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Die
vorliegende Erfindung bezieht auf ein neues Verfahren zur Bestimmung
der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Ausstrom-
oder Efflux-Weges eines menschlichen oder tierischen Subjektes,
und auf die Verwendung eines Gallensäure-Derivats bei einem
derartigen Verfahren.
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MRP2/Mrp2
(ABCC2/Abcc2), auch bekannt als Multidrug Resistance Protein 2,
ist ein Mitglied der ABCC-Teilfamilie der ATP-Binding-Cassette-Transporter-Überfamilie.
Ein Überblick über die ATP-Binding-Cassette-Transporter-Überfamilie
ist in ”The Human ATP-Binding Cassette (ABC) Transporter-Superfamily” von Michael
Dean vom National Cancer Institute, Frederick, Maryland angegeben,
veröffentlicht von dem US-National Center for Biotechnology
Information. MRP2 wird auf der apikalen Domäne von Hepatozyten,
Enterozyten des proximalen Dünndarms und proximalen Nierentubuluszellen
sowie im Gehirn und der Plazenta exprimiert.
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MRP2
ist klinisch wichtig, weil es die Pharmakokinetik vieler Medikamente
moduliert, und seine Expression und Aktivität ebenfalls
durch einen Bereich von Medikamenten und Krankheiten geändert
wird. Beispielsweise wird die Expression von MRP2 in Patienten mit
Lebererkrankungen geändert, wie z. B. der primären
biliären Zirrhose, der Cholestase (beispielsweise einer
medikamentös bedingten Cholestase), Fettlebererkrankung,
alkoholbedingter Lebererkrankung, einer primären Sklerose-Cholangitis
oder einer Virushepatitis. In den Nieren wirkt MRP2 bei der renalen
Entfernung von Substraten aus dem Blut in den Urin. In der Leber
ist MRP2 ein wesentlicher Exporter von organischen Anionen von der
Leber in die Galle. MRP2 kann sulfatierte und glukuronosierte Gallensalze
sowie andere organische Anionen und/oder ihre Konjugate mit Glukuronat, Glutathion
und Sulfat transportieren [Gerk et al J Pharmakol Exp Ther
2002 Aug; 302(2): 407–415]. Zusätzlich zum
Transport von Konjugaten transportiert MRP2 einen Bereich von Molekülen,
unter Einschluss von chemotherapeutischen Krebsmtteln, Urikosurika,
Antibiotika, Leukotrienen, Glutathionen, Toxinen und Schwermetallen.
MRP2 spielt weiterhin eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von
Bilirubin-Glucuronosiden von Hepatozyten in die Galle. Das MRP2-Gen
ist in Patienten mit dem Dubin-Johnson-Syndrom mutiert, einer Fehlfunktion des
organischen Ionentransports beim Menschen. Das Fehlen von funktionellen
MRP2 in der kanalikulären Membran ruft eine konjugierte
Hyperbilirubinämie hervor, wie sie bei der erblichen Dubin-Johnson-Syndrom-Erkrankung
beobachtet wird.
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Der
Verlust der MRP2-Funktion wird in vielen Fällen durch die
Aufwärtsregelung anderer Membran-Transporter gut toleriert
und kompensiert, insbesondere des Multidrug Resistance Proteins
3 (MRP3, auch als ABCC3 bekannt) in dem basolateralen Element von
Hepatozyten [Nies et al Pflugers Arch (2007) 453: 643–659].
Genauso wie MRP2 ist MRP3 ein Mitglied der ABCC-Teilfamilie der
ATP-Binding-Cassette-Transporter-Überfamilie. MRP3 ist
im Darm, der Niere und der Leber vorhanden.
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Die
Kenntnis des Zustandes der MRP2/3-Aktivität einer Person
könnte daher zur Anzeige eines weiten Bereiches von möglichen
Konditionierungen verwendet werden.
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Es
ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Feststellung der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Ausstrom- oder Efflux-Weges eines Menschen oder Tieres zu schaffen.
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Wir
haben in unerwarteter Weise herausgefunden, dass MRP2 der am stärksten
herausragende Transporter ist, der für die Gallenexkretion
von Cholyl-Lysyl-Fluorescin (CLF) verantwortlich ist, was auch als Fluorescin-Lisikol
bekannt ist, und dass MRP3 für die basolaterale Exkretion
von CLF verantwortlich ist. Entsprechend können CLF und
andere Gallensäuren, die einen ähnlichen metabolischen/Ausscheidungs-Pfad haben,
zur Feststellung der funktionellen Aktivität der MRP2/3-Ausfluss-Bahn
verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist insbesondere im Hinblick auf die Veröffentlichung
von Mills et al in Biochim Biophys Acta 1991 Dec 6; 1115(2):
151–156 überraschend. Sie zeigten, dass
in Ratten die Gallen-Exkretionsrate von CLF nach einer Halsveneninjektion
eine ähnliche Kinetik zu der von Glycocholat hat, von dessen Transport
bekannt ist, dass er durch ABCB11 vermittelt wird. ABCB11 ist ein
Mitglied der ABCB-Teilfamilie der ATP-Binding Cassette (ABC)-Transporter-Überfamilie.
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Weitere
Anhaltspunkte die zu der Annahme führten, dass CLF über
ABCB11 transportiert wird, wurden von Baxter et al. [Biochim
Biophys Acta 1995 Jun 6; 1256(3): 374–380] geliefert. Baxter
et al. verabreichten Glycocholat und CLF an isolierte getrennte
Rattenlebern unter Recycling-Bedingungen und beobachteten, dass
CLF in der Lage war, die Phospholipid- und Cholesterol-Abgabe in
einer ähnlichen Weise wie die zu vergrößern,
die für Glycocholat festgestellt wurde. Es wurde in der
gleichen Studie gezeigt, dass Rattenleber eine wesentlich größere
Fähigkeit zur Übertragung von Glycocholat (GC)
aus dem Perfusat zur Galle hat, als CLF, und dass gleichzeitig die
Vergrößerung der Phospholipid- und Cholesterol-Abgabe
bei CLF verglichen mit GC kleiner war.
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In
einer späteren Studie [Mills et al in J Hepatol
1999 Oct; 31(4): 678–684], untersuchten Mills
et al ABCC2/Abcc2 als möglichen Transporter für
CLF. Sie schlossen jedoch aus einer Studie mit normalen und TR (Abcc2-Mangel-)Wistar-Ratten,
dass Abcc2 nicht an der Gallenexkretion von CLF beteiligt war, und
zwar auf der Grundlage der Beobachtung einer ähnlichen
Gallenexkretion in beiden Stämmen.
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Zusammenfassend
ist festzustellen, dass vor den vorliegenden Untersuchungen die
Gesamtheit des Standes der Technik hinsichtlich dieses Gegenstandes
einhellig geschlossen hat, dass CLF von der Leber in die Galle durch
den ABCB11/Abcb11-Weg transportiert wurde, und nicht über
den ABCC2/Abcc2-Weg, und es wurde daher nicht als ein Mittel zur
Verwendung in einem Verfahren für die Bestimmung der MRP2/3-Aktivität in
Betracht gezogen.
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Gemäß der
vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der funktionellen
Aktivität des MRP2 und/oder MRP3-Efflux- oder Ausstrom-Weges
eines menschlichen oder tierischen Subjekts geschaffen, wobei das
Verfahren Folgendes umfasst:
- (i) Bestimmen
des Pegels eines Gallensäure-Derivats im Blut des Menschen
oder Tieres zu einem vorgegebenen Zeitintervall nach der Einführung
einer Menge des Gallensäure-Derivats in das Subjekt, und
- (ii) Verwenden der im Schritt (i) gewonnenen Bestimmung zur
Anzeige der funktionellen Aktivität des MRP2 und/oder MRP3-Ausfluss-Pfades
des Subjektes.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Durchführung
einer Prognose oder Diagnose an einem menschlichen oder tierischen
Subjekt geschaffen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
Bestimmen
des Pegels der Gallensäure-Derivats in dem Blut des menschlichen
oder tierischen Subjekts zu einem vorgegebenen Zeitintervall nach
der Einführung einer Menge des Gallensäure-Derivats
in das Subjekt,
dadurch gekennzeichnet, dass die gewonnene
Bestimmung zur Anzeige der funktionellen Aktivität des
MRP2- und/oder MRP3-Efflux-Weges des Subjektes verwendet wird.
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Der
Ausdruck ”Bestimmung” in diesem Kontext hat eine
breite Bedeutung. Er schließt sowohl eine quantitative
Analyse zum Quantifizieren des Pegels oder der Menge des Gallensäure-Derivats
in der Probe als auch die qualitative Analyse zur Feststellung,
ob diese Gallensäure vorliegt oder nicht, und falls passend,
das Ausmaß ein, in dem dieses vorhanden ist. Somit ist
es für dieses Verfahren nicht wesentlich, dass ein numerischer
Wert für den Pegel des Gallensäure-Derivats in
dem Blut gewonnen wird. Beispielsweise kann die Feststellung, dass
der Pegel des Gallensäure-Derivats in dem Blut innerhalb
eines bestimmten Bereiches liegt, dazu verwendet werden, die funktionelle
Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Weges abzuschätzen.
Durch Analogie werden den Worten ”bestimmen” und ”Bestimmung” eine
gleiche Bedeutung gegeben.
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Die
Bestimmung des Pegels der Gallensäure kann so ausgeführt
werden, wie dies in der europäischen Patentschrift
EP 1 003 458 beschrieben
ist (wobei der gesamte Text hiervon durch diese Bezugnahme eingeführt
wird und einen integralen Teil dieser Offenbarung bilden soll).
Diese Patentschrift beschreibt die Verwendung von gefärbten
oder fluoreszierenden Gallensäure-Derivaten in menschlichen
Subjekten zur Feststellung der Leberfunktion des Subjektes. Ein
Beispiel eines derartigen Gallensäure-Derivats, das in
der
EP 1 003 458 angegeben
ist, ist das fluoreszierende Fluoreszein-Derivat Cholyl-Lysyl-Fluorescin
(CLF). Die
EP 1 003 458 beschreibt
die Verwendung von CLF als möglichen Leberfunktionstest.
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Der
Zweck der Verwendung einer Gallensäure-Derivat-Verbindung,
wie z. B. CLF, in einem Leberfunktionstest bestand darin, eine Verbindung
zu schaffen, die von Hepatozyten in die Galle in der gleichen Weise transportiert
würden, wie natürliche Gallensäuren.
Gallensäuren werden in die Leberzellen durch zumindest zwei
Transportsysteme aufgenommen: ein Na+-abhängiges System,
das Na+/Taurocholat-Cotransporter-Polypeptid (auch bekannt als NTCP)
und ein Na+-unabhängiges System, das Transporter in der
organischen Anion-Transporter-Familie beinhaltet (bekannt als die
OATP-Familie). Gallensäuren werden in die Gallenkanäle durch
die Gallensalz-Exportpumpe exkretiert, die auch als BSEP oder ABCB11
bekannt ist, was auf der Gallenkanal-Seite der Leberzellen exprimiert.
Wie dies vorstehend beschrieben wurde, wurde vor der vorliegenden
Erfindung angenommen, dass CLF in die Galle über ABCB11
exkretiert wird.
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Statt
dessen haben wir festgestellt, dass das vorstehende Verfahren zur
Anzeige der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Efflux- oder Ausstrom-Weges eines Subjektes verwendet werden
kann. Die MRP2/MRP3-Expression und Aktivität werden durch
einen weiten Bereich von Arzneimitteln und Erkrankungszuständen
geändert, so dass die Kenntnis der funktionellen Aktivität
des MRP2- und/oder MRP3-Ausscheidungs-Pfades des Subjektes zur Anzeige
eines weiten Bereiches von Bedingungen unter Einschluss der vorstehend
erwähnten verwendet werden kann. Dieses Verfahren ist daher
bei der Diagnose oder Prognose eines Bereiches von Bedingungen nützlich,
die aus denen ausgewählt sind, bei denen die MRP2- und/oder MRP3-Expression
modifiziert wird, beispielsweise aufwärts geregelt oder
abwärts geregelt wird, oder bei denen das MRP2- und/oder
MRP3-Gen mutiert ist. Vorzugsweise wird das Verfahren der vorliegenden
Erfindung dazu verwendet, einen Zustand oder eine Erkrankung zu
diagnostizieren oder prognostizieren, wie sie hier beschrieben ist.
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Die
Ausdrücke ”funktionelle Aktivität des
MRP2- und/oder MRP3-Efflux-Weges” oder ”funktionelle
Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Ausscheidungs-Weges”,
wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf die Transportaktivität
des MRP2-Transporter-Proteins und/oder des MRP3-Transporter-Proteins
beim Transport von Substraten über Zellularmembranen hinweg.
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Die
Bestimmung des Pegels des Gallensäure-Derivats in dem Blut
kann auf eine Anzahl von Arten verarbeitet oder analysiert werden.
Der Pegel des Gallensäure-Derivats in dem Blut kann mit
zumindest einer Standardmessung verglichen werden. Ähnliche
Ergebnisse, die zu unterschiedlichen vorgegebenen Zeitintervallen
gewonnen werden, können mit derartigen Standardmessungen
verglichen werden.
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Es
ist jedoch nicht erforderlich, einen Vergleich mit einem Standard
durchzuführen. Es ist möglich, die gewonnene Bestimmung
dazu zu verwenden, eine direkte Anzeige der funktionellen Aktivität
des MRP2- und/oder MRP3-Ausscheidungs-Weges eines Subjektes zu erzielen,
ohne dass die Notwendigkeit irgendeines Vergleichs mit Ergebnissen
von einem gesunden Subjekt oder einem Subjekt mit einer bekannten MRP2-/MRP3-Funktion
besteht.
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Vorzugsweise
umfasst das Verfahren einen weiteren Schritt der Verwendung der
Bestimmung des Pegels des Gallensäure-Derivats zur Gewinnung
eines numerischen Wertes, wobei der numerische Wert die funktionelle
Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Efflux-Weges des Subjektes
anzeigt. Ein einziger Zahlenwert, der die funktionelle Aktivität
des MRP2- und/oder MRP3-Efflux-Weges des Subjektes anzeigt, liefert
in vorteilhafter Weise eine brauchbare Maßnahme für Ärzte,
Funktionen eines Patienten abzuschätzen, die durch die
MRP2/3-Aktivität beeinflusst werden, wie z. B. eine Leberfunktion,
Nierenfunktion oder Darmfunktion. Ein derartiger Zahlenwert kann
durch Verwendung der Bestimmung des Pegels des Gallensäure-Derivats
zur Erzielung eines direkten Maßes der funktionellen Aktivität
des MRP2- und/oder MRP3-Efflux-Weges des Subjektes gewonnen werden.
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Vorzugsweise
wird die erreichte Bestimmung mit zumindest einem Standard verglichen,
um die funktionelle Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Efflux-Weges
des Subjektes anzuzeigen.
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Vorzugsweise
wird der Pegel des Gallensäure-Derivats in dem Blut des
Subjektes zu zwei oder mehr vorgegebenen Zeitintervallen nach der
Einführung einer Menge des Gallensäure-Derivats
in das Subjekt bestimmt. Dadurch, dass eine Serie von Blutproben über
die Zeit genommen wird, kann eine Plasma-Ausscheidungs-Kurve konstruiert
und mit Plasma-Ausscheidungs-Kurven verglichen werden, die von Subjekten
gewonnen wurden, die eine bekannte MRP2/3-Aktivität haben.
Zwei oder mehr Bestimmungen des Pegels des Gallensäure-Derivats
in dem Blut des Subjektes, die zu unterschiedlichen Zeitintervallen
gewonnen werden, können zur Gewinnung des numerischen Wertes
verwendet werden, der die funktionelle Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Ausscheidungs-Weges des Subjektes anzeigt.
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Wenn
beispielsweise der Pegel des Gallensäure-Derivats in dem
Blut des Subjektes zu zwei oder mehr vorgegebenen Zeitintervallen
bestimmt wird, kann die zu einem ersten Zeitintervall nach der Verabreichung
gewonnene Bestimmung und die zu einem zweiten Zeitintervall nach
der Verabreichung gewonnene Bestimmung als ein Verhältnis
oder als ein prozentualer Anteil ausgedrückt werden. So
kann ein Verhältnis der Bestimmung nach 30 Minuten oder
nach 60 Minuten als das Verhältnis der Bestimmung nach
10 Minuten ausgedrückt werden. Dieses Verhältnis
ergibt einen Zahlenwert, im Allgemeinen kleiner als 1, der eine
Anzeige der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Weges des Subjektes ergibt.
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Alternativ
kann die Bestimmung zu dem späteren Zeitintervall, beispielsweise
30, 60 oder 90 Minuten, als ein prozentualer Teil der Bestimmung
zu dem früheren Zeitintervall, beispielsweise 10 Minuten,
nach der Verabreichung des Gallensäure-Derivats ausgedrückt
werden. Dieser prozentuale Wert ergibt in gleicher Weise eine Anzeige
der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Weges
des Subjektes.
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Alternativ
kann ein Zahlenwert, der die funktionelle Aktivität des
MRP2/3-Weges eines Subjektes anzeigt, durch Bestimmen der Steigung
einer logarithmisch-linearen Plasma-Ausscheidungskurve gewonnen werden,
die aus den gewonnenen Bestimmungen abgeleitet wird. Alternativ
kann ein Zahlenwert durch Bestimmen der Fläche unter einer
Plasma-Ausscheidungskurve gewonnen werden, die aus den Ergebnissen
abgeleitet ist. Weiterhin kann die Differenz zwischen den Steigungen
einer logarithmisch-linearen Kurve, die aus einer Test-Plasma-Ausscheidungskurve
und einer logarithmisch-linearen Kurve, die von einer Standard-Ausscheidungskurve
abgeleitet wird, berechnet werden, um den Zahlenwert zu liefern,
der die funktionelle Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Weges
anzeigt. In gleicher Weise kann die Differenz zwischen der Fläche
unter der Plasma-Ausscheidungskurve, die von Testergebnissen abgeleitet
wird, und einer Standard-Ausscheidungskurve berechnet werden, um
den Zahlenwert zu liefern.
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Der
Ausdruck ”Standard” in diesem Kontext hat eine
weite Bedeutung. Er soll irgendeine einzelne Messung oder eine Serie
(zwei oder mehr) Messungen umfassen, die von einem menschlichen
oder tierischen Subjekt gewonnen werden. Dies schließt
Messungen ein, die von gesunden Subjekten, Subjekten mit einer bekannten
MRP2/3-Funktion ein, und es kann eine Messung oder Messungen einschließen,
die von dem Subjekt gewonnen werden, dessen MRP2/3-Funktion untersucht
wird. Dies bedeutet, dass wenn man sich mit dem Fortschreiten oder
der Stadienbestimmung einer Krankheit befasst, man Messungen vergleichen
kann, die über die Zeit gewonnen werden, wobei das Subjekt
selbst als Kontrolle wirkt.
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Vorzugsweise
umfasst das Gallensäure-Derivat einen Marker, wie z. B.
eine Farbe, oder eine Fluoreszenz.
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Vorzugsweise
umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt der Lieferung von zumindest
einer Blutprobe, die durch die Leber des Subjektes hindurch gelaufen
ist, wobei diese Probe zu einem vorgegebenen Zeitintervall nach
der Verabreichung des Gallensäure-Derivats an das Subjekt
gesammelt wurde, wobei die Blutprobe oder die Blutproben verarbeitet
werden, um Blutplasma oder Blutserum zu gewinnen. Daher kann ein in-vitro-Verfahren
zur Bestimmung der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Efflux-Weges eines Subjektes geschaffen werden.
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Vorzugsweise
werden die Blutprobe oder die Blutproben durch Zentrifugieren verarbeitet.
Vorzugsweise werden die Blut-Proteine von dem Blutplasma/Blutserum
getrennt.
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Vorzugsweise
wird das Gallensäure-Derivat dem Subjekt intravenös
verabreicht.
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Vorzugsweise
umfasst das Gallensäure-Derivat (a) einen Steroid-Anteil,
der (i) zumindest einen Substituenten, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus einem 3-Hydroxyl-Substituenten, einem 7-Hydroxyl-Substituenten
und einem 12-Hydroxyl-Substituenten besteht und (ii) eine Carboxyl-Gruppe
aufweist, die mit Hilfe einer Amid-Koppelung an einer Seitenkette
des Steroid-Anteils angebracht ist; und (b) einen aktiven Anteil,
der auf die Leber zu richten ist, wobei der aktive Anteil an einem α-Carbon-Atom
bezüglich der Carboxyl-Gruppe angebracht ist.
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Insbesondere
wird bevorzugt, dass das Gallensäure-Derivat die allgemeine
Formel (I):
hat, worin
A aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus α-OH
und β-OH besteht; B aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus α-H und β-H besteht; C aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus -H, α-OH und β-OH
besteht; oder B und C zusammen eine Doppelbindung bilden; D aus
der Gruppe ausgewählt ist, die aus -H, α-OH und β-OH besteht;
E aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H, α-OH
und β-OH besteht; L ein Bindungsanteil ist; J ein eingefärbter
oder fluoreszierender Anteil ist; und n gleich 0 oder 1 ist.
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In
der vorstehenden Formel ist der Bindungsanteil L vorzugsweise an
seinem Ende N-terminiert und an dem eingefärbten oder fluoreszierenden
Anteil J angebracht und ist vorzugsweise -(CH2)nNH, worin n gleich 3 oder 4 ist, -(CH2)4NH-(CH2)3NHC(=NH)NH- oder
-(CH2)2-CH(OH)CH2NH-.
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Alternativ
kann der Anteil -NH-CH(COOH)-L- von S-Adenosylhomocystein, S-Adenosylmethionin, S-Amino-Imadazol-4-Carboxiamid,
Asparagin, Cadaverin, Cystamin, Citrullin, Diaminopimelinsäure,
2,4-Diaminobutylsäure, Cysteamin, Glutamin, 3-Hydroxykynurenin,
Kynurenin, Putrescin oder Negamycin abgeleitet sein. Alternativ
können azidische Aminosäuren anstelle des vorstehenden
verwendet werden, wobei der aktive Anteil J eine Aminogruppe aufweist
und/oder Hydrophob ist.
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In
der vorstehenden Formel ist J ein Fluoreszin, Rhodamin oder ein
anderer fluoreszierender Anteil oder schließt diesen ein.
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Vorzugsweise
beruht der Steroid-Anteil des Gallensäure-Derivats auf
einer Säure, die aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Deoxycholsäure,
Hyodeoxycholsäure, Hyocholsäure, α-, β-,
oder ω-Muricholsäure, Nor-Gallensäuren,
Lithocholsäure, 3β-Hydroxycholenoidsäure,
Ursodeoxycholsäure und Allocholsäure (5α-Cholan-24-OIC-Säure)
besteht.
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Besonders
bevorzugt ist das Gallensäure-Derivat ein Cholyl-Lysyl-Fluoreszin
(CLF) mit der Formel:
oder Salze
hiervon. Vorzugsweise ist das Gallensäure-Derivat ein Trinatrium-Salz.
Vorzugsweise ist das Gallensäure-Derivat ein Cholyl-L-Lysyl-Fluoreszin,
das als Floureszin-Lisicol bekannt ist. Vorzugsweise ist das Gallensäure-Derivat
ein Fluoreszin-Lisicol-Trinatrium-Salz.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung der funktionellen
MRP2- und/oder MRP3-Aktivität, die aus dem vorstehenden
Verfahren gewonnen wird, zur Bestimmung der Leberfunktion eines
menschlichen oder tierischen Subjektes geschaffen.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines Gallensäure-Derivats zur
Bestimmung der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Efflux-Weges eines menschlichen oder tierischen Subjektes geschaffen.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines Gallensäure-Derivats bei
der Diagnose oder Prognose des Dubin-Johnson-Syndroms, der Zirrhose
der Leber, der Cholestase, der Fettlebererkrankung, der Alkohollebererkrankung,
der primären Sklerose-Cholangitis oder der viralen Hepatitis geschaffen.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines Gallensäure-Derivats bei
der Herstellung eines Diagnose- oder Prognose-Mittels zur Verwendung
bei der Diagnose oder Prognose des Dubin-Johnson-Syndroms, der der
Zirrhose der Leber, der Cholestase, der Fettlebererkrankung, der
Alkohollebererkrankung, der primären Sklerose-Cholangitis
oder der viralen Hepatitis geschaffen.
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Gemäß einem
weiteres Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines Gallensäure-Derivats bei
der Bestimmung des Zustandes des Bilirubin-Clearance-Pfades oder
des konjugierten Bilirubin-Clearance-Pfades eines menschlichen oder
tierischen Subjektes geschaffen.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines Gallensäure-Derivats bei
der Herstellung eines diagnostischen oder prognostischen Mittels
zur Bestimmung des Zustandes des Bilirubin-Clearance-Pfades oder
des konjugierten Bilirubin-Clearance-Pfades eines menschlichen oder
tierischen Subjektes geschaffen.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines Gallensäure-Derivats zur
Bestimmung der Nierenfunktion, der Gallenfunktion, der Darmfunktion
oder der Leberfunktion eines menschlichen oder tierischen Subjektes
geschaffen.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird die Verwendung eines Gallensäure-Derivats für
die Herstellung eines Diagnose- oder Prognose-Mittels zur Bestimmung
der Nierenfunktion, der Gallenfunktion, der Darmfunktion oder der
Leberfunktion eines menschlichen oder tierischen Subjektes geschaffen.
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Vorzugsweise
umfasst das Gallensäure-Derivat (a) einen Steroid-Anteil
der (i) zumindest einen Substituenten, der aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus einem 3-Hydroxyl-Substituenten, einem 7-Hydroxyl-Substituenten
und einem 12-Hydroxyl-Substituenten besteht, und (ii) eine Carboxyl-Gruppe
aufweist, die mit Hilfe einer Amid-Koppelung an eine Seitenkette
des Steroid-Anteils angebracht ist, und (b) einen aktiven Anteil,
der auf die Leber zu zielen ist, wobei der aktive Anteil an einem α-Carbon-Atom
bezüglich der Carboxyl-Gruppe angebracht ist.
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Vorzugsweise
ist das Gallensäure-Derivat eine Verbindung der Formel
(I):
worin
A aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus α-OH
und β-OH besteht; B aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus α-H und β-H besteht; C aus der Gruppe
ausgewählt ist, die aus -H, α-OH und β-OH
besteht; oder B und C zusammen eine Doppelbindung bilden; D aus
der Gruppe ausgewählt ist, die aus -H, α-OH und β-OH
besteht; E aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H, α-OH
und β-OH besteht; L ein Bindungsanteil ist; J ein eingefärbter
oder fluoreszierender Anteil ist; und n gleich 0 oder 1 ist.
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Vorzugsweise
schließt J einen Fluoreszein-, Rhodamin oder anderen fluoreszierenden
Anteil ein oder ist dieser.
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Vorzugsweise
ist der Bindungsanteil N-abgeschlossen und an seinem Ende an dem
aktiven Anteil J angebracht, und L ist aus der Gruppe ausgewählt,
die aus Folgendem besteht: -(CH2)nNH, worin n 3 oder 4 ist, -(CH2)4NH-(CH2)3NHC(=NH)NH- und -(CH2)2-CH(OH)CH2NH-.
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Vorzugsweise
ist der Anteil -NH-CH(COOH)-L- in der allgemeinen Formel (I) von
einer Verbindung abgeleitet, die aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus S-Adenosylhomocystein, S-Adenosylmethionin, S-Amino-Imadazol-4-Carboxiamid,
Asparagin, Cadaverin, Cystamin, Citrullin, Diaminopimelsäure,
2,4-Diaminobutylsäure, Cysteamin, Glutamin, 3-Hydroxykynurenin,
Kynurenin, Putrescin und Negamycin besteht.
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Vorzugsweise
beruht der Steroid-Anteil des Gallensäure-Derivats auf
einer Säure, die aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Deoxycholsäure,
Hyodeoxycholsäure, Hyocholsäure, α-, β-,
oder ω-Muricholsäure, Nor-Gallensäuren,
Lithocholsäure, 3β-Hydroxycholenoidsäure,
Ursodeoxycholsäure und Allocholsäure (5α-Cholan-24-OIC-Säure)
besteht.
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Vorzugsweise
ist das Gallensäure-Derivat ein Cholyl-Lysyl-Fluoreszein
(CLF) mit der Formel:
oder Salzen
hiervon. Vorzugsweise ist das Gallensäure-Derivat ein Trinatrium-Salz.
Vorzugsweise ist das Gallensäure-Derivat ein Fluoreszein-Lysycol-Trinatrium-Salz.
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Der
Anmelder hat unerwartet herausgefunden, dass im Gegensatz zu den
Lehren des Standes der Technik MRP2 und MRP3 Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) transportieren. Eine Verbindung dieser Formel kann daher
zur Bestimmung der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Weges eines menschlichen oder tierischen Subjektes verwendet
werden.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können bei der Diagnose oder
Prognose des Dubin-Johnson-Syndroms oder bei der Herstellung eines
diagnostischen oder prognostischen Mittels zur Verwendung bei der
Diagnose oder Prognose des Dubin-Johnson-Syndroms verwendet werden.
Das Dubin-Johnson-Syndrom ist mit Mutationen in dem MRP2-Gen verknüpft.
