BE1018734A3 - Methode de pronostic. - Google Patents

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BE1018734A3 BE2009/0307A BE200900307A BE1018734A3 BE 1018734 A3 BE1018734 A3 BE 1018734A3 BE 2009/0307 A BE2009/0307 A BE 2009/0307A BE 200900307 A BE200900307 A BE 200900307A BE 1018734 A3 BE1018734 A3 BE 1018734A3
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Abstract

La pr‚sente invention concerne un proc‚d‚ de d‚termination de l'activit‚ fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal, ledit proc‚d‚ comprenant: (i) la d‚termination du niveau d'un d‚riv‚ d'acide biliaire dans le sang dudit sujet humain ou animal un intervalle de temps pr‚d‚termin‚ aprŠs l'introduction d'une quantit‚ du d‚riv‚ d'acide biliaire dans le sujet; et (ii) l'utilisation de la d‚termination obtenue dans l'‚tape (i) pour indiquer l'activit‚ fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.

Description

Méthode de pronostic
La présente invention concerne un nouveau procédé de détermination de l'activité fonctionnelle de là voie d'effîux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal, ainsi que l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire dans un tel procédé.
MRP2/Mrp2 (ABCC2/Abcc2), également connu comme la Multidrug Resistance Protein 2, est un membre de la sous-famille ABCC de la superfamille des transporteurs de la cassette de liaison· à ΓΑΤΡ. Une vue d'ensemble de la famille des transporteurs de la cassette de liaison à ΓΑΤΡ est proposée dans « The Human ATP-Binding Cassette (ABC) Transporter Superfamily » de Michael Dean du National Cancer Institute, Frederick, Maryland, publié par le US National Center for Biotechnology Information. MRP2 est exprimé sur le domaine apical des hépatocytes, des entérocytes de l'intestin grêle proximal, et des cellules tubulaires rénales, ainsi que dans le cerveau et le placenta.
Etant donné qu'il module la pharmacocinétique d'un grand nombre de médicaments, MRP2 est cliniquement important, et son expression ainsi que son activité sont également modifiées par toute une gamme de médicaments et de maladies. Par exemple, l'expression de MRP2 est modifiée chez les patients atteints de maladies hépatiques telles qu'une cirrhose biliaire primitive, une cholestase (par exemple une cholestase médicamenteuse), une stéatose hépatique, une maladie hépatique due à l'alcool, une cholangite sclérosante primitive, ou une hépatite virale. Dans les reins, MRP2 fonctionne pour l'élimination de substrats du sang via l'urine. Dans le foie, MRP2 est le principal exportateur d'anions organiques du foie dans la bile. MRP2 peut transporter des sels biliaires sulfatés et glucuronidés ainsi que d'autres anions organiques et/ou leurs conjugués avec du glucuronate, du glutathion et du sulfate [Gerk et al. J Pharmacol Exp Ther 2002 Aug ; 302 (2) : 407-415]. Outre transporter des conjugués, MRP2 transporte toute une gamme de molécules comprenant des produits chimiothérapeutiques contre le cancer, des uricosuriques, des antibiotiques, des leucotriènes, le glutathion, des toxines et des métaux lourds. MRP2 joue aussi un rôle important dans l'élimination des glucuronosides de bilirubine des hépatocytes via la bile. Le gène MRP2 est muté chez les patients présentant le syndrome de Dubin-Johnson, un trouble du transport des ions organiques touchant les humains. L'absence de MRP2 fonctionnel de la membrane canaliculaire entraîne une hyperbilirubinémie conjuguée, tel que ceci est observé dans le syndrome de Dubin-Johnson, un trouble héréditaire.
La perte de fonction MRP2 est souvent bien tolérée et compensée par la régulation à la hausse d'autres transporteurs de la membrane, particulièrement la protéine Multidrug Resistance Protein 3 (MRP3, également connue sous le nom de ABCC3) dans la membrane basolatérale des hépatocytes [Nies et al. Pflügers Arch (2007) 453 : 643-659]. Tout comme MRP2, MRP3 est un membre de la sous-famille ABCC de la grande famille des transporteurs de la cassette de liaison à ΓΑΤΡ. MRP3 est présent dans les intestins, le foie et les reins.
La connaissance de l'état de l'activité de MRP2/3 d'un sujet pourrait par conséquent être utilisée pour indiquer tout un éventail de conditions possibles.
Un objectif de la présente invention consiste donc à proposer un procédé de détermination de l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal.
Nous avons, de manière inattendue, découvert que MRP2 est le plus important des transporteurs responsables de l'excrétion biliaire de la cholyl lysyl fluorescéine (CLF), qui est également connue comme la fluorescéine lisicol, et que MRP3 est responsable de l'excrétion basolatérale de la CLF. En conséquence, la CLF et d'autres acides biliaires ayant une voie métabolique/d'élimination similaire peuvent être utilisés pour déterminer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2/3.
La présente invention est particulièrement surprenante lorsque l'on prend en considération la description de Mills et al. dans Biochim Biophys Acta 1991 Dec 6 ;1115 (2) : 151-156. Ils ont mis en évidence que, chez les rats, le taux d'excrétion biliaire de la CLF après une injection dans la veine jugulaire avait une cinétique similaire à celle du glycocholate, dont on sait que le transport est médié par ABCB11.
ABCB11 est un membre de la sous-famille ABCB de la superfamille des transporteurs de la cassette de liaison à ΓΑΤΡ (ABC).
Une autre preuve qui a conduit à croire que la CLF était transportée via ABCB 11 a été fournie par Baxter et al. [Biochim Biophys Acta 1995 Jun 6 ;1256 (3) : 374-380]. Baxter et al. ont administré du glycocholate et de la CLF à des foies de rat perfusés et isolés dans des conditions de recyclage, et ont observé que la CLF était capable de faire augmenter la production de phospholipides et de cholestérol d'une manière similaire à celle observée pour le glycocholate. Dans la même étude, il a été mis en évidence que le foie de rat possède une capacité largement supérieure à transférer le glycocholate (GC) d'un perfusât à la bile que la CLF et, en même temps, l'augmentation de la production de phospholipides et de cholestérol était inférieure avec la CLF comparé au GC.
Dans une étude ultérieure [Mills et al. in J Hepatol 1999 ,Oct ;31 (4) : 678-684], Mills et al. ont étudié ABCC2/Abcc2 en tant qu'éventuel transporteur de la CLF. Ils ont toutefois conclu d'une étude avec des rats Wistar normaux et TR (Abcc2 déficients) qu'Abcc2 n'était pas impliqué dans l'expression biliaire de la CLF, en se basant sur l'observation d'une excrétion biliaire similaire dans les deux souches.
En résumé, avant les présentes recherches, tout l'art antérieur sur le sujet concluait unanimement que la CLF était transportée du foie dans la bile par la voie de ABCBll/Abcbll, et non par la voie de ABCC2/Abcc2, et n'était par conséquent pas considérée comme un agent destiné à être utilisé dans un procédé de détermination d'une activité de MRP2/3.
Selon la présente invention, on propose un procédé de détermination de l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal, ledit procédé comprenant : (i) la détermination in vitro du niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang dudit sujet humain ou animal à un intervalle de temps prédéterminé après l'introduction d'une quantité du dérivé d’acide biliaire dans le sujet, et (ii) l'utilisation de la détermination obtenue dans l'étape (i) pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose un procédé de réalisation d'un pronostic ou d'un diagnostic sur un sujet humain ou animal, ledit procédé comprenant : la détermination du niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang dudit sujet humain ou animal à un intervalle de temps prédéterminé après l'introduction d'une quantité du dérivé d’acide biliaire dans le sujet, caractérisé en ce que la détermination obtenue est utilisée pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
Le terme « déterminer » dans ce contexte a une vaste signification. Il comprend à la fois une analyse quantitative pour quantifier le niveau ou la quantité du dérivé d’acide biliaire dans l'échantillon et l'analyse qualitative pour détecter si l'acide biliaire est présent ou non et, si adapté, le degré auquel il est présent. Ainsi, il n'est pas crucial pour ce procédé d'obtenir une valeur numérique pour le niveau de dérivé d’acide biliaire dans le sang. Par exemple, il est possible de s'assurer que le niveau du dérivé d’acide biliaire dans le sang se trouve dans une certaine plage pour évaluer l'activité fonctionnelle de la voie de MRP2 et/ou MRP3. Par analogie, les termes « déterminer » et « détermination » doivent être entendus de manière similaire.
La détermination du niveau de l'acide biliaire peut être réalisée tel que ceci est décrit dans la demande de brevet européen n° EP 1 003 458 (dont le contenu, dans sa totalité, est intégré au présent document à titre de référence, et destiné à former partie intégrante de cette description). Cette description décrit l'utilisation de dérivés de l'acide biliaire colorés ou fluorescents chez des sujets humains pour déterminer la fonction hépatique du sujet. Un exemple d'un tel dérivé d’acide biliaire proposé dans le brevet EP 1 003 458 est le dérivé de la fluorescéine fluorescente, la cholyl lysyl fluorescéine (CLF). Le brevet EP 1 003 458 décrit l'utilisation de la CLF en tant qu'un test potentiel de la fonction hépatique.
L'objectif lié à l'utilisation d'un composé dérivé de l'acide biliaire, tel que la CLF, Hans un test de la fonction hépatique consistait à fournir un composé qui pouvait être transporté des hépatocytes dans la bile de la même manière que les acides biliaires naturels. Les acides biliaires sont absorbés dans les cellules hépatiques par au moins deux systèmes de transport : un système Na+ dépendant, impliquant le polypeptide cotransporteur de Na+/taurocholate (connu sous le nom de NTCP) et un système indépendant de Na+, impliquant des transporteurs de la famille des transporteurs des anions organiques (connue comme la famille OATP). Les acides biliaires sont excrétés dans les canaux biliaires par la pompe d'exportation des sels biliaires, également connue sous les noms BSEP ou ABCB11, qui est exprimée sur le côté du canal biliaire des cellules hépatiques. Tel que ceci a été décrit ci-dessus, avant la présente invention, on supposait que la CLF était excrétée dans la bile via ABCB11.
En revanche, nous avons découvert que le procédé ci-dessus pouvait être utilisé pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet. L'expression et l'activité de MRP2/MRP3 sont modifiées par une vaste gamme de médicaments et d'états pathologiques, la connaissance de l'activité fonctionnelle de la voie d'élimination de MRP2 et/ou MPR3 du sujet peut par conséquent être utilisée pour indiquer un large éventail de conditions, y compris celles mentionnées dans le présent document. Ce procédé est par conséquent utile dans le diagnostic ou le pronostic de tout un ensemble de conditions choisies parmi celles dans lesquelles l'expression de MRP2 et/ou MRP3 est modifiée, par exemple régulée à la hausse ou régulée à la baisse, ou dans lesquelles le gène MRP2 et/ou MRP3 est muté. De préférence, le procédé de la présente invention est utilisé pour diagnostiquer ou pronostiquer une condition ou une maladie spécifiée dans le présent document.
Les termes « activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 » ou « activité fonctionnelle de la voie d'élimination de MRP2 et/ou MRP3 » tels qu'ils sont utilisés dans le présent document font référence à l'activité de transport de la protéine de transport MRP2 et/ou de la protéine de transport MRP3 dans le transport de substrats à travers les membranes cellulaires.
La détermination du niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang peut être réalisée ou analysée d'un certain nombre de manières. Le niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang peut être comparé avec au moins une mesure standard. De manière similaire, des résultats pris à différents intervalles de temps prédéterminés peuvent être comparés avec ces mesures de référence.
Il n'est cependant pas nécessaire de faire une comparaison avec une mesure référence. Il est possible d'utiliser la détermination obtenue pour donner une indication directe de l'activité fonctionnelle de la voie d'élimination de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet, sans qu'aucune comparaison avec des résultats d'un sujet sain ou d'un sujet dont la fonction MRP2/3 est connue ne soit nécessaire.
De préférence, le procédé comprend une étape supplémentaire consistant à utiliser la détermination du niveau de dérivé d’acide biliaire pour obtenir une valeur numérique, la valeur numérique indiquant l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet. Une seule valeur numérique indiquant l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet fournit avantageusement des moyens utiles aux médecins pour évaluer les fonctions d'un patient affectées par l'activité de MRP2/3, telles que la fonction hépatique, la fonction rénale, ou la fonction intestinale. Ladite valeur numérique peut être obtenue en utilisant la détermination du niveau du dérivé d’acide biliaire pour donner une mesure directe de l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
De préférence, la détermination obtenue est comparée à au moins une référence pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
De préférence, le niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang du sujet est déterminé à deux intervalles de temps prédéterminés ou plus après l'introduction d'une quantité du dérivé d’acide biliaire dans le sujet. En prélevant une série d'échantillons sanguins dans le temps, une courbe d'élimination plasmatique peut être construite et comparée à des courbes d'élimination plasmatique obtenues de sujets dont l'activité MRP2/3 est connue. Deux déterminations ou plus du niveau du dérivé d’acide biliaire dans le sang du sujet prises à différents intervalles de temps peuvent être utilisées pour obtenir ladite valeur numérique indiquant l'activité fonctionnelle de la voie d'élimination de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
Par exemple, lorsque le niveau du dérivé d’acide biliaire dans le sang du sujet est déterminé à deux intervalles de temps prédéterminés ou plus, la détermination obtenue à un premier intervalle de temps après l'administration et la détermination obtenue à un deuxième intervalle de temps après l'administration peuvent être exprimées sous la forme d'un rapport ou sous la forme d'un pourcentage. Ainsi, un rapport de la détermination après 30 minutes ou après 60 minutes peut être exprimé sous la forme d'un rapport de la détermination après 10 minutes. Ce rapport fournit une valeur numérique, généralement inférieure à l'unité, qui donne une indication de l'activité fonctionnelle de la voie de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
En variante, la détermination à un intervalle de temps ultérieur, par exemple 30, 60 ou 90 minutes, peut être exprimée sous la forme d'un pourcentage de la détermination à l'intervalle de temps antérieur, par exemple 10 minutes, après l'administration du dérivé de l'acide biliaire. Ce pourcentage donne, de la même manière, une indication sur l'activité fonctionnelle de la voie de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
En variante, une valeur numérique indiquant l'activité fonctionnelle de la voie de MRP2/3 d'un sujet peut être obtenue par détermination de la pente d'une courbe d'élimination plasmatique log-linéaire dérivée des déterminations obtenues. En variante, une valeur numérique peut être obtenue par détermination de l'aire sous une courbe d'élimination plasmatique dérivée des résultats. En outre, la différence entre les pentes d'une courbe log-linéaire dérivée d'une courbe d'élimination plasmatique de test et d'une courbe log-linéaire d'une courbe d'élimination de référence peut être calculée pour fournir ladite valeur numérique indiquant l'activité fonctionnelle de la voie de MRP2 et/ou MRP3. De manière similaire, la différence entre les zones sous la courbe d'élimination plasmatique dérivée des résultats de tests et une courbe d'élimination de référence peut être calculée pour fournir ladite valeur numérique.
Dans ce contexte, le terme « de référence » a une vaste signification. Il est destiné à couvrir toute mesure ou série (deux ou plus) de mesures prises sur un sujet humain ou animal. Ceci comprend des mesures prises sur des sujets sains, des sujets dont la fonction MRP2/3 est connue, et peut comprendre une mesure ou des mesures prises sur le sujet dont on étudie la fonction MRP2/3. En d'autres termes, lorsque l'on est concerné par la progression ou l'évaluation d'une maladie, il est possible de comparer les mesures prises dans le temps, le sujet servant lui-même de contrôle.
De préférence, le dérivé d’acide biliaire comprend un marqueur tel qu'une couleur ou une fluorescence.
De préférence, le procédé comprend en outre l'étape consistant à fournir au moins un échantillon de sang qui est passé par le foie du sujet et qui a été recueilli à un intervalle de temps prédéterminé après l'administration du dérivé d’acide biliaire au sujet, l'échantillon (les échantillons) de sang étant traité(s) pour obtenir le plasma ou le sérum. Par conséquent, un procédé in vitro de détermination de l'activité fonctionnelle de la voie d'efïlux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet peut être proposé.
De préférence, le(s) échantillon(s) de sang est (sont) traité(s) par centrifugation. De préférence, les protéines sanguines sont séparées du plasma/du sérum.
De préférence, le dérivé d’acide biliaire est administré au sujet par voie intraveineuse.
De préférence, le dérivé d’acide biliaire comprend (a) une fraction stéroïde ayant (i) au moins un substituant choisi dans le groupe constitué par un substituant 3-hydroxyle, un substituant 7-hydroxyle et un substituant 12-hydroxyle, et (ii) un groupe carboxyle fixé par les moyens d'une liaison amide à une chaîne latérale de la fraction stéroïde ; et (b) une fraction active qui cible le foie, ladite fraction active étant fixée à un atome de carbone en a du groupe carboxyle.
De manière particulièrement préférée, le dérivé d’acide biliaire répond à la formule générale (I) :
Figure BE1018734A3D00101
dans laquelle A est choisi dans le groupe constitué par a-OH et ß-OH ; B est choisi dans le groupe constitué par a-H et ß-H ; C est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; ou B et C forment ensemble une double liaison ; D est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; E est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; L est un résidu de liaison ; J est un résidu coloré ou fluorescent ; et n vaut 0 ou 1.
Dans la formule ci-dessus, le résidu de liaison L a de préférence une terminaison N au niveau de son extrémité fixée à au résidu fluorescent ou coloré, J, et est de préférence -(CH2) „NH, où n vaut 3 ou 4, -(CH2) 4NH- (CH2) 3NHC (=NH)NH-, ou -(CH2)2-CH (OH)CH2NH-.
En variante, la fraction -NH-CH (COOH)-L- peut être dérivée de S-adénosylhomocystéine, de S-adénosylméthionine, de S-amino-imadazole-4-carboxamide, d'asparagine, de cadavérine, de cystamine, de citrulline, d'acide diaminopimélique, d'acide 2,4-diaminobutyrique, de cystéamine, de glutamine, de 3-hydroxykynurénine, de kynurénine, de putrescine ou négamycine. En variante, les acides aminés acides peuvent être utilisés à la place des composés ci-dessus lorsque la fraction active J a un groupe aminé et/ou est hydrophobe.
