung eines flüssigen
Waschmittels wie vorstehend angegeben.
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Der
Weißheitsgrad, d. h. die Aufhellung der Anschmutzungen,
als Maß für die Reinigungsleistung wird bevorzugt
mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein
hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das
Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für
die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard,
bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.
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Durch
den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Protease
wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen
des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die
Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen
Eigenschaften, also beispielsweise die Reinigungsleistung an bestimmten
Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige
spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren
Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Verfahren zur Bestimmung
der Proteaseaktivität sind dem Fachmann auf dem Gebiet
der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet.
Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in Tenside,
Band 7 (1970), S. 125–132.
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Alternativ
kann die Protease-Aktivität über die Freisetzung
des Chromophors para-Nitroanilin (pNA) aus dem Substrat suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-Nitroanilid
(AAPF) bestimmt werden. Die Protease spaltet das Substrat und setzt
pNA frei. Die Freisetzung des pNA verursacht eine Zunahme der Extinktion
bei 410 nm, deren zeitlicher Verlauf ein Maß für
die enzymatische Aktivität ist (vgl. Del Mar et
al., 1979). Die Messung erfolgt bei einer Temperatur von
25°C, bei pH 8,6, und einer Wellenlänge von 410
nm. Die Messzeit beträgt 5 min und das Messintervall 20
s bis 60 s.
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Die
Proteaseaktivität wird üblicherweise in Protease-Einheiten
(PE) angegeben. Geeignete Proteaseaktivitäten betragen
beispielsweise 2,25, 5 oder 10 PE pro ml Waschflotte. Die Proteaseaktivität
ist jedoch nicht gleich Null.
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Proteine
können über die Reaktion mit einem Antiserum oder
einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter
Proteine zusammengefasst werden. Die Angehörigen einer
solchen Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von
einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen.
Sie sind daher einander strukturell so ähnlich, dass sie
von einem Antiserum oder bestimmten Antikörpern erkannt
werden. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Proteasen,
die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend
bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene
Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Protease
aufweisen. Solche Proteasen sind auf Grund ihrer immunologischen Übereinstimmungen
den erfindungsgemäßen Proteasen strukturell so ähnlich,
dass auch von einer gleichartigen Funktion auszugehen ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine erfindungsgemäße
Protease natürlicherweise in einem Organismus vorhanden,
der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist. Diese
Ausführungsform ist deshalb besonders vorteilhaft, weil
dann der zugehörige Organismus selbst in Kultur genommen
werden kann. Vorteilhafterweise lassen sich dann aus dessen Zellextrakten
oder Kulturüberständen erfindungsgemäße
Proteasen isolieren und herstellen.
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Bevorzugt
ist die Protease in einem Mikroorganismus vorhanden, weiter bevorzugt
in einem Pilz, in einem gramnegativen oder in einem grampositiven
Bakterium, und hierunter besonders bevorzugt in einem Bakterium
der Gattung Bacillus. Denn besonders für diese Organismen
sind im Stand der Technik Kultivierungsmethoden bekannt und etabliert.
Das gilt insbesondere für Bacilli, die in der technischen
Enzymherstellung eine herausragende Rolle einnehmen. Ganz besonders
bevorzugt ist die Protease vorhanden in Bacillus halodurans.
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Proteasen
bzw. Enzyme im allgemeinen können durch verschiedene Verfahren,
z. B. gezielte genetische Veränderung durch Mutageneseverfahren,
weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich
spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen
Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert werden.
Hierfür werden insbesondere Änderungen der Nukleotid-
oder Aminosäuresequenz herbeigeführt und als Mutationen
bezeichnet. Grundsätzlich sind Deletions-, Insertions-
oder Substitutionsmutationen möglich oder solche, bei denen
verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert werden.
Die zugehörigen Organismen sind entsprechende Mutanten,
und von mutierten Nukleinsäuren codierte Proteine die entsprechenden
Enzym-Varianten. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-,
Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-,
substitutionsmutierten Genen bzw. Fusionsgenen und auf Proteinebene
zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten
beziehungsweise Fusionsproteinen. Das Ziel ist es, in die bekannten
Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen
oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung
von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. Hierzu
können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder
der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre
Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So
kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert
werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für
den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ
oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende
Mutationen die Stabilität der Protease erhöht
und dadurch ihre Reinigungsleistung verbessert werden. Vorteilhafte
Eigenschaften einzelner Mutationen, z. B. einzelner Substitutionen,
können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter
Eigenschaften bereits optimierte Protease, zum Beispiel hinsichtlich
ihrer Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln
und/oder anderen Komponenten, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich
weiterentwickelt werden.
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Unter
Fragmenten werden alle Proteine oder Peiltide verstanden, die kleiner
sind als natürliche Proteine und beispielsweise auch synthetisch
erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen
können sie den jeweiligen vollständigen Proteinen
zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen
annehmen oder enzymatische Aktivitäten oder Teilaktivitäten
ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines bestimmten
Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen
sind prinzipiell gleichartig dadurch, dass eine oder mehrere Aminosäuren
im Vergleich zu einer Ausgangssequenz fehlen; während Fragmente üblicherweise
kleine Stücke einer Ausgangssequenz umfassen, fehlen Deletionsmutanten üblicherweise
nur kurze Bereiche und damit ggfs. nur einzelne Teilaktivitäten.
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Insertionen
sind wie Deletionen nicht auf einzelne Aminosäuren beschränkt.
Vielmehr können auch mehrere Aminosäuren oder
ganze Fragmente oder selbst ganze Proteine in eine Ausgangssequenz
eingefügt sein oder mit einer Ausgangssequenz fusioniert
sein. Im letzteren Fall handelt es sich dann um ein chimäres Protein.
Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren
Enzymabschnitten, also Fragmenten, mit anderen Enzymen oder Proteinen
anderer Funktion. So ist es beispielsweise möglich, ein
erfindungsgemäßes Enzym oder Teile davon über
peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen
aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose-Bindungsdomäne,
zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu
gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße
Enzyme beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen oder Fragmenten
davon verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Protease, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass sie aus einer Protease wie vorstehend beschrieben
durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution erhaltbar
ist, insbesondere derart, dass die erhaltene Protease noch mindestens
zu 85% identisch zu SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 2 ist und/oder
an Position 127 in der Zählweise von SEQ ID NO. 3 oder
SEQ ID NO. 2 die Aminosäure Alanin (Ala, A) aufweist. Vorteilhafterweise
ist die erhaltene Protease noch mindestens zu 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch zu
SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 2 und/oder umfasst an Position 127
in der Zählweise von SEQ ID NO. 3 bzw. SEQ ID NO. 2 die
Aminosäure Alanin (Ala, A). Der Begriff ”konservative
Aminosäuresubstitution” bedeutet den Austausch (Substitution)
eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest,
wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität
oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure
führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes
gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen
im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, I=V=L=M,
D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
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Alternativ
oder ergänzend ist die Protease dadurch gekennzeichnet,
dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease
als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung,
Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz
umfasst, die über eine Länge von mindestens 50
oder mindestens 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160,
170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266, 267
oder 268 zusammenhängenden Aminosäurepositionen
mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
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So
ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den
Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne
dass dadurch die proteolytische Aktivität verloren wird.
Durch derartige Deletionen kann beispielsweise auch die Allergenizität
betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert
werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Fragmentierung
oder Deletionsmutagenese ihre proteolytische Aktivität.
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Auch
Substitionen können vorteilhafte Wirkungen bewirken. Sowohl
einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren
können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
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Alternativ
oder ergänzend ist die Protease dadurch gekennzeichnet,
dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease
als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder mehrere
Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die den Positionen
3, 4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118,
120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224,
229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Protease aus Bacillus lentus
gemäß SEQ ID NO. 4 in einem Alignment zugeordnet
sind. Die Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein
Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen
Protease mit der Aminosäuresequenz der Protease aus Bacillus
lentus, wie sie in SEQ ID NO. 4 angegeben ist, definiert. Ein solches
Alignment ist in 1 angegeben. Da die Protease
aus Bacillus lentus im Stand der Technik ein wichtiges Referenzmolekül
zur Beschreibung neuer Proteasen und von Aminosäureveränderungen
darstellt und die hier beschriebenen neuen Proteasen und somit auch
ihre Sequenz bislang unbekannt sind, ist es vorteilhaft, in der Zuordnung
der Aminosäurepositionen auf die Zählung der Protease
aus Bacillus lentus (SEQ ID NO. 4) Bezug zu nehmen. Weiterhin richtet
sich die Zählung nach dem reifen (maturen) Protein. Diese
Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz
der erfindungsgemäßen Protease eine höhere
Zahl von Aminosäurenresten umfasst als die Protease aus
Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. 4. Ausgehend
von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der
Protease aus Bacillus lentus sind die Veränderungspositionen
in einer erfindungsgemäßen Protease diejenigen,
die eben diesen Positionen in einem Alignment gemäß 1 zugeordnet
sind.
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Vorteilhafte
Positionen für Sequenzveränderungen, insbesondere
Substitutionen, der Protease aus Bacillus lentus, die übertragen
auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen
Proteasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Protease vorteilhafte
funktionelle Eigenschaften verleihen, sind demnach die Positionen 3,
4, 36, 42, 47, 56, 61, 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118,
120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224,
229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268, zuzuordnen in einem Alignment
mit SEQ ID NO. 4 und damit in der zählung gemäß SEQ
ID NO. 4. In den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der
Protease aus Bacillus lentus folgende Aminosäurereste:
S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61, T69, E87, A96, R99, A101, I102,
S104, N114, H118, A120, S130, S139, T141, S142, S154, S157, A188,
V193, V199, G205, L211, A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255
beziehungsweise T268.
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Vorteilhaft
sind insbesondere beispielsweise Substitutionen 3T, 4I, 61A, 99G,
99A, 99S, 154D, 154E, 211D, 211G und 211E, sofern die entsprechend
homologen Positionen in einer erfindungsgemäßen
Protease nicht schon natürlicherweise von einer dieser
bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden. Die Austausche
3T und 4I führen über einen Stabilisierungseffekt
auf das Molekül zu einer Verbesserung der Reinigungsleistung
der Protease und damit zu einer verbesserten Reinigungsleistung
eines Wasch- oder Reinigungsmittels, das die Protease enthält.
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Eine
weitere Bestätigung der korrekten Zuordnung der zu verändernden
Aminosäuren, d. h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung,
können Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf
der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden
miteinander verglichenen Proteasen auf die gleiche Weise verändert
werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität
auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein
Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der Protease
aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. 4 mit einer
Veränderung eines enzymatischen Parameters einher, beispielsweise
mit der Erhöhung des KM-Wertes,
und wird eine entsprechende Veränderung des enzymatischen
Parameters, beispielsweise also ebenfalls eine Erhöhung
des KM-Wertes, in einer erfindungsgemäßen Protease-Variante
beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte
Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin eine Bestätigung
dieses Erfindungsaspekts zu sehen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Protease,
die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine
oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch
Kopplung an ein Polymer. Denn eine Erhöhung der Stabilität
bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise
beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität
länger anhält und damit die Reinigungsleistung
verbessert wird. Grundsätzlich kommen alle im Stand der
Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten
in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Muationen
des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im
Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte
erfordern. Beispiele für hierfür geeignete Sequenzveränderungen
sind vorstehend genannt. Weitere geeignete Sequenzveränderungen
sind aus dem Stand der Technik bekannt. So können Proteasen
beispielsweise auch dadurch stabilisiert werden, dass einer oder
mehrere Tyrosin-Reste gegen andere Aminosäuren ausgetauscht
werden.
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Weitere
Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:
- – Veränderung der Bindung
von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise durch
Austauschen von einer oder mehreren der an der Calcium-Bindung beteiligten
Aminosäure gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren
und/oder durch Einführen von Sequenzveränderungen in
mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin;
- – Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien
wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der
Aminosäuresequenz auf bzw. an der Oberfläche des
Proteins bewirken;
- – Austausch von Aminosäuren, die nahe dem
N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente
Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten
und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären
Struktur leisten.
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Bevorzugte
Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf
mehrere Arten stabilisiert wird, da mehrere stabilisierende Mutationen
additiv oder synergistisch wirken.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Protease wie vorstehend
beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens
eine chemische Modifikation aufweist. Eine Protease mit einer solchen Veränderung
wird als Derivat bezeichnet, d. h. die Protease ist derivatisiert.
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Unter
Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche
Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch
modifiziert worden ist. Solche Dertvatisierungen können
beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein
exprimiert. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer
Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben.
Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt
werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer
Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung
an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen
eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich.
Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein,
das beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen
an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden wird.
Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen
makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter
Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen.
Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder
die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine
vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität
herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz
um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für
den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können
ferner die Stabilität oder die enzymatische Aktivität
beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergenizität
und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und
damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen.
Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen,
beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität
und/oder Hautverträglichkeit verbessern.
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Unter
Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können
im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden
werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation
kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet
sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen.
Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner
Lagerstabilität, mit anderen Stoffen gezielt versetzt worden
sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen
eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch
unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation
tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet
oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der
Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und
erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet.
Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe
gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von
Proteasen mit Protease-Inhibitoren ist vorteilhaft.
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Betreffend
alle vorstehend beschriebenen Proteasen bzw. Proteasevarianten und/oder
Derivate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung diejenigen besonders
bevorzugt, deren Aktivität mindestens derjenigen der Protease
gemäß SEQ ID NO. 3 entspricht, und/oder deren
Reinigungsleistung mindestens derjenigen der Protease gemäß SEQ
ID NO. 3 entspricht, wobei die Reinigungsleistung in einem Waschsystem
bestimmt wird wie vorstehend beschrieben. Die Bestimmung der Proteaseaktivität
ist eine fachübliche Maßnahme und erfolgt diesbezüglich
vorzugsweise nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125–132 beschriebenen
Methode. Üblicherweise wird die Proteaseaktivität
in PE (Protease-Einheiten) angegeben.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure,
die für eine erfindungsgemäße Protease codiert,
sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure.
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Unter
Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung
die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger
dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare
Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen codieren, insbesondere
DNA- oder RNA-Moleküle. Sie können als Einzelstrang, als
ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang
oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen
sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge
in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen.
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Ferner
ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also
Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren
können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz
von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden
kann, was als Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet wird.
Aus diesen Gründen werden sowohl Aminosäuresequenzen
als auch Nukleinsäuresequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs
einbezogen. Daher sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen
in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der
vorstehend beschriebenen Proteasen codieren können. Der
Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei
zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes
einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind.
Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz
für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren
problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen
Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons
ersetzt worden sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf
die heterologe Expression der erfindungsgemäßen
Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle
eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Usage. Unter Codon-Usage
wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren
durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen
in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure
liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen
Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen.
Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt
das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert
wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure
codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl
von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann
dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
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Einem
Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden,
wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen
Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder
Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren
bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige
Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch,
E. F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual,
3. Edition Cold Spring Laborstory Press. bekannt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die
Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße
Protease codiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz
umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
- a) Nukleinsäuresequenz, die zu der
in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem
Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden
Nukleotiden identisch ist
- b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1
angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 277 bis
1083 identisch ist
- c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1
angegebenen Nukleinsäuresequenz identisch ist.
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In
einer weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist die
Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz
umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in
einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 400, 500, 600,
700, 800, 900, 1000, 1100 zusammenhängenden Nukleotiden
identisch ist.
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Betreffend
die Gesamtsequenz von SEQ ID NO. 1 weist diese in den Positionen
1 bis 3 alternativ das Codon GTG auf. Da es sich hierbei um das
Startcodon handelt, codiert dieses ebenfalls für die Aminosäure Methionin
(bzw. Formyl-Methionin (fMet)) und nicht für Valin (Val).
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Die
vorstehend unter b) angegebene Nukleinsäuresequenz betrifft
den Bereich, der für die reife (mature) Protease codiert.
Sollte sich herausstellen, dass das reife (mature) Protein nur von
einem Teil dieser Sequenz gebildet wird, so gilt der Schutzbereich
entsprechend für diesen Teil. Bevorzugt sind solche Nukleinsäuren,
die für reife (mature) Proteine codieren.
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Mit
allen genannten Erfindungsgegenständen und Ausführungsformen
sind als weitere Erfindungsgegenstände entsprechende Vektoren,
Wirtszellen, Herstellungsverfahren, in denen entsprechende Vektoren oder
Wirtszellen eingesetzt werden sowie Verwendungen entsprechender
Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen verbunden. Daher
betreffen die vorstehenden Ausführungen diese Erfindungsgegenstände
entsprechend.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Vektor, der eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält,
insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
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Unter
Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren
bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich
eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie
vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über
mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches
Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung
in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente.
Es wird unterschieden zwischen Klonierungsvektoren, die der Lagerung
und somit gewissermaßen auch der gentechnischen Arbeit
dienen, und Expressionsvektoren, die die Funktion erfüllen,
die Nukleinsäure bzw. das auf dieser vorhandene Gen (oftmals
Transgen) in der Wirtszelle zu realisieren, das heißt,
die Expression des betreffenden Polypeptids zu ermöglichen.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße
Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren
zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle
Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend
synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster
Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen
vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über
mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren.
Sie können extrachomosomal als eigene Einheiten vorliegen
oder in ein Chromosom bzw. chromosomale DNA integrieren. Welches
der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt
wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können
beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung
stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen,
oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten
Wirtszellen sein.
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Expressionsvektoren
umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen,
in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen,
besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene
Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression
wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche
die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch
den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden
Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch
durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor
der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig
anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle.
Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die
Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure
zur Verfügung gestellt und für deren Expression
genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar
sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen
oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen
oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren
der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz
ist das Galactose-Derivat Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons)
verwendet wird.
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Expressionsvektoren
ermöglichen, dass ein erfindungsgemäßes
Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als
derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden
kann, produziert wird. Die Zellen können dabei zu verschiedenen
Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen.
Auch eine homologe Gewinnung eines erfindungsgemäßen
Proteins aus einer Wirtszelle, die dieses Protein natürlicherweise
(also bereits in ihrer Wildtyp-Form) exprimiert, ist mit einem erfindungsgemäßen
Vektor möglich. Dies kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche,
mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationen an
dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie
sie auch natürlicherweise ablaufen würden.
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Zu
einem einsetzbaren Expressionssystem können ferner zusätzliche
Nukleinsäuren (Gene) bzw. von ihnen codierte Proteine zählen,
beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung
gestellt werden, und die die Produktion erfindungsgemäßer
Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Proteine
handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen
Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische
Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine
oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die
die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beeinflussen. In
der Regel müssen aus der Fülle an verschiedenen
im Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systemen die
optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell
ermittelt werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle,
die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure
oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet,
oder die eine erfindungsgemäße Protease beinhaltet,
insbesondere eine, die die Protease in das die Wirtszelle umgebende
Medium sezerniert. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure
bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor wird bevorzugt
in die Wirtszelle eingebracht durch deren Transformation. Bevorzugt
wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure
bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus
transformiert, der dann eine erfindungsgemäße
Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten,
d. h. Nukleinsäure-Teile bzw. -Fragmente einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden,
dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße
Nukleinsäure bzw. einen erfindungsgemäßen
Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann,
wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer
erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. eines
erfindungsgemäßen Vektors enthält und
die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden.
Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik
etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen
eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische
oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die
sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise
die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor
und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige
Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen
durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit
aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe
Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und
gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine.
Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren
das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende
Medium. Ferner können die Proteasen von den sie produzierenden
Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise
durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen,
Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können
die Protease funktionell beeinflussen.
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Weitere
bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen
dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise
auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch
von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können,
in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch
kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren
dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder
bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese
zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche
Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein
Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend
beschrieben.
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Bevorzugte
Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien
zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche
an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige
Kultivierungsverfahren bzw. Herstellungsverfahren etabliert werden.
Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über
einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion
können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell
zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen,
Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive
Bakterien geeignet sein.
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Bei
gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird
eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert,
also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden
Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft
sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet
werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen
Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen.
Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten
oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber
keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine
sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium,
abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen
lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder
weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit
den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige
Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare
Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Usage
verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend
ausgerichtet ist.
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Erfindungsgemäße
Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an
die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche
Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche
Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen
handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren.
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Die
vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen,
insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders
bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt
dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße
Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann
Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.
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In
einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle
dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines,
das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia,
Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter,
Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt
eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia
coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus,
Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus
halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus camosus, Corynebacterium
glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces
coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
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Die
Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren
Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz
zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage,
das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele
dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces
oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft
sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische
Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen.
Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang
mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise
die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder
Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können
beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten
Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit
den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen,
wie beispielsweise Cellulasen oder Lipasen, kann vorteilhaft sein.
Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche
Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger
Proteine oder Varianten eignen.
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Die
erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in an sich
bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen
oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes
Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt
nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium
geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen
eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen
vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber
auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein
entnommen werden kann.
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Erfindungsgemäße
Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße
Proteasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist
daher ein Verfahren zur Herstellung einer Protease umfassend
- a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen
Wirtszelle
- b) Isolieren der Protease aus dem Kulturmedium oder aus der
Wirtszelle.
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Dieser
Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind
an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen
großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt
von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes,
beispielsweise der erfindungsgemäßen Protease.
Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren
zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease
beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes
dar.
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Fermentationsverfahren,
die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über
eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere
in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die
fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert.
Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl
in der Zelldichte als auch in der Zellmasse bzw. Trockenmasse und/oder
vor allem der Aktivität der interessierenden Protease erreicht
werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass
unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder
durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert
werden.
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Die
hergestellte Protease kann aus dem Fermentationsmedium geerntet
werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber
einer Isolation der Protease aus der Wirtszelle, d. h. einer Produktaufbereitung aus
der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung
von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten
Sekretionsmarkern bzw. -mechanismen und/oder Transportsystemen,
damit die Wirtszellen die Protease in das Fermentationsmedium sezernieren.
Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Protease aus der
Wirtszelle, d. h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse,
erfolgen. Auch hierfür sind verschiedene Verfahren bekannt,
wie Fällung z. B. durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder
die chromatographische Reinigung.
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Alle
vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu
Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße
Proteasen herzustellen.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass es eine erfindungsgemäße Protease wie
vorstehend beschrieben enthält. Bevorzugt ist das Mittel
ein Wasch- oder Reinigungsmittel. Da erfindungsgemäße
Proteasen vorteilhafte Reinigungsleistungen insbesondere an Blut und/oder
Milch und/oder Gras enthaltenden Anschmutzungen aufweisen, sind
die Mittel insbesondere zur Entfernung von solchen Anschmutzungen
geeignet und vorteilhaft.
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Zu
diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch-
bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt
anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab,
in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise
-reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für
Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung
Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise
auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen
oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für
harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik,
Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz
oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet
wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln
beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler,
usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung
zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder
maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel
hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner
zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung
auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit
denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche
in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anläsen hartnäckiger
Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen
Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere
wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit
oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel
werden u. a. die Weichspüler gerechnet.
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Die
erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel,
die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter
Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen
können, können neben einer erfindungsgemäßen
Protease alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen
Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer
Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen
Mittel können insbesondere Buildersubstanzen, oberflächenaktive
Tenside, Bleichmittel auf Basis organischer und/oder anorganischer
Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel,
Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und weitere
Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren
sowie Farb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
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Insbesondere
durch eine Kombination einer erfindungegemäßen
Protease mit einem oder mehreren weiteren Inhaltsstoffen) des Mittels
ist vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungsleistung durch
sich ergebende Synergismen aufweist. Insbesondere durch die Kombination
einer erfindungsgemäßen Protease mit einem der
nachfolgend beschriebenen Tenside und/oder einer der nachfolgend
beschriebenen Buildersubstanzen und/oder einem der nachfolgend beschriebenen
Bleichmittel wird ein solcher Synergismus erreicht.
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Die
erfindungsgemäßen Mittel können ein Tensid
oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside,
nichtionische Tenside und deren Gemische, aber auch kationische,
zwitterionische und amphotere Tenside in Frage kommen.
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Geeignete
nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs-
und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen
oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil
und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Weiterhin
sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte
von N-Alkyl-aminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden,
die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten
entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C-Atomen im Alkylrest
brauchbar.
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Als
nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise
ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise
8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid
(EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear
oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann beziehungsweise
lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so
wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere
sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen
nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, z. B. aus Kokos-, Palm-,
Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro
Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen
gehören beispielsweise C
12-C
14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C
9-C
11-Alkohole mit
7 EO, C
13-C
15-Alkohole
mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C
12-C
18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und
Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C
12-C
14-Alkohol mit 3 EO und C
12-C
18-Alkohol mit 7 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade
stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles
Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können.
Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung
auf (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen
nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr
als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind (Talg-)Fettalkohole
mit 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Insbesondere in
Mitteln für den Einsatz in maschinellen Verfahren werden üblicherweise
extrem schaumarme Verbindungen eingesetzt. Hierzu zählen
vorzugsweise C
12-C
18-Alkylpolyethylenglykolpolypropylenglykolether
mit jeweils bei zu 8 Mol Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten
im Molekül. Man kann aber auch andere bekannt schaumarme
nichtionische Tenside verwenden, wie zum Beispiel C
12-C
18-Alkylpolyethylenglykol-polybutylenglykolether
mit jeweils bis zu 8 Mol Ethylenoxid- und Butylenoxideinheiten im
Molekül sowie endgruppenverschlossene Alkylpolyalkylenglykolmischether.
Besonders bevorzugt sind auch die hydroxylgruppenhaltigen alkoxylierten
Alkohole, wie sie in der europäischen Patentanmeldung
EP 0 300 305 beschrieben
sind, sogenannte Hydroxymischether. Zu den nichtionischen Tensiden
zählen auch Alkylglykoside der allgemeinen Formel RO(G)
x eingesetzt werden, in der R einen primären
geradkettigen oder methylverzweigten, insbesondere in 2-Stellung
methylverzweigten aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise
12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G für eine Glykoseeinheit
mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht.
Der Oligomerisierungsgrad x, der die Verteilung von Monoglykosiden
und Oligoglykosiden angibt, ist eine beliebige Zahl – die
als analytisch zu bestimmende Größe auch gebrochene
Werte annehmen kann – zwischen 1 und 10; vorzugsweise liegt
x bei 1,2 bis 1,4. Ebenfalls geeignet sind Polyhydroxyfettsäureamide
der Formel (III), in der R
1CO für
einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R
2 für Wasserstoff, einen Alkyl-
oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für
einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen
und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht:
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Vorzugsweise
leiten sich die Polyhydroxyfettsäureamide von reduzierenden
Zuckern mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere von der Glucose
ab. Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören
auch Verbindungen der Formel (IV),
in der
R
3 für einen linearen oder verzweigten
Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R
4 für einen linearen, verzweigten
oder cyclischen Alkylenrest oder einen Arylenrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen
und R
5 für einen linearen, verzweigten
oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest
mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C
1-C
4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind,
und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest, dessen
Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist,
oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte
Derivate dieses Restes steht. [Z] wird auch hier vorzugsweise durch
reduktive Aminierung eines Zuckers wie Glucose, Fructose, Maltose,
Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose erhalten. Die N-Alkoxy-
oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können dann beispielsweise
durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestem in Gegenwart eines
Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt
werden. Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer
Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder
in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden, insbesondere
zusammen mit alkoxylierten Fettalkoholen und/oder Alkylglykosiden,
eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte
oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester,
vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere
Fettsäuremethylester. Auch nichtionische Tenside vom Typ
der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid
und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide
können geeignet sein. Die Menge dieser nichtionischen Tenside
beträgt vorzugsweise nicht mehr als die der ethoxylierten
Fettalkohole, insbesondere nicht mehr als die Hälfte davon.
Als weitere Tenside kommen sogenannte Gemini-Tenside in Betracht.
Hierunter werden im Allgemeinen solche Verbindungen verstanden,
die zwei hydrophile Gruppen pro Molekül besitzen. Diese
Gruppen sind in der Regel durch einen sogenannten ”Spacer” voneinander
getrennt. Dieser Spacer ist in der Regel eine Kohlenstoffkette,
die lang genug sein sollte, dass die hydrophilen Gruppen einen ausreichenden
Abstand haben, damit sie unabhängig voneinander agieren
können. Derartige Tenside zeichnen sich im Allgemeinen durch
eine ungewöhnlich geringe kritische Micellkonzentration
und die Fähigkeit, die Oberflächenspannung des
Wassers stark zu reduzieren, aus. In Ausnahmefällen werden
unter dem Ausdruck Gemini-Tenside nicht nur derartig ”dimere”,
sondern auch entsprechend ”trimere” Tenside verstanden.
Geeignete Gemini-Tenside sind beispielsweise sulfatierte Hydroxymischether
oder Dimeralkohol-bis- und Trimeralkohol-tris-sulfate und -ethersulfate.
Endgruppenverschlossene dimere und trimere Mischether zeichnen sich
insbesondere durch ihre Bi- und Multifunktionalität aus.
So besitzen die genannten endgruppenverschlossenen Tenside gute
Netzeigenschaften und sind dabei schaumarm, so dass sie sich insbesondere
für den Einsatz in maschinellen Wasch- oder Reinigungsverfahren
eignen. Eingesetzt werden können aber auch Gemini-Polyhydroxyfettsäureamide
oder Poly-Polyhydroxyfettsäureamide. Geeignet sind auch
die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid
ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C
7-C
21-Alkohole, wie 2-Methylverzweigte C
9-C
11-Alkohole mit
im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C
12-C
18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO. Zu den bevorzugten
Aniontensiden gehören auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure,
die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester
bezeichnet werden, und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure
mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten
Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C
8- bis C
18-Fettalkoholreste
oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate
enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen
ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside
darstellen. Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste
sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung
ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich,
Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen
in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen. Als weitere
anionische Tenside kommen Fettsäure-Derivate von Aminosäuren,
beispielsweise von N-Methyltaurin (Tauride) und/oder von N-Methylglycin
(Sarkoside) in Betracht. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Sarkoside
beziehungsweise die Sarkosinate und hier vor allem Sarkosinate von
höheren und gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten
Fettsäuren wie Oleylsarkosinat. Als weitere anionische
Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind insbesondere gesättigte
Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure,
Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure,
hydrierten Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere
aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-,
Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Zusammen mit diesen Seifen oder als Ersatzmittel für Seifen
können auch die bekannten Alkenylbemsteinsäuresalze
eingesetzt werden.
