DE102009021784B4

DE102009021784B4 - Vorrichtung und Verfahren zur Passage von fluiden Medien

Info

Publication number: DE102009021784B4
Application number: DE102009021784.3A
Authority: DE
Inventors: Dipl.-Ing. Huchler Roland; Dr. Fritsche Michael; Dipl.-Ing. Malthan Dirk
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2017-12-21
Anticipated expiration: 2029-05-19
Also published as: DE102009021784A1

Abstract

Vorrichtung zur Passage von Zellmaterial aufweisender Flüssigkeit aus mindestens einem Kulturgefäß (30) und/oder Vorratsbehältnis (5, 6, 7) in mindestens eine Tochterflasche (31), enthaltend eine Überdruckquelle (1) oder Unterdruckquelle (1) und druckdichte Verbindungsleitungen, zum Transport der Flüssigkeit durch eine Druckdifferenz entweder mittels Unterdruck oder mittels Überdruck, und spezifisch so ausgebildet, dass die ganze Passage der Flüssigkeit durch diese Druckdifferenz in einer Richtung bis zum Endpunkt der Verteilung in die Tochterflasche (31) ohne Wechsel zwischen Unterdruck und Überdruck durchführbar ist, wobei die Druckdifferenz nicht Null ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Transport von einer Flüssigkeit oder mehreren Flüssigkeiten von mindestens einem Kulturgefäß und/oder mindestens einem Vorratsbehältnis in mindestens ein weiteres Vorratsbehältnis mit einer Überdruckquelle oder Unterdruckquelle und mit druckdichten Verbindungsleitungen, wobei mindestens eine Flüssigkeit Zellmaterial aufweist und wobei der Transport der einen Flüssigkeit oder der mehreren Flüssigkeiten durch eine Druckdifferenz erfolgt. Bevorzugtes Anwendungsgebiet ist die Produktion von biologischem Zellmaterial.
Insbesondere auf dem Gebiet der biopharmazeutischen Industrie beispielsweise bei der Entwicklung von Medikamenten, der Produktion von künstlichen Geweben z. B. für Testsysteme oder im Rahmen der regenerativen Medizin stellt die Produktion von biologischen Zellen einen zentralen Prozessschritt dar.
Die Produktion von Zellen beruht auf einer gezielten Vermehrung der Zellen in geeigneten Kulturgefäßen. Hierbei werden die Zellen unter Nährmedium in einer geeigneten klimatisierten Umgebung (z. B. Brutschrank, Inkubator) gehalten. Während der Inkubation wird regelmäßig ein Medienwechsel durchgeführt, der das verbrauchte Nährmedium gegen frisches Nährmedium ersetzt. Außerdem wird regelmäßig eine sogenannte Passage durchgeführt, bei der die zu einem Zellrasen zusammengewachsenen Zellen wieder vereinzelt werden und in neue Kulturgefäße überführt werden.
Insbesondere für den Prozessschritt der Passage sind eine Reihe von Handhabungsschritten notwendig, bei der Teilmengen der Kulturflüssigkeiten sowie exakt definierte Volumina von Nährmedien, enzymatischen Lösungen und Hilfsflüssigkeiten, sowie insbesondere die Zellen selbst, transportiert und exakt verteilt werden müssen. An den Prozess des Transportvorgangs werden sehr hohe Anforderungen gestellt:

– Sterilität: Alle Handhabungsschritte müssen absolut steril durchgeführt werden, so dass eine Kontamination des Zellmaterials ausgeschlossen wird.
– Volumen-Präzision: Die Flüssigkeitsmengen sind bis auf wenige Volumenprozent genau zu dosieren, da ansonsten Testergebnisse verfälscht werden können.
– Zeit-Präzision: Während der Passage wirken teilweise enzymatische Prozesse, die eine exakte Verweildauer voraussetzen.
– Flexibilität: Unterschiedliche Zellen und unterschiedliche Aufgaben erfordern unterschiedliche Volumina unterschiedlicher Nährmedien, enzymatischer Lösungen und Hilfsflüssigkeiten.
– Zeitaufwand: Da die Passage und der Medienwechsel regelmäßig durchgeführt werden müssen, sollte der Zeitaufwand möglichst gering sein.