Entsprechend kann die Bestimmung der Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Weges eines Subjektes Information zur Verwendung bei der Diagnose
oder Prognose bezüglich des Dubin-Johnson-Syndroms liefern.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können weiterhin zur Bestimmung
der Nierenfunktion, der Gallenfunktion, der Darmfunktion oder der
Leberfunktion eines menschlichen oder tierischen Subjektes verwendet werden
oder sie können bei der Herstellung eines Diagnose- oder
Prognose-Mittels zur Bestimmung der Nierenfunktion, Gallenfunktion,
Darmfunktion oder Leberfunktion eines menschlichen oder tierischen
Subjektes verwendet werden. MRP2 wird in der Niere, dem Darm und
der Leber exprimiert, so dass die Bestimmung der Aktivität
des MRP2- und/oder MRP3-Weges eines Subjektes Information zur Verwendung
bei der Bestimmung der Nierenfunktion, Gallenfunktion, Darmfunktion
oder Leberfunktion eines Subjektes liefern kann.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können weiterhin bei der Diagnose
oder Prognose der Leberzirrhose, der Cholestase, der Fettlebererkrankung,
der Alkohollebererkrankung, der primären Sklerose-Cholangitis
oder der Virushepatitis oder bei der Herstellung eines Diagnose-
oder Prognose-Mittels zur Verwendung bei der Diagnose oder Prognose
der Leberzirrhose, Cholestase, Fettlebererkrankung, Alkohollebererkrankung,
primären Sklerose-Cholangitis oder der viralen Hepatitis
verwendet werden.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können weiterhin bei der Bestimmung
des Zustandes des Bilirubin-Clearance-Weges oder des konjugierten
Bilirubin-Clearance-Weges eines menschlichen oder tierischen Subjektes
oder bei der Herstellung eines Diagnose- oder Prognose-Mittels zur
Bestimmung des Zustandes des Bilirubin-Clearance-Weges oder des
konjugierten Bilirubin-Clearance-Weges eines menschlichen oder tierischen
Subjektes verwendet werden.
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Bilirubin
ist ein Abbauprodukt des Häm-Katabolismus. In der Leber
wird Bilirubin mit Glucuronsäure konjugiert und in der
Galle exkretiert. Bilirubin und Konjugierte von Bilirubin unter
Einschluss von Bilirubin-Glucuroniden, wie z. B. Glucuronosyl-Bilirubin,
werden über MRP2 [Jedlitschky et al, Expert Opin
Drug Metab Toxicol 2006 Jun 2(3): 351–66] transportiert.
Vergrößerte Pegel von konjugiertem Bilirubin in
Plasma zeigen eine mögliche Störung des Gallentransportes
von konjugiertem Bilirubin an, so dass Serum-Bilirubin-Pegel bei
der Vorhersage der Sterblichkeit von Lebertransplantations-Kandidaten
nützlich sind.
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Bilirubin
und Bilirubin-Konjugierte werden über den MRP2-Efflux-Weg
transportiert, so dass Bestimmungen der funktionellen Aktivität
des MRP2- und/oder MRP3-Efflux-Weges dazu verwendet werden, die Clearance-Aktivität
von Bilirubin oder konjugiertem Bilirubin zu bestimmen. Die Bestimmung
der Bilirubin- und konjugiertem Bilirubin-Clearance kann eine Anzeige
des Zustandes des Bilirubin-Efflux-Weges geben. Durch Bestimmen
des Zustandes des Bilirubin-Clearance-Weges oder des konjugierten
Bilirubin-Clearance-Weges eines Subjektes kann dies Störungen
bei dem Bilirubin oder konjugiertem Bilirubin-Transport anzeigen.
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Die
Ausdrücke ”Bilirubin-Clearance-Weg” und ”konjugierter
Bilirubin-Clearance-Weg”, wie sie hier verwendet werden,
beziehen sich auf den Transport von Bilirubin/konjugiertem Bilirubin über
Zellmembranen.
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Die
bevorzugten Merkmale dieser Gesichtspunkte sind so, wie dies weiter
oben beschrieben wurde.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Computerprogramm zur
Bestimmung der funktionellen Aktivität des MRP2- und/oder
MRP3-Ausscheidungs-Weges eines menschlichen oder tierischen Subjektes
unter Verwendung der Bestimmung des Pegels eines Gallensäure-Derivats
in dem Blut eines menschlichen oder tierischen Subjektes zu einem
vorgegebenen Zeitintervall nach der Einführung einer Menge
des Gallensäure-Derivats in das Subjekt geschaffen, um
einen numerischen oder Zahlenwert zu gewinnen, wobei der numerische
Wert die funktionelle Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Ausscheidungs-Weges
des Subjektes anzeigt.
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Gemäß einem
weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung
der funktionellen Aktivität des OATP1B3-Aufnahme-Weges
eines menschlichen oder tierischen Subjektes, wobei das Verfahren
Folgendes umfasst:
- (i) Bestimmen des Pegels
eines Gallensäure-Derivats in dem Blut des menschlichen
oder tierischen Subjektes zu einem vorgegebenen Zeitintervall nach
der Einführung einer Menge des Gallensäure-Derivats
in das Subjekt; und
- (ii) Verwenden der im Schritt (i) gewonnenen Bestimmung zur
Anzeige der funktionellen Aktivität des OATP1B3-Aufnahme-Weges
des Subjektes.
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Frühere
Studien zeigten die partielle Natrium-abhängige Aufnahme
von einigen, jedoch nicht allen fluoreszierenden Gallensalzen in
Ratten-Hepatozyten [Maglova LM et al, Hepatology 1995 Aug;
22(2): 637–647]. Zusätzlich wurde die
Aufnahme von Cholyl-Glycyl-Fluoreszin in Ratten-Ntcp-exprimierende
CHO-Zellen, nicht jedoch in Wildtyp-Zellen gezeigt [Boyer
JL et al, Am J Physiol 1994 Mar; 266(3 Pt 1): G382–G387].
Es könnte daher erwartet werden, dass CLF über
NTCP in Hepatozyten aufgenommen werden könnte. Stattdessen
haben wir gefunden, dass CLF in Hepatozyten über OATP1B3
aufgenommen wird, und wir haben gefunden, dass das vorstehende Verfahren
zur Anzeige der funktionellen Aktivität des OATP1B3-Aufnahmeweges
eines Subjektes verwendet werden kann.
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Die
bevorzugten Merkmale dieses Gesichtspunktes sind so, wie dies vorstehend
bezüglich der vorher beschriebenen Gesichtspunkte der Erfindung
beschrieben wurde.
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Die
Erfindung wird nunmehr in Form eines Beispiels unter Bezugnahme
auf die Zeichnungen beschrieben, in denen:
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1A eine
Immunofluoreszenz-Mikrographiedarstellung ist, die die Expression
von Na*/Taurocholat-Kotransporter-Polypeptid (NTCP) in stabil transfizierten
Zellen zeigt. In 1A erscheinen die fluoreszierenden
Teile der Mikrografiedarstellung dunkel und die nicht fluoreszierenden
Teile erscheinen weiß. NTCP ist ein Protein, das die Aufnahme
von Gallensäuren in Leberzellen vermittelt. NTCP wurde
so visualisiert, wie dies in dem nachfolgenden Material- und Methoden-Abschnitt
beschrieben ist.
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1B zeigt
eine kinetische Charakterisierung von CHO-NTCP, bei der die Zellen
mit zunehmenden TC-(Taurocholat-)Konzentrationen für 45
Sekunden bei Vorliegen von Natrium
oder
Kalium
inkubiert
wurden. Natrium-abhängige Aufnahmeraten
wurden
zur Bestimmung der kinetischen Parameter verwendet. Daten stellen
Mittel ± SD von Triplikaten dar. Wenn Fehlerbalken fehlen,
waren sie kleiner als das Symbol.
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2A–2D beziehen
sich auf Aufnahmestudien an CHO-Zellen, die hepatozellulare Aufnahmetransporter
exprimieren; die Daten für 2B–2D stellen
Mittelwerte ± SD dar.
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2A zeigt
Fluoreszenz-Bilder nach der Inkubation von CHO-Transporter-Zellen
mit 1 μmol/L CLF über 5 Minuten. Fluoreszenz-Bilder
(rechte Felder) werden mit Phasenkontrast-Bildern (linke Felder)
komplementiert. In den Fluoreszenz-Bildern (rechte Felder) erscheinen
die fluoreszierenden Teile dunkel, und die nicht fluoreszierenden
Teile erscheinen weiß.
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2B ist
eine grafische Darstellung, die den durch NTCP vermittelten Transport
von CLF bei Vorliegen (schwarze Streifen) und Fehlen von Natrium
(weiße Streifen) für 1 und 5 Minuten zeigt.
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2C ist
eine grafische Darstellung, die den Transport von CLF für
CHO-Zellen (Wildtyp und mit OATP1B1, OATP1B3 und OATP2B1 transfizierte
Zellen) zeigt. Die Zellen wurden mit 1 μmol/L CLF während 1
(weiße Balken) oder 5 Minuten (schwarze Balken) inkubiert.
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2D bezieht
sich auf die Kinetiken des durch OATP1B3 vermittelten CLF-Transports
und zeigt eine grafische Darstellung des CLF-Transports gegenüber
der CLF-Konzentration. Zellen wurden mit zunehmenden Konzentrationen
von CLF über 45 Sekunden inkubiert. Gezeigt sind Aufnahmeraten,
die für eine Null-Sekunden-Bindung korrigiert sind.
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3A–3D beziehen
sich auf die Behinderung der Transportaktivität von hepatozellularen
Aufnahme-Transportern durch CLF. CHO-Zellen, die NTCP, OATP1B1,
OATP1B3 und OATP2B1 exprimieren, wurden mit 0,5 oder 50 μmol/L
CLF inkubiert, und zwar mit den Substraten 2,5 μmol/L TC,
1 μmol/L Estron-3-Sulfat, 10 μmol/L TC bzw. 1 μmol/L
Estron-3-Sulfat. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD von
Triplikat-Bestimmungen dar.
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3 zeigt die Ergebnisse für CHO-Zellen,
die NTCP exprimieren, mit 2,5 μmol/L TC.
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3B zeigt
die Ergebnisse für CHO-Zellen, die OATP1B1 exprimieren,
mit 1 μmol/L Estron-3-Sulfat.
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3C zeigt
die Ergebnisse für CHO-Zellen, die OATP1B3 exprimieren,
mit 10 μmol/L TC.
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3D zeigt
die Ergebnisse für CHO-Zellen, die OATP2B1 exprimieren,
mit 1 μmol/L Estron-3-Sulfat.
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4A zeigt
Westernblots von Membranvesikeln von Sf21-Insektenzellen, die mit
ABCB11, ABCC2, ABCC3 und ABCG2 cDNA enthaltenden Bakulovirus nicht
infiziert und infiziert waren. Die Westernblots zeigen das Vorliegen
von Proteinen ABCB11, ABCC2, ABCC3 und ABCG2 in den jeweiligen infizierten
Sf21-Insektenzellen.
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4B bis 4 zeigen den zeitabhängigen Transport
von CLF in Plasma-Membran-Vesikel vom Wildtyp-Sf21-Zellen (B), Sf21-Zellen,
die ABCB11 exprimieren (C, ABCG2 (D), ABCC2 (E) bzw. ABCC3 (F).
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4G und 4H zeigen
die konzentrationsabhängige Aufnahme von CLF in Sf21-Membran-Vesikel,
die ABCC2 (G) bzw. ABCC3 (H) enthalten.
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5A und 5B zeigen
die Veränderung des DNP-SG- und TC-Transports in ABCC2
(A) und ABCB11 (B)-Protein, die Sf21-Membran-Vesikel enthalten,
durch CLF. Die Werte sind als prozentualer Anteil des maximalen
ATP-abhängigen Transports ausgedrückt. Die Signifikanz
wurde unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests getestet:
*P < 0,05 für
den Transport bei Vorliegen gegenüber dem Fehlen des Inhibitors.
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6 zeigt
die Plasma-Clearance von CLF in Mäusen. Wildtyp, Abcc3-/- und Abcc2-/--Mäuse
erhielten 100 μl an 2 mmol/L CLF durch Injektion in die
Schwanzvene. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurde Blut abgenommen.
Die Daten sind als der mittlere prozentuale Anteil des anfänglichen
CLF-Pegels bei zwei Minuten ausgedrückt. Die Signifikanz
wurde unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests getestet:
*P < 0,05 für
Abcc2-/- gegenüber Wildtyp-Mäusen.
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7A zeigt
das zeitabhängige Auftreten von CLF in der Galle vom Wildtyp,
Abcc3-/- und Abcc2-/--Mäusen.
Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar.
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7B zeigt
die CLF-Pegel im Blut, Urin, Leber und Galle vom Wildtyp, Abcc3-/- und Abcc2-/--Mäusen nach
zwei Stunden. Die Mäuse erhielten 100 μl an 1
mmol/L CLF durch Injektion in die Schwanzvene. Die Daten stellen
den Mittelwert ± SD dar. Plasma-Pegel sind in nmol/L ausgedrückt,
und die Pegel in Urin, in der Leber und in der Galle als prozentualer
Anteil der verabreichten Dosis. Die Signifikanz wurde unter Verwendung
des zweiseitigen Student-t-Tests getestet: *P < 0,05 für Abcc2-/- gegenüber
Wildtyp-Mäusen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD
dar.
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8 bezieht
auf die intestinale Aufnahme von TC und CLF. Das Auftreten von TC
und CLF in der Galle nach der ilealen Verabreichung einer 100 μL-Mischung
von 2 mmol/L TC und CLF in Wildtyp-Mäusen. Die Galle wurde
nach den angegebenen Zeitpunkten gesammelt. Die Daten stellen einen
Mittelwert ± SD dar. Die grafische Darstellung ist eine
Kurve der kumulativen Gallenpegel als prozentualer Anteil der verabreichten Dosis.
Die Signifikanz wurde unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests
getestet: *P < 0,05
für die TC-Aufnahme gegenüber der CLF-Aufnahme.
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9 zeigt
die Plasma-Eliminations-Kurven bezüglich des Beispiels
2. Die linke Kurve hat eine lineare und die rechte Kurve hat eine
logarithmisch-lineare Achse.
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10 zeigt
die Plasma-Eliminations-Kurven bezüglich des Beispiels
10. Die linke Kurve hat eine lineare und die rechte Kurve hat eine
logarithmisch-lineare Achse.
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Beispiel 1: Demonstration, dass das Gallensäure-Derivat
CLF ein Substitut für MRP2 ist
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Materialien
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Cholyl-Lysyl-Fluoreszein
(CLF) wurde von Norgine, Harefield, UK beschafft. [3H]GSH
(52 Ci/mmol) and [3H]TC 1,19 Ci/mmol) wurden
von Perkin Elmer Life and Analytical Sciences (Boston, MA, USA)
beschafft. Die [3H]DNP-SG-Synthese wurde
so durchgeführt, wie dies von de Waart DR et al
[Liver Int 2006 Apr; 26(3): 362–368] beschrieben
wurde. [3H]E217βG
(40,5 Ci/mmol) wurde von NEN Life Science Products (Boston, MA, USA)
gekauft. Zellulose-Azetat-Membranfilter wurden von Schleicher und
Schuell (Dassel, Deutschland) gekauft. Sucrose wurde von Brunschwig
Chemie (Amsterdam, Niederlande) beschafft. Kreatin-Kinase wurde
von Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) gekauft. Methanol
(HPLC-Güte) wurde von Baker (Deventer, Niederlande) beschafft.
Triton X-100 wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) gekauft. Alle
anderen Chemikalien und Reagenzien wurden von Sigma-Alldrich (Zwijndrecht,
Niederlande) gekauft.
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Tiere
-
Abcc2-/--Mäuse (gegen einen Friend-Virus
B-Typ-(FVB-)Hintergrund) wurden a dem National Cancer Institute
(Amsterdam, Niederlande) aufgezogen. Die Produktion und Charakterisierung
der Abcc2-/--Mäuse wurde von Vlaming
e al [Pharmacol Exp Ther 2006 Jul; 318(1): 319–327] beschrieben.
Wildtyp- und Abcc3-/--Mäuse (gegen
einen FVB-Hintergrund) wurden an dem Tierinstitut des Academic Medical
Center aufgezogen. Die Produktion und Charakterisierung der Abcc3-/--Mäuse war so, wie dies von Zelcer
et al [J Hepatol 2006 Apr; 44(4): 768–775] beschrieben
wurde.
-
Erzeugung
von CHO-Zellen, die stabile NTCP und Zellen-Linien exprimieren cDNA
für menschliches NTCP [Hagenbuch et al, J Clin
Invest 1994 Mar; 93(3): 1326–1331] wurde mit EcoRV
und Hindl verschnitten und der Codierungsbereich wurde in pcDNA5/FRT
verknüpft (Invitrogen, Life-Technologies, Karlsbad, CA). CHO
Flpln-Zellen (Invitrogen, Life-Technologies) wurden mit dem resultierenden
Konstrukt unter Verwendung von Lipofektamin® 2000
(Invitrogen, Life-Technologies) transfiziert. Stabile transfizierte
Zellen wurden mit 550 μg Hygromycin-B in einem HAM-F-12-Medium
(Gibco, Invitrogen, Life-Technologies) selektiert. Transfizierte Zellen
wurden mit dem begrenzenden Verdünnungsverfahren geklont.
Klone, die funktionelle NTCP exprimieren, wurden durch Transport-Assays
mit radioaktiv markiertem Taurocholat (siehe unten) identifiziert.
Um die geklonten Zellen weiter zu charakterisieren wurde eine Immunofluoreszenz-Lokalisierung
von NTCP unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers
gegen NTCP [Kullak-Ublick G et al, Gastroenterology 1997
Oct; 113(4): 1295–1305] durchgeführt,
wie dies von Huber RD et al [Am J Physiol Cell Physiol 2007
Feb; 292(2): C795–C806] beschrieben wurde. CHO-Zellen,
die OATP1B1, OAT1B3 und OATP2B1 exprimieren, wurden bereits vorher
beschrieben [Treiber et al, DMD 35: 1400–407, 2007].
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Transportexperimente mit stabil
infizierten Zellen-Linien
-
Für
alle Transportexperimente wurde auf 3 cm-Kulturschalen gezogene
Zellen über 24 Stunden in Medien kultiviert), die mit 5
mmol/L Natrium-Butyrat ergänzt wurden, um die Exprimations-Pegel
transfizierter Transporter zu vergrößern [Palermo
DP et al, J Biotechnol 1991 Jun; 19(1): 35–47].
- – Transportexperimente mit der Aufnahme
von radioaktiv markierten Substraten: diese Experimente wurden durchgeführt,
wie dies von Huber RD et al [Am J Physiol Cell Physiol 2007
Feb; 292(2): C795–C806] beschrieben wurde.
- – Transportexperimente mit Aufnahme von CLF: die Aufnahme
wurde in den gleichen Puffern wie für die vorstehend genannten
radioaktiven Substrate durchgeführt. Für die Visualisierung
der CLF-Aufnahme wurden Zellen unmittelbar mit einem Leica-DM-IRBE-invertierten
Mikroskop (Leica-Microsystems, Wetzlar, Deutschland) inspiziert,
das mit einer Hamamatsu-ORKA-ER-Kamera ausgerüstet war
(Hamamatsu-Photonics, Japan). Um die Aufnahme von CLF zu bestimmen,
wurden Zellen durch die Hinzufügung von 2 ml 1% (w/v) Triton
X-100 solubilisiert. Nach der vollständigen Solubilisation
wurden 1,5 ml zur Messung der Fluoreszenz in einem Perkin-Elmer
LS-5-Lumineszenz-Spektrometersatz bei λexc 486
nm (Schlitz 10 nm) und λern 520
nm (Schlitz 5 nm) verwendet. Protein wurde mit dem Bicinchonin-Säure-Verfahren
unter Verwendung eines Kit von Interchim (Montfucon, Frankreich)
bestimmt. Transportdaten von OATP, das Zellen-Linien exprimiert,
wurden für die Bindung durch Subtrahieren von 0 min-Zeitpunkten
(Leerwerte) korrigiert und wurden mit Ausnahme der 2B und 2C pro
Minute normalisiert. Eine kinetische Analyse wurde mit einer nichtlinearen
Regression der Daten auf die Michaelis-Menten-Gleichung unter Verwendung der
GraphPad PRISM-V-4.00 (GraphPad-Software-Inc., San Diego, CA) durchgeführt.
-
Vorbereitung der Membran-Vesikel
-
Die
Produktion von rekombinatem Bakulovirus wurde vom de Waart
et al [Liver Int 2006 Apr: 26(3): 362–368] beschrieben.
ABCC3 und ABCG2-rekombinante Bakuloviren waren eine freundliche
Gabe von Borst [Breedveld P. et al, Cancer Res 2004 Aug
15; 64(16): 5804–5811 und Borst P. et al J Biol
Chem 2001 Dec 7; 276(49): 46400–46407]. ABCB11-rekombinanter
Bakulovirus war eine freundliche Gabe von Thompson [Thompson
RJ et al, Gastroenterology 2002 Nov; 123(5): 1649–1658].
Sf21-Zellen, die bei 27°C aufgezogen wurden, wurden mit
ABCB11, ABCC2, ABCC3 und ABCG2-cDNA infiziert, die Bakulovirus enthält.
Zellen wurden 2–4 Tage nach der Infektion entnommen. Die
Membran-Vesikel-Zubereitung war so, wie dies von de Waart et
al [Liver Int 2006 Apr; 26(3): 362–368] beschrieben
wurde.
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Westernblotting und Protein-Analyse
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Membran-Vesikel
wurden durch 5% SDS-PAGE fraktioniert, auf Nitrozellulose Membranen
(Schleicher & Schuell,
Dassel, Deutschland) geblottet, die in Phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS)/5% Milchpulver/0,05% Tween-20 blockiert wurden. Die folgenden
Antikörper wurden verwendet: anti-his-Probe; sc-803 (Santa
Cruz, USA), anti-ABCG2; BXP-21 [Maliepaard M et al, Cancer
Res 2001 Apr 15; 61(8): 3458–3464], anti-ABCC2;
M2III6 [Scheffer et al, Cancer Res
2000 Sep 15; 60(18): 5269–5277] und anti-ABCC3;
M6III21 [Scheffer et al, Cancer
Res 2000 Sep 15; 60(18): 5269–5277]. Immun-Komplexe
wurden mit Meerrettich-Peroxidasekonjugierten Immunoglobulinen visualisiert
und unter Verwendung einer Chemilumineszenz (Amersham, UK) detektiert.
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Transport-Assays mit Plasma-Membran-Vesikeln
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Transport-Studien
mit Membran-Vesikeln wurden unter Verwendung der Schnellfiltrationstechnik durchgeführt,
wie sie von Heijn M et al [Am J Physiol 1992 Jan; 262(1
Pt 1): C104–C110] beschrieben wurde. Eine Markierung
mit radioaktiven Atomen wurde mit einem Szintillationszähler
gemessen. Wenn CLF als eine Probe verwendet wurde, wurden Filter
in einem Glasrohr angeordnet, 0,1% Triton X-100 wurde hinzugefügt, und
die Rohre wurden verwirbelt. Die Proben wurden in Platten mit 96-Vertiefungen
(Kartell, Noviglio, Italien) pipettiert, und die Menge von CLF durch
die Messung der Fluoreszenz bei λexc 485
nm und λern 520 nm unter Verwendung
eines NovoStar (BMG-labtech, Offenburg, Deutschland) quantifiziert.
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Tierexperimente
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Männliche
Mäuse wurden in einer Pathogen-freien Tieranlage auf einem
12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht. Die Mäuse
wurden mit einer Kombination von Hypnorm (VetaPharma, UK; 11,8 mg/kg
Fluanison und 0,37 mg/kg Fentanyl-Zitrat) und Diazepam (Centrafarm,
Etten-Leur, Niederlande; 5,9 mg/kg Valium) anästisiert.
Die Körpertemperatur wurde auf 36 ± 1°C
auf thermostatisch gesteuerten Heizkissen gehalten. Für
Clearance-Studien wurden Mäuse mit CLF dadurch infusiert,
dass 100 μL (2 mmol/L) CLF in die Schwanzvene injiziert
wurde. Nachfolgend wurde Blut von der Carotis zu den angegebenen
Zeitpunkten entnommen. Blutproben wurden durch die Hinzufügung
von zwei Volumen Methanol deproteinisiert, und die Menge an CLF in
dem Überstand wurde durch Messung der Fluoreszenz in der
vorstehend beschriebenen Weise quantifiziert.
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Für
Gallensekretionsstudium wurde die Gallenblase mit PE10-Polyethylen-Schlauch
kanülisiert und 100 μL (1 mmol/L) CLF wurde in
die Schwanzvene injiziert. Galle wurde in 10 Minuten-Fraktionen
gesammelt. Leber und Blut wurden am Ende des Experimentes gewonnen.
Homogenisierte Leber wurden durch Hinzufügung von zwei
Volumen von MeOH deproteinisiert, und Gallen- und Blutproben wurden
mit 0,1% Triton X-100 verdünnt. Die Menge an CLF wurde
durch die Messung der Fluoreszenz in der vorstehend beschriebenen
Weise quantifiziert.
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Für
die intestinalen Aufnahme-Studien von Taurocholat (TC) und CLF wurden
Mäuse anästisiert und die Gallenblase wurde in
der vorstehend beschriebenen Weise kanülisiert. Mäuse
erhielten sowohl TC als auch CLF durch Injizieren von 100 μL
(2 mmol/L) CLF in das Ileum. Galle wurde allen 15 Minuten gesammelt. Die
Radioaktivität wurde in einem Szintillationszähler
gemessen und CLF wurde in der vorstehend beschriebenen Weise quantifiziert.
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Ergebnisse
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Die
Rolle unterschiedlicher hepatozellularer Gallensalz-Transporter
in der hepatitischen Aufnahme von CLF wurde untersucht. Für
diesen Zweck wurden CHO-Zellen, die NTCP stabil exprimieren, erzeugt (CHO-NTCP)
und charakterisiert. 1A zeigt eine Immunofluoreszenz-Mikrographie
von stabil transfizierten Zellen von einem Immunofluoreszenz-Assay
unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen NTCP. Eine
Immunofluoreszenz-Mikrographie für Wildtyp-Zellen (nicht
gezeigt) zeigte keine Fluoreszenz und daher keine Expression von
NTCP in Wildtyp-CHO-Zellen, doch zeigt die Immunofluoreszenz-Mikrographie
für transfizierte Zellen (1A) eine
Fluoreszenz an den Zellmembranen, und zeigt daher eine klare Plasma-Membran-Expression
von NTCP in stabil transfizierten Zellen. Weiterhin war die Aufnahme
von Taurocholat (TC) in diese Zellen Natrium-abhängig (Daten
nicht gezeigt) und war mit zunehmenden Taurocholat-Konzentrationen sättigbar.
Selbst bei hohen Taurocholat-Konzentrationen war die Aufnahme bei
Fehlen von Natrium vernachlässigbar (1B).
Die Km und die Vmax-Werte waren 16,0 μmol/L
bzw. 6738 pmol TC/mg Protein/min, für den Natrium-abhängigen
Transport von TC (1B). Im Gegensatz hierzu konnte
keine Natrium-abhängige Aufnahme von CLF unter Vermittlung
durch MTCP durch die Fluoreszenz-Analyse und die quantitative Bestimmung
von CLF von NTCP-Zellen beobachtet werden, die mit CLF inkubiert
wurden (2A bzw. 26). Das Fluoreszenz-Bild
der OHO-Zellen, die NTCP exprimieren (siehe 2A) zeigt
das Fehlen der CLF-Aufnahme in Zellen. Die langen Zellen nach rechts
des Bildes von CHO-Zellen, die NTCP exprimieren, was eine schwache Fluoreszenz-Färbung
zeigt, können möglicherweise nicht mehr vital
gewesen sein. Die Aufnahme von CLF bei Fehlen von Natrium (2B)
war vergleichbar mit der von Wildtyp-Zellen (nicht gezeigt) und
neigte dazu, mit zunehmender Inkubationszeit minimal größer
zu werden.
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Als
nächstes wurde die durch OATP1B1, OATP1B3 und OATP2B1 vermittelte
Aufnahme von CLF im Wildtyp und stabil transfizierten CHO-Zellen überprüft.
Die Fluoreszenz-Bilder der CHO-Zellen, die OATP1B1, OATP1B3 und
OATP2B1 exprimieren (siehe 2A), zeigen
die Aufnahme von CLF für die CHO-Zellen, die OATP1B3 exprimieren,
jedoch nicht für OATP1B1 und OATP2B1. Das Floureszenz-Bild
der CHO-Zellen, die OATP1B3 exprimieren, zeigt eine starke Fluoreszenz-Färbung
der Zellen und zeigt damit eine eindeutige Aufnahme von CLF in die
OATP1B3 exprimierenden Zellen. Das Fluoreszenz-Bild der CHO-Zellen,
die OATP1B1 exprimieren, zeigt eine sehr schwache Fluoreszenz-Färbung,
was zeigt, dass die Aufnahme von CLF in OATP1B1 Zellen sehr schwach
jedoch stetig war. Im Gegensatz hierzu wurde keine Aufnahme im OATP2B1 gefunden,
und das Fluoreszenz-Bild der OATP2B1 exprimierenden CHO-Zellen zeigt
keine Fluoreszenz-Färbung, mit Ausnahme einer einzigen
positiven Zelle, die in dem Fluoreszenz-Bild sichtbar ist, was eine
Zelle mit teilweise reduzierter Vitalität sein kann, wie
dies durch die Phasenkontrast-Mikroskopie beurteilt wird. Hohe zeitabhängige
Transportraten von CLF wurden lediglich in OATP1B3 exprimierenden
CHO-Zellen gefunden (2A bzw. 2B). Die
Aufnahme von CLF durch OATP1B1-Zellen wurde übereinstimmend
beobachtet, jedoch nicht durch OATP2B1-Zellen (2A und 2C),
was anzeigt, dass CLF kein Substrat für OATP2B1 ist. Der
OATP1B3-vermittelte CLF-Transport war konzentrationsabhängig
(2D) mit Km und den Vmax-Werten von 4,6 ± 2,7 μol/L
bzw. 213 ± 42 pmol CLF/mg Protein/min (Mittelwert von drei
unabhängigen Bestimmungen). Aufnahmeexperimente mit zunehmenden
CLF-Konzentrationen und OATP1B1-Zellen zeigten einen Nachweis für
eine Sättigbarkeit (nicht gezeigt). Aufgrund eines niedrigen
Signal-/Störverhältnisses, insbesondere bei höheren
CLF-Konzentrationen, war keine Bestimmung der kinetischen Parameter
möglich.
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Es
wurden Untersuchungen ausgeführt, um festzustellen, ob
der Transport von Modell-Verbindungen, die durch NTCP, OATP1B1,
OATP1B3 und OATP2B1 vermittelt wurden, durch CLF behindert werden
könnte, obwohl CLF ein Substrat lediglich für
OATP1B3 ist. CHO-Zellen, die NTCP, OATP1B1, OATP1B3 und OATP2B1
exprimieren, wurden mit 0,5 oder 50 μmol/L CLF und mit
den Substraten 2,5 μmol/L TC, 1 μmol/L Estron-3-Sulfat,
10 μmol/L TC bzw. 1 μmol/L Estron-3-Sulfat inkubiert.
Daten stellen Mittelwerte ± SD von dreifachen Bestimmungen
dar. Unübersehbar hemmte CLF sehr wirkungsvoll den Transport
von TC über NTCP (3A). Der
durch OATP1B3 vermittelte Transport von TC konnte durch CLF in einer
Dosis abhängigen Weise (3C) gehemmt
werden, wie dies erwartet wurde. Schließlich wurde der
Transport des Modellsubstrats Estron-3-Sulfat vermittelt durch OATP1B1
und OATP2B3 durch CLF gehemmt, wenn auch weniger wirkungsvoll (3B bzw. 3D)
was die Aufnahmeexperimente mit CLF bestätigt. Es sei bemerkt,
dass die Hinzufügung von CLF zu Wildtyp-Zellen keinen Einfluss
auf die Substrat-Aufnahme hatte, was zeigt, dass dies die strukturelle
Integrität der Plasma-Membran nicht stört (3).
-
Um
zu testen, ob die kanalikulären ATP-abhängigen
Transporter ABCB11, ABCC2 und ABCG2 sowie die basolateralen Transporter
ABCC3 den Transport von CLF vermitteln, wurden diese menschlichen
Proteine in Sf21-Insektenzellen exprimiert (4A). 4B zeigt,
dass eine geringe ATP-abhängige Aufnahme in Kontroll-Vesikel
erfolgte, was anzeigt, dass ein endogener Transporter in der Lage
ist, CLF in einer ATP-abhängigen Weise aufzunehmen. Der
ATP-abhängige Transport von CLF in ADCB11 und ABCG2-Protein-enthaltenden
Membran-Vesikeln war nicht höher als in Kontroll-Vesikeln
(4C bzw. B). ABCC2 und ABCC3 enthaltende Membran-Vesikel
zeigten jedoch wesentlich höhere CLF-Transportraten verglichen
mit Kontroll-Wildtyp-Sf21-Membran-Vesikein (4E bzw.
F).
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Membran-Vesikel
(10 μg und 30 μg vom Gesamteiweiß für
ABCC2 bzw. ABCC3) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von
CLF bei Vorliegen oder Fehlen von 4 mmol/L ATP inkubiert. Der ABCC2- und
ABCC3-vermittelte Transport von CLF war konzentrationsabhängig
(4G bzw. H). Die km-Werte
waren 3,3 ± 2,0 μmol/L und 3,7 ± 1,0 μmol/L
für ABCC2 bzw. ABCC3, und die Vmax-Werte
waren 4,36 ± 2,15 pmol CLF/mg Protein/min bzw. 188 ± 55
pmol CLF/mg Protein/min.
-
Ein
weiteres Modellsubstrat für ABCC2 ist Dinitrophenyl-Glutathion
(DNP-SG) und CLF sollte den Transport dieser Verbindung behindern.
Eine halbe maximale Behinderung des DNP-SG-Transports mit CLF wurde
bei ungefähr 1 μmol/L erzielt (5A).
Obwohl kein Hinweis gefunden wurde, dass CLF ein Substrat für
ABCB11 ist, enthält es einen Cholyl-Anteil und könnte
daher in der Lage sein, den Gallensalz-Transport über ABCB11
zu hemmen. Tatsächlich konnte der TC-Transport durch CLF
in einer Dosis-abhängigen Weise gehemmt werden und die
Konzentration, bei der der halbe maximale Transport beobachtet wurde,
betrug ungefähr 10 μmol/L (5B).
-
Um
die Rolle von Abcc2 und Abcc3 bei der Plasma-Clearance von CLF zu
untersuchen, wurden die CLF-Pegel im Plasma von Wildtyp-Abcc2-/- und Abcc3-/--Mäusen
nach einer einzigen Injektion von CLF in die Schwanzvene untersucht.
Die Clearance von CLF wurde sehr stark bei Abcc2-/--Mäusen
im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen beeinträchtigt,
wurde jedoch nicht bei Abcc3-/--Mäusen
beeinflusst (6). Um die Rolle von Abcc2-/- beim Gallen-Ausgang von CLF zu untersuchen,
wurden Infusionsexperimente mit Wildtyp- und Abcc2-/--Mangel-Mäusen
durchgeführt. Die Gallenexkretion von CLF war bei den Abcc2-/--Mäusen stark verzögert
(7A). Als Folge wurden fast 70% der CLF-Dosis in
die Galle von Wildtyp-Mäusen innerhalb von 20 Minuten exkretiert,
während in der gleichen Zeitspanne weniger als 2% in Galle
in Abcc2-/--Mäusen exkretiert wurde.
Bei 120 Minuten nach der Verabreichung (7B) war
die kumulative Gallen-Exkretion von CLF bei Wildtyp-Mäusen
immer noch beträchtlich höher als bei Abcc2-/--Mäusen (85% gegenüber
32% der verabreichten Dosis), was zu einer beträchtlich
höheren hepatitischen Retention von CLF in Abcc2-/- gegenüber Wildtyp-Mäusen
(64% gegenüber 1% der verabreichten Dosis) und zu einem
höheren Blutpegel in Abcc2-/- gegenüber
Wildtyp-Mäusen führte (1306 ± 749 nmol/L
gegenüber 83 ± 21 nmol/L). Diese Daten zeigen,
dass bei Mäusen Abcc2-/- der Haupttransporter
ist, der für die Gallen-Exkretion von CLF verantwortlich
ist. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen von 7A wurde
beobachtet, dass der Gallen-Ausgang von CLF in Abcc3-/--Mäusen
verglichen mit Wildtyp-Mäusen nicht beeinflusst wurde,
und dass keine Unterschiede hinsichtlich der Plasma- und Leber-CLF-Inhalte
gefunden wurden (7B).
-
Nach
der Exkretion in die Galle und der Zuführung in das Duodenum
wurden die Gallensalze in dem Ileum über dem apikalen Natrium-abhängigen
Gallensäure-Transporter (ASBT) aufgenommen [Wong
MH et al, J Biol Chem 1995 Nov 10; 270(45): 27228–27234].
Um zu untersuchen, ob CLF im Intestinum aufgenommen wurde, wurden äquimolare
Mengen von CLF und [3H]TC in das Duodenum
oder Ileum vom Wildtyp-FVB-Mäusen injiziert. Danach wurde
die Galle gesammelt und die Mengen von in die Galle exkretierten [3H]TC und CLF wurden quantifiziert. 4,5 Stunden
nach ilealen Injektion beider Verbindungen wurde lediglich 2% der
CLF in Galle zurückgewonnen, während dies 68%
für [3H]TC war. Entsprechend ist
die Aufnahme von CLF in dem End-Ileum minimal. Dies zeigt, dass
CLF kein gutes Substrat für das Asbt ist.
-
Schlussfolgerungen
-
Die
Ergebnisse der Untersuchungen hinsichtlich der Aufnahme von CLF
zeigen, dass die Aufnahme von CLF in Hepatozyten wahrscheinlich
nicht durch NTCP vermittelt wird, weil keine Aufnahme von CLF in CHO-Zellen,
die menschliches NTCP exprimieren, festgestellt wurde. Dies beruhte
nicht auf einem nicht-funktionellen Protein, weil diese Zellen vollständig
in der Lage waren, die Aufnahme des natürlich auftretenden
Gallensalzes, TC, zu vermitteln. Das ileale Gegenstück
des hepatitischen NTCP ist ASPT, und dies vermittelt den Transport
von konjugierten und nicht konjugierten Gallensalzen [Geyer
J et al, Arch Pharmacol 2006 Mar; 372(6): 413–431].
Ein indirekter Nachweis wurde erzielt, um anzudeuten, dass CLF nicht über
(murines) Asbt transportiert wird, während in das ileale
Lumen von Wildtyp-Mäusen injiziertes TC sehr effizient
in Galle zurückgewonnen wurde (obwohl nahezu kein CLF gefunden
wurde). Diese Daten deuten an, dass sowohl NTCP als auch Asbt, die
homologe Natrium-abhängige Gallensalz-Transporter sind,
nicht in der Lage sind, CLF zu transportieren.
-
Frühere
Studien zeigten die partielle Natrium-abhängige Aufnahme
von einigen, jedoch nicht allen fluoreszierenden Gallensalzen in
Ratten-Hepatozyten [Maglova LM et al, Hepatology 1995 Aug;
22(2): 637–647]. Zusätzlich wurde die
Aufnahme von Cholyl-Glycyl-Fluoreszin in Ratten-Ntcp-exprimierende
CHO-Zellen, nicht jedoch in Wildtyp-Zellen gezeigt [Boyer
JL et al, Am J Physiol 1994 Mar; 266(3 Pt 1): G382–G387].
Im Gegensatz zu CLF wurde festgestellt, dass ein anderes Gallensalz-Konjugat,
Taurocholyl-Chlorambucil, ein Substrat für NTCP ist [Kullak-Ublick
GA et al, Gastroenterology 1997 Oct; 113(4): 1295–1305].
Die letztere Verbindung ist ein Konjugat an der 3-OH-Gruppe von
Gallensalz, während CLF an der Seitenkette konjugiert ist.
In diesem Kontext ist es interessant, dass Baringhaus et al die
Pharmacophor-Eigenschaften sowohl von NTCP als auch ASTE bestimmten
und feststellten, dass die 3-OH-Gruppe für den Transport
nicht wesentlich ist, während die saure Seitenkette dies
ist [Baringhaus KH et al, J Lipid Res 1999 Dec; 40(12):
2158–2168]. Die vorstehenden Daten stimmen vollständig
mit diesem Modell überein und zeigen eine Spezies-Differenz
der Substrat-Spezifität von NTCP/Ntcp.
-
Der
weniger spezifische Gallensalz-Transporter, OATP1B3 erweist sich
als wahrscheinlicherer Kandidat für die Aufnahme in die
Hepatozyten, was in die breite Substrat-Spezifität dieses
Transporters passt [Hagenbuch B et al, Pflugers Arch 2004
Feb; 447(5): 653–665].
-
Diese
Daten zeigen überraschend jedoch schlüssig, dass
ABCC2/Abcc2 der am stärksten überwiegende Transporter
ist, der für die Gallen-Exkretion von CLF verantwortlich
ist, und nicht ABCB11. In Mäusen wird die große
Mehrheit von CLF im Plasma in die Galle über Abcc2 exkretiert.
Es kann argumentiert werden, dass die Substrat-Spezifität
von menschlichem ABCC2 von der in Mäusen verschieden sein
kann. In Plasmamembran-Vesikel-Assays wurde jedoch gezeigt, dass
der Transport von CLF über menschliches ABCB11 unbedeutend
verglichen mit dem über menschliches ABCC2 ist. Unsere
derzeitigen Daten zeigen deutlich, dass CLF nicht über
ABCB11 transportiert wird.
-
Wie
dies oben beschrieben wurde, verwendeten Mills et al. Abcc2-Mangel-TR-Ratten
und haben CLF in der Galle nach der Injektion von CLF in die Jugularvene
gemessen [J Hepatol 1999 Oct; 31(4): 678–684]. Die
kumulative Menge von CLF in der Galle war ähnlich in TR-
und normalen Wistar-Ratten nach 30 Minuten. Auf der Grundlage dieser
neuen Daten scheint es jedoch so zu sein, dass die kumulativen Daten
fehlinterpretiert wurden (weil nämlich die anfänglichen
Transportraten immer noch unterschiedlich sein könnten).
Die neuen hier beschriebenen Tests führten eine ähnliche
jedoch umfangreichere Studie unter Verwendung von Wildtyp- und Abcc2-/--Mäusen aus. Bei Mäusen
mit Abcc2-Mangel war die Gallen-Exkretion von CLF stark beeinträchtigt
und es blieb in der Leber, was andeutet, dass Abcc2 und Abcb11 der
Haupt-Transporter ist, der für die Gallen-Exkretion von
CLF verantwortlich ist. Weil es nur noch einen kleinen Rest-Gallentransport
von CLF in Abcc2-/--Mäusen gibt,
kann ein Beitrag von Abcb11, wenn auch klein, nicht ausgeschlossen
werden.
-
Der
Verlust der MRP2-Funktion wird in vielen Fällen gut toleriert
und durch die Aufwärtsregelung anderer Membran-Transporter
kompensiert, insbesondere MRP3 [Nies et al Pflugers Arch
(2007) 453: 643–659]. Die Untersuchungen zeigen,
dass nicht nur ABCC2 sondern auch ABCC3 den Transport von CLF vermittelt. Wenn
daher MRP2 in Patienten heruntergeregelt ist, kann dies durch eine
Aufwärtsregelung von MRP3 kompensiert werden, und die funktionelle
Aktivität des MRP2- und/oder MRP3-Pfades des Subjektes
kann unter Verwendung von CLF untersucht werden.
-
Beispiel 2
-
Eine
Studie wurde an zwölf gesunden Versuchspersonen (sech Männer,
sechs Frauen) im Alter von 21 bis 40 Jahren durchgeführt,
um die Plasma-Pharmakokinetiken von CLF nach einer einzigen 15 Sekunden dauernden
intravenösen Injektion von 2 mg CLF bei Vorliegen von Medikations-induzierten Änderungen
der Gallen-Transporter-Proteine zu vergleichen. Die Studie wurde
unter Bedingungen von keiner Vorbehandlung, einer Vorbehandlung
mit Rifampizin, auch als Rifampin bekannt (ein nicht-spezifischer
Induktor und Inhibitor von hepatitischen Clearance-Pfaden) und einer
Vorbehandlung mit Cyclosporin durchgeführt (Cyklosporin
ist ein bekannter Inhibitor für MRP2 [Jedlitschky
et al, Expert Opin Drug Metab Toxicol 2006 Jun 2(3): 351–55]).
-
CLF
wurde von Norgine, Harefield, UK beschafft. Die Subjekte wurden
in Rückenlage studiert. 2 mg CLF wurde zu drei Gelegenheiten
durch eine 15 Sekunden dauernde intravenöse Injektion am
Morgen des Tages D01 nach einem Fasten über Nacht und einer
Ruhe mit den folgenden Modalitäten verabreicht:
- • Behandlung R: keine Vor- oder Mit-Medikation.
- • Behandlung T1: ambulatorische Besuche am Abend des
Tages D-7 bis zum Abend des Tages – 2 für eine einzige
Abend-Dosis von 600 mg Rifampizin; die letzte Dosis von Rifampizin
wurde am Abend des Tages D-1 nach der Einlieferung verabreicht.
- • Behandlung T2: Einzeldosis von 100 mg Cyclosporin
am Abend des Tages D-1 und am Morgen von D01 eine Stunde vor der
Verabreichung von CLF.
-
Verschiedene
Blutproben wurden vor der Injektion und 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45,
60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 240 und 360 Minuten nach der Dosierung
(17 Proben) gesammelt. Der Pegel von CLF in jeder Probe wurde unter
Verwendung von HPLC bestimmt.
-
Der
Zeitverlauf der beobachteten mittleren Plasma-CLF-Konzentrationen
ist in 9 gezeigt. Es ist zu erkennen, dass die Vorbehandlung
mit Rifampizin zu einer leichten Verringerung der Elimination und
der Clearance von CLF führte. Eine vorherige und gleichzeitige
Behandlung mit Cyclosporin rief eine deutliche Inhibition der Elimination
und Clearance von CLF hervor. Diese Studie zeigt, dass CLF zur Bestimmung
der OATP1B3-Aktivität und/oder der MRP2/3-Aktivität
eines Subjektes verwendet werden kann, wobei das Subjekt mit Medikament-Substraten
vorbehandelt wurde, die die OATP1B3- und/oder die MRP2/3-Aktivität
beeinflussen.
-
Beispiel 3
-
Eine
Studie wurde an zwölf gesunden Versuchspersonen (sechs
Männer, sechs Frauen) im Alter von 21 bis 40 Jahren durchgeführt,
um die Plasma-Pharmakokinetiken von CLF nach einer einzigen 15 Sekunden dauernden
intravenösen Injektion von 2 mg CLF bei Vorliegen von Medikations-induzierten Änderungen
der Gallen-Transporter-Proteine zu vergleichen. Die Wechselwirkung
mit Ursodeoxycholsäure und Cloxacillin wurde in diesem
Beispiel studiert.
-
CLF
wurde von Norgine, Harefield, UK beschafft. Die Subjekte wurden
in Rückenlage studiert. 2 mg CLF wurde an drei Gelegenheiten
durch 15 Sekunden dauernde intravenöse Injektionen am Morgen
des Tages D01 nach einem Fasten über Nacht und Ruhe mit
den folgenden Modalitäten verabreicht:
- • Referenz
R: keine Vorbehandlung.
- • Behandlung T1: vorherige und gleichzeitige Behandlung
mit 1 g Cloxacillin t. i. d. für drei Tage vom Morgen von
D-3 bis zum Morgen des Tages D01, 0:30 Stunden vor der Verabreichung
von CLF.
- • Behandlung T2: dreiwöchige Vorbehandlung
mit täglichen Dosen von 500 mg b. i. d. Ursodeoxycholsäure (am
Morgen und am Abend jedesmal mit Nahrung) bis zum Abend des Tages
D-1.
-
Venöse
Blutproben wurden vor der Injektion und 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45,
60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 240 und 360 Minuten nach der Dosierung
(17 Proben) gesammelt. Der Pegel von CLF in jeder Probe wurde unter
Verwendung von HPLC bestimmt.
-
Der
Zeitverlauf der beobachteten mittleren Plasma-CLF-Konzentrationen
ist in 10 gezeigt. Es ist zu erkennen,
dass eine vorherige und gleichzeitige Behandlung mit Cloxacillin
(einem bekannten BSEP-Inhibitor) eine leichte, jedoch statistisch
bedeutsame Hemmung der Elimination und der Clearance von CLF zeigt. Im
Gegensatz hierzu hatte eine Vorbehandlung mit Ursodeoxycholsäure
keine Wirkung (Ursodiol ist ein bekannter Multi-Faktor-Verbesserer
und Erleichterer der hepatitischen Gallen-Clearance.
-
Diese
Beispiele zeigen, dass CLF zur Bestimmung der Medikations-induzierten Änderungen
der MRP2/3-Aktivität eines Subjektes verwendet werden kann.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
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