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Die
anionischen Tenside, einschließlich der Seifen, können
in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche
Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen.
Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium-
oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.
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Tenside
sind in erfindungsgemäßen Mitteln in Mengenanteilen
von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-%
bis 30 Gew.-%, enthalten.
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Ein
erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise
mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen,
organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasserlöslichen
organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren,
insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere
und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycindiessigsäure,
Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure
sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren,
insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetrakis(methylenphosphonsäure)
und 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxyverbindungen
wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, insbesondere
die durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen
zugänglichen Polycarboxylate, polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren,
Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe
Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität
einpolymerisiert enthalten können. Die relative Molekülmasse
der Homopolymeren ungesättiger Carbonsäuren liegt
im allgemeinen zwischen 3 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen
2 000 und 200 000, vorzugsweise 30 000 bis 120 000, jeweils bezogen
auf freie Säure. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure-Maleinsäure-Copolymer
weist eine relative Molekülmasse von 30 000 bis 100 000
auf. Handelsübliche Produkte sind zum Beispiel Sokalan® CP 5, CP 10 und PA 30 der Firma
BASF. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser
Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure
mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propy len
und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50
Gew.-% beträgt. Als wasserlösliche organische
Buildersubstanzen können auch Terpolymere eingesetzt werden,
die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder
deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem
veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. Das erste
saure Monomer beziehungsweise dessen Salz leitet sich von einer
monoethylenisch ungesättigten C3-C8-Carbonsäure und vorzugsweise von
einer C3-C4-Monocarbonsäure,
insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. Das zweite saure
Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C4-C8-Dicarbonsäure, wobei
Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat
einer Allylsulfonsäure, die in 2-Stellung mit einem Alkyl-
oder Arylrest substituiert ist, sein. Derartige Polymere weisen
im Allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000
und 200 000 auf. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die
als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze
beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Die organischen Buildersubstanzen
können, insbesondere zur Herstellung flüssiger
Mittel, in Form wäßriger Lösungen, vorzugsweise
in Form 30- bis 50-gewichtsprozentiger wäßriger
Lösungen eingesetzt werden. Alle genannten Säuren
werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze,
insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.
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Derartige
organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls
in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise
von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten
Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen,
insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen
Mitteln eingesetzt.
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Als
wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere
Alkalisilikate, Alkalicarbonate und Alkaliphosphate, die in Form
ihrer alkalischen, neutralen oder sauren Natrium- oder Kaliumsalze
vorliegen können, in Betracht. Beispiele hierfür
sind Trinatriumphosphat, Tetranatriumdiphosphat, Dinatriumdihydrogendiphosphat,
Pentanatriumtriphosphat, sogenanntes Natriumhexametaphosphat, oligomeres
Trinatriumphosphat mit Oligomerisierungsgraden von 5 bis 1000, insbesondere
5 bis 50, sowie die entsprechenden Kaliumsalze beziehungsweise Gemische
aus Natrium- und Kaliumsalzen. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare
anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline
oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%,
vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen
Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Unter
diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität,
insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, allein oder in Mischungen,
beispielsweise in Form eines Co-Kristallisats aus den Zeolithen
A und X (Vegobond
® AX, ein Handelsprodukt
der Condea Augusts S. p. A.), bevorzugt. Mengen nahe der genannten
Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln
eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen
mit einer Korngröße über 30 μm
auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen
mit einer Größe unter 10 μm. Ihr Calcium bindevermögen,
das nach den Angaben der deutschen Patentschrift
DE 24 12 837 bestimmt werden kann,
liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm.
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Geeignete
Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte
Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im
Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in
den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe
brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis
von Alkalioxid zu SiO2 unter 0,95, insbesondere
von 1:1,1 bis 1:12 auf und können amorph oder kristallin
vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere
die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis
Na2O:SiO2 von 1:2
bis 1:2,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch
mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise
kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na2SixO2x+1·yH2O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul,
eine Zahl von 1,9 bis 22, insbesondere 1,9 bis 4 und y eine Zahl
von 0 bis 33 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4
sind. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen
x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt.
Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilikate
(Na2Si2O5·yH2O)
bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch
wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen
Formel, in der x eine Zahl von 1,9 bis 2,1 bedeutet, können
in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer
Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul
von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden
kann. Kristalline Natrumsilikate mit einem Modul im Bereich von
1,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Kristalline
schichtförmige Silikate der oben angegebenen Formel (I)
werden von der Fa. Clariant GmbH unter dem Handelsnamen Na-SKS vertrieben,
z. B. Na-SKS-1 (Na2Si22O45·xH2O, Kenyait),
Na-SKS-2 (Na2Si14O29x·H2O,
Magadiit), Na-SKS-3 (Na2Si8O,7·xH2O) oder Na-SKS-4 (Na2Si4O9·xH2O, Makatit). Von diesen eignen sich vor
allem Na-SKS-5 (α-Na2Si2O5), Na-SKS-7 (β-Na2Si2O5, Natrosilit),
Na-SKS-9 (NaHSi2O5·3H2O), Na-SKS-10 (NaHSi2O5·3H2O,
Kanemit), Na-SKS-11 (t-Na2Si2O5) und Na-SKS-13 (NaHSi2O5), insbesondere aber Na-SKS-6 (δ-Na2Si2O5).
In einer bevorzugten Ausgestaltung erfindungsgemäßer
Mittel setzt man ein granulares Compound aus kristallinem Schichtsilikat
und Citrat, aus kristallinem Schichtsilikat und oben genannter (co-)polymerer
Polycarbonsäure, oder aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat
ein, wie es beispielsweise unter dem Namen Nabion® 15
im Handel erhältlich ist.
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Buildersubstanzen
sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise
in Mengen bis zu 75 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 50 enthalten.
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Als
für den Einsatz in erfindungsgemäßen
Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere
organische Persäuren beziehungsweise persaure Salze organischer
Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure
oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoff- Peroxid
und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische
Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat
wie Caroat gehören, in Betracht. Sofern feste Persauerstoffverbindungen
eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern
oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter
Weise umhüllt sein können. Falls ein erfindungsgemäßes
Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in
Mengen von vorzugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-%
bis 30 Gew.-%, vorhanden. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren
wie beispielsweise von Phosphonaten, Borsten beziehungsweise Metaboraten
und Metasilikaten sowie Magnesiumsalzen wie Magnesiumsulfat kann
zweckdienlich sein.
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Als
Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen
aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis
10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte
Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind
Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl
und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind
mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin
(TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin
(DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril
(TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte
Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat
(n- bzw. iso-NOBS), Carbonsäureanhydride, insbesondere
Phthalsäureanhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere
Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran
und Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise
deren beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate,
insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose
und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes
Glucamin und Gluconolacton, und/oder N-acylierte Lactame, beispielsweise
N Benzoylcaprolactam. Die hydrophil substituierten Acylacetale und
die Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch Kombinationen
konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden.
Derartige Bleichaktivatoren können, insbesondere bei Anwesenheit
obengenannter Wasserstoffperoxid-liefernder Bleichmittel, im üblichen
Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%,
insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel,
enthalten sein, fehlen bei Einsatz von Percarbonsäure als
alleinigem Bleichmittel jedoch vorzugsweise ganz.
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Zusätzlich
zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können
auch Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze
beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe als sogenannte
Bleichkatalysatoren enthalten sein.
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Zu
den in den erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere
wenn sie in flüssiger oder pastöser Form vorliegen,
neben Wasser verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören
Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol
und tert.-Butanol, Diole mit 2 bis 4 C-Atomen, insbesondere Ethylenglykol
und Propylenglykol, sowie deren Gemische und die aus den genannten
Verbindungsklassen ableitbaren Ether. Derartige wassermischbare
Lösungsmittel sind in den erfindungsgemäßen
Mitteln vorzugsweise in Mengen nicht über 30 Gew.-%, insbesondere
von 6 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorhanden.
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Zur
Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung
der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts
können die erfindungsgemäßen Mittel system-
und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure,
Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure,
Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure
und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren,
insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium-
oder Alkalihydroxide, enthalten. Derartige pH-Regulatoren sind in
den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise
nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%,
enthalten.
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Vergrauungsinhibitoren
haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz
in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche
Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke,
Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren
der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern
der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche,
saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck
geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate
verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden
Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose,
Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose,
Methylhydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren
Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen
auf die Mittel, eingesetzt.
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Erfindungsgemäße
Textilwaschmittel können als optische Aufheller beispielsweise
Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise
deren Alkalimetallsalze enthalten, obgleich sie für den
Einsatz als Colorwaschmittel vorzugsweise frei von optischen Aufhellern
sind. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'-disulfonsäure
oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe
eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe
oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können
Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein,
zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls,
4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls.
Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können
verwendet werden.
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Insbesondere
beim Einsatz in maschinellen Verfahren kann es von Vorteil sein,
den Mitteln übliche Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren
eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer
Herkunft, die einen hohen Anteil an C18-C24-Fettsäuren aufweisen. Geeignete
nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane
und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure
sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische
mit silanierter Kieselsäure oder Bisfettsäurealkylendiamiden.
Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren
verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen.
Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder
Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser
lösliche beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz
gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und
Bistearylethylendiamid bevorzugt.
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Die
zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter
denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur,
pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Verhältnisse oder
mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige
Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche Temperaturen
für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 10°C über
40°C und 60°C bis hin zu 95° bei maschinellen
Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Vorzugsweise werden die
Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt, insbesondere
derart, dass sich Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung
ergeben. Besonders bevorzugt sind Synergien, die in einem Temperaturbereich
zwischen 10°C und 60°C vorhanden sind, insbesondere
in einem Temperaturbereich von 10°C bis 50°C,
von 10°C bis 40°C, von 10°C bis 30°C,
von 15°C bis 30°C von 10°C bis 25°C,
von 15°C bis 25°C und ganz besonders bevorzugt
bei 20°C.
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Die
Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet
keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel
durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei Enzyme
und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie
zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat
zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer
Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere
im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein einen Extrusionschritt
aufweisendes Verfahren bevorzugt.
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Zur
Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform,
die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig und insbesondere
aus einer Schicht oder aus mehreren, insbesondere aus zwei Schichten
bestehen können, geht man vorzugsweise derart vor, dass
man alle Bestandteile – gegebenenfalls je einer Schicht – in
einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher
Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen,
mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100
kN, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN verpreßt. Insbesondere
bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens
eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei
Preßkräften zwischen 5 und 20 kN, insbesondere
bei 10 bis 15 kN durchgeführt. Man erhält so problemlos
bruchfeste und dennoch unter Anwendungsbedingungen ausreichend schnell
lösliche Tabletten mit Bruch- und Biegefestigkeiten von
normalerweise 100 bis 200 N, bevorzugt jedoch über 150
N. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht
von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform
der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein,
wobei auch Zwischenformen möglich sind. Ecken und Kanten
sind vorteilhafterweise abgerundet. Runde Tabletten weisen vorzugsweise
einen Durchmesser von 30 mm bis 40 mm auf. Insbesondere die Größe
von eckig oder quaderförmig gestalteten Tabletten, welche überwiegend über
die Dosiervorrichtung beispielsweise der Geschirrspülmaschine
eingebracht werden, ist abhängig von der Geometrie und
dem Volumen dieser Dosiervorrichtung. Beispielhaft bevorzugte Ausführungsformen
weisen eine Grundfläche von (20 bis 30 mm) × (34
bis 40 mm), insbesondere von 26 × 36 mm oder von 24 × 38
mm auf.
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Flüssige
beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße
Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden
Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der
Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen
automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Wasch-
oder Reinigungsmittel stellen demnach einen eigenen Erfindungsgegenstand
dar. Alle Verfahren, mit denen ein Wasch- oder Reinigungsmittel,
wie es in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, erhalten werden
kann, werden in den Schutzbereich dieses Erfindungsgegenstandes
eingeschlossen.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält
ein erfindungsgemäßes Mittel die Protease in einer
Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg
bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und
ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des
Mittels. Ferner kann die in dem Mittel enthaltene Protease, und/oder
weitere Inhaltsstoffe des Mittels, mit einer bei Raumtemperatur
oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen
Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen
des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine
solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet,
dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit
von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz
umhüllt ist. Weiterhin kann auch das Wasch- oder Reinigungsmittel
selbst in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen
Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch
oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird.
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In
weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Mittel
dadurch gekennzeichnet, dass es
- (a) in fester
Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit
einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere
500 g/l bis 900 g/l, oder
- (b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt,
und/oder
- (c) als Einkomponentensystem vorliegt, oder
- (d) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.
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Diese
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle
festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen
oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer
Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können
sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das
Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere
mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere
500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen
des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten
oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig,
gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in
Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels
oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen
Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Weiterhin
kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel
bestehen bevorzugt aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch
aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in
mehrere Komponenten aufgeteilt.
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Erfindungsgemäße
Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich
eine Protease enthalten. Alternativ können sie auch weitere
hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die
Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration
enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit
Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen,
wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke
etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt
einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen
Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können,
insbesondere eine insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase,
Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, β-Glucosidase,
Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase,
sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip
natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen
Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und
Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung,
die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden.
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Erfindungsgemäße
Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 × 10–8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen
auf aktives Protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%,
weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von
0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-%
in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei
jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen
vorliegen kann. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter
Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure;
2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A.
G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177
(1948), S. 751–766) bestimmt werden. Die Proteaseaktivität
in derartigen Mitteln kann wiederum nach einer in Tenside,
Band 7 (1970), S. 125–132 beschriebenen Methode
ermittelt werden.
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Bei
dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme muss zwischen
proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden
werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien
Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht.
Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob
dieselben Proteinmengen – als Maß für
den Ertrag der fermentativen Produktion – zu vergleichbaren
Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse
von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität)
auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu
empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften
verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität
durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen
werden kann.
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Besonders
bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung
des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch-
oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder
Flecken. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte
hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen
oder Flecken, d. h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen
Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig.
Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen
Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren
Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
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Einen
eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen
Wasch- oder Reinigungsmittels zur Entfernung von Anschmutzungen,
insbesondere von proteasesensitiven Anschmutzungen, auf Textilien
oder harten Oberflächen, d. h. zur Reinigung von Textilien
oder von harten Oberflächen, dar.
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Denn
erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere
auf Grund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften der enthaltenen
Protease, vorteilhaft dazu verwendet werden, um von Textilien oder
von harten Oberflächen entsprechende Verunreinigungen zu
beseitigen. Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes
stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung
von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder
die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren
dar.
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Alle
Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen,
die für erfindungsgemäße Wasch- oder
Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand
anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf
die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis,
dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße
Verwendung gilt. In bevorzugten Ausführungsformen dieser
Verwendung werden die betreffenden Wasch- oder Reinigungsmittel
daher nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen
bereitgestellt.
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Einen
weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von
Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens
in einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes
Mittel verwendet wird. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien
oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet,
dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes
Mittel angewendet ist.
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Hierunter
fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle
Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was
beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt
sind.
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Verfahren
zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch
aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive
Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit
abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise
mit einem Waschmittel oder einer Lösung bzw. Verdünnung
dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für
Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien,
insbesondere von harten Oberflächen. Alle denkbaren Wasch-
oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der
Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen
Wasch- oder Reinigungsmittels bereichert werden und stellen dann
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle
Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen,
die für erfindungsgemäße Wasch- oder
Reinigungsmittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar.
Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung
an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung
auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen
Verfahren gilt.
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Einen
weiteren Gegenstand der Erfindung stellen Verfahren zur Reinigung
von Textilien oder harten Oberflächen dar, die dadurch
gekennzeichnet sind, dass in mindestens einem Verfahrensschritt
eine erfindungsgemäße Protease katalytisch aktiv
ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis
4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt
von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg
bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist. Alle Sachverhalte, Gegenstände
und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße
Proteasen bzw. sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch
auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser
Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender
Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für
die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
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Da
erfindungsgemäße Proteasen natürlicherweise
bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese
auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen
wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner
und/oder der einziger Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen,
dass gewünschtenfalls als einzige reinigungsaktive Komponente
eine solche Protease mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird,
bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt
eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes
dar.
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Alternative
Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen
auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege
dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße
Protease aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe,
Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt,
und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
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Es
kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien
zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung,
oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener
Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben
beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige
Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen
um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien
mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder
Seide.
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Erfindungsgemäße
Enzyme sind entsprechend der vorstehenden Ausführungen
vorteilhaft in erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere
Wasch- und Reinigungsmitteln, und Verfahren, insbesondere Wasch- und
Reinigungsverfahren, einsetzbar. Sie können also dazu verwendet
werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige
Verunreinigungen zu beseitigen.
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Einen
weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher die Verwendung einer
erfindungsgemäßen Protease, wie sie vorstehend
beschreiben wurde zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.
Bevorzugt wird die Protease in einer Menge von 40 μg bis
4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt
von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg
bis 1 g pro Anwendung eingesetzt. Alle Sachverhalte, Gegenstände
und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße
Proteasen bzw. sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch
auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser
Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender
Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für
die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung
werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme
im Rahmen eines erfindungsgemäßen Mittels, vorzugsweise
eines erfindungsgemäßen Wasch- beziehungsweise
Reinigungsmittels, bereitgestellt.
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Eine
weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt
die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease
zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Wasch-
oder Reinigungsmitteln dar.
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Denn
Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln können
durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonsten
eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ebenfalls
ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es wie oben beschrieben
möglich, dass durch Proteolyse eine andere Komponente erst
aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen
Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt. Ein anderes Beispiel
für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente
zum Schutz oder zur Kontrolle ihrer Aktivität in einem
Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird.
Erfindungsgemäße Proteasen können somit
zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet
werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln.
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Ferner
stellen auch folgende Verwendungen Ausführungsformen der
vorliegenden Erfindung dar:
- – Die
Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur
Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten
in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten
auf Geweben;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Protease zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege
und hierunter bevorzugt
- – die entsprechende Verwendung für Textilrohstoffe,
Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz
besonders für solche mit Wolle oder Seide.
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Die
vorliegende Erfindung wird auch in Form von solchen eine erfindungsgemäße
Protease enthaltenden Mitteln verwirklicht, bei denen es sich um
Kosmetika handelt. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und
pflegenden Mitteln für menschliche Haut oder Haar verstanden,
insbesondere reinigende Mittel. Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozess
der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle. Dementsprechend
werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln
verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen
zu unterstützen. Wie vorstehend ausführlich erläutert
können erfindungsgemäße Proteasen weiterentwickelt
werden, beispielsweise über Aminosäuresubstitutionen
und/oder weitere Mutationen. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße
Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch
Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer
Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in
Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt
sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben,
beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger
stabilisiert und/oder durch Substitutionen an hochallergenen Positionen
verändert oder derivatisiert sind, so dass sie für
den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen.
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Dementsprechend
werden auch entsprechende kosmetische Reinigungs- und Pflegeverfahren
und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen
Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere
in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen,
oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten
werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel,
beziehungsweise zu dessen Herstellung ist eingeschlossen.
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Neben
dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln und Kosmetika sind im
Stand der Technik zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten von
Proteasaen, insbesondere Subtilasen etabliert. Einen Überblick
hierüber bietet beispielsweise das Handbuch „Industrial
enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New
York, 1998. All diese Techniken können durch erfindungsgemäße ße
bereichert werden. Hierzu gehören insbesondere folgende
Einsatzgebiete:
- – die Verwendung einer
erfindungsgemäßen Protease zur biochemischen Analyse
oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen;
- – darunter bevorzugt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung
im Rahmen einer Peptid-Sequenzanalyse;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Protease zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen
oder biologischen Wertstoffen;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Protease zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen
chemischen Verbindungen;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Protease zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere
zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders zur Behandlung
von Leder;
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Protease zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere
zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten;
und
- – die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Protease zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.
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Beispiele
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Alle
molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie
sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook
und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual",
Cold Spring Harbour Laborstory Press, New York, 1989, oder
vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme
und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen
Hersteller eingesetzt.
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Beispiel 1
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Klonierug der neuen Serinprotease
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Das
proteolytisch aktive Bakterium (Bacillus halodurans) wurde in Medium
(10 g/l Glucose, 5 g/l Polypepton, 5 g/l Hefeextrakt, 1 g/l K2HPO4, 0,2g/l MgSO4·7H2O,
50 g/l NaCl, 8 g/l Na2CO3,
pH 10,0) kultiviert. Die Gesamt-DNA dieses Bakteriums wurde nach
Standardmethoden präpariert, mit dem Restriktionsenzym
Sau 3A behandelt und in einen Bacillusvektor (Derivat des pBC16; Bernhard
et al. (1978), J. Bacteriol., Band 133 (2), S. 897 ff.)
kloniert. Dieser Vektor wurde in den Proteasenegativen Wirtsstamm
Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura und Doi (1984), J. Bacteriol.,
Band 160 (1), S. 442–444) transformiert.
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Die
Transformanden wurden zunächst auf DM3-Medium regeneriert
und dann auf milchpulverhaltige Agarplatten (TBY-Skimmilk-Platten;
1,5% Agar, 0,1% K2HPO4,
0,5% Hefeextrakt, 1% Peilton, 1% Milchpulver, 0,02% MgSO4·7H2O,
0,4% Na2CO3, pH
10) überimpft und bei 30°C inkubiert. Proteolytisch
aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert.
Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt,
dessen Plasmid (Vektor) isoliert und das in diesem Vektor enthaltene
Genfragment (Insert) nach Standardmethoden sequenziert.
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Das
Insert enthält einen offenen Leserahmen von ca. 1,2 kb,
dessen DNA-Sequenz für eine Protease vom Subtilisin-Typ
codiert. Die Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert und in den E.
coli Vektor pUC19 kloniert. Die für die Protease codierende
Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID NO. 1 angegeben.
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Beispiel 2: Ermittlung der Reinigungsleistung
bei Einsatz in einem handelsüblichen pulverförmigen
Waschmittel
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Für
dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt.
Es wurden folgende Anschmutzung und Textilien verwendet:
- A:
- Gras auf Baumwolle:
Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma Eidgenössische
Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St.
Gallen, Schweiz
- B:
- Erdnuss Öl-Pigment/Tusche
auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 erhältlich von
CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- C:
- Schokoladenmilch/Ruß auf
Baumwolle: Produkt Nr. C-03 erhältlich von CFT (Center
For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
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Mit
diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf
ihre Reinigungsleistung hin untersucht. Dafür wurden die
Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von
20°C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels
pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von
16° deutscher Härte gewaschen.
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Als
Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender
Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10% lineares
Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1,5% C12-C18-Fettalkoholsulfat
(Natrium-Salz), 2,0% C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20% Natriumcarbonat,
6,5% Natriumhydrogencarbonat, 4,0% amorphes Natriumdisilikat, 17%
Natriumcarbonatperoxohydrat, 4,0% TAED, 3,0% Polyacrylat, 1,0% Carboxymethylcellulose,
1,0% Phosphonat, 25% Natriumsulfat, Rest: Schauminhibitoren, optischer
Aufheller, Duftstoffe. Die Waschmittel-Basis-Rezeptur wurde für
die verschiedenen Versuchsreihen aktivitätsgleich (5 PE/ml
Endkonzentration) mit folgenden Proteasen versetzt: erfindungsgemäße
Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ
ID NO. 3 (Ansatz 1) und eine leistungsverbesserte Variante der alkalischen
Protease aus Bacillus lentus, wie sie in
WO 97/21760 offenabrt ist (Ansatz
2).
-
Nach
dem Waschen wurde der Weißheitsgrad der gewaschenen Textilien
gemessen. Die Messung erfolgte an einem Spektrometer Minolta CM508d
(Lichtart D65, 10°). Das Gerät wurde zuvor mit
einem mitgelieferten Weißstandard kalibriert. Die erhaltenen
Ergebnisse sind die Differenzremissionen zwischen einem Waschvorgang
mit einem Waschmittel enthaltend eine Protease und einem parallel
durchgeführten Kontrollwaschgang mit einem Waschmittel
ohne Protease. STABW bezeichnet die Standardabweichung bei parallel durchgeführten
Versuchsansätzen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle 1 zusammengestellt und erlauben einen unmittelbaren Rückschluss
auf den Beitrag des jeweils enthaltenen Enzyms zur Reinigungsleistung
des verwendeten Mittels. Tabelle 1: Waschergebnisse mit einem pulverförmigen
Waschmittel bei 20°C
Anschmutzung | Ansatz
1 | STABW | Ansatz
2 | STABW |
A | 3,1 | 0,7 | 1,9 | 0,1 |
B | 9,3 | 0,2 | 8,4 | 0,4 |
C | 8,3 | 0,2 | 8,1 | 0,8 |
-
Es
wird deutlich, dass die erfindungsgemäße Protease
bereits in ihrer Wildtyp-Form eine bessere Reinigungsleistung zeigt
im Vergleich mit einer für Waschmittel etablierten und
leistungsverbesserten Proteasevariante gemäß Ansatz
2, die kein Wildtyp-Molekül ist.
-
Beispiel 3: Ermittlung der Reinigungsleistung
bei Einsatz in einem handelsüblichen flüssigen
Waschmittel
-
Für
dieses Beispiel wurden standardisiert verschmutze Textilien eingesetzt.
Es wurden folgende Anschmutzung und Textilien verwendet:
- A:
- Gras auf Baumwolle:
Produkt Nr. 164 erhältlich von der Firma Eidgenössische
Material- und Prüfanstalt (EMPA) Testmaterialien AG, St.
Gallen, Schweiz,
- B:
- Erdnuss Öl-Pigment/Tusche
auf Polyester/Baumwolle: Produkt Nr. PC-10 erhältlich von
CFT (Center For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- C:
- Schokoladenmilch/Ruß auf
Baumwolle: Produkt Nr. C-03 erhältlich von CFT (Center
For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
- D:
- Blut-Milch/Tusche
auf Baumwolle: Produkt Nr. C-05 erhältlich von CFT (Center
For Testmaterials) B. V. Vlaardingen, Niederlande
-
Mit
diesem Testmaterial wurden verschiedene Waschmittelrezepturen auf
ihre Reinigungsleistung hin untersucht. Dafür wurden die
Ansätze für 60 Minuten bei einer Temperatur von
20°C gewaschen. Die Dosierung lag bei 5,9 g des Waschmittels
pro Liter Waschflotte. Es wurde mit Stadtwasser mit einer Wasserhärte von
16° deutscher Härte gewaschen.
-
Als
Kontroll-Waschmittel diente eine Waschmittel-Basis-Rezeptur folgender
Zusammensetzung (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3–0,5%
Xanthan Gum, 0,2–0,4% Anti-Schaummittel, 6–7%
Glycerin, 0,3–0,5% Ethanol, 4–7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat),
24–28% nichtionische Tenside, 1% Borsäure, 1-2% Natriumcitrat
(Dihydrat), 2–4% Soda, 14–16% Kokosnuss-Fettsäuren,
0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1,1-di-phosphonsäure)), 0–0,4%
PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0–0,05% optischer Aufheller,
0–0,001% Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Die
Waschmittel-Basis-Rezeptur wurde für die verschiedenen
Versuchsreihen aktivitätsgleich (10 PE/ml Endkonzentration)
mit folgenden Proteasen versetzt: erfindungsgemäße
Protease umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ
ID NO. 3 (Ansatz 1) sowie Protease gemäß
WO 03/057713 (Ansatz 2).
Die weitere Versuchsdurchführung und -auswertung erfolgte
wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2: Waschergebnisse mit einem flüssigen
Waschmittel bei 20°C
Anschmutzung | Ansatz
1 | STABW | Ansatz
2 | STABW |
A | 4,4 | 0,0 | 2,0 | 0,1 |
B | 8,2 | 0,2 | 5,1 | 0,8 |
C | 6,9 | 0,4 | 4,6 | 0,7 |
D | 15,9 | 3,3 | 9,7 | 1,9 |
-
Es
wird wiederum deutlich, dass eine erfindungsgemäße
Protease bereits in ihrer Wildtyp-Form, insbesondere in einem Flüssigwaschmittel
bei 20°C, eine bessere Reinigungsleistung zeigt im Vergleich
mit einer weiteren für Waschmittel etablierten leistungsverbesserten
Proteasevaritante gemäß Ansatz 2.
-
Beschreibung der Figur:
-
1:
Sequenzvergleich (Alignment) der erfindungsgemäßen
reifen Protease (SEQ ID NO. 3) mit Proteasen aus dem Stand der Technik,
erstellt mit dem Programm Vector NTI® Suite
10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien,
USA) unter Standardparametern. Dann bedeuten:
- 1:
- Erfindungsgemäße
Protease gemäß SEQ ID NO. 3 (reifes Enzym)
- 2:
- AprM Serinprotease
aus Bacillus sp. (UNIPROT-Datenbankeintrag Q45521; vgl. SEQ ID NO.
5)
- 3:
- Protease aus Bacillus
lentus DSM 5483 (reifes Enzym, vgl. auch WO 92/21760 A1 bzw. SEQ
ID NO. 4)
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 97/21760
A1 [0025]
- - WO 03/057713 [0029, 0150]
- - EP 0300305 [0093]
- - DE 2412837 [0099]
- - WO 97/21760 [0145]
- - WO 92/21760 A1 [0152]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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