DE102009013147A1 - Spektroskopie heterogener Proben - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft das technische Gebiet der spektroskopischen Analyse und Fluoreszenzmessung, besonders von mikropartikulären Proben mit zu analysierenden Oberflächen- oder Volumenabschnitten im Größenbereich von 1 bis 100 µm. Es wird ein verbessertes Messverfahren zur Registrierung der in dem Oberflächen- oder Volumenabschnitt einer Probe emittierten elektromagnetischen Strahlung bereitgestellt, welches die Nachteile von optischen Messeinheiten mit kleiner numerischer Apertur überwindet und eine hochempfindliche und schnelle Messung des gesamten Oberflächen- oder Volumenabschnitts ermöglicht.

Description

  • Die Erfindung betrifft das technische Gebiet der spektroskopischen Analyse und Fluoreszenzmessung, besonders von mikropartikulären Proben mit zu analysierenden Oberflächen- oder Volumenabschnitten im Größenbereich von 1 bis 100 μm. Es wird ein verbessertes Messverfahren zur Registrierung der in dem Oberflächen- oder Volumenabschnitt einer Probe emittierten elektromagnetischen Strahlung bereitgestellt, welches die Nachteile von optischen Messeinheiten mit kleiner numerischer Apertur überwindet und eine hochempfindliche und schnelle Messung des gesamten Oberflächen- oder Volumenabschnitts ermöglicht.
  • Stand der Technik
  • Bei der spektroskopischen Analyse ist es wünschenswert, einen möglichst großen Abschnitt einer Probe in einem einzigen Messdurchgang zu erfassen. Bei heterogenen Oberflächen von Proben oder Volumina, beispielsweise partikulären Proben oder kompartimentierten biologischen Zellen, oder bei Oberflächen, die mit Beschichtungen zur „surface enhanced” Ramanstreuung (SERS) versehen sind, besteht das technische Problem, dass innerhalb des zu untersuchenden Volumen- oder Flächenabschnitts der Probe optisch „aktive”, das heißt elektromagnetische Strahlung emittierende, Zonen, zum Beispiel bestimmte Zellkompartimente oder SERS-„hot-spots”, nur sporadisch vorhanden und insbesondere inhomogen verteilt sind. Aktive Zonen, deren Emissionen spektroskopisch analysierbar wären, liegen wie Inseln zwischen überwiegend optisch inaktiven Abschnitten. Das Gesamtsignal aus dem von der Probe regist rierten Volumen- oder Flächenabschnitten ist klein, trotz gegebenenfalls hoher lokaler Emission innerhalb der optisch aktiven Zonen.
  • Zur verbesserten Analyse der Signale aus den optisch aktiven Zonen, soll das repräsentative Emissionsspektrum mit hoher Signalqualität und in kurzer Messzeit erfasst werden. Im Stand der Technik existieren bisher nicht zufriedenstellende Ansätze zur Lösung dieses Problems: Im Messstrahlengang werden beispielsweise optisch abbildende Einrichtungen (Objektive) mit kleiner numerischer Apertur eingesetzt, welche ein großes Fokusvolumen und damit verbundenes Detektionsvolumen aufweisen. Dadurch soll es ermöglicht werden, dass die emittierte Strahlung aus einem größeren Abschnitt der Probe gleichzeitig registriert werden kann. Nachteilig ist dabei vor allem, dass aufgrund der kleinen numerischen Apertur nur ein kleiner Raumwinkel zur Registrierung der in der Regel diffus emittierten Strahlung zur Verfügung steht, und deshalb innerhalb des Fokusvolumens nur ein geringer Anteil der Strahlung registriert werden kann.
  • Um schwache Signale zu kompensieren, müssen zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden, die die Intensität der Emission und/oder die Empfindlichkeit der Messung erhöhen. Zur Verstärkung der Emission wird vor allem die Intensität der Anregungsstrahlung, die zur Anregung (insbesondere Fluoreszenz oder Ramanstreuung) der Emission eingesetzt wird erhöht. Dies hat bekannte Nachteile wie die Gleichung von lichtempfindlichen Strukturen in der Probe zur Folge. Außerdem ist der apparative Aufwand zur Bereitstellung einer höheren Lichtleistung des Anregungslichts, insbesondere in Form einer Laserlichtquelle, hoch und letztlich auch überproportional teuer. In einigen Fällen ist die weitere Steigerung der Lichtleistung von technischer Seite gar nicht möglich.
  • Alternativ oder zusätzlich wird deshalb die Messempfindlichkeit, beispielsweise durch Verlängern der Integrationszeit bei der Messung, erhöht. Eine lange Integrationszeit ist nachteilig, weil es die Gesamtmesszeit der Analyse verlängert und einen hohen Probendurchsatz und/oder die Analyse transienter Vorgänge in der Probe erschwert oder verhindert.
  • Alternativ werden Maßnahmen ergriffen, die eine Registrierung der von der Probe emittierten Strahlung über einen möglichst großen Raumwinkel ermöglichen. Objektive mit hoher numerischer Apertur weisen typischerweise ein kleines Fokusvolumen und Detektionsvolumen auf, innerhalb dessen die von der Probe emittierte Strahlung registriert werden kann. Dadurch können pro Messung die Signale nur eines kleinen Abschnitts der Probe registriert oder analysiert werden. Zwar ist die Messung an der Stelle des Fokusvolumens hochempfindlich, nachteilig ist aber, dass das Fokusvolumen zur Messung stets gezielt auf die optisch aktive Zone in der Probe gerichtet werden muss, um gegebenenfalls ein verwertbares Signal zu erhalten. Dies ist nur in wenigen Fällen überhaupt technisch zufriedenstellend möglich. Es verlangt vor allem, dass die Probe, möglichst unter optischer Kontrolle in der Ausgangszone und in der Messzone des Fokusvolumens, festgehalten werden kann, damit die ausgewählte aktive Zone während der gesamten Messung innerhalb des Fokusvolumens bleibt. Dies ist besonders problematisch, wenn es sich bei der Probe um eine heterogene Struktur, beispielsweise eine biologische Zelle mit spektroskopisch unterschiedlich „aktiven” und gegebenenfalls nicht ortsfesten Kompartimenten handelt.
  • Kleine partikuläre Proben wie biologische Zellen oder deren Teile, wie Organellen, Zellkern, etc. können außerdem unter dem Einfluss der Anregungsstrahlung wie in einer sogenannten „optischen Pinzette” an einer bestimmten Position, nämlich in der Regel im Zentrum der optischen Achse des Anregungsstrahlengangs, festgehalten werden, so dass sich der Fokus des Messstrahlengangs, der in der Regel konfokal zum Strahlengang der Anregungsstrahlung (Anregungsstrahlengang) verläuft, nicht mehr ohne weiteres gezielt auf andere Abschnitte der Probe richten lässt.
  • Beispielsweise wenn bei der spektroskopischen Analyse von biologischen Zellen sich der Zellkern als prominente Struktur innerhalb der Zelle stets in der optischen Achse der Anregungsstrahlung anordnet, kann von anderen Zellkompartimenten, Cytoplasma, Membranabschnitten, Organellen, kein repräsentatives Emissionspektrum registriert werden. Dieses Problem stellt sich auch, wenn versucht wird, einzelne Messungen zeitlich nacheinander an räumlich nebeneinander liegenden, angrenzenden oder sich überlappenden Flächen- oder Volumenabschnitten der biologischen Zelle durchzuführen: Auch wenn die Zelle selbst auf einem Substrat fixiert ist, „folgt” der Zellkern dem Anregungslichtkegel bei einzelnen Messungen benachbarter Abschnitte der Probe. Es existiert eine „Sogwirkung” der durch das Anregungslicht gebildeten optischen Pinzette für prominente Strukturen die innerhalb einer Probe beweglich sind, also insbesondere der Zellkern einer Zelle. Die Erfassung repräsentativer Emissionsspektren von Probenabschnitten, die zu solchen prominenten beweglichen Strukturen benachbart sind, ist mit bekannten sequenziellen Verfahren nicht oder nur unzureichend möglich.
  • Ebenfalls im Stand der Technik unbefriedigend gelöst ist die spektroskopische Analyse von SERS-aktivierten Oberflächen, beispielsweise im Rahmen der Materialprüfung. SERS-Oberflächen weisen sporadisch verteilte sogenannte „hot spots” mit hoher optischer Aktivität (hohe Strahlungsemission) auf. Es soll mit ausreichend hoher Messgeschwindigkeit und/oder hoher Empfindlichkeit ein großer Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe in möglichst einer Messung analysiert werden, um ein repräsentatives Emissionsspektrum von der Probe zu erhalten. Dazu muss der Flächen- oder Volumenabschnitt zumindest so groß gewählt werden, dass eine ausreichend große Zahl an „hot spots” darin enthalten ist.
  • Ein weiteres Problem, das im Zusammenhang mit der SERS-Methode steht, besteht darin, dass durch die Metallinseln, welche die Anregungswellenlänge absorbieren und damit für eine Verstärkung des Signals sorgen, bei einer Steigerung der Lichtleistung der Anregungsstrahlung letztlich zuviel Energie absorbieren können und damit die Gefahr besteht, dass die zu analysierende Oberfläche der Probe zerstört wird; die Lichtleistung der Anregungsstrahlung ist also besonders bei der SERS-Methode nicht beliebig steigerbar.
  • Aufgabenstellung
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein spektroskopisches Analyseverfahren so weiterzubilden, dass die Analyse von vor allem inhomogenen oder heterogenen Strukturen, besonders mit sporadisch und heterogen verteilten spektroskopisch optisch aktiven Zonen, wie kompartimentierte Zellen, Volumina und/oder Oberflächen mit SERS „hot spots”, einfacher, schneller und/oder präziser durchgeführt werden kann. Dabei soll möglichst die Messgenauigkeit oder Sensitivität des Systems verbessert und dabei möglichst die Messzeit zur Erfassung repräsentativer Spektren verringert werden.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur spektroskopischen Analyse eines Flächen- oder Volumenabschnitts einer Probe in einer Messanordnung mit Anregungsstrahlengang und Messstrahlengang, wobei über den Anregungsstrahlengang in der Probe Strahlungsemission angeregt und emittierte Strahlung von einem Fokusvolumen des Messstrahlengangs innerhalb eines zeitlichen Messintervalls aufgefangen wird, welches vor allem dadurch gekennzeichnet ist, dass
    • – das Fokusvolumen über den Flächen- oder Volumenabschnitt, welcher einem Mehrfachen des Fokusvolumens entspricht, bewegt wird und
    • – die im bewegten Fokusvolumen über die Dauer des Messintervalls registrierte Strahlung integriert wird.
  • Die im bewegten Fokusvolumen registrierte Strahlung wird bevorzugt so integriert, dass in einem, vorzugsweise einzigen, zeitlichen Messintervall ein Summensignal erhalten wird, welches den gesamten Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe repräsentiert.
  • Die spektroskopische Analyse im Sinne der Erfindung ist bevorzugt ausgewählt aus: Fluoreszenz-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie, SERS, IR-Spektroskopie und verwandten oder davon abgeleiteten spektroskopischen Verfahren.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung, die geeignet ist und insbesondere speziell ausgebildet ist zur Durchführung des Verfahrens der spektroskopischen Analyse eines Flächen- oder Volumenabschnitts einer Probe gemäß der Erfindung. Die Vorrichtung enthält dabei zumindest: mikroskop-optische Anordnung, Anregungsstrahlungsquelle zur Anregung elektromagnetischer Strahlung in einer Probe und Messeinrichtung mit Messstrahlengang zur Registrierung von der Probe emittierter elektromagnetischer Strahlung der Probe, wobei der Messstrahlengang eine numerische Apertur und ein Fokusvolumen zur Registrierung emittierter Strahlung aufweist. Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass das Fokusvolumen um ein Mehrfaches kleiner ist als der zu analysierende Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe und dass das Fokusvolumen während der Messung über den Flächen- oder Volumenabschnitt bewegbar ist.
  • Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem also primär durch die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens der insbesondere spektroskopischen oder fluoreszenzoptischen Analyse einer Probe, besonders einer partikulären Probe oder einer Probe mit heterogen und/oder sporadisch verteilten optisch aktiven Zonen innerhalb der zu untersuchenden Flächen- oder Volumenabschnitte. Die Probe wird dabei zumindest innerhalb des zu untersuchenden Flächen- oder Volumenabschnitts mittels Anregungsstrahlung (Anregungsstrahlengang) angeregt, elektromagnetische Strahlung zu emittieren. Bevorzugterweise emittieren ein oder mehrere optisch aktive Zonen innerhalb des untersuchten Flächen- oder Volumenabschnitts der Probe diese Strahlung. Diese Strahlung, insbesondere Fluoreszenz und Ramanstreustrahlung, wird von einer optischen Messeinrichtung zu deren Registrierung aufgefangen. Die optische Messeinrichtung weist dazu also zumindest einen Messstrahlengang (Detektionsstrahlengang) auf, der im Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe fokussiert wird und dort einen Fokus, also ein räumlich abgegrenztes Fokusvolumen bildet, innerhalb dessen die emittierte Strahlung registriert werden kann (Detektionsvolumen). Der Messstrahlengang weist eine im Wesentlichen durch die Bauart der Messeinrichtung, insbesondere des Objektivs und dessen Frontlinse bedingte numerische Apertur und ein damit im direkten Zusammenhang stehendes begrenztes Fokusvolumen des Messstrahlengangs auf.
  • Die zur Analyse durchgeführte mindestens eine, bevorzugt aber die einzige, Messung findet also innerhalb eines bevorzugt einzigen zeitlichen Messintervalls statt. Innerhalb dieses Messintervalls wird die emittierte Strahlung aus einem Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe registriert und mindestens ein Messwert, der die Emission der optisch aktiven Zone(n) in dem gesamten Flächen- oder Volumen-Abschnitt repräsentiert, registriert. Dieser Messwert ist in einer ersten Variante der Erfindung ein Skalar, welcher der in diesem Flächen- oder Volumenabschnitt emittierten elektromagnetischen Strahlung proportional ist.
  • In einer alternativen und bevorzugten Variante ist das Messergebnis ein Spektrum (Spektrogramm) der im gemessenen Flächen- oder Volumenabschnitt einer Probe emittierten elektromagnetischen Strahlung. Dazu wird die spektrale Verteilung der Strahlung ermittelt, indem insbesondere die Frequenz/Wellenlänge gegen ihre Intensität aufgetragen wird. Bevorzugte Ausführungsformen sind die Ramanspektroskopie und die Fluoreszenzspektroskopie.
  • Die Erfindung sieht primär ein Verfahren vor, worin das Fokusvolumen des Messstrahlengangs zur Registrierung der Emissionen während der Messung, das heißt besonders zumindest innerhalb des Messintervalls, den zu messenden Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe, gegebenenfalls mehrfach, bevorzugt wiederkehrend und bevorzugt mit hoher Frequenz beziehungsweise Geschwindigkeit des Fokusvolumens, besonders in lateraler Ausdehnung der Probe (x-Richtung, y-Richtung), überstreicht, so dass Emissionen von sich im jeweils momentanen Fokusvolumen befindlichen optisch aktiven Zonen aufgefangen und alle während der Messung in dem gesamten Flächen-/Volumenabschnitt aufgefangenen Emissionen und innerhalb des Messintervalls zeitlich zu einem Summensignal integriert werden oder werden können. Sie löst so das zugrunde liegende technische Problem vollständig.
  • Die Erfindung erlaubt, dass das Verfahren in einer bekanntermaßen für die Registrierung schwacher Emissionen, beispielsweise Fluoreszenz oder Ramanstreuung, geeigneten optischen Einrichtung, insbesondere eine Mikroskop-basierte Anordnung, mit hoher numerischer Apertur, insbesondere 0,7 oder größer, im Falle von Immersionsobjektiven bevorzugt größer als 1,0, durchgeführt werden kann. Eine gemäß der Erfindung wählbare und bevorzugte hohe numerische Apertur gestattet es, die Emissionen über einen möglichst großen Raumwinkel aufzunehmen. Der damit bisher verbundene Nachteil, bekanntermaßen Signale eines nur sehr begrenzten Fokusvolumens, insbesondere 1 μm3 (1 fL) oder kleiner, registrieren zu können, wird durch die Lehre der Erfindung, das Fokusvolumen wäh rend der Messung über den zu messenden Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe zu bewegen und die Messsignale aus dem Fokusvolumen zeitlich zu integrieren, überwunden.
  • Dank der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft möglich, mit einer so genannten und bekanntermaßen „hoch geöffneten” Optik mit numerischer Apertur von bevorzugt 0,7 oder größer, besonders bevorzugt 1,0 oder größer, dennoch die Emissionen aus einem großen Flächen- oder Volumenabschnitt einer Probe, besonders aber aus der gesamten Probe, innerhalb einer bevorzugt einzigen Messung, das heißt innerhalb eines einzigen abgeschlossenen zeitlichen Messintervalls, zu registrieren und gegebenenfalls zu analysieren. Die Registrierung erfolgt bevorzugt in Form eines repräsentativen Emissionsspektrums von dem Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe.
  • Der Flächenabschnitt beziehungsweise Volumenabschnitt der Probe, innerhalb dessen erfindungsgemäß die emittierte Strahlung registriert wird, beträgt erfindungsgemäß ein Vielfaches, bevorzugt mindestens das Zehnfache, besonders bevorzugt mindestens das Hundertfache des vom statischen Fokusvolumen der eingesetzten optischen Anordnung registrierten Flächenabschnitt der Probe: Bei einem Fokusvolumen von 1 µm3 wird näherungsweise von einem statisch registrierten Flächenabschnitt auf der Probe von 1 µm2 ausgegangen (x- und y-Richtung). Durch das erfindungsgemäße Vorgehen kann dieser Flächenabschnitt auf bevorzugt 100 µm2 oder mehr, bevorzugt 500 µm2 oder mehr, vergrößert sein.
  • Bevorzugt wird das Fokusvolumen durch eine in einem optischen System der Messeinrichtung vorgesehene optische Scannereinheit, bevorzugt in zumindest einer Raumrichtung periodisch bewegt wird. In einer Variante wird das Fokusvolumen nach einem strukturierten Muster geordnet bewegt (Scanning). In einer alternativen Variante wird das Fokusvolumen stochastisch oder quasi-stochastisch bewegt (Wobble).
  • Bevorzugt beträgt die Grundfrequenz der insbesondere periodischen Bewegung des Fokusvolumens zumindest im Bereich des zu untersuchenden Flächenabschnitts beziehungsweise Volumenabschnitts der Probe, zumindest über die Dauer des Messintervalls, von 1 bis 1000 Hz, bevorzugt von 2 bis 200 Hz.
  • Bevorzugt beträgt die Amplitude der Bewegung des Fokusvolumens, zumindest über die Dauer des Messintervalls, 1 bis 100 µm, bevorzugt 2 bis 10 µm.
  • Bevorzugt beträgt die Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens zumindest im Bereich des zu untersuchenden Flächenabschnitts beziehungsweise Volumenabschnitts, zumindest über die Dauer des Messintervalls, im Mittel mindestens 1 mm/s, bevorzugt 2 mm/s oder mehr, mehr bevorzugt 10 mm/s oder mehr, vorzugsweise bis 100 mm/s. Besonders bevorzugt beträgt die Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens im Bereich des zu untersuchenden Flächenabschnitts beziehungsweise Volumenabschnitts, zumindest über die Dauer des Messintervalls, stets 2 mm/s oder mehr, besonders stets 10 mm/s oder mehr. Bevorzugt werden maximale Geschwindigkeiten bis 100 mm/s gewählt.
  • Bevorzugt wird die Geometrie und/oder Position des Flächen- oder Volumenabschnitts (Scanbereich), der von dem sich erfindungsgemäß bewegenden Fokusvolumen zumindest während der Messung überstrichen wird, anhand mikrophotographischer Daten der Probe, die insbesondere unmittelbar zuvor erhoben wurden, bevorzugt automatisch, besonders bevorzugt durch automatische Bildanalyse gestützt, festgelegt. Bevorzugt ist die Messung ausschließlich auf diesen Abschnitt beschränkt.
  • Bevorzugt hält der Anregungsstrahl die Probe, insbesondere einer partikulären Probe, bevorzugt einer biologischen Zelle, zumindest für die Dauer der Messung ortsfest; insbesondere vermittelst der Wirkung der „optischen Pinzette”. Vorzugsweise werden die Tiefpasseigenschaften des mechanischen Systems der Probe ausgenützt, indem die Bewegungsparameter der erfindungsgemäßen Scanbewegung bevorzugt so gewählt werden, dass die Probe zwar im Anregungsstrahl festgehalten wird, dessen bevorzugt vorgesehenen Scanbewegungen im einzelnen aber nicht folgen kann.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird ein „Flächenabschnitt” der Probe als die in x- und y-Richtung, und zwar senkrecht zur optischen Achse des Messstrahlengangs (z-Richtung), aufgespannte Fläche angesehen. Besonders entspricht dies der primären Ebene der Probe, beispielsweise die Ebene eines Objektträgers oder der Boden eines Zellkulturgefäßes worauf die Probe angeordnet oder fixiert ist, oder eine SERS-aktive Oberfläche eines Materials. Im Zusammenhang mit der Erfindung wird ein „Volumenabschnitt” der Probe als der in x- und y-Richtung, also senkrecht zur optischen Achse des Messstrahlengangs, und in z-Richtung, das heißt in Richtung der optischen Achse, ausgedehnte Raum angesehen.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „mikroskop-basierter Anordnung” oder „mikroskopoptisches System” im einfachsten Fall ein Lichtmikroskop mit Abbe'scher Abbildung verstanden. Weitere Ausführungen solcher Anordnungen, die insbesondere für ramanspektroskopische Analysen und/oder Fluoreszenzanalysen geeignet sind, kennt der Fachmann. Besonders bevorzugt sind Fluoreszenzmikroskope und Konfokalmikroskope.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „numerischer Apertur” (Formelzeichen: NA, n. A. oder AN) das Produkt aus dem Sinus des halben objektseitigen Öffnungswinkels (Akzeptanzwinkel) α und dem Brechungsindex n der Umgebung verstanden. An Luft (n = 1) ist die numerische Apertur immer kleiner als 1. Sie kann Werte größer als 1 annehmen, wenn der Raum zwischen Probe und Objektiv mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt wird, deren Brechungsindex n größer ist als 1. Immersionsobjektive besitzen insbesondere eine numerische Apertur von 1,2 bis 1,4. Ein optisch abbildendes Element, insbesondere ein Objektiv, wird durch seine Vergrößerung, seine numerische Apertur, den optischen Arbeitsabstand und den rückwärtigen Abbildungsabstand charakterisiert. Der Öffnungswinkel des Objektivs wird durch eine Blende in der hinteren Brennebene des Objektivs bestimmt. Aus bautechnischer Sicht ist aber vor allem die Fassung der ersten Linse limitierend. Analog zur numerischen Apertur ist vor allem in der Fotografie das Öffnungsverhältnis be kannt; das Öffnungsverhältnis bezieht sich dabei auf den bildseitigen Öffnungswinkel.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einem „Fokusvolumen” die räumliche Ausdehnung des „theoretischen” Brennpunkts des Messstrahlengangs verstanden. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, ist der in Praxis entstehende Brennpunkt kein mathematischer Punkt, sondern ein Fokusraum, der desto kleiner wird, je größer die numerische Apertur des verwendeten Objektivs ist. Da die numerische Apertur nur einen gewissen bauartbedingten maximalen Wert annehmen kann, bleibt das Volumen des Fokus stets endlich; es ist letztlich „beugungsbegrenzt”. Unter „Fokusvolumen” wird auch derjenige Raum verstanden, worin die Emissionen der Probe vom Messstrahlengang (Detektionsstrahlengang) „aufgefangen” und in der Messeinrichtung (Detektor) registriert werden können. Je nach Bauart der optischen Anordnung kann das Detektionsvolumen kleiner als das Fokusvolumen sein, aber entspricht in bevorzugter Ausführung im Wesentlichen dem Fokusvolumen. Bei hohen numerischen Aperturen, d. h. etwa 1,2 (Wasserimmersion) oder 1,4 (Ölimmersion) werden Volumina von etwa 1 bis 2 fL (Femtoliter) erreicht. Bildet man den Objektraum über eine konfokale Lochblende (Konfokalmikroskop) auf einen Messdetektor ab, so entsteht ein Detektionsvolumen von weniger als 1 fL.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter der „Amplitude” die momentan gewählte oder maximal erreichbare Ausdehnung des Scanfelds in einer Raumrichtung, bevorzugt in x- oder y-Richtung (bei zweidimensionalem Scan) das heißt des vom sich bewegenden Fokusvolumen überstrichenen Flächen-/Volumenabschnitts. Im Falle eines kreisförmigen Scanfelds entspricht der Amplitudenwert dem Durchmesser dieses Kreises. Im Falle eines ellipsenförmigen Flächenabschnitts entspricht der Amplitudenwert vor allem dem Durchmesser der Ellipse in Längsrichtung.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „Grundfrequenz” die Frequenz eines insbesondere periodischen Vorgangs verstanden, bei dem sich ein bestimmtes Muster ständig wiederholt. So beschreibt die Grundfrequenz, wie häufig eine solche Muster-Wiederholung stattfindet. In der Realität sind periodische Schwin gungen aber auch nicht periodische Bewegungen immer mit einem gewissen Anteil an Nebenwellen oder Oberwellen behaftet. Ein zeitliche Abfolge lässt sich durch die Überlagerung von sinusförmigen Schwingungen beschreiben (Fourier-Komponenten; Fourier-Transformation). Periodische Signale sind nur aus Fourier-Komponenten zusammengesetzt, bei denen die Frequenz ein Vielfaches der Grundfrequenz der Grundschwingung beträgt. Die anderen höherfrequenten Komponenten, deren Frequenz ein Vielfaches der Grundfrequenz betragen, werden auch Harmonische, Partial-, Teil, oder Oberschwingungen bezeichnet. Ihr relativer Anteil am Gesamtsignal ist vor allem von systembedingten Parametern wie Resonanzen und frequenzabhängigen Kopplungen abhängig.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter einer „biologischen Probe” eine oder mehrere biologische Zellen, einzeln oder in Zellverbünden, Gewebe, Transplantate, Implantate, Organ- und Gewebeersatzpräparate und Teile davon verstanden. Als biologische Zellen gelten hier vor allem tierische und menschliche Zellen, wie Gewebe-, Embryonalzellen oder Stammzellen, Bakterienzellen und Bakteriensporen, Mykoplasmen, Pilzzellen, -hyphen und -sporen. Dabei muss die biologische Probe nicht notwendigerweise solche Zellen enthalten; Detektion und Identifikation in einer Probe potentiell enthaltener Zellen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die biologische Probe ist eine potentiell mindestens eine biologische Zelle enthaltende Zusammensetzung; darunter sind auch klinische Proben, Biopsien, sowie flüssige und überwiegend nicht flüssige biologische Proben von Geweben, Transplantaten, Organ- und Gewebeersatzpräparaten und Teilen davon und Rückstände der Sterilfiltration zu verstehen.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „Partikel” oder „partikulär” auch eine biologische Zelle oder ein Teil einer biologischen Zelle verstanden, die in einer biologischen Probe, beispielsweise in Form einer Flüssigkeit vorliegen kann. Unter „Partikel” werden auch alle individualisierbaren oder kategorisierbaren Zellen oder Zellfragmente, die in biologischen Proben, besonders in Zellverbünden, Geweben, Transplantaten, Implantaten, Organ- und Gewebeersatzpräparaten oder Teilen davon vorhanden sind, verstanden. Ist in die Fragestellung der Analyse primär auf die Charakterisierung von Vita lität oder Differenzierungsstadium von Gewebezellen gerichtet, so erlaubt die Vorauswahl anhand der Kategorisierung der im mikroskopischen Bild detektierten Gewebezellen, beispielsweise Chondrozyten, die gezielte spektroskopische Analyse dieser Zellen auf „Vitalitätsmarken” beziehungsweise „Gewebetypmarker” die anhand von spezifischen Kennwerten der Raman-Spektrogramme erkennbar sind.
  • Die Erfindung erlaubt Messungen von größeren Flächen- oder Volumenabschnitten einer Probe in einer einzigen Messung mittels Integration lokaler Signale. Die Messung kann vorteilhafterweise mit höherer Geschwindigkeit, höherem Probendurchsatz und/oder bevorzugt höherer Empfindlichkeit bei der Registrierung der Emission durchgeführt werden. Die Erfindung ermöglicht erstmals die zuverlässige und einfache Registrierung gemittelter, repräsentativer Spektren von Flächen- oder Volumenabschnitten partikulärer und/oder inhomogener Proben oder Oberflächen.
  • Die Erfindung erlaubt es, die spektroskopische Messung mit derart hohem Signal/Rausch-Abstand und so empfindlich durchzuführen, dass auf eine in bekannten Verfahren übliche intensive Anregungsstrahlung, welche, insbesondere in biologischen Systemen, nachteilhaft schädigend oder bleichend wirken könnte, verzichtet werden kann. Die erfindungsgemäße Methode ist deshalb besonders vorteilhaft zur Analyse von lebenden biologischen Zellen oder lichtempfindlichen Proben einsetzbar. Beispiele solcher Proben sind Gewebeschnitte, Gewebe- und Zellkulturen.
  • Die Erfindung ermöglicht vorteilhafterweise, dass sowohl bei der Medikamentenentwicklung, als auch bei der Bereitstellung individueller Therapeutika, das heißt beispielsweise biologischer Implantate und Gewebepräparate, primär biologische Flüssigkeiten als Proben untersucht werden können, ohne dass die Zusammensetzung der untersuchten biologischen Flüssigkeit verändert oder verschlechtert wird. Besonders werden die in der biologischen Flüssigkeit gegebenenfalls enthaltenen Partikel, das heißt besonders biologische Zellen, besonders Gewebezellen, in ihren Vitalfunktionen nicht beeinflusst und in ihrer Integrität nicht gestört.
  • Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt auf dem Gebiet der spektroskopischen Messung und der Analyse partikulärer Proben, besonders von biologischen Zellen. Diese weisen meist ungefähr sphärische oder rotationsellipsoide Formen auf. Die Zellen sind nicht notwendigerweise auf ein Substrat fixiert oder darin eingebettet; oft sind diese Zellen als ganze oder Kompartimente davon, Organellen oder der Zellkern, leicht beweglich. Durch das Anregungslicht im Anregungsstrahlengang wird die partikuläre Probe, also insbesondere die Zelle oder deren Teile, nach dem Prinzip der „optischen Pinzette” im Bereich des Strahls festgehalten.
  • Nun wird durch die erfindungsgemäß eingesetzte hohe Bewegungsgeschwindigkeit des sich bei der Messung bewegenden Fokusvolumens und des damit verbundenen Anregungsstrahl, der in der Regel koaxial zum Messstrahlengang verläuft, vorteilhaft erreicht, dass die partikuläre Probe oder biologische Zelle oder deren Teile aufgrund ihrer Eigenträgheit oder der Eigenträgheit von Teilen davon, beispielsweise der Zellkern, der schnellen Bewegung des Anregungsstrahls nicht folgen kann.
  • Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, werden hier die materialbedingten Tiefpasseigenschaften von eingebetteten Strukturen in der Probe wirkungsvoll ausgenützt. Es kann so vorteilhafterweise gewährleistet werden, dass alle Bereiche innerhalb des zu messenden Flächen-/Volumenabschnitts der Probe, bevorzugt gleich gedichtet oder alternativ schwerpunktmäßig in die Messung einbezogen werden, bevorzugt auch dann, wenn sich der primär zu analysierende Flächen-/Volumenabschnitt der Probe innerhalb dessen die Emissionen registriert werden, außerhalb der „optischen Achse” einer konventionellen, das heißt unbewegten, stationären Anregungsstrahlung befindet.
  • Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, kann der Anregungsstrahl der Messanordnung bevorzugt gezielt genutzt werden, die partikuläre Probe beziehungsweise biologische Zelle im Ganzen an Ort und Stelle zu halten, durch die entsprechend der mechanischen und fluid-mechanischen Trägheitseigenschaften der Probe erfindungsgemäß bevorzugt gewählten Bewegungsgeschwindigkeiten des erfindungsgemäß während der Messung bevorzugt schnell wandern den Fokusvolumens und damit des, bevorzugt konfokalen, Anregungsstrahls können in der so im Ganzen festgehaltenen Probe bestimmte ausgewählte Flächen-/Volumenabschnitte innerhalb der Probe oder alternativ die gesamte Probe gleichgewichtet in einer einzigen Messung die angeregten Emissionen registriert und gegebenenfalls analysiert werden, ohne dass es zu Bewegungsartefakten durch die Probe kommt. Eine schwerwiegende Art von Bewegungsartefakten ist auch die „Sogwirkung” der optischen Pinzette der Anregungsstrahlung, welche insbesondere auf prominente bewegliche Strukturen der Zelle wie den Zellkern ausgeübt wird, so dass sich dieser von selbst in den Fokus der Anregung und damit der Messung bewegt.
  • Die Erfindung erlaubt also, die Vorteile der optischen Pinzette der Anregungsstrahlung bei der Fixierung der zu untersuchenden Probe auszunützen, ohne dass die nachteiligen Auswirkungen der Sogwirkung der optischen Pinzette, wodurch prominente bewegliche Strukturen innerhalb der Probe, vor allem der Zellkern einer biologischen Zelle, in den Fokus der Messung gezogen werden, in Kauf genommen werden müssen.
  • Die Erfindung sieht bevorzugt vor, mittels zusätzlich aufgenommener mikroskopischer Bilddaten des Gesamtprobenfelds (Mikrophotographie) die Koordinaten der Probe oder Probenabschnitte, insbesondere die Koordinaten von Zellkompartimenten, Organellen, Zytoplasma etc., zu bestimmen. Dies geschieht bevorzugt durch automatisierte Analyse der mikrophotographischen Aufnahme. Dies geschieht in an sich bekannter Weise.
  • Die Erfindung erlaubt so, beispielsweise nach einer mikrophotographischen Prüfung oder bildverarbeitenden Analyse der zu untersuchenden Probe, insbesondere der biologischen Zelle, den Scanbereich auf einen bestimmten Flächen-/Volumenabschnitt innerhalb der Probe auszurichten und zu beschränken; im Falle einer biologischen Zelle vor allem auf bevorzugte Abschnitte der Zellmembran, bestimmte Organellen oder ähnliche Strukturen im Cytoplasma.
  • Die bevorzugt durchgeführte mikrophotographische Voranalyse der zu untersuchenden Probe erlaubt ebenfalls automatische Erkennung dergleichen Struktur, beispielsweise für die wiederholte Messung einer Mehrzahl gleichartiger Werkstücke oder Proben, welche so nacheinander bevorzugt automatisiert analysiert werden können. Die Strukturerkennung innerhalb einer Probe erfolgt in an sich bekannter Weise.
  • Die Erfindung sieht bevorzugt eine dynamische Anpassung, Größe und/oder des Scanfelds des erfindungsgemäß wandernden Fokusvolumens vor. Beispielsweise können so in einer Probe immer gleiche Zellkompartimente von biologischen Zellen gemessen werden. Dies kann wiederholt an derselben Zelle geschehen; dies kann aber auch an mehreren gleichartigen Zellen innerhalb eines zu untersuchenden Präparats, beispielsweise eines Gewebeabschnitts oder einer Zellkultur, erfolgen.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden Proben, insbesondere biologische Zellen, mit Anregungsstrahlung bestrahlt, die eine unelastische Streustrahlung, das heißt Raman-Streustrahlung in der bestrahlten Probe anregt. Die von der Probe innerhalb des Fokusvolumens des Messstrahlengangs der Analyseanordnung emittierte Raman-Streustrahlung wird über dem Messstrahlengang zugeordnete Detektoren und Sensoren detektiert, und die Intensität und bevorzugt die spektrale Verteilung der Raman-Streustrahlung wird analysiert. Dabei wird zumindest ein für den Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe bzw. Zelle repräsentatives Raman-Spektrum registriert.
  • Von dem mindestens einen Raman-Spektrum können einer oder bevorzugt mehrere charakteristische Kennwerte isoliert (Intensität an bestimmten Frequenzbändern) werden. Es ist bevorzugt vorgesehen, die ermittelten Kennwerte mit bekannten und hinterlegten Kennwerten, vorzugsweise nach an sich bekannten Analyseverfahren, zu vergleichen. In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch den erfindungsgemäßen Kennwertvergleich, bei ausreichender Übereinstimmung bestimmter Kennwerte, der zurückgehaltene Partikel charakterisiert, das heißt vor allem der Zelltyp, Zellspezies und/oder der Differenzierungsgrad der Zelle bestimmt, sodass beispielsweise das Vorhandensein einer bestimmten Zellspezies beziehungsweise einer Zelle mit einem bestimmten Differenzierungsgrad in der biologischen Flüssigkeit nachgewiesen werden kann.
  • Es versteht sich, dass das erfindungsgemäße Messverfahren nicht auf die Raman-Spektroskopie beschränkt ist. Das Verfahren kann auf jegliche spektroskopische Verfahren ausgeweitet werden, in denen in einer einzigen Messung ein möglichst großer Flächen-/Volumenabschnitt an einer Probe analysiert werden soll. Die Erfindung betrifft deshalb auch die Fluoreszenzspektroskopie, die Infrarotspektroskopie und Sonderformen wie FREI sowie abgeleitete Formen davon.
  • Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt auch auf dem Gebiet der spektroskopischen Messung und der Analyse SERS-modifizierter Oberflächen, welche typischerweise heterogenen und sporadisch verteilte „hot spots” der SERS aufweisen. Es ist dazu insbesondere vorgesehen, die Probe vor der Analyse an der Oberfläche mit Metall oder Metallkolloiden zu beschichten oder anzureichern. Die Beschichtung und Bindung des oder der Metalle geschieht in an sich bekannter Weise, vorzugsweise durch lokale Derivatisierung der Oberfläche. Besonders bevorzugt ist die Anreicherung der Probenoberfläche mit Goldkolloiden. Die elektronischen Eigenschaften der aufgetragenen Metalle sind geeignet, im Sinne der bekannten „surface enhanced” Ramanstreuung (SERS) Raman-Emissionen der bestrahlten Probe zu erhöhen. Durch die Intensitätssteigerung der Ramanstreuung nach den an sich bekannten Prinzipien lässt sich die Integrationszeit der Messung verkürzen und/oder die Empfindlichkeit erhöhen. Außerdem ermöglicht die Kombination mit SERS eine weitere Verbesserung des Signal/Rausch-Abstands.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter „SERS” vor allem eine ultrasensitive Variante der Ramanstreuung für Moleküle auf und in der Nähe von metallischen Nanostrukturen verstanden. Beispielsweise verstärken sphärische Nanopartikel aus Silber oder Gold mit Durchmessern von typischerweise 20 bis 100 nm die Raman-Streuung. Es kommt aufgrund kollektiver Schwingungen des freien Elektronengases im Metall zu einer elektromagnetischen Felderhöhung im Nahfeld der Metallpartikel, welche das Raman-Signal von Molekülen um bis zu 14 Größenordnungen verstärken. Dieser ver stärkte Effekt ist jedoch nur in solchen Zonen zu erwarten, in denen solche verstärkenden Strukturen vorhanden sind. Zonen verstärkter Raman-Streuung werden im Zusammenhang mit der Erfindung auch als „hot spots” bezeichnet.
  • Die Erfindung erlaubt es, mindestens ein oder mehrere „hot spots” innerhalb des Flächen- oder Volumenabschnitts der Probe zu registrieren, weil der gemessene Flächen-/Volumenabschnitt groß ist. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet vorteilhafterweise die Möglichkeit, größere Flächen-/Volumenabschnitte mit einer höheren Antreffwahrscheinlichkeit von „hot spots” in einer einzigen Messung zu überdecken, zum anderen braucht auf Objektive mit hoher numerischer Apertur, welche die Empfindlichkeit der Messung erhöhen, nicht verzichtet werden.
  • Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Materialprüfung, besonders die Prüfung von Oberflächen. In der Praxis werden für Raman-spektroskopische Untersuchungen Materialoberflächen regelmäßig Techniken der Oberflächenverstärkten Ramanstreuung (SERS) eingesetzt. Die Erfindung erlaubt es, gezielt große Oberflächenabschnitte der zu untersuchenden Materialprobe in einer Messung zu analysieren, so dass gewährleistet werden kann, dass eine repräsentative Anzahl an optisch aktiven „hot-spots” innerhalb dieses Oberflächenabschnitts vorhanden ist. Auf diese Weise kann die Messzeit verringert und die Sensitivität und Aussagekraft verbessert werden.
  • Um eine repräsentative Anzahl von „hot-spots” innerhalb des analysierten Oberflächenabschnitts anzutreffen, ist man in bekannten Verfahren auf die Verwendung eines maximal 20-fach vergrößerten Objektivs mit entsprechend großem Fokusvolumen und kleiner numerischer Apertