DE102009017607B4

DE102009017607B4 - Verfahren zur Funktionalisierung von Halbleiter-Nanopartikeln mit einem Detektionsmolekül, die dadurch hergestellten Halbleiter-Nanopartikel und deren Verwendung

Info

Publication number: DE102009017607B4
Application number: DE200910017607
Authority: DE
Inventors: Dr. Hofinger Jürgen; Kevin Zirpel; Steffen Roos
Original assignee: Namos GmbH
Current assignee: Namos GmbH
Priority date: 2009-04-08
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2011-11-17
Anticipated expiration: 2029-04-09
Also published as: DE102009017607A1

Abstract

Verfahren zur Funktionalisierung eines Halbleiter-Nanopartikels aus wenigstens einem Halbleiter-Nanopartikel-Kern aus ZnS (Zinksulfid) als Halbleitermaterial und wenigstens einer hydrophilen äußeren Slekülen besteht, die wenigstens eine Kopplungsgruppe pro Molekül zur Kopplung eines Detektionsmoleküls umfassen, mit den Schritten: a) Aktivierung der Kopplungsgruppen der hydrophilen äußeren Schicht, b) Bindung des Detektionsmoleküls über die Kopplungsgruppe an den Halbleiter-Nanopartikel, wobei Detektionsmolekül und Halbleiter-Nanopartikel in einem Verhältnis von 1:1 bis 30:1, vorzugsweise 2:1 bis 20:1, bevorzugt 3:1 bis 10:1 zur Reaktion gebracht werden, wobei das Detektionsmolekül ausgewählt ist aus Aminosäuren, Proteinen, Nukleinsäuren, Polysacchariden oder einem sonstigen biochemischen Agens, und wobei über das Detektionsmolekül eine Bindung an weitere biologische Substanzen ermöglicht wird, und c) Deaktivierung der freien Kopplungsgruppen durch gleichzeitige oder anschließende Zugabe eines nicht-aktiven Biomoleküls.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Funktionalisierung von Halbleiter-Nanopartikeln mit einem Biomolekül als Detektionsmolekül, das eine spezifische Bindung an weitere biologische Substanzen ermöglicht, die so hergestellten funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel sowie deren Verwendung. Die Herstellung der Konjugate aus Halbleiter-Nanopartikel und Detektionsmolekül erfordert dabei verglichen mit konventionellen Verfahren nur sehr geringe Mengen an Detektionsmolekülen.
Die Markierung von biologischen Molekülen ist eine essentielle Aufgabenstellung der modernen Molekularbiologie. Ziel der Markierung ist dabei die Erkennung und die Unterscheidung verschiedener biologischer Moleküle. Dazu werden Licht emittierende Stoffe spezifisch an die zu detektierenden Moleküle gebunden. Zur Lösung dieser Aufgabe stehen gegenwärtig verschiedene Markierungsstoffe und Detektionsmethoden zur Auswahl.
Traditionellerweise werden biologische Moleküle zu deren Erkennung mit Radionukliden markiert. In dem als Autoradiographie bezeichneten Verfahren werden Antikörper mit Radioisotopen wie 14C (Kohlenstoff), 35S (Schwefel), 32P (Phosphor) und 3H (Tritium) markiert. Diese weisen eine spezifische hohe Bindungsaffinität zu den zu markierenden Proteinen aus. Nach erfolgter Kopplung dieser Antikörper können die Signale mittels eines Strahlungsdetektors oder eines Röntgenfilmes detektiert werden. Die Problematik dieser Methode besteht in der Verwendung von radioaktiven Isotopen, die eine akute Gesundheitsgefährdung für den Durchführenden darstellen. Der damit verbundene hohe Aufwand schließt die Verwendung speziell abgesicherter und zertifizierter Räumlichkeiten sowie das Tragen von spezieller Schutzkleidung und Sensoren zur Abschätzung der individuellen radioaktiven Belastung ein.
Um dieses hohe Risikopotential abzumildern, wurden Verfahren mit chemilumineszenten Enzymen wie Meerrettichperoxidase entwickelt. Hierbei werden die Antikörper statt mit radioaktiven Isotopen mit Enzymen gekoppelt, welche unter Umsatz eines Substrates Licht emittieren. Diese Signale werden mit hochempfindlichem Photopapier detektiert. Dadurch konnte die Gesundheitsgefährdung für den Durchführenden erheblich gemildert werden, jedoch treten dabei andere Probleme zu Tage. So ist die erzeugte Lichtmenge sehr gering und es bedarf teuren Photopapiers, um das schnell nachlassende Licht zu detektieren. Zur Entwicklung des belichteten Filmes sind wie bei der Autoradiographie teure und toxische Photochemikalien sowie eine hohe Genauigkeit und Sorgfalt bei der Durchführung nötig.
Eine weitere Methode zur Markierung von Biomolekülen stellt die Verwendung von fluoreszierenden organischen Verbindungen dar. Hierbei werden Detektionsmoleküle, die Zielstrukturen an den zu detektierenden Biomolekülen spezifisch binden können, wie beispielsweise Antikörper, kovalent mit Stoffen wie Fluorescein oder Rhodamin gekoppelt. Diese haben die Eigenschaft, unter Anregung mit einer spezifischen Wellenlänge Licht in einen schmalen Wellenlängenbereich zu emittieren, was zur Detektion z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie genutzt wird. Problematisch ist hierbei vor allem das schnelle Ausbleichen (Bleaching) der Fluoreszenzfarbstoffe unter UV-Anregung, das die Zeitspanne bis zur Detektion kritisch verkürzt und nicht regenerierbar ist.
Eine Alternative zur Fluoreszenzmarkierung mit organischen Verbindungen stellen Halbleiter-Nanopartikel dar. In dieser Größe behalten sie zwar weitgehend die Eigenschaften des Halbleitermaterials, gewinnen jedoch neue Eigenschaften, die direkt von der Partikelgröße abhängig sind. Insbesondere weisen Halbleiter-Nanopartikel eine Zusammensetzungs-, Form- und Größen-abhängige Lumineszenz auf, welche sie für die Anwendung zur Fluoreszenzmarkierung geeignet macht. An der Optimierung der photooptischen Eigenschaften der Halbleiter-Nanopartikel ebenso wie deren Markierung mit Detektionsmolekülen besteht nach wie vor Bedarf. Bekannte Verfahren zur Modifikation der Oberfläche von Halbleiter-Nanopartikeln liegen in deren Beschichtung mit Phytochelatin-verwandten Peptiden, welche mit N-terminalen Cysteinen modifiziert sind. Nach Reduktion mit Dithiothreitol kann über Maleimid ein organisches Detektionsmolekül an die Oberfläche der Halbleiter-Nanopartikel gekoppelt werden (z. B. Biocytin, vgl. Pinaudt F. et al., Biomaterials 27, 2006, S. 1679–1687).
Eine wesentliche Verbesserung der Langzeitbeständigkeit wird durch II–VI Halbleiter-Nanoleuchtstoffe erreicht, die aus einem Cadmiumselenid-Kern (CdSe) und mindestens einer äußeren Schale aus einem weiteren Halbleitermaterial bestehen (sog. Core/Shell- bzw. Kern/Schale-Konstrukte).
US 2004/0101465 A1 offenbart oberflächenmodifizierte Halbleiternanopartikel, welche in wässrigen Medien verbesserte Dispersionseigenschaften aufweisen. Dies wird dadurch erreicht, dass Halbleiternanopartikel bereitgestellt werden, die eine Kernstruktur mit einer hydrophoben Oberfläche und eine äußere Schicht eines amphipatischen Detergens enthalten. Das Detergens sind typischerweise Polymere, die zwei oder mehr hydrophobe und zwei oder mehr hydrophile Regionen enthalten. Es sind Methoden offenbart, wie eine derartige Oberflächenmodifikation auf Halbleiternanopartikeln erzielt werden kann, so dass monodisperse Nanopartikel bereitgestellt werden. Mit diesem Verfahren können auch direkt Moleküle, wie Peptide oder Oligonukleotide auf die Halbleiternanopartikel aufgebracht werden.
US 6,114,038 A offenbart funktionalisierte Halbleiternanokristalle, die wasserlöslich sind. Die Kristalle sind mit einer Schicht einer sogenannten Abdeckkomponente der Struktur HS(CH₂)_nX versehen, wobei n die Größe von 1 bis 20 annimmt und X eine Carboxyleinheit ist. Darauf ist eine weitere Schicht abgelagert, die eine Diaminocarboxylsäure enthält. Darauf können weitere Schichten, beispielsweise aus Aminosäuren, abgelagert sein.
In DE 699 05 832 T2 werden biologische Anwendungen beschrieben, die derartige Halbleiter als Markerstoffe für biologische Moleküle beinhalten. Der Cadmiumselenid-Kern ist jedoch toxisch und stellt damit ein Gefahrenpotenzial dar. Core/Shell-Konstrukte haben einzig den Zweck, Kontakte des umgebenden Mediums mit dem toxischen CdSe-Kern zu vermeiden. Die Darstellung des fluoreszierenden Halbleiterkerns und seiner Schale ist jedoch relativ aufwändig und trotz dieser Schalenstruktur kann das Freiwerden von Cadmium und Selen auf lange Sicht nicht vermieden werden. Um eine Solubilisierung der Core/Shell-Konstrukte in wässrigen Medien zu erreichen, ist außerdem ein bedeutender Mehraufwand bei der Synthese notwendig. Da die Darstellung des Core/Shell-Konstruktes in organischen Medien erfolgen muss, resultiert eine Schicht aus einer unpolaren Capping-Substanz um die Core/Shell-Konstrukte. Dieser ersten Schicht muss eine zweite hydrophile Schicht hinzugefügt werden, um ein Resuspendieren in polaren Flüssigkeiten wie Wasser erst zu ermöglichen.
Um die Detektionsmoleküle mit der Oberfläche der Halbleiter zu verbinden, wird die so geschaffene hydrophile Oberfläche mit einem geeigneten Agens (z. B. Carbodiimiden) aktiviert. Daraufhin wird die Oberfläche mit einem Überschuss an Detektionsmolekülen abgesättigt, wobei eine erhebliche Menge dieser teuren Ressource in der Lösung verbleibt.
In der Dissertation von Kathrin Hoppe (Universität Hamburg, 2001) wird ein Verfahren beschrieben, welches die Anbindung von Biomolekülen an CdSe-Halbleiter-Nanoleuchtstoffe ermöglicht. Die Bindung der Biomoleküle ist dadurch einfacher, jedoch bleibt der toxische CdSe-Kern damit ungeschützt.
Aus der Entwicklung von Anzeigesystemen sind fluoreszierende Farbstoffe bekannt, die aus dotierten Zinksulfidpartikeln bestehen. Bei diesen Stoffen handelt es sich ebenfalls um Halbleiter, die bei geringer Partikelgröße Fluoreszenz zeigen.
Um sich als Detektionssystem zur Biomarkierung zu eignen, müssen die Halbleiternanopartikel vor allem eine hohe Lumineszenzeffizienz aufweisen, sie müssen wasserlöslich sein und biokompatibel. Zur Herstellung solcher Halbleiternanopartikel mit ZnS-Kern wurden Verfahren etabliert, bei denen mit Mn dotierte ZnS-Nanopartikel unter Zugabe von Thioglycolsäure als Stabilisator in wässriger Lösung in Luft hergestellt werden (Xiao Q & Xiao C, Applied Surface Science 254, 2008, S. 6432–6435).
Halbleiternanopartikel mit Zinksulfid (ZnS) zeigen hervorragende Fluoreszenzeigenschaften mit einem besonders langsamen Abfall der Fluoreszenzintensität nach UV-Anregung, dies wurde z. B. für Thioglycolsäure-beschichtete ZnS:Mn Halbleiternanopartikel nachgewiesen (Cheng et al. J. Phys. Chem. C 112, 2008, S. 17931–17939). ZnS-haltige Nanopartikel sind daher ein besonders geeignetes, nicht-toxisches Agens für nanoforensische Anwendungen.
Die Verwendung von Halbleiternanopartikeln auf ZnS-Basis zur Biomarkierung verlangt eine effektive Beladung der Nanopartikel mit Detektionsmolekülen, z. B. Biotin. Es sind Verfahren zur Herstellung biotinylierter, mit Mn dotierter ZnS-Nanopartikel bekannt, bei dem ZnS:Mn Halbleiternanopartikel durch Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen synthetisiert werden, denen Biotin zugesetzt wurde. Problematisch gestaltet sich bei diesen Verfahren, dass die spektrale Emission durch die Biotinylierung beeinträchtigt wurde. Da bei dem Verfahren Detektionsmoleküle im Überschuss zugegeben werden, ist dieses nicht universell auch für nicht ubiquitär vorhandene Detektionsmoleküle anwendbar bzw. wirtschaftlich nicht realisierbar (Mohagheghpour E et al., Materials Science and Engineering C 29, 2009, S. 1842–1848).
In DE 196 50 602 A1 werden Verfahren beschrieben, sulfidhaltige Leuchtstoffzubereitungen mit α-Hydroxycarbonsäure in wässriger Lösung zu dispergieren und zu stabilisieren.
DE 101 06 643 A1 offenbart lumineszierende anorganische dotierte Nanoteilchen (lad-Nanoteilchen). Diese sind mit Fremdionen dergestalt dotiert, dass sie nach Anregung mit einer Strahlungsquelle materialspezifisch nachgewiesen werden können. Diese Nanopartikel können oberflächenmodifiziert sein, z. B. durch eine Umhüllung mit Silica, so dass über die Oberflächenmodifikation organische Moleküle konjugiert werden können.
DE 102 59 935 A1 offenbart Verfahren zur Herstellung von in-situ modifizierten Metallsalznanopartikeln, wobei die spätere chemische Modifizierung der Nanopartikeloberfläche vereinfacht werden soll. Dies wird durch Zugabe eines sogenannten Modifizierungsreagenz zur Synthesemischung der Nanopartikel erreicht. Dieses lagert sich bei der Synthese mit einer funktionalen Gruppe an die Nanopartikeloberfläche an und besitzt eine zweite funktionale Gruppe, die zur späteren Anbindung von Molekülen dient. Zwischen beiden funktionalen Gruppen ist ein Spacermolekül plaziert. Durch das Modifizierungsreagenz wird bewirkt, dass das Wachstum der Nanopartikel gezielt gesteuert werden kann und gleichzeitig eine gezielte Modifikation der Oberfläche realisiert wird.
Nach wie vor besteht großer Bedarf an fluoreszierenden Markierungsstoffen, die spezifisch oder unspezifisch an biologische Moleküle gebunden werden können. Fluoreszierende Halbleiter stellen für viele Anwendungsfälle die technisch beste Lösung dar. Eine wesentliche Hürde für deren breiten Einsatz sind jedoch die hohen Kosten, aber auch Bedenken bezüglich Gesundheit und Umwelt durch den toxischen Kern der bisher verwendeten Cadmiumselenid-Kern-Schale-Konstrukte.
Bei allen bisherigen Verfahren werden außerdem die Detektionsmoleküle im Überschuss eingesetzt. Da aber in der Regel einige wenige Detektionsmoleküle pro Nanoteilchen ausreichend sind, um das Zielmolekül mit hoher Wahrscheinlichkeit stabil mit einem Nanoteilchen zu markieren, stellt dies eine unnötige Verschwendung von Ressourcen dar. Vor allem bei Detektionsmolekülen, die nicht ohne einen bestimmten Kostenaufwand erhältlich sind, führt dies zu unnötig hohen Kosten für die Markierung.
Außerdem führen die bisher eingesetzten Verfahren dazu, dass erhebliche Mengen ungebundener Detektionsmoleküle frei in der Lösung der an Nanoteilchen gebundenen Detektionsmoleküle vorhanden sind. Dies senkt die Effizienz der Markierung, da die ungebundenen Detektionsmoleküle mit den an die Nanoteilchen gebundenen Detektionsmolekülen um die Bindungsstellen an den Zielmolekülen konkurrieren. Aus diesem Grund wird je nach Anwendung eine aufwändige Aufreinigung der an die Nanoteilchen gebundenen Detektionsmoleküle erforderlich.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ein Markierungsstoff basierend auf einem fluoreszierenden Halbleiter hergestellt werden kann, der diese Nachteile überwindet.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Funktionalisierung eines Halbleiter-Nanopartikels aus wenigstens einem Halbleiter-Nanopartikel-Kern aus ZnS (Zinksulfid) als Halbleitermaterial und wenigstens einer hydrophilen äußeren Schicht, wobei die hydrophile äußere Schicht aus Molekülen besteht, die wenigstens eine Kopplungsgruppe pro Molekül zur Kopplung eines Detektionsmoleküls umfassen, mit den Schritten:

a) Aktivierung der Kopplungsgruppen der hydrophilen äußeren Schicht durch geeignete Reagenzien.
b) Bindung des Detektionsmoleküls über die Kopplungsgruppe an den Halbleiter-Nanopartikel, wobei Detektionsmolekül und Halbleiter-Nanopartikel in einen Verhältnis von 1:1 bis 30:1, vorzugsweise 2:1 bis 20:1, bevorzugt 3:1 bis 10:1, zur Reaktion gebracht werden und wobei das Detektionsmolekül ausgewählt ist aus Aminosäuren, Proteinen, Nukleinsäuren, Polysacchariden oder einem sonstigen biochemischen Agens, und wobei über das Detektionsmolekül eine Bindung an weitere biologische Substanzen ermöglicht wird.
c) Deaktivierung der freien hochreaktiven Kopplungsgruppen durch anschließende Zugabe eines Biomoleküls, welches keine spezifische Bindung gegenüber den zu detektierenden Zielmotiven aufweist (nicht-aktives Biomolekül). Nachfolgend wird diese Deaktivierung der freien Kopplungsgruppen auch kurz als Absättigung bezeichnet.

Die Erfindung umfasst auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten funktionalisierten Nanopartikel und die Verwendung dieser funktionalisierten Nanopartikel zur Markierung und/oder Detektion eines Biomoleküls bzw. einer biologischen Substanz.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel sind ebenfalls Teil der Erfindung und folgendermaßen aufgebaut:

a) Im Inneren befindet sich der Halbleiter-Nanopartikel-Kern aus ZnS (Zinksulfid) als Halbleitermaterial.
b) Um diesen Halbleiter-Nanopartikel-Kern herum befindet sich eine hydrophile äußere Schicht aus Molekülen, die wenigstens eine Kopplungsgruppe pro Molekül zur Kopplung eines Detektionsmoleküls umfassen.
c) An die Halbleiter-Nanopartikel sind über die Kopplungsgruppen der hydrophilen äußeren Schicht im Durchschnitt zwischen 1 und 30, vorzugsweise zwischen 2 und 20, bevorzugt zwischen 3 und 10 Detektionsmoleküle kovalent gebunden. Diese Zahl genügt vorteilhaft, um eine zuverlässige Markierung der Zielsubstanz mit dem Nanopartikel zu gewährleisten.
d) an die übrigen Kopplungsgruppen sind entweder kovalent nicht-aktive Biomoleküle gebunden oder es sind gegebenenfalls gar keine Biomoleküle daran gebunden, wenn die Aktivierung der Kopplungsgruppen nicht alle vorhandenen Kopplungsgruppen vollständig erfasste.

Die erfindungsgemäßen Konjugate enthalten einen Halbleiter-Nanopartikel-Kern mit ZnS als Halbleitermaterial. Vorteilhaft besitzt ZnS keinerlei toxische Eigenschaften und ist somit als unbedenklich einzustufen. Der Halbleiter-Nanopartikel-Kern aus ZnS wird dabei gegebenenfalls mit Fremdatomen dotiert, wodurch vorteilhaft die Leuchteigenschaften des Halbleiter-Nanopartikels beeinflusst werden.
Ein Aufbau von äußeren Schalen aus einem weiteren Halbleiter-Material ist nicht notwendig. Die Absorption sowohl der anregenden Lichtwellen als auch der emittierenden Lichtwellen durch äußere Schalen wird so vermieden und die Fluoreszenz der erfindungsgemäßen Konjugate kann sowohl mit freiem Auge als auch unter einem Lichtmikroskop deutlich erkannt werden.
Durch die hydrophile äußere Schicht sind die Halbleiter-Nanopartikel der erfindungsgemäßen Konjugate in polaren Flüssigkeiten wie z. B. Wasser resuspendierbar. Die hydrophile äußere Schicht bedingt eine außergewöhnliche Stabilität über Zeiträume von mehreren Monaten bei Zimmertemperatur auch im leicht sauren sowie basischen Milieu sowie die UV-Beständigkeit der Halbleiter-Nanopartikel. Weiterhin bietet sie durch die Kopplungsgruppen die Möglichkeit, praktisch beliebige Biomoleküle mit entsprechenden funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des Halbleiter-Nanopartikels zu immobilisieren und diesen somit zu funktionalisieren.
Kopplungsgruppen sind im Zusammenhang mit der Erfindung funktionelle Gruppen der Moleküle, welche die hydrophile äußere Schicht bilden. Diese funktionellen Gruppen sind zur Bildung kovalenter Bindungen mit den Detektionsmolekülen bzw. den nicht aktiven Biomolekülen geeignet. Als Kopplungsgruppe kommt eine Vielzahl an hydrophilen funktionellen Gruppen in Frage. Bevorzugt sind die Kopplungsgruppen der Moleküle der hydrophilen äußeren Schicht ausgewählt aus Hydroxygruppen, Carboxygruppen, Aminogruppen, Peroxycarboxygruppen, Thiocarboxygruppen, Alkoxycarbonylgruppen, Carbamoylgruppen, Aldehydgruppen, Hydrazidgruppen und Acylhydrazidgruppen.
Bevorzugt sind die Detektionsmoleküle bzw. die nicht-aktiven Biomoleküle über eine Peptidbindung (Amidbindung) oder über eine Esterbindung mit den Kopplungsgruppen der hydrophilen äußeren Schicht verbunden.
Die Kopplungsgruppen müssen für die Bindung des Detektionsmoleküls bzw. des nicht-aktiven Biomoleküls durch geeignete quervernetzende Reagenzien aktiviert werden.
Handelt es sich bei den eingesetzten Kopplungsgruppen um Carboxylgruppen, werden diese mittels geeigneter Reagenzien aktiviert. Dabei wird die Carboxylgruppen aktivierende Verbindung bevorzugt ausgewählt aus geeigneten Carbodiimiden, wie beispielsweise EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid), DIC (N,N'-Diisopropylcarbodiimid) oder DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimid), und BMPH (N-[β-Maleimidopropionsäure]-hydrazid trifluoroacetat).
Handelt es sich bei den eingesetzten Kopplungsgruppen um Aminogruppen, ist die Aminogruppen aktivierende Verbindung bevorzugt ausgewählt aus Glutaraldehyd und SMPB (Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrat).
Handelt es sich bei den eingesetzten Kopplungsgruppen um Thiole, ist die Thiolgruppen aktivierende Verbindung bevorzugt SMPB (Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrat).
Handelt es sich bei den eingesetzten Kopplungsgruppen um Hydrazidgruppen, ist die Hydrazidgruppen aktivierende Verbindung bevorzugt BMPH (N-[β-Maleimidopropionsäure]-hydrazid trifluoroacetat)
Methoden zur Herstellung von Halbleiter-Nanopartikel-Kernen aus ZnS (Zinksulfid) sind aus dem Stand der Technik bekannt (Yang P. et al. Synthesis and photoluminescence characteristics of doped ZnS nanoparticles. Applied physics. A: Materials science & processing. 2001; vol. 73, no. 4, pp. 455–458; Robert Vacassy et al. Synthesis of Controlled Spherical Zinc Sulfide Particles by Precipitation from Homogeneous Solutions. Journal of the American Ceramic Society. 1998; vol. 81, no. 10; pp. 2699–2705).
Zur Beschichtung des Halbleiter-Nanopartikel-Kerns mit der hydrophilen äußeren Schicht wird vorzugsweise eine Thiol-haltige Verbindung, eine alpha-Hydroxycarbonsäure, ein Polyphosphat, eine Sulfonsäure, Thioacetamid, Acrylsäure oder einer Kombination davon eingesetzt.
Bevorzugt ist die Thiol-haltige Verbindung ausgewählt aus Thioglyzerin (3-Mercaptopropan-1,2-diol), Mercaptoessigsäure (Sulfanylessigsäure, Thioglycolsäure), 3-Mercaptopropionsäure, Cysteamin und/oder β-Mercaptoethanol.
Besonders bevorzugt ist dabei die Verwendung von Thioglyzerin.
Die Präparation von mit Thioglyzerin oder anderen Molekülen stabilisierten Halbleiter-Nanopartikeln wird in der entsprechenden Literatur hinreichend beschrieben. Generell handelt es sich dabei um die Kopräzipitation von Elementen der II. und VI. Hauptgruppe, in diesem konkreten Fall also um Zink und Schwefel. Dabei wird gegebenenfalls zur Beeinflussung der Bandlücke mit Mn (Mangan), Cu (Kupfer), Eu (Europium), Al (Aluminium) oder einer Kombination dotiert, was direkt eine Veränderung der Leuchteigenschaften zur Folge hat. Weiterhin steigt dadurch die Quantenausbeute und damit die Intensität der Fluoreszenz gegenüber undotiertem ZnS an, wodurch die Sensitivität der Detektion vorteilhaft erhöht wird.
Die Synthese von nanoskaligen Partikeln wird dabei durch die Zugabe des stabilisierenden Moleküls, das gleichzeitig die hydrophile äußere Schicht bildet, gewährleistet. Dieses verhindert während der Präzipitation das unkontrollierte Wachstum der Partikel und schirmt diese durch Präsentation einer negativen Ladung auf der Oberfläche gegeneinander ab. Weiterhin bewirkt diese Passivierung eine hervorragende Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, wie beispielsweise Wasser. Vorteilhaft stellt die hydrophile äußere Schicht zusätzlich zur Stabilisierung des Halbleiter-Nanopartikel-Kerns auch die für die Bindung von weiteren Molekülen erforderlichen Kopplungsgruppen zur Verfügung.
Thioglyzerin wird bei der Zugabe als Stabilisator mit der Thiolgruppe in das Kristallgitter des Halbleiter-Nanopartikels eingebaut, womit die beiden Hydroxylgruppen nach außen hin präsentiert werden. Somit sind sie hochverfügbar für die Anbindung von Biomolekülen.
Typische, nach den oben stehenden Vorgaben synthetisierte Halbleiter-Nanopartikel haben einen Kristalldurchmesser von 5–50 nm. Die Extinktions- und Emissionswellenlänge hängt wesentlich von den eingesetzten Dotierungstoffen ab. Mit Mangan dotierte ZnS-Halbleiter-Nanopartikel weisen ein Extinktionsmaximum bei 315 nm (UV) und ein Emissionsmaximum bei 580 nm (Orange) auf. Bei mit Cu dotierten ZnS-Halbleiter-Nanopartikeln liegen die entsprechenden Maxima bei 300 nm (UV) und 500 nm (Grün).
Als Detektionsmoleküle werden alle Biomoleküle eingesetzt, die über eine spezifische Interaktion mit einer Zielstruktur am zu detektierenden biologischen Molekül eine Bindung zwischen dem Halbleiter-Nanopartikel und dem zu detektierenden biologischen Molekül herstellen können. Bevorzugt sind dabei polyklonale und monoklonale Antikörper, Haptene, Biotin, Avidin, Streptavidin, Phagen oder deren Bindungsproteine sowie Bindemotive von Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren.
Um den Einsatz von Detektionsmolekülen zu minimieren und den Verbleib von nicht gebundenen Detektionsmolekülen in der Lösung zu verhindern, werden erfindungsgemäß kostengünstige, neutrale Proteine eingesetzt, mit denen die nicht durch Detektionsmoleküle besetzten Kopplungsgruppen auf dem Halbleiter-Nanopartikel abgesättigt werden. Dazu wird zunächst die aktivierte Oberfläche mit den Detektionsmolekülen belegt, die jedoch nur in der für Funktionalisierung des Partikels erforderlichen Menge vorliegen.
Die Detektionsmoleküle werden in einem Verhältnis von 1:1 bis 30:1, vorzugsweise in einem Verhältnis von 2:1 bis 20:1, bevorzugt in einem Verhältnis von 3:1 bis 10:1 zu den Halbleiter-Nanopartikeln eingesetzt.
Vorteilhaft wird durch den großen Überschuss an Kopplungsgruppen im Verhältnis zu den in der Lösung vorhandenen Detektionsmolekülen ein großer Anteil der Detektionsmoleküle an die Halbleiter-Nanopartikel gebunden und es verbleiben nur wenige Detektionsmoleküle in der Lösung. Dadurch ist einerseits ein ökonomischer Einsatz der Detektionsmoleküle möglich, andererseits wird durch die Abwesenheit von Detektionsmolekülen in der Lösung, die mit den erfindungsgemäßen funktionalisierten Halbleiternanopartikeln um die Bindungsstellen an den zu detektierenden Biomolekülen konkurrieren, eine hohe Spezifität der Detektion gewährleistet.
Um ein Agglomerieren der Partikel aufgrund der ungesättigten Kopplungsgruppen zu verhindern, werden erfindungsgemäß diese Bindungen durch Biomoleküle, bevorzugt Proteine, Peptide und/oder Aminosäuren, abgesättigt, welche keine spezifische Bindungsaffinität zu den zu detektierenden Zielmotiven aufweisen. Diese Proteine verhalten sich daher in der vorgesehen Anwendung neutral, d. h. nicht aktiv. Ihre Anwesenheit in der Lösung in ungebundener Form hat keinen Einfluss auf den Detektionsprozess.
Bevorzugt verwendet werden Serumprotein wie Albumin, bspw. RSA (Rinder-Serumalbumin), Magermilchprotein, Magermilchpulver, Gelatine, Casein, Aminosäuren, Polypeptide, Desoxyribonukleinsäuren, Ribonukleinsäuren und/oder organische Moleküle welche eine entsprechende Bindungsstelle gegenüber den aktivierten Oberflächengruppen aufweisen.
Vorzugsweise werden anstelle von nicht aktiven Proteinen nicht aktive Aminosäuren bzw. Oligo- und Polypeptide auf die Oberfläche aufgebracht, um die Agglomeration der Nanopartikel aufgrund der ungesättigten Bindungsstellen zu verhindern. Der Vorteil dieser Vorgehensweise liegt in den geringen räumlichen Abmessungen der Aminosäuren bzw. Peptide gegenüber dem Detektionsmolekül. Dadurch liegen die eigentlich aktiven Detektionsproteine gleichsam exponiert auf der Oberfläche, während die aktiven Peptide oder Aminosäuren im Hintergrund bleiben.
Die erfindungsgemäß verwendeten Oligopeptide sind bevorzugt 4 bis 20 Aminosäuren lang, Polypeptide sind vorzugsweise 21 bis 600 Aminosäuren lang. Generell können auch nicht homogene Protein-, Peptid- bzw. Aminosäuregemische oder Proteinhydrolysate wie Pepton oder Trypton zur Absättigung verwendet werden.
Vorzugsweise eignen sich als nicht-aktive Biomoleküle für die Absättigung auch niedermolekulare organische Verbindungen, wie beispielsweise niedermolekulare Amine, Alkohole etc., zur Absättigung der ungesättigten Bindungsstellen. Bevorzugt wird dabei Ethanolamin, PEI (Polyethylenimin) und/oder Harnstoff verwendet.
Weiterhin ist bekannt, dass positive oder negative Oberflächenladungen von Nanopartikeln die Funktionalität von Detektionsmolekülen durch Einfluss auf deren Tertiär- und Quartärstruktur deutlich einschränken können. Daher werden im Fall besonders sensibler Detektionsmoleküle diese Oberflächenladungen durch Verwendung von positiven bzw. negativ geladenen nicht-aktiven Biomolekülen, bevorzugt von positiven bzw. negativ geladenen Polypeptiden, Aminosäuren und/oder anderen geladenen niedermolekularen organischen Verbindungen, zur Absättigung der freien Bindungsstellen derart neutralisiert, dass sie die Aktivität der Detektionsmoleküle nicht mehr negativ beeinflussen.
Als positiv geladene Aminosäuren sind die bei physiologischem pH-Wert positiv geladenen Aminosäuren Lysin, Arginin und Histidin bevorzugt. Als negativ geladene Aminosäuren sind die bei physiologischem pH-Wert negativ geladenen Aminosäuren Aspartat und Glutamat bevorzugt.
Da die hervorragenden Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Halbleiter-Nanopartikel in besonderer Weise von Oberflächeneffekten abhängen, können in einer besonders bevorzugten Ausführung Biomoleküle, bevorzugt Polypeptide oder Aminosäuren, zur Absättigung der aktivierten Oberfläche des Nanopartikels verwendet werden, die eine Verstärkung des Fluoreszenzeffektes hervorrufen oder eine Verschiebung der Anregungswellenlänge bewirken. Somit ist eine Anpassung der erfindungsgemäßen Halbleiter-Nanopartikel an verschiedene Anwendungen möglich.
Die erfindungsgemäßen funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel werden aufgrund der chemischen Eigenschaften der Detektionsmoleküle vorzugsweise in einer wässrigen Lösung aufbewahrt und verwendet. Die Lösung enthält dazu bevorzugt Puffersubstanzen zur Stabilisierung des pH-Werts. Bevorzugt werden dazu Phosphatpuffer eingesetzt. Gegebenenfalls kann die Pufferlösung weitere Bestandteile enthalten. Dazu gehören z. B. Reduktionsmittel wie beispielsweise β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT), Chelatoren wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Ethylenglycoltetraessigsäure (EGTA), Salze wie beispielsweise NaCl, CaCl₂, MgCl₂ oder KCl, und/oder Proteine zur Stabilisierung der funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel, wie beispielsweise RSA (Rinder-Serumalbumin).
Die erfindungsgemäßen funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel eignen sich zur Verwendung in Blotting-Verfahren wie z. B. Northern-, Southern- und Westernblotting zur Markierung von Biomolekülen. Bei den Blotting-Verfahren werden z. B. anstelle von mit chemilumineszenten Proteinen konjugierten Antikörpern erfindungsgemäße, mit Antikörpern funktionalisierte Halbleiter-Nanopartikel verendet. Alternativ kann auch ein erfindungsgemäßes Halbleiter-Nanopartikel, das mit Streptavidin funktionalisiert wurde, verwendet werden, das z. B. einen biotinylierten Antikörper bindet.
Des Weiteren ist Bestandteil der Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel in durchflusscytometrischen Verfahren zur Markierung und Selektion von Zellen. Hierbei werden die mit konventionellen Fluorophoren markierten Antikörper durch erfindungsgemäße, mit Antikörpern funktionalisierte Halbleiter-Nanopartikeln ersetzt.
Dabei sind die Antikörper spezifisch gegen bestimmte Oberflächengruppen von zu markierenden Zellen gerichtet. Die markierten Zellen werden durch extrem dünne Kapillaren geschleust und einzeln mit einem Laser detektiert. Die Zellen emittieren dabei zwei unterschiedliche Arten von Licht: Zum einen Streulicht; aus diesem lassen sich diverse Eigenschaften wie Zellgröße, Struktur der Zellmembran, sowie intrazelluläre Bestandteile bestimmen. Weist die Zelle zusätzlich bestimmte Oberflächenmerkmale auf gegen die die erfindungsgemäßen Konjugate gerichtet sind, tritt dabei die zweite Form von detektierbarem Licht auf, nämlich Fluoreszenzimpulse.
Auch hierbei kann die Markierung mittels eines Halbleiter-Nanopartikels, der mit einem direkt gegen spezifische Oberflächenmerkmale gerichteten Antikörper funktionalisiert wurde, erfolgen, oder mittels eines primären biotinylierten Antikörpers, der anschließend durch einen mit Streptavidin funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel detektiert wird.
Anhand folgender Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:
Ausführungsbeispiel 1
Konjugation von Streptavidin an mit Thioglyzerin stabilisierten II–VI Halbleiter-Nanopartikeln.
Die Lösung der eingesetzten, mit Thioglyzerin stabilisierten Halbleiter-Nanopartikel hat eine Konzentration von 0,5 g/l. 2 ml dieser Lösung mit Thioglyzerin stabilisierter Halbleiter-Nanopartikel werden mit 400 μl MES Puffer (100 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure; pH = 6) versetzt und 2–3 min inkubiert.
Es wird weiterhin eine 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid(EDC)-Lösung von 5 g/l in dest. H₂O hergestellt.
Daraufhin wird eine Endkonzentration von EDC in der Nanopartikellösung von 0,025 g/l eingestellt und für 5 min inkubiert. Die Nanopartikel mit der aktivierten Oberfläche werden nun in einen Visking Dialyse Schlauch (Ausschlussgröße 15 kDa) überführt und gegen 5 l dest. H₂O dialysiert.
Die Nanopartikelsuspension wird nun dem Dialyseschlauch entnommen und in ein sauberes Reagiergefäß überführt. Der Lösung wird nun 1,6 ml Boratpuffer (200 mM, pH = 8,5) zugesetzt und für 3 min inkubiert.
Hiernach erfolgt die Zugabe von 100 μl einer 1 g/l konzentrierten Streptavidinlösung (molares Verhältnis Streptavidin:Halbleiter-Nanopartikel ≈ 3:1) und anschließender Inkubation für 5 min.
Zur Absättigung etwaiger noch vorhandener Bindungsstellen werden anschließend 187,5 μl RSA (20 g/l) zugegeben. Die Lösungen werden nun für 90 min inkubiert und anschließend erneut für 30 min gegen 5 1 PBS (0,2 g/l KCl; 0,2 g/l KH₂PO₄; 1,15 g/l Na₂HPO₄; 8 g/l NaCl, pH 7,4) dialysiert. Damit ist die Lösung gebrauchsfertig.
Ausführungsbeispiel 2
Das hierin beschriebene Verfahren gleicht im Wesentlichen dem Ausführungsbeispiel 1, mit dem einzigen Unterschied, dass nach der Konjugation der Halbleiter-Nanopartikel mit Streptavidin eine Absättigung der noch aktiven Oberfläche mit Monoethanolamin anstelle von RSA durchgeführt wird.
Daraus ergibt sich eine deutlich bessere Präsentation der Streptavidinmoleküle auf der Nanopartikeloberfläche. Dadurch soll die Kinetik der Anbindung des Halbleiter-Nanopartikel-Streptavidin-Konjugates an z. B. biotinylierte Zielproteine beschleunigt werden.
Die Probenpräparation verläuft bis einschließlich der Zugabe von Streptavidin zur Nanopartikelsuspension wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Danach wird eine Konzentration mit Monoethanolamin von 0,025 g/l eingestellt und für 90 min inkubiert. Diese Lösung wird anschließend zunächst gegen 51 dest. H₂O für 15 min und anschließend gegen 5 1 PBS für 30 min dialysiert. Abschließend können zur Erhöhung der Stabilität der Lösung noch 180 μl einer RSA Lösung (20 g/l) zugegeben werden.
Ausführungsbeispiel 3
Die, wie in Ausführungsbeispiel 1 oder 2 beschrieben, hergestellten Konjugate aus Streptavidin und Halbleiter-Nanopartikel eignen sich zum Nachweis von mit Biotin markierten Zielproteinen im Immunoblot.
In dem Versuch wird in einem Bakterienstamm (E. coli) ein Protein heterolog exprimiert und anschließend mittels Western Blot Analysen im Zelllysat detektiert. Dabei wird, um die Sensitivität des Versuchsansatzes zu validieren, das Zelllysat des genetisch modifizierten Stammes mit dem Zelllysat eines Naturstammes in der Weise verdünnt, dass die Menge an zu detektierendem Zielprotein in einer Reihe abnimmt. Dazu wird in einem E. coli Stamm ein eGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) überexprimiert, das an seinem C-Terminalen Ende mit einem His-Tag, d. h. einer Folge von 5 Histidinresten hintereinander versehen ist.
Dazu wird von dem Stamm E. coli HA-eGFP-His eine Vorkultur in 5 ml LB-Amp-Chl Medium angesetzt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Mit 2,5 ml der Vorkultur werden 50 ml LB-Amp-Chl Medium angeimpft und bei 30°C inkubiert. Nachdem die OD600 von etwa 0,5 erreicht hat, wird die Proteinexpression durch 20 μl IPTG (Endkonzentration 0,4 mM) induziert. Nach Zugabe von IPTG wird 3 Std. bei 30°C inkubiert.
Anschließend werden 50 ml der Kultur in ein Zentrifugiergefäß gegeben und bei 10000 g 2 min abzentrifugiert. Das Pellet wird in 3–5 ml Puffer B (5 mM Imidazol) gelöst, eine Spatelspitze Lysozym und etwas DNAse und RNAse dazugegeben und 30 min/37°C geschüttelt. Anschließend wird der Ansatz 15 min auf Eis inkubiert, und dann die Zellen durch Ultraschall (5 × 1 min, a' 9 Impulse; max. Power, kurze Pause zw. den einzelnen Impulsen) aufgeschlossen. Von dem Ansatz werden 20 μl der Probe entnommen, mit Puffer B auf 5 ml aufgefüllt und auf zwei Zentrifugenröhrchen verteilt (1500 g/20 min/4°C). Der Überstand wird in ein neues Falconröhrchen überführt und davon 200 μl Probe für die Konzentrationsbestimmung entnommen.
Für die Gelelektrophorese werden 12% Polyacrylamid-Gele gegossen. Aufgrund der hohen Proteinkonzentration der Zelllysats werden Verdünnungen mit jeweils 1 g/l hergestellt und pro Tasche 10 μg Protein mit Lämmli-Puffer (6 × Lämmli-Puffer: 0,35 M Tris-HCl; 10,28% (w/v) SDS; 36% (v/v) Glycerin; 0,012% (w/v) Bromphenolblau; 100 mM DTT; pH 6,8) aufgetragen. Als Standard dient die PageRuler Prestained Protein Ladder Plus (3 μl).
Mittels eines Tank Blots werden nun die Proteine auf eine PVDF Membran transferiert. Der Western Blot wird nach folgendem Prinzip aufgebaut (von oben nach unten):

– zwei dicke Blotting Papiere
– Polyacrylamid-Gel
– PVDF Membran
– zwei Blotting Papiere

Der Western Blot wird bei 182 V durchgeführt; der Transferpuffer setzt sich folgendermaßen zusammen: 25 mM Tris; 190 mM Glycin; 0,01% (w/v) SDS; 10% (v/v) Methanol; pH 8,3
Nach dem Transfer wird die Membran über Nacht bei 4°C mit 5% Magenmilchpulver in TBS-T (20 mM Tris/HCl pH 7,4; 137 mM NaCl; 0,1% Tween 20) blockiert. Nachdem die Blocking Lösung verworfen wurde, wird der Primärantikörper (Anti-His-Biotin-Antikörper, ICL-Lab) in einer Verdünnung von 1:1000 direkt zugegeben und die Membran 1 h inkubiert. Anschließend wird die Membran 3 × mit TBS-T gewaschen. Anschließend werden 1 ml mit Streptavidin konjugierte Halbleiter-Nanopartikel (hergestellt wie in Ausführungsbeispiel 1 oder 2 beschrieben) mit 5% Magermilchpulver TBS-T auf 20 ml aufgefüllt. Die Lösung wird zu der Membran zugegeben und 1½ h inkubiert. Es folgen 3 Waschschritte mit TBS-T.
Die Aufnahme wird mit der trockenen Membran auf dem Transilluminator gemacht. Dazu wird Durchlicht der Wellenlänge 302 nm, eine Belichtungszeit von 8 Sekunden und der Filtersatz für Ethidiumbromid-gefärbte Gele verwendet. Unter diesen Bedingungen ist im Bereich des Zielproteins (32 kDa) eine deutliche Bande zu erkennen. Die funktionalisierten Halbleiter-Nanopartikel eignen sich also für die Markierung von Proteinen im Western Blot.

Claims

Verfahren zur Funktionalisierung eines Halbleiter-Nanopartikels aus wenigstens einem Halbleiter-Nanopartikel-Kern aus ZnS (Zinksulfid) als Halbleitermaterial und wenigstens einer hydrophilen äußeren Schicht, wobei die hydrophile äußere Schicht aus Molekülen besteht, die wenigstens eine Kopplungsgruppe pro Molekül zur Kopplung eines Detektionsmoleküls umfassen, mit den Schritten: a) Aktivierung der Kopplungsgruppen der hydrophilen äußeren Schicht, b) Bindung des Detektionsmoleküls über die Kopplungsgruppe an den Halbleiter-Nanopartikel, wobei Detektionsmolekül und Halbleiter-Nanopartikel in einem Verhältnis von 1:1 bis 30:1, vorzugsweise 2:1 bis 20:1, bevorzugt 3:1 bis 10:1 zur Reaktion gebracht werden, wobei das Detektionsmolekül ausgewählt ist aus Aminosäuren, Proteinen, Nukleinsäuren, Polysacchariden oder einem sonstigen biochemischen Agens, und wobei über das Detektionsmolekül eine Bindung an weitere biologische Substanzen ermöglicht wird, und c) Deaktivierung der freien Kopplungsgruppen durch gleichzeitige oder anschließende Zugabe eines nicht-aktiven Biomoleküls.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile äußere Schicht aus einer Thiol-haltigen Verbindung, einer alpha-Hydroxycarbonsäure, einem Polyphosphat, einer Sulfonsäure, Thioacetamid, Acrylsäure oder einer Kombination davon besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Thiol-haltige Verbindung ausgewählt ist aus Thioglyzerin, Mercaptoessigsäure, 3-Mercaptopropionsäure (MPA), Cysteamin und/oder Mercaptoethanol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Halbleiter-Nanopartikel mit Mn (Mangan), Cu (Kupfer), Eu (Europium), Al (Aluminium) oder einer Kombination davon dotiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsmoleküle ausgewählt sind aus polyklonalen Antikörpern, monoklonalen Antikörpern, Haptenen, Biotin, Avidin, Streptavidin, Phagen oder deren Bindungsproteine sowie Bindemotiven von Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-aktive Biomolekül ausgewählt ist aus Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, Desoxyribonukleinsäuren, Ribonukleinsäuren und niedermolekularen organischen Molekülen.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das als nicht-aktives Biomolekül verwendete Protein ausgewählt ist aus Casein, Magermilchprotein, Magermilchpulver, Gelatine und Serumprotein, bevorzugt Albumin, besonders bevorzugt RSA.
Verwendung eines Halbleiter-Nanopartikels hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Markierung eines biologischen Moleküls.
Verwendung eines Halbleiter-Nanopartikels hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Markierung eines biologischen Moleküls in einem Western Blot.
Funktionalisierte Halbleiter-Nanopartikel aus wenigstens einem Halbleiter-Nanopartikel-Kern aus ZnS (Zinksulfid) als Halbleitermaterial und wenigstens einer hydrophilen äußeren Schicht, wobei die hydrophile äußere Schicht aus Molekülen besteht, die wenigstens eine Kopplungsgruppe pro Molekül zur Kupplung eines Detektionsmoleküls umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass an die Kupplungsgruppen eines Halbleiter-Nanopartikels im Durchschnitt zwischen 1 und 30, vorzugsweise zwischen 2 und 20, bevorzugt zwischen 3 und 10 Detektionsmoleküle kovalent gebunden sind, und dass an die übrigen Kopplungsgruppen entweder ein nicht-aktives Biomolekül oder kein Molekül kovalent gebunden ist.
Funktionalisierte Halbleiter-Nanopartikel gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsmolekül ausgewählt ist aus Avidin, Streptavidin und Biotin.