Dans la formule ci-dessus, J est ou comprend de préférence une fluorescéine, une rhodamine ou autre fraction fluorescente.
De préférence, la fraction stéroïde du dérivé d’acide biliaire est basée sur un acide choisi dans le groupe constitué par l'acide cholique, l'acide chénodésoxycholique, l'acide désoxycholique, l'acide hyodésoxycholique, l'acide hyocholique, l'acide a-, ß- ou ω-muricholique, des acides biliaires -nor, l'acide lithocholique, l'acide 3 β-hydroxycholénoïque, l'acide ursodésoxycholique et l'acide allocholique (acide 5 a-cholan-24-oïque).
Idéalement, le dérivé d’acide biliaire est une cholyl-lysyl-fluorescéine (CLF) répondant à la formule :
Figure BE1018734A3D00111
ou ses sels. De préférence, le dérivé d’acide biliaire est un sel trisodique. De préférence, le dérivé d’acide biliaire est la cholyl-lysyl-fluorescéine, également connue comme la fluorescéine lisicol. De préférence, le dérivé d’acide biliaire est un sel trisodique de la fluorescéine lisicol.
Selon un autre aspect de la présente invention, on propose l'utilisation de l'activité fonctionnelle de la MRP2 et/ou de la MRP3 obtenue à partir du procédé ci-dessus pour déterminer la fonction hépatique d'un sujet humain ou animal.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire pour déterminer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou de MRP3 d'un sujet humain ou animal.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire dans le diagnostic ou le pronostic du syndrome de Dubin-Johnson, d'une cirrhose hépatique, de la cholestase, d'une stéatose hépatique, d'une maladie hépatique due à l'alcool, d'une cholangite sclérosante primitive, ou d'une hépatite virale.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire dans la fabrication d'un agent de diagnostic ou de pronostic destiné à être utilisé dans le diagnostic ou le pronostic du syndrome de Dubin-Johnson, d'une cirrhose hépatique, de la cholestase, d'une stéatose hépatique, d'une maladie hépatique due à l'alcool, d'une cholangite sclérosante primitive, ou d'une hépatite virale.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire pour déterminer l'état de la voie de clairance de la bilirubine ou de la voie de clairance de la bilirubine conjuguée d'un sujet humain ou animal.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire dans la fabrication d'un agent de diagnostic ou de pronostic pour déterminer l'état de la voie de clairance de la bilirubine ou de la voie de clairance de la bilirubine conjuguée d'un sujet humain ou animal.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire pour déterminer la fonction rénale, la fonction biliaire, la fonction intestinale, ou la fonction hépatique d'un sujet humain ou animal.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose l'utilisation d'un dérivé d’acide biliaire dans la fabrication d'un agent de diagnostic ou de pronostic pour déterminer la fonction rénale, la fonction biliaire, la fonction intestinale, ou la fonction hépatique d'un sujet humain ou animal.
De préférence, ledit dérivé d’acide biliaire comprend (a) une fraction stéroïde ayant (i) au moins un substituant choisi dans le groupe constitué par un substituant 3-hydroxyle, un substituant 7-hydroxyle et un substituant 12-hydroxyle, et (ii) un groupe carboxyle fixé par les moyens d'une liaison amide à une chaîne latérale de la fraction stéroïde ; et (b) une fraction active qui cible le foie, ladite fraction active étant fixée à un atome de carbone en a du groupe carboxyle.
De préférence, ledit dérivé d’acide biliaire est un composé de formule (I)
Figure BE1018734A3D00131
dans laquelle A est choisi dans le groupe constitué par a-OH et ß-OH ; B est choisi dans le groupe constitué par a-H et ß-H ; C est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; ou B et C forment ensemble une double liaison ; D est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; E est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; L est un résidu de liaison ; J est un résidu coloré ou fluorescent ; et n vaut 0 ou 1.
De préférence, J est ou comprend une fluorescéine, une rhodamine ou autre fraction fluorescente.
De préférence, l'extrémité du résidu de liaison qui est liée à la faction active J est une extrémité N-terminale, et L est choisi dans le groupe constitué par -(CH2)nNH, où n vaut 3 ou 4, -(CH2) 4NH- (CH2) 3NHC (=NH)NH-, et -(CH2)2-CH (OH)CH2NH-.
De préférence, le résidu -NH- CH (COOH)-L- dans la formule générale (I) est dérivé d'un composé choisi dans le groupe constitué par la S-adénosylhomocystéine, la S-adénosylméthiodine, le S-aminoimadazole-4-carboxamide, l'asparagine, la cadavérine, la cystamine, la citrulline, l'acide diaminopimélique, l'acide 2,4-diaminobutyrique, la cystéamine, la glutamine, la 3-hydroxykynurénine, la kynurénine, la putrescine et la négamycine.
De préférence, la fraction stéroïde du dérivé d’acide biliaire est basée sur un acide choisi dans le groupe constitué par l'acide cholique, l'acide chénodésoxycholique, l'acide désoxycholique, l'acide hyodésoxycholique, l'acide hyocholique, l'acide α-, ß- ou ω-muricholique, des acides biliaires -nor, l'acide lithocholique, l'acide 3 β-hydroxycholénoïque, l'acide ursodésoxycholique et l'acide allocholique (acide 5a-cholan-24-oïque).
De préférence, le dérivé d’acide biliaire est une cholyl-lysyl-fluorescéine (CLF) répondant à la formule :
Figure BE1018734A3D00141
ou ses sels. De préférence, le dérivé d’acide biliaire est un sel trisodique. De préférence, le dérivé d’acide biliaire est un sel trisodique de la fluorescéine lisicol.
Le demandeur a découvert, de manière inattendue, que, contrairement aux enseignements de l'art antérieur, MRP2 et MRP3 transportent des composés de formule générale (I). Un composé de ladite formule peut par conséquent être utilisé pour déterminer l'activité fonctionnelle de la voie de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal.
Les composés de formule (I) peuvent être utilisés dans le diagnostic ou le pronostic du syndrome de Dubin-Johnson ou dans la fabrication d'un agent de diagnostic ou de pronostic destiné à être utilisé dans le diagnostic ou le pronostic du syndrome de Dubin-Johnson. Le syndrome de Dubin-Johnson est lié à des mutations dans le gène MRP2. En conséquence, la détermination de l'activité de la voie de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet peut fournir des informations utiles dans le diagnostic ou le pronostic du syndrome de Dubin-Johnson.
Les composés de formule (I) peuvent également être utilisés pour déterminer la fonction rénale, la fonction biliaire, la fonction intestinale, ou la fonction hépatique d'un sujet humain ou animal, ou être utilisés dans la fabrication d'un agent de diagnostic ou de pronostic destiné à déterminer la fonction rénale, la fonction biliaire, la fonction intestinale, ou la fonction hépatique d'un sujet humain ou animal. MRP2 est exprimé dans les reins, les intestins et le foie, la détermination de l'activité de la voie MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet peut par conséquent fournir des informations destinées à être utilisées dans la détermination de la fonction rénale, de la fonction biliaire, de la fonction intestinale, ou de la fonction hépatique d'un sujet.
Les composés de formule (I) peuvent également être utilisés dans le diagnostic ou le pronostic de la cirrhose hépatique, de la cholestase, d'une stéatose hépatique, d'une maladie hépatique due à l'alcool, d'une cholangite sclérosante primitive, ou d'une hépatite virale, ou dans la fabrication d'un agent de diagnostic ou de pronostic destiné à être utilisé dans le diagnostic ou le pronostic d'une cirrhose hépatique, de la cholestase, d'une stéatose hépatique, d'une maladie hépatique due à l'alcool, d'une cholangite sclérosante primitive, ou d'une hépatite virale.
Les composés de formule (I) peuvent également être utilisés pour déterminer l'état de la voie de clairance de la bilirubine ou de la voie de clairance de la bilirubine conjuguée d'un sujet humain ou animal, ou pour fabriquer un agent de diagnostic ou de pronostic destiné à déterminer l'état de la voie de clairance de la bilirubine ou de la voie de clairance de la bilirubine conjuguée d'un sujet humain ou animal.
La bilirubine est un produit de décomposition du catabolisme de Thème. Dans le foie, la bilirubine est conjuguée avec de l'acide glucuronique et est excrétée dans la bile. La bilirubine et les conjugués de la bilirubine, y compris sous la forme de glucuronides de la bilirubine tels que la glucuronosyl-bilirubine, sont transportés via MRP2 [Jedlitschky et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol 2006 Jun 2 (3) : 351-66]. Des niveaux accrus de bilirubine conjuguée dans le plasma indiquent un trouble potentiel du transport biliaire de la bilirubine conjuguée, par conséquent les niveaux de bilirubine sériques sont utiles pour prédire la mortalité chez les candidats à la transplantation hépatique.
La bilirubine et les conjugués de la bilirubine sont transportés via la voie d'efflux de MRP2, des déterminations de l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 peuvent par conséquent être utilisées pour déterminer l'activité de clairance de la bilirubine ou de la bilirubine conjuguée. La détermination de la clairance de la bilirubine et de la bilirubine conjuguée peut donner une indication de l'état de la voie d'efflux de la bilirubine. La détermination de l'état de la voie de clairance de la bilirubine ou de la voie de clairance de la bilirubine conjuguée d'un sujet peut indiquer des troubles du transport de la bilirubine ou de la bilirubine conjuguée.
Les termes « voie de clairance de la bilirubine » et « voie de clairance de la bilirubine conjuguée » tels qu'ils sont utilisés dans le présent document font référence au transport de la bilirubine/de la bilirubine conjuguée à travers les membranes cellulaires.
Les caractéristiques préférées de ces aspects sont telles que décrites ci-dessus.
Selon un autre aspect de l'invention, on propose un programme informatique destiné à déterminer l'activité fonctionnelle de la voie d'élimination de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal en utilisant une détermination du niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang d'un sujet humain ou animal à un intervalle de temps prédéterminé après l'introduction d'une quantité du dérivé d’acide biliaire dans le sujet pour obtenir une valeur numérique, la valeur numérique indiquant l'activité fonctionnelle de la voie d'élimination de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
Selon un autre aspect de l’invention, il est fourni un procédé de détermination de l’activité fonctionnelle de la voie d’absorption d’OATPlB3 chez un sujet humain ou animal, ledit procédé comprenant : (i) la détermination in vitro du niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang dudit sujet humain ou animal à un intervalle de temps prédéterminé après l'introduction d'une quantité du dérivé d’acide biliaire dans le sujet, et (ii) l'utilisation de la détermination obtenue dans l'étape (i) pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d’absorption d’OATPlB3 du sujet.
Des études précédentes ont montré l’absorption partielle dépendante du sodium de certains, mais pas tous, sels biliaires fluorescents dans des hépatocytes de rat [Maglova LM et al, Hepatology 1995 Aug;22(2):637-647]. En outre, l’absorption de cholyl-glycyl-fluorescéine dans des cellules CHO exprimant Ntcp de rat, mais pas dans les cellules de type sauve, a été démontrée [Boyer JL et al, Am J Physiol 1994 Mar;266(3 Pt 1):G382-G387]. On pourrait donc s’attendre à ce que le CLF soit incorporé par les hépatocytes via NTCP. A la place, on a trouvé que le CLF est incorporé dans les hépatocytes via OATP1B3, et nous avons trouvé que le procédé ci-dessus peut être utilise pour indiquer l’activité fonctionnelle de la voie d’absorption d’OATPlB3 chez un sujet
Les caractéristiques préférées de cet aspect de l’invention sont comme décrits ci-dessus en relation avec les aspects précédemment décrits de l’invention.
L'invention va maintenant être décrite par le moyen d'exemples par référence aux dessins, dans lesquels :
La figure 1A est une microphotographie en immunofluorescence présentant l'expression du polypeptide co-transporteur de Na+/taurocholate (NTCP) dans des cellules transfectées de manière stable. Sur la figure IA, les parties fluorescentes de la microphotographie apparaissent plus sombres et les parties non fluorescentes apparaissent en blanc. Le NTCP est une protéine qui médie l'absorption des acides biliaires dans les cellules hépatiques. Le NTCP a été visualisé tel que ceci est décrit dans la section matériels et méthodes, ci-dessous.
La figure IB présente la caractérisation cinétique de cellules CHO-NTCP, les cellules ayant fait l'objet d'une incubation avec des concentrations croissantes de TC (taurocholate) pendant 45 secondes en présence de sodium () ou de potassium (A). Les taux d'absorption dépendante du sodium (▼) ont été utilisés pour déterminer les paramètres cinétiques. Les données représentent les moyennes ± 1ΈΤ (écart-type) de déterminations en triple. Lorsque les barres d'erreur sont absentes, elles étaient inférieures au symbole.
Les figures 2A à 2D concernent des études d'absorption sur des cellules CHO exprimant les transporteurs de l'absorption hépatocellulaire ; les données des figures 2B à 2D représentent les moyennes ± l'ET.
La figure 2A présente des images de fluorescence après l'incubation de cellules transporteurs CHO avec 1 pmole/L de CLF pendant 5 minutes. Les images de fluorescence (panneaux de droite) sont complétées par des images en contraste de phase (panneaux de gauche). Sur les images en fluorescence (panneaux de droite), les parties fluorescentes apparaissent plus sombres et les parties non fluorescentes apparaissent en blanc.
La figure 2B est un graphique présentant le transport de la CLF médié par le NTCP en présence (barres noires) et en l'absence (barres blanches) de sodium pendant 1 et 5 minutes.
La figure 2C est un graphique présentant le transport de la CLF pour des cellules CHO (de type sauvage et cellules transfectées avec OATP1B1, OATP1B3 et OATP2B1). On a fait incuber les cellules avec 1 pmole/L de CLF pendant 1 (barre blanche) ou 5 (barres noires) minutes.
La figure 2D concerne la cinétique du transport de la CLF médié par OATP1B3 et propose un graphique du transport de la CLF par rapport à la concentration de CLF. On a fait incuber les cellules avec des concentrations croissantes de CLF pendant 45 secondes. Les taux d'absorption corrigés pour une liaison de 0 seconde sont proposés.
Les figures 3A à 3D concernent l'inhibition par la CLF de l'activité de transport des transporteurs assurant la capture hépatocellulaire. On a fait incuber des cellules CHO exprimant NTCP, OATP1B1, OATP1B3 et OATP2B1 avec 0, 5 ou 50 pmoles/L de CLF et avec les substrats, 2,5 pmoles/L de TC, 1 pmole/L d'estrone-3-sulfate, 10 pmoles/L de TC et 1 pmole/L d'estrone-3-sulfate, respectivement. Les données représentent les moyennes ± ΓΕΤ de déterminations en triple.
La figure 3A présente les résultats pour des cellules CHO exprimant le NTCP avec 2,5 pmoles/L de TC.
La figure 3 B présente les résultats pour des cellules CHO exprimant OATP1B1 avec 1 pmole/L d'estrone-3-sulfate.
La figure 3C présente les résultats pour des cellules CHO exprimant OATP1B3 avec 10 pmoles/L de TC.
La figure 3D présente les résultats pour des cellules CHO exprimant OATP2B1 avec 1 pmole/L d'estrone-3-sulfate.
La figure 4A présente des transferts de type Western de vésicules membranaires de cellules d'insectes SJ21 non infectées et infectées par un baculovirus contenant l'ADNc d'ABCBll, d'ABCC2, d'ABCC3 et d'ABCG2. Les transferts de type Western montrent la présence de protéines ABCB11, ABCC2, ABCC3 et ABCG2 dans les cellules d'insectes Sfl\ infectées respectives.
Les figures 4B à 4F présentent le transport dépendant du temps de la CLF dans des vésicules de la membrane plasmatiques de cellules Sfl\ de type sauvage (B), de cellules Sfl\ exprimant ABCB11 (C), ABCG2 (D), ABCC2 (E) ou ABCC3 (F), respectivement.
Les figures 4G et 4H présentent l'absorption dépendante de la concentration de CLF dans des vésicules membranaires de SJ21 contenant ABCC2 (G) ou ABCC3 (H) respectivement.
Les figures 5A et 5B présentent l'inhibition par la CLF du transport de DNP-SG et de TC dans des vésicules membranaires SJ21 contenant les protéines ABCC2 (A) et ABCB11 (B), respectivement. Les valeurs sont exprimées sous la forme d'un pourcentage du transport dépendant de ΓΑΤΡ maximal. On a testé la signification en utilisant un test t de Student bilatéral : *P < 0,05 pour le transport, en présence vs. en l'absence d'inhibiteur.
La figure 6 présente la clairance plasmatique de la CLF chez les souris. On a administré, à des souris de type sauvage, Abcc3'/' et Abcc2~/~, 100 pL de CLF à 2 mmoles/L par injection dans la veine caudale. Après les points temporels indiqués, on a prélevé du sang. Les données sont exprimées sous la forme du pourcentage moyen du niveau initial de CLF à 2 minutes. On a testé la signification en utilisant un test t de Student bilatéral : *P < 0,05 pour les souris Abcc2-/- vs. de type sauvage.
La figure 7A présente l'apparition dépendante du temps de CLF dans la bile de souris de type sauvage, Abcc3'/' et Abcc2'/\ Les données représentent les moyennes ± ΓΕΤ.
La figure 7B présente les niveaux de CLF dans le sang, dans l'urine, dans le foie et dans la bile de souris de types sauvage, Abcc3'/' et Abcc2'/' après 2 heures. Les souris ont reçu 100 yCL de CLF à 1 mmole/L par injection dans la veine caudale. Les données représentent les moyennes ± ΓΕΤ. Les niveaux plasmatiques sont exprimés en nmoles/L et les niveaux dans les urines, le foie et la bile, en pourcentage de la dose administrée. On a testé la signification en utilisant un test t de Student bilatéral : *P < 0,05 pour les souris Abcc2"/" vs. de type sauvage. Les données représentent les moyennes ± ΓΕΤ.
La figure 8 concerne l'absorption intestinale de TC et de CLF. L'apparition de TC et de CLF dans la bile après l'administration iléale d'un mélange de 100 μί, de CLF et de TC à 2 mmoles/L dans des souris de type sauvage. On a prélevé la bile après les points temporels indiqués. Les données représentent les moyennes ± l'ET. Le graphique est un tracé des niveaux biliaires cumulés sous la forme de pourcentage de la dose appliquée. On a testé la signification en utilisant un test t de Student bilatéral : *P < 0,05 pour l'absorption de TC vs l'absorption de CLF.
La figure 9 présente les courbes d'élimination plasmatique relatives à l'exemple 2. Le graphique de droite a un axe linéaire et le graphique de gauche a un axe log-linéaire.
La figure 10 présente les courbes d'élimination plasmatique relatives à l'exemple 10. Le graphique de droite a un axe linéaire et le graphique de gauche a un axe log-linéaire.
Exemple 1 : démonstration établissant que le dérivé d’acide biliaire CLF est un substrat pour MRP2
Matériels
On a obtenu la cholyl lysyl fluorescéine (CLF) auprès de Norgine, Harefield, Royaume-Uni. On a obtenu les [3H]GSH (52 Ci/mmole) et [3H]TC (1,19 Ci/mmole) auprès de Perkin Eimer Life and Analytical Sciences (Boston, MA, USA). On a mené à bien la synthèse du [3H]DNP-SG tel que ceci est décrit par de Waart DR et al. [Liver Int 2006 Apr ;26 (3) : 362-368]. On a acheté du [3H]E2l7ßG (40,5 Ci/mmole) auprès de NEN Life Science Products (Boston, MA, USA). On a acheté des filtres à membrane d'acétate de cellulose auprès de Schleicher et Schuell (Dassel, Allemagne). On a obtenu le sucrose auprès de Brunschwig Chemie (Amsterdam, Pays Bas). On a acheté du phosphate de créatine auprès de Boehringer Mannheim (Almere, Pays Bas). On a acheté la créatine kinase auprès de Roche Diagnostics (Mannheim, Allemagne). On a obtenu le méthanol (qualité CLHP) auprès de Bäcker (Deventer, Pays Bas). On a acheté du Triton X-100 auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne). On a acheté tous les autres produits chimiques et réactifs auprès de Sigma-Aldrich (Zwijndrecht, Pays Bas).
Animaux
Des souris Abcc2'/' (contre un virus Friend type B (FVB) comme fond) ont été élevées au National Cancer Institute (Amsterdam, Pays Bas). La production et la caractérisation des souris AbccZ/' étaient telles que décrites par Vlaming et al. [J Pharmacol Exp Ther 2006 Jul ;318 (1) : 319-327]. Des souris de type sauvage et Abcc3~/~ (dans un contexte de FVB) ont été élevées à l'institut pour animaux du Academie Medical Center. La production et la caractérisation des souris Abcc3'A étaient telles que décrites par Zelcer et al. [J Hepatol 2006 Apr ;44 (4) : 768-775].
Génération de cellules CFTO exprimant NTCP de manière stable et lignées cellulaires On a coupé l'ADNc du NTCP humain [Hagenbuch et al, J Clin Invest 1994 Mar ;93 (3) : 1326-1331] avec EcoRV et Hindi puis on a ligaturé la région codante dans pcDNA5/FRT (Invitrogen, Life-Technologies, Carlsbad, CA). On a transfecté des cellules CHO Flpln (Invitrogen, Life-Technologies) avec la construction résultante en utilisant de la lipofectamine® 2000 (Invitrogen, Life-Technologies). On a sélectionné les cellules transfectées de manière stable avec 550 pg d'hygromycine B dans un milieu HAM-F12 (Gibco, Invitrogen, Life-Technologies). On a cloné les cellules transfectées par la méthode de dilution limite. On a identifié les clones exprimant le NTCP fonctionnel par des tests de transport avec du taurocholate marqué par la radioactivité (voir ci-dessous). Pour davantage caractériser les cellules clonées, on a localisé le NTCP par immunofluorescence en utilisant un anticorps polyclonal contre le NTCP [Kullak-Ublick G et al., Gastroenterology 1997 Oct;113 (4) : 1295-1305] tel que décrit par Huber RD et al. [Am J Physiol Cell Physiol 2007 Feb ;292 (2) : C795-C806]. Les cellules CHO exprimant OATP1B1, OATP1B3 et OATP2B1 ont été décrites préalablement (Treiber et al, DMD 35 :1400-1407,2007].
Expérience de transport avec des lignées cellulaires transfectées de manière stable Pour les expériences portant sur le transport, on a cultivé des cellules, développées dans des boîtes de culture de 3 cm, pendant 24 heures dans un milieu supplémenté de butyrate de sodium à 5 mmoles/L pour faire augmenter les niveaux d'expression des transporteurs transfectés [Palermo DP et al, J Biotechnol 1991 Jun ;19 (1) : 35-47].
- Expériences portant sur le transport avec capture de substrats marqués par la radioactivité : on a réalisé ces expériences tel que décrit par Huber RD et al. [Am J Physiol Cell Physiol 2007 Feb ;292 (2) : C795-C806].
- Expériences portant sur le transport avec absorption de CLF : l'absorption a été réalisée dans les mêmes tampons que pour les substrats radioactifs ci-dessus. Pour visualiser l'absorption de la CLF, on a immédiatement inspecté les cellules avec un microscope inverse Leica-DM-IRBE (Leica-Microsystems, Wetzlar, Allemagne) doté d'une caméra (Hamamatsu-Photonoics, Japon). Pour déterminer l'absorption de la CLF, on a solubilisé les cellules par addition de 2 mL de Triton-X-100 à 1 % (pds/v). Après la solubilisation complète, on a utilisé 1,5 mL pour mesurer la fluorescence dans un spectromètre à luminescence réglé à λβχς 486 nm (fente lOnm) et Xem 520 nm (fente 5 nm). On a déterminé la protéine avec le procédé à l'acide bicinchoninique en utilisant un kit d'Interchim (Montluçon, France). On a corrigé les données de transport de lignées cellulaires exprimant OATP pour la liaison par soustraction des points temporels 0 minute (valeurs nulles) et, à l'exception des figures 2B et 2C, on les a normalisées par minute. On a réalisé une analyse cinétique avec une régression non linéaire des données à l'équation de Michaelis-Menten en utilisant GraphPad PRISM-V-4.00 (GraphPad-Software-Inc., San Diego, CA).
Préparation des vésicules membranaires
On a produit un baculovirus recombinant tel que ceci est décrit par de Waart et al. [Liver Int 2006 Apr ;26 (3) : 362-368]. Les baculovirus ABCC3- et ABCG2-recombinants étaient une courtoisie de Borst [Breedveld, P. et al, Cancer Res 2004 Aug 15 ;64 (16) : 5804-5811 et Borst P. et al, J Biol Chem 2001 Dec 7 ;276 (49) : 46400-46407.]. Le baculovirus ABCB11-recombinant était une courtoisie de Thompson [Thompson RJ et al, Gastroenterology 2002 Nov ;123 (5) : 1649-1658]. On a infecté des cellules Sß. 1 cultivées à 27°C avec un baculovirus contenant l'ADNc d'ABCB11, ABCC2, ABCC3 et ABCG2. On a récolté les cellules 2 à 4 jours après l'infection. La préparation de vésicules membranaires a été réalisée tel que ceci est décrit par de Waart et al. [Liver Int 2006 Apr ;26 (3) : 362-368].
Transfert de type Western et analyse de protéines
On a fractionné des vésicules membranaires par SDS-PAGE à 6 %, on les a transférées sur des membranes en nitrocellulose (Schleicher & Schuell, Dassel, Allemagne) que l'on a bloquées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)/5 % de lait en poudre/0,05 % de Tween-20. On a utilisé les anticorps suivants : sonde anti-his ; sc-803 (Santa Cruz, USA), anti-ABCG2 ; BXP-21 [Maliepaard M et al.,Cancer Res 2001 Apr 15 ;61 (8) : 3458-3464], anti-ABCC2 ; M2III6 [Scheffer et al., Cancer Res 2000 Sep 15 ;60 (18) : 5269-5277] et anti-ABCC3 ; Μ3ΠΙ21 [Scheffer et al., Cancer Res 2000 Sep 15 ;60 (18) : 5269-5277]. On a visualisé les complexes immuns avec des immunoglobulines conjuguées à la peroxydase de raifort et on les a détectés en utilisant la chimiluminescence (Amersham, RU).
Test de transport avec des vésicules de membrane plasmatique
On a étudié le transport avec des vésicules membranaires en utilisant les techniques de filtration rapide décrites par Heijn M et al. [Am J Physiol 1992 Jan ;262 (1 Pt 1) : C104-C110]. On a mesuré le marqueur radioactif avec un compteur à scintillation. Lorsque l'on a utilisé la CLF en tant que sonde, on a placé les filtres dans un tube en verre, on a ajouté du Triton-X-100 à 0,1 % et on a soumis les tubes à un vortex. On a pipeté les échantillons dans des plaques à 96 puits (Kartell, Noviglio, Italie) et on a quantifié la quantité de CLF par mesure de fluorescence à λεΧ0 485 nm et λεΠι520 nm en utilisant un Novostar (BMG-labtech, Offenburg, Allemagne).
Expériences animales
On a placé des souris mâles dans des locaux pour animaux exempts de pathogènes sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures. On a anesthésié les souris avec une combinaison d'Hypnorm (VetaPharma, RU ; 11,8 mg/kg de fluanisone et 0,37 mg/kg de citrate de fentanyle) et du diazépam (Centrafarm, Etten-Leur, Pays-Bas ; 5,9 mg/kg de valium). On a maintenu les températures corporelles à 36 ± 1°C sur des coussins chauffants thermostatés. Pour les études de clairance, on a injecté aux souris de la CLF, 100 pL (2 mmoles/L) dans la veine caudale. Ensuite, on a prélevé du sang de la carotide aux points temporels indiqués. On a déprotéinisé les échantillons par addition de deux volumes de méthanol et on a quantifié la quantité de CLF dans le surnageant par mesure de fluorescence, tel que ceci est décrit ci-dessus.
Pour les études portant sur la sécrétion biliaire, on a canulé la vésicule biliaire avec une tubulure en polyéthylène PE 10 et on a injecté 100 pL (1 mmole/L) dans la veine caudale. On a recueilli la bile par fractions de 10 minutes ; on a prélevé le foie et le sang à la fin de l'expérience. On a déprotéinisé les foies homogénéisés par addition de 2 volumes de MeOH, et on a dilué les échantillons de bile et de sang avec du Triton-X-100 à 0,1 %. On a quantifié la quantité de CLF par mesure de fluorescence tel que ceci est décrit ci-dessus.
Pour les études d'absorption intestinale de taurocholate (TC) et de CLF, on a anesthésié les souris et on a canulé leur vésicule biliaire tel que ceci est décrit ci-dessus. On a administré aux souris à la fois du TC et de la CLF par injection de 100 pL (2 mmole/L) de CLF dans l'iléon. On a recueilli la bile toutes les 15 minutes. On a mesuré la radioactivité dans un compteur à scintillation et on a quantifié la CLF tel que ceci a été décrit ci-dessus.
Résultats
On a étudié le rôle de différents transporteurs hépatocellulaires des sels biliaires dans l'absorption hépatique de la CLF. A ces fins, on a généré des cellules CHO exprimant stablement le NTCP (CHO-NTCP) et on les a caractérisées. La figure IA présente la microphotographie en immunofluorescence de cellules transfectées de manière stable, d'un test d'immunofluorescence utilisant un anticorps polyclonal contre le NTCP. Une microphotographie en immunofluorescence de cellules de type sauvage (non montrée) n'a pas mis en évidence de fluorescence et par conséquent pas de NTCP dans les cellules CHO de type sauvage, mais la microphotographie en immunofluorescence des cellules transfectées (figure IA) a affiché une fluorescence au niveau des membranes cellulaires et présente par conséquent une expression claire de la membrane plasmatique du NTCP dans des cellules stablement transfectées. En outre, l'absorption de taurocholate (TC) dans ces cellules était dépendante du sodium (données non illustrées) et saturable avec des concentrations croissantes de taurocholate. Même à des concentrations élevées de taurocholate, l'absorption en l'absence de sodium était négligeable (figure IB). Les valeurs de Km et de Vmax étaient de 16,0 pmoles/L et de 6 738 pmoles de TC/mg de protéine/minute, respectivement, pour le transport dépendant du sodium du TC (figure IB). En revanche, on n'a pas observé d'absorption dépendante du sodium de la CLF médiée par le NTCP par analyse de fluorescence ni par détermination quantitative de la CLF de cellules exprimant le NTCP incubées avec de la CLF (figures 2A et 2B), respectivement. L'image en fluorescence des cellules CHO exprimant le NTCP (voir la figure 2A) met en évidence l'absence d'absorption de CLF dans les cellules. La longue cellule sur la droite de l'image des cellules CHO exprimant le NTCP ; qui présente une faible coloration fluorescente, pouvait n'être plus vivante. L'absorption de CLF en l'absence de sodium (figure 2B) était comparable à celle de cellules de type sauvage (non illustrées) et avait tendance à augmenter un minimum avec une augmentation de la durée d'incubation.
Ensuite, on a étudié l'absorption de CLF médiée par OATP1B1, OATP1B3 et OATP2B1 dans des cellules CHO de type sauvage et transfectées de manière stable. Les images de fluorescence des cellules CHO exprimant OATP1B1, OATP1B3 et OATP2B1 (voir la figure 2A) mettent en évidence l'absorption de CLF pour les cellules CHO exprimant OATP1B3 mais pas pour OATP1B1 et OATP2B1. L'image en fluorescence des cellules CHO exprimant OATP1B3 présente une forte coloration fluorescente des cellules, et présente par conséquent une absorption nette de la CLF dans les cellules exprimant OATP1B3. L'image en fluorescence des cellules CHO exprimant OATP1B1 présente une très faible coloration par fluorescence, mettant en évidence que l'absorption de CLF dans les cellules OATP1B1 était faible mais cohérente. En revanche, pas d'absorption dans OATP2B1 n'a été constatée, l'image en fluorescence des cellules CHO exprimant OATP2B1 ne présentant pas de coloration de fluorescence à l'exception d'une seule cellule positive, visible sur l'image en fluorescence, qui peut être une cellule dont la vitalité est partiellement réduite, tel qu'évalué par la microscopie en contraste de phase. Des taux élevés de transport de la CLF dépendant du temps sont observés uniquement dans des cellules CHO exprimant OATP1B3 (figure 2A et 2C, respectivement). L'absorption de CLF par les cellules OATP1B1 a été observée de manière cohérente, mais pas par les cellules OATP2B1 (figure 2A et 2C), indiquant que la CLF n'est pas un substrat pour OATP2B1. Le transport de la CLF médié par OATP1B3 était dépendant de la concentration (figure 2D) avec des valeurs de 4,6 ± 2,47 pmoles/L et de 213 ± 42pmoles de CLF/mg de protéine/minutes, respectivement (moyenne de trois déterminations indépendantes). Les expériences d'absorption avec des concentrations croissantes de CLF et des cellules OATP1B1 ont présenté des preuves de saturabilité (non illustré). En raison d'un faible rapport signal/bruit, en particulier à des concentrations en CLF plus élevées, aucune détermination des paramètres cinétiques n'a été possible.
On a réalisé des études pour déterminer si le transport de composés modèles médié par le NTCP, OATP1B1, OATP1B3 et OATP2B1 pouvait être inhibé par la CLF en dépit du fait que la CLF soit un substrat pour OATP1B3 uniquement. On a fait incuber des cellules CHO exprimant NTCP, OATP1B1, OATP1B3 et OATP2B1 avec 0, 5 ou 50 pmole/L de CLF et avec les substrats, 2,5 pmoles/L de TC, 1 pmole/L d'estrone-3-sulfate, 10 pmoles/L de TC et 1 pmole/L d'estrone-3-sulfate, respectivement. Les données représentent les moyennes ± ΓΕΤ de déterminations en triple. De manière étonnante, la CLF a inhibé très efficacement le transport de TC via le NTCP (figure 3 A). Le transport de TC médié par OATP1B3 a pu être inhibé par la CLF de manière dose-dépendante (figure 3C) comme on s’y attendait. Finalement, le transport du modèle de substrat estrone-3-sulfate médié par OATP1B1 et OATP2B1 a été inhibé par la CLF, toutefois bien moins efficacement (figures 3B et 3D, respectivement), ce qui corrobore les expériences d'absorption avec la CLF. Il faut remarquer que l'addition de CLF à des cellules de type sauvage n'a pas eu d'influence sur l'absorption du substrat, indiquant qu'elle n'interfère pas avec l'intégrité structurelle de la membrane plasmatique (figure 3).
De manière à tester si les transporteurs canaliculaires dépendants de ΓΑΤΡ ABCB11, ABCC2 et ABCG2, ainsi que le transporteur basolatéral ABCC3, médiaient le transport de la CLF, on a fait exprimer ces protéines humaines dans des cellules d'insectes Sfl\ (figure 4A). La figure 4B présente la légère absorption dépendante de l'ATP qui s'est produite dans les vésicules témoins, indiquant qu'un transporteur endogène est capable d'absorber la CLF de manière dépendante de l'ATP. Le transport de la CLF dépendant de ΓΑΤΡ dans des vésicules membranaires contenant les protéines ABCB11 et ABCG2 n'était pas plus important que dans les vésicules témoins (figures 4C et D, respectivement). Cependant, des vésicules membranaires contenant ABCC2 et ABCC3 ont présenté des taux de transport de la CLF largement supérieurs comparés aux vésicules membranaires de SJ21 de type sauvage témoins (figures 4E et F, respectivement).
On a fait incuber les vésicules membranaires (10 pg et 30 pg de protéine totale pour ABCC2 et ABCC3, respectivement) avec différentes concentrations de CLF en présence ou en l'absence de 4mmoles/L d'ATP. Le transport de la CLF médié par ABCC2 et ABCC3 était dépendant de la concentration (figures 4G et H, respectivement). Les valeurs de Km étaient de 3,3 ± 2,0 pmoles/L et de 3,7 ± 1,0 pmole/L pour ABCC2 et ABCC3, respectivement, et les valeurs de Vmax étaient de 436 ± 215 pmoles de CLF/mg de protéine/minute et de 188 ± 55 pmoles de CLF/mg de protéine/minute, respectivement.
Un autre substrat modèle pour ABCC2 est le dinitrophényl-glutathion (DNP-SG) et la CLF devrait inhiber le transport de ce composé. On a atteint 50 % de l'inhibition maximale du transport du DNP-SG avec la CLF à approximativement 1 pmole/L (figure 5A). Bien qu'on n'ait pas obtenu d'indications selon lesquelles la CLF était un substrat pour ABCB11, elle contient la fraction cholyle et par conséquent peut être capable d'inhiber le transport des sels biliaires via ABCB11. En effet, le transport de TC a été inhibé par la CLF d'une manière dose dépendante et la concentration à laquelle 50 % du transport maximal a été observé était d'approximativement 10 pmoles/L (figure 5B).
Pour étudier le rôle d'Abcc2 et Abcc3 dans la clairance plasmatique de la CLF, on a examiné les niveaux de CLF dans le plasma de souris de type sauvage, Abcc2~/~ et Abcc3'A après une seule injection de CLF dans la veine caudale. La clairance de la CLF était fortement réduite chez les souris Abcc2'/' comparées aux souris de type sauvage, mais n'était pas modifiée chez les souris Abcc3'A (figure 6). Pour examiner le rôle d'Abcc2 dans la production biliaire de la CLF, on a réalisé des expériences de perfusion avec des souris de type sauvage et des souris Abcc2 déficientes. L'excrétion biliaire de la CLF était largement retardée chez les souris Abcc2~/~ (figures 7A). En conséquence, pratiquement 70 % de la dose de CLF étaient excrétés dans la bile chez les souris de type sauvage au cours des 20 minutes suivantes, alors que pendant la même durée, moins de 2 % étaient excrétés dans la bile de souris Âhcc2~/~. Cent-vingt minutes (120 minutes) après l'administration (figure 7B), l'excrétion biliaire cumulée de CLF était toujours considérablement supérieure chez les souris de type sauvage comparées aux souris Abcc2'A (85 % vs. 32 % de la dose administrée), ce qui a résulté en une rétention hépatique considérablement supérieure de la CLF chez les souris Abcc27 vs. de type sauvage (64 % vs. 1 % de la dose administrée) et en des niveaux dans le sang plus élevés chez les souris Abcc2'/' vs de type sauvage (1306 ± 749 nmoles/L vs 83 ± 21 nmoles/L). Ces données indiquent que, chez les souris, Abcc2 est le principal transporteur responsable de l'excrétion biliaire de la CLF. Conformément aux observations de la figure 7A, on a observé que la production biliaire de CLF n'était pas affectée chez les souris Abcc3~/m comparées aux souris de type sauvage et on n'a pas constaté de différences dans les niveaux plasmatiques et hépatiques de CLF (figure 7B).
Après l'excrétion Hans la bile et la délivrance dans le duodénum, les sels biliaires sont absorbés dans l'iléon via le transporteur apical de l'acide biliaire dépendant du sodium (ASBT) [Wong MH et al, J Biol Chem 1995 Nov 10 ;270 (45) : 27228-27234], Pour étudier si la CLF est absorbée dans l'intestin, on a injecté des quantités équimolaires de CLF et de [3H]TC dans le duodénum ou l'iléon de souris FVB de type sauvage. Après ceci, on a recueilli la bile et on a quantifié les quantités de [3H]TC et de CLF excrétés dans la bile. Quatre heures et demie après l'injection iléale des deux composés, uniquement 2 % de la CLF étaient récupérés dans la bile alors que cette quantité atteignait 68 % pour le [3H]TC. Par conséquent, l'absorption de la CLF dans l'iléon terminal est minimale. Ceci met en évidence que la CLF n'est pas un bon substrat pour l'Asbt.
Conclusions
Les résultats des études portant sur l'absorption de CLF mettent en évidence que l'absorption de CLF dans les hépatocytes n'est probablement pas médiée par le NTCP, étant donné que l'on n'a pas constaté d'absorption de CLF dans des cellules CHO
exprimant le NTCP humain. Ceci n'était pas dû à une protéine non fonctionnelle, étant donné que ces cellules étaient complètement capables de médier l'absorption du sel biliaire naturel, le TC. L'homologue iléal du NTCP hépatique est l'ASBT, qui médie le transport de sels biliaires conjugués et non conjugués [Geyer J et al., Arch Pharmacol 2006 Mar ;372 (6) : 413-431]. On a obtenu une preuve indirecte suggérant que la CLF n'était pas transportée via l'Asbt (murin), alors que le TC injecté dans la lumière iléale de souris de type sauvage était très efficacement récupéré dans la bile (bien que pas de CLF ne soit rencontrée). Ces données suggèrent que le NTCP et l'Abst, qui sont des transporteurs homologues des sels biliaires dépendants du sodium, sont incapables de transporter la CLF.
Des études préalables ont mis en évidence une absorption dépendante du sodium partielle de certains, mais pas de la totalité, des sels biliaires fluorescents dans les hépatocytes de rats [Maglova LM et al., Hepatology 1995 Aug ;22 (2) : 637-647]. En outre, l'absorption de cholyl-glycyl-fluorescéine dans les cellules CHO exprimant le Ntcp de rat, mais pas dans les cellules de type sauvage, a été mise en évidence [Boyer JL et ai, Am J Physiol 1994 Mar ;266 (3 Pt 1) : G382-G387]. Contrairement à la CLF, un autre conjugué de sel biliaire, le taurocholyl-chlorambucil, s'est avéré être un substrat pour le NTCP [Kullak-Ublick GA et al., Gastroenterology 1997 Oct ;113 (4) : 1295-1305]. Le dernier composé est conjugué au groupe 3-OH du sel biliaire alors que la CLF est conjuguée à la chaîne latérale. Dans ce contexte, il est intéressant que Baringhaus et al. aient déterminé le pharmacophore du NTCP et de l'ASBT et qu'ils aient découvert que le groupe 3-OH n'est pas essentiel pour le transport alors que la chaîne latérale acide l'est [Baringhaus KH et al., J Lipid Res 1999 Dec ;40 (12) : 2158-2168]. Les données ci-dessus sont en accord complet avec ce modèle et indiquent une différence inter-espèces de spécificité du substrat du NTCP/Ntcp.
Le transporteur de sel biliaire moins spécifique, OATP1B3, s'avère être un candidat plus probable pour l'absorption dans l'hépatocyte, ce qui est en accord avec la vaste spécificité de substrats de ce transporteur [Hagenbuch B et al., Pflügers Arch 2004 Feb ;447 (5) : 653-665].
Ces données mettent en évidence, de manière surprenante et concluante, que ABCC2/Abcc2 est le plus important des transporteurs responsables de l'excrétion biliaire de la CLF et pas ABCB11. Chez les souris, la grande majorité de la CLF dans le plasma est excrétée dans la bile via Abcc2. Il est possible d'arguer du fait que la spécificité de substrat d'ABCC2 humain peut être différente de celle chez les souris. Cependant, Hans les tests portant sur la vésicule membranaire plasmatique, il a été mis en évidence que le transport de la CLF via ABCB11 humain était insignifiant comparé à celui via ABCC2 humain. Les données que nous proposons ici mettent définitivement en évidence que la CLF n'est pas transportée via ABCB11.
Tel que ceci a été décrit ci-dessus, Mills et al ont utilisé des rats TR^hcc2-déficients et ont mesuré la CLF dans la bile après une injection de CLF dans la veine jugulaire [J Hepatol 1999 Oct;31 (4) : 678-684]. La quantité cumulée de CLF dans la bile était similaire chez les rats TR et normaux après 30 minutes. Cependant, en prenant pour base ces nouvelles données, il semble que les données cumulées aient été mal interprétées (précisément, que les taux de transport initiaux pourraient encore être différents). Les nouveaux tests, décrits dans le présent document, ont consisté en une étude similaire mais plus poussée en utilisant des souris de type sauvage et Abcc2’/~. Chez les souris déficientes en Abcc2, l'excrétion biliaire de la CLF était fortement réduite et est restée dans le foie, ce qui suggère qu'Abcc2, et non Abcbll, est le principal transporteur responsable de l'excrétion biliaire de la CLF. Etant donné qu'il existe toujours un transport biliaire résiduel de la CLF chez les souris Abcc2/, une contribution d'Abcb 11, si mimine soit-elle, ne peut pas être exclue.
La perte de fonction MRP2 est souvent bien tolérée et compensée par la régulation à la hausse d'autres transporteurs membranaires, particulièrement de MRP3 [Nies et. al. Pflügers Arch (2007) 453 : 643-659]. Les études mettent en évidence que non seulement ABCC2, mais aussi ABCC3 médient le transport de la CLF. Par conséquent, si MRP2 est régulé à la baisse chez les patients, ceci peut être compensé par une régulation à la hausse de MRP3, et l'activité de la voie fonctionnelle de MRP2 et/ou MRP3 du sujet peut être examinée en utilisant la CLF.
EXEMPLE 2
On a réalisé une étude sur douze volontaires sains (six hommes, six femmes) âgés de 21 à 40 ans, pour comparer la pharmacocinétique plasmatique de la CLF après une injection intraveineuse unique de 15 secondes de 2mg de CLF, en présence de modifications des protéines de transport biliaire, induites par des médicaments. On a réalisé l'étude dans les conditions de pas de prétraitement, prétraitement à la rifampicine, également connue sous le nom de rifampine (un inducteur et inhibiteur non spécifique des voies de clairance hépatique), et prétraitement à la cyclosporine (la cyclosporine est un inhibiteur connu de MPR2 [Jedlitschky et al., Expert Opin Drug Metab Toxicol 2006 Jim 2 (3) : 351-66]).
On a obtenu la CLF de Norgine, Harefield, Royaume-Uni. On a étudié les sujets alors qu'ils étaient allongés. On a administré 2 mg de CLF à trois occasions par injection intraveineuse de 15 secondes le matin du jour D01 après une nuit de repos à jeun, en respectant les modalités suivantes : • Traitement R : pas de prétraitement ni de traitement concomitant • Traitement Tl : visites ambulatoires le soir du jour D-7 jusqu'au soir du jour D-2 pour une dose unique de 600 mg de rifampicine administrée dans la soirée ; la dernière dose de rifampicine a été administrée dans la soirée du jour D-l après l'administration • Traitement T2 : une dose unique de 100 mg de cyclosporine le soir de D-l et le matin de D01 une heure avant l'administration de CLF.
On a prélevé des échantillons de sang veineux avant l'injection et 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 240 et 360 minutes après l'administration (17 échantillons). On a déterminé le niveau de CLF dans chaque échantillon en utilisant une HPLC.
L’évolution dans le temps des concentrations plasmatiques moyennes de CLF observées est présentée sur la figure 9. On peut observer que le prétraitement avec la rifampicine a résulté en une légère diminution de l'élimination et de la clairance de la CLF. Les pré- et co-traitements avec la cyclosporine sont responsables d'une inhibition distincte de l'élimination et de la clairance de la CLF. Cette étude met en évidence que la CLF peut être utilisée pour déterminer l’activité de OATP1B3 et/ou l'activité de MRP2/3 d'un sujet lorsque le sujet a reçu un prétraitement avec des substrats médicamenteux qui affectent l'activité de OATP1 A3 et/ou l’activité de MRP2/3.
EXEMPLE 3
On a réalisé une étude sur douze volontaires sains (six hommes, six femmes) âgés de 21 à 40 ans, pour comparer la pharmacocinétique plasmatique de la CLF après une seule injection intraveineuse de 15 secondes de 2 mg de CLF en présence de modifications des protéines de transport biliaire, induites par des médicaments. On a étudié l'interaction avec l'acide ursodésoxycholique et la cloxacilline dans cet exemple.
On a obtenu la CLF de Norgine, Harefield, Royaume-Uni. On a étudié les sujets alors qu'ils étaient allongés. On a administré 2 mg de CLF à trois occasions par injection intraveineuse de 15 secondes le matin du jour D01 après une nuit de repos à jeun, en respectant les modalités suivantes : • Référence R : pas de prétraitement
• Traitement Tl : prétraitement et co-traitement avec 1 g de cloxacilline trois fois par jour pendant trois jours du matin de D-3 au matin de D01 une demi-heure avant l'administration de CLF
• Traitement T2 : prétraitement de trois semaines avec des doses quotidiennes de 500 mg deux fois par jour d'acide ursodésoxycholique (le matin et le soir, chaque fois au cours du repas) jusqu'au soir du jour D-l.
On a prélevé des échantillons de sang veineux avant l'injection et 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 240 et 360 minutes après l'administration (17 échantillons). On a déterminé le niveau de CLF dans chaque échantillon en utilisant la CLHP.
L’évolution Hans le temps des concentrations plasmatiques moyennes de CLF observées est présentée sur la figure 10. Il est possible d'observer que les pré- et co-traitement à la cloxacilline (un inhibiteur connu de BSEP) a entraîné une inhibition légère mais statistiquement significative de l'élimination et de la clairance de la CLF. En revanche, un prétraitement à l'acide ursodésoxycholique n'a pas eu d'effet secondaire (l'ursodiol est un stimulateur et facilitateur multifactoriel de la clairance biliaire hépatique).
Ces exemples mettent en évidence que la CLF peut être utilisée pour déterminer les modifications de l'activité MRP2/3 chez un sujet, induites par les médicaments.

Claims (22)

1. Procédé de détermination de l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal, ledit procédé comprenant : (i) la détermination in vitro du niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang dudit sujet humain ou animal à un intervalle de temps prédéterminé après l'introduction d'une quantité du dérivé d’acide biliaire dans le sujet ; et (ii) l'utilisation de la détermination obtenue dans l'étape (i) pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
2. Procédé selon la revendication 1, le procédé comprenant une étape supplémentaire consistant à utiliser la détermination obtenue pour arriver à une valeur numérique, la valeur numérique indiquant l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, dans lequel la détermination obtenue est comparée à au moins une référence pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 du sujet.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang dudit sujet humain ou animal est déterminé à deux intervalles de temps prédéterminés ou plus après l'introduction d'une quantité dudit dérivé d’acide biliaire dans le sujet.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le procédé comprend en outre l'étape consistant à déterminer une pente d'un tracé log-linéaire des déterminations obtenues par rapport au temps.
6. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le procédé comprend en outre l'étape consistant à déterminer une aire sous une courbe d'efflux du plasma dérivée des déterminations obtenues.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dérivé d’acide biliaire comprend un marqueur tel qu'une couleur ou une fluorescence.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le procédé comprenant en outre l'étape consistant à fournir au moins un échantillon de sang qui est passé par le foie du sujet et qui a été recueilli à un intervalle de temps prédéterminé après l'administration du dérivé d’acide biliaire au sujet, l'échantillon (les échantillons) de sang étant traité (s) pour obtenir le plasma ou le sérum.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le(s) échantillon(s) de sang est (sont) traité(s) par centrifugation.
10. Procédé selon les revendications 8 ou 9, dans lequel les protéines sanguines sont séparées du plasma/du sérum.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le dérivé d’acide biliaire est administré au sujet par voie intraveineuse.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le dérivé d’acide biliaire comprend (a) une fraction stéroïde ayant (i) au moins un substituant choisi dans le groupe constitué par un substituant 3-hydroxyle, un substituant 7-hydroxyle et un substituant 12-hydroxyle, et (ii) un groupe carboxyle fixé par les moyens d'une liaison amide à une chaîne latérale de la fraction stéroïde ; et (b) une fraction active qui cible le foie, ladite fraction active étant fixée à un atome de carbone en a du groupe carboxyle.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le dérivé d’acide biliaire répond à la formule générale (I) :
Figure BE1018734A3C00371
dans laquelle A est choisi dans le groupe constitué par a-OH et ß-OH ; B est choisi dans le groupe constitué par a-H et ß-H ; C est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; ou B et C forment ensemble une double liaison ; D est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; E est choisi dans le groupe constitué par -H, a-OH et ß-OH ; L est un résidu de liaison ; J est un résidu coloré ou fluorescent ; et n vaut 0 oui.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel J est ou comprend une fluorescéine, une rhodamine ou autre fraction fluorescente.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, dans lequel l'extrémité du résidu de liaison qui est lié à la faction active J est une extrémité N-terminale, et L est choisi dans le groupe constitué par - (CH2)nNH, où n vaut 3 ou 4, -(CH2)4NH- (CH2)3NHC (=NH)NH-, et -(CH2)2-CH (OH)CH2NH-.
16. Procédé selon la revendication 13 ou la revendication 14, dans lequel le résidu -NH- CH (COOH)-L- dans la formule générale (I) est dérivé d'un composé choisi dans le groupe constitué par la S-adénosylhomocystéine, la S-adénosylméthiodine, le S-aminoimadazole-4-carboxamide, l'asparagine, la cadavérine, la cystamine, la citrulline, l'acide diaminopimélique, l'acide 2,4-diaminobutyrique, la cystéamine, la glutamine, la 3-hydroxykynurénine, la kynurénine, la putrescine et la négamycine.
17. Procédé selon la revendication 12, dans lequel la fraction stéroïde du dérivé d’acide biliaire est basée sur un acide choisi dans le groupe constitué par l'acide cholique, l'acide chénodésoxycholique, l'acide désoxycholique, l'acide hyodésoxycholique, l'acide hyocholique, l'acide α-, ß- ou ω-muricholique, des acides biliaires -nor, l'acide lithocholique, l'acide 3 β-hydroxycholénoïque, l'acide ursodésoxycholique et l'acide allocholique (acide 5a-cholan-24-oïque).
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications là6ou8àll, dans lequel le dérivé d’acide biliaire est une cholyl-lysyl-fluorescéine (CLF) répondant à la formule :
Figure BE1018734A3C00381
19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel le dérivé d’acide biliaire est un sel de la cholyl-lysyl-fluorescéine.
20. Utilisation in vitro d'un dérivé d’acide biliaire pour déterminer l'activité fonctionnelle de la voie d'efflux de MRP2 et/ou MRP3 d'un sujet humain ou animal.
21. Utilisation d'une détermination de l'activité fonctionnelle de MRP2 et/ou MRP3 obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour déterminer la fonction hépatique d'un sujet humain ou animal.
22. Procédé de détermination de l’activité fonctionnelle de la voie d’absorption d’OATPlB3 chez un sujet humain ou animal, ledit procédé comprenant : (i) la détermination in vitro du niveau d'un dérivé d’acide biliaire dans le sang dudit sujet humain ou animal à un intervalle de temps prédéterminé après l'introduction d'une quantité du dérivé d’acide biliaire dans le sujet, et (ii) l'utilisation de la détermination obtenue dans l'étape (i) pour indiquer l'activité fonctionnelle de la voie d’absorption d’OATPlB3 du sujet.
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