Alle bisherigen Lösungsansätze für automatisierte Systeme beruhen auf einer technischen Nachbildung der manuellen Prozesse durch automatisierte Geräte und Anlagen. Dabei wird der Arm und die Hand des Laborpersonals durch eine geeignete Roboterkinematik ersetzt. Der eigentliche Schritt der Flüssigkeitshandhabung erfolgt dabei durch Aufnahme und Abgabe von Flüssigkeiten in den jeweiligen Prozessschritten. D. h. die verschiedenen Flüssigkeiten werden angesogen und wieder ausgespritzt oder durch einen Druckausgleich wieder abgegeben. Durch diese Art des Flüssigkeitstransports und der dadurch involvierten Zellbehandlung werden die Zellen extremem Stress unterzogen. Die entsprechenden Gesamtsysteme (”Pipettierroboter”) sind für Routineaufgaben in den entsprechenden Labors etabliert. Der für die Durchführung einer kompletten Zellkulturpassage notwendige Geräteaufwand ist extrem hoch. Dies ist durch die Vielzahl an unterschiedlichen Flüssigkeiten und der Handhabungsschritte sowie durch die hohen Anforderungen an die Sterilität bedingt. Demzufolge konnten sie sich auf automatisierte Verfahren zur Durchführung von Zellkulturpassagen im Labormaßstab bisher nicht durchsetzen.
Aufgrund des hohen Zellbedarfs, den hohen Ansprüchen an die Sterilität und im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit und damit auch auf die Qualität der Zellen besteht in der Zellkultur, dem Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin der Bedarf bereits etablierte Laborprozesse unter Reinraumbedingungen zu automatisieren. Durch die Automatisierung erhofft man sich neben der höheren Ausbeute und Prozesssicherheit vor allem auch eine standardisierte und verbesserte Möglichkeit der Prozessoptimierung- und Kontrolle und Ergebnisreproduzierbarkeit. Die Schwierigkeiten bestehen darin, die Vielzahl an unterschiedlichen manuellen Schritten der Zellkultivierung durch leicht automatisierende Handhabungen zu ersetzen. Eine besondere Herausforderung stellt dabei das Problem der Passage dar.
Die EP 1 011 752 B1 ( DE 698 27 019 T1 ) offenbart ein Gerät und Verfahren zum Transport biologischer Zellen in einer sterilen Umgebung.
Die technische Aufgabe ist die Konstruktion einer automatisierten Zellpassage, die den hohen Ansprüchen an Sterilität, die Reproduzierbarkeit und damit auch an die Qualität der Zellen gerecht wird.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch eine Vorrichtung und ein Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen. Vorteilhafte Ausführungen und Weiterbildungen werden durch die abhängigen Ansprüche angegeben und lassen sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den Ausführungsbeispielen entnehmen. Der erfindungsgemäße Lösungsweg basiert darauf, dass die verschiedenen Flüssigkeiten nicht mehr aufgenommen und abgegeben werden. Stattdessen werden die einfache Flüssigkeiten und gegebenenfalls die Flüssigkeiten mit dem Zellmaterial nur noch in eine Richtung gedrückt. Insbesondere das Verteilen der Zellen wird dermaßen realisiert, dass ein Druckwechsel überflüssig gemacht wird. Dadurch wird Stress auf die Zellen minimiert. Der zentrale Punkt ist die Aufrechterhaltung nur noch einer Art der Belastung auf die Flüssigkeiten und damit auch auf das Zellmaterial. Es wird der ganze Passageprozess entweder mittels Überdruck oder mittels Unterdruck auf die Flüssigkeiten und damit auch auf das Zellmaterial realisiert. Ein doppelter Zugang in das Gefäß macht dies möglich. Das bedeutet, dass je nach Druckrichtung die Flüssigkeiten und somit auch das Zellmaterial entweder in die eine oder die andere Richtung bis zum Endpunkt der Verteilung in die Tochterflaschen gedrückt wird. Der bisherige Ansatz, mittels Wechsel zwischen Unterdruck und Überdruck Flüssigkeit aufzunehmen und anschließend zu verteilen, was auch durch einen Druckausgleich geschehen kann, ist nicht mehr notwendig.
Die eingesetzten kinematischen und fluidischen Komponenten sind Ventile und Verfahrachsen. Dabei ist die Verschaltung der Ventile flexibel bzw. modular. Der aufzubringende Druck ist in der Höhe irrelevant, muss im gesamten System entweder als Überdruck oder Unterdruck vorliegen.
Der Vorteil der Erfindung besteht unter anderem darin, dass auf die Zwischenspeicherung der Flüssigkeit verzichtet wird. Die Wegfall dieses Zwischenschritts stellt einen beträchtlichen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik dar. Zusätzlich wird der Stress auf das in der Flüssigkeit befindliche Zellmaterial im Vergleich zu Stand der Technik geschont.
Als Überdruckquellen sind beispielsweise Pumpen jeder Art und Gasflaschen geeignet. Beispiele für Unterdruckquellen sind Vakuumpumpen.
Als Pufferlösung bietet sich vorteilhafterweise Weise eine Phosphat-gepufferte Salzlösung an. Sie hat keine schädliche Wirkung auf Zellmaterial und wird unter anderem zum Reinigen der Zellkulturen genutzt. Für die Zellvereinzelung und Ablösung können Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Trypsin entweder einzeln oder auch in Kombination genutzt werden. Proteolytische Enzyme sind gut zur Vereinzelung von Zellmaterial geeignet.
Das Nährmedium ist vorzugsweise flüssig (Bouillon, Nährbouillon, Nährlösung). Als Nährmedien sind MEM und RPMI vorteilhaft. Als Reinigungsmedien für Leitungen, Gefäße und Ventile nach dem Passageprozess haben sich insbesondere Ethanol, Propanol, Peressigsäure und Wasserstoffperoxid bewährt.
Ohne Einschränkung der Allgemeinheit wird die Erfindung anhand von Beispielen nachfolgend näher beschrieben. Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform wird durch Drücken von Flüssigkeit kombiniert mit Luft im Überdruck im Bereich ca. 0,5 bis ca. 2,0 bar durch den kompletten Fluidikaufbau realisiert. Dies erfordert parallel eine präzise Abdichtung der Luftauslassporen in den Probegefäßen und eine zugehörige mechanische Kinematik. Die Öffnungen der Kulturgefäße 30, Vorratsbehältnisse 5, 6, 7 und Tochterflaschen 31 sind vorteilhafter Weise durch Septen verschlossen, damit eine Kontaminierung während des Transports der Flüssigkeiten ausgeschlossen ist. Die Ventile 11–26 sind auf einem Manifold montiert und über druckdichte Verbindungsleitungen aus Teflon miteinander und mit den diversen Behältnissen und Anschlüssen verbunden. Maximal sollten die Verbindungsleitungen einen Durchmesser von 1/8'' aufweisen. Die Steuerung der Leitungswege, der Druckverhältnisse, der Bewegung der Einzelnadel 33 zum Dosieren in die Tochterflaschen 31 geschieht über einen Microcontroller; vorteilhaft mit 16 Bit. Die Anzahl der Tochterflaschen 31 kann zwischen 1–10 variiert werden. Ein elektrooptischer Sensor detektiert die Anzahl der Tochterflaschen 31.
Vor dem Transport der Flüssigkeit mit dem Zellmaterial werden die Tochterflaschen 31 mit Nährmedium befüllt. Dabei werden die Ventile 11–26 dermaßen durch den Microcontroller gesteuert, dass durch den mit Druckluft erzeugten Überdruck das Nährmedium in die Tochterflaschen 31 gedrückt wird. Durch das eingegebene Volumen wird das Nährmedium zu gleichen Anteilen, gesteuert durch den Microcontroller, mittels einer Einzelnadel 33 in die Tochterflaschen 31 dosiert.
Die Beaufschlagung und Entnahme der Flüssigkeit mit dem Zellmaterial aus der Kulturflasche 30 geschieht mittels einer Handhabungsnadel 34, die idealerweise als Doppelnadel ausgeführt ist. Vor dem Transport der Flüssigkeit mit dem Zellmaterial in die Tochterflaschen 31 wird durch Zugabe der Enzymlösung – beispielsweise eine Trypsinlösung oder EDTA oder einer Kombination aus beidem – die Zellen abgelöst und vereinzelt. Eine Klopfvorrichtung 32 kann dabei unterstützend wirken. Nach Durchströmen der druckdichten Verbindungsleitungen, wird die Flüssigkeit mit dem Zellmaterial mittels der Einzelnadel 33 in die Tochterflaschen 31 mit dem Nährmedium gedrückt. Auch dabei wird der Leitungsweg und das gleichmäßige Aufteilen der Flüssigkeit mit dem Zellmaterial auf die Tochterflaschen 31 durch den Microcontroller gesteuert. Zur abschließenden Reinigung werden durch den Fluidikaufbau Reinigungsmittel wie Wasserstoffperoxid, Propanol, Ethanol oder Peressigsäure gedrückt.
Offenbart wird besonders eine Vorrichtung zum Transport von einer Flüssigkeit oder mehreren Flüssigkeiten von mindestens einem Kulturgefäß (30) und/oder mindestens einem Vorratsbehältnis (5, 6, 7) in mindestens ein weiteres Vorratsbehältnis (31) mit einer Überdruckquelle (1) oder Unterdruckquelle (1) und mit druckdichten Verbindungsleitungen, wobei mindestens eine Flüssigkeit Zellmaterial aufweist und wobei der Transport der einen Flüssigkeit oder der mehreren Flüssigkeiten durch eine Druckdifferenz erfolgt, dadurch gekennzeichnet, dass der Transport der einen Flüssigkeit oder der mehreren Flüssigkeiten durch Druckdifferenz ohne Wechsel zwischen Überdruck und Unterdruck oder zwischen Unterdruck und Überdruck erfolgt und die Druckdifferenz nicht Null ist.
Diese ist besonders dadurch gekennzeichnet, dass das Zellmaterial tierischen Ursprungs ist.
Diese ist alternativ oder zusätzlich besonders dadurch gekennzeichnet, dass die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten eine Pufferlösung ist.
Diese ist alternativ oder zusätzlich besonders dadurch gekennzeichnet, dass die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten ein Nährmedium ist.
Diese ist alternativ oder zusätzlich besonders dadurch gekennzeichnet, dass die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten eine Enzymlösung ist.
Diese ist alternativ oder zusätzlich besonders dadurch gekennzeichnet, dass der angelegte Druck auf die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten durch eine Beaufschlagung mit einer weiteren Flüssigkeit erreicht wird.
Diese ist alternativ oder zusätzlich besonders dadurch gekennzeichnet, dass der angelegte Druck auf die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten durch eine Beaufschlagung mit einem Gas erreicht wird, besonders dadurch, dass das Gas Druckluft ist, alternativ oder zusätzlich dadurch, dass das Gas keimfrei ist, alternativ oder zusätzlich dadurch, dass das Gas Luft ist, welches mit Kohlendioxid oder Sauerstoff oder eine Mischung beider angereichert ist, alternativ oder zusätzlich dadurch, dass der angelegte Druck auf die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten mit einem Gas und einer Flüssigkeit erreicht wird.
Die Vorrichtung ist alternativ oder zusätzlich dadurch gekennzeichnet, dass die Ventile durch einen Microcontroller gesteuert werden. Sie ist alternativ oder zusätzlich auch dadurch gekennzeichnet, dass die Druckdifferenz durch einen Microcontroller gesteuert wird.
Die Vorrichtung ist alternativ oder zusätzlich dadurch gekennzeichnet, dass der Transport der einen Flüssigkeit oder der mehreren Flüssigkeiten vollständig oder teilweise durch Kavitäten in einer gemeinsamen Trägerplatte stattfindet.
Die Vorrichtung ist alternativ oder zusätzlich dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung mindestens ein Ventil (11–26) aufweist.
Offenbart wird besonders auch ein Verfahren zum Bewegen von einer Flüssigkeit oder mehreren Flüssigkeiten, wobei mindestens eine Flüssigkeit Zellmaterial aufweist und wobei der Transport der einen Flüssigkeit oder der mehreren Flüssigkeiten durch eine Druckdifferenz erfolgt, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Flüssigkeit oder die mehreren Flüssigkeiten durch Druckdifferenz ohne Wechsel zwischen Überdruck und Unterdruck oder zwischen Unterdruck und Überdruck transportiert wird oder werden und die Druckdifferenz nicht Null ist.
Dieses Verfahren ist besonders dadurch gekennzeichnet, dass der Transport der einen Flüssigkeit oder der mehreren Flüssigkeiten vollständig oder teilweise durch Kavitäten in einer gemeinsamen Trägerplatte stattfindet.
Alternativ oder zusätzlich ist es besonders dadurch gekennzeichnet, dass im Verfahren mindestens ein Ventil (11–26) genutzt wird.
Bezugszeichenliste

1: Druckluft
2: Druckminderer
3: Filter
4: Druckluft
5: Pufferlösung
6: Enzymlösung
7: Nährmedium
8: Reinigungsflüssigkeit
9: Entlüftung
10: Filter
11–26: Ventile
27: Filter
28: Entlüftung
29: Abfall
30: Kulturflasche
31: Tochterflaschen
32: Klopfvorrichtung
33: Einzelnadel
34: Handhabungsnadel

Claims

Vorrichtung zur Passage von Zellmaterial aufweisender Flüssigkeit aus mindestens einem Kulturgefäß (30) und/oder Vorratsbehältnis (5, 6, 7) in mindestens eine Tochterflasche (31), enthaltend eine Überdruckquelle (1) oder Unterdruckquelle (1) und druckdichte Verbindungsleitungen, zum Transport der Flüssigkeit durch eine Druckdifferenz entweder mittels Unterdruck oder mittels Überdruck, und spezifisch so ausgebildet, dass die ganze Passage der Flüssigkeit durch diese Druckdifferenz in einer Richtung bis zum Endpunkt der Verteilung in die Tochterflasche (31) ohne Wechsel zwischen Unterdruck und Überdruck durchführbar ist, wobei die Druckdifferenz nicht Null ist.
Verfahren zur Passage von Flüssigkeit, die Zellmaterial aufweist, wobei der Transport der Flüssigkeit durch eine Druckdifferenz erfolgt, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit durch Druckdifferenz ohne Wechsel zwischen Überdruck und Unterdruck oder zwischen Unterdruck und Überdruck transportiert wird und die Druckdifferenz nicht Null ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der angelegte Druck auf die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten durch eine Beaufschlagung mit einer weiteren Flüssigkeit erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der angelegte Druck auf die eine Flüssigkeit oder die eine der mehreren Flüssigkeiten durch eine Beaufschlagung mit einem Gas erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gas Luft ist, welches mit Kohlendioxid oder Sauerstoff oder einer Mischung beider angereichert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Druckdifferenz durch einen Microcontroller gesteuert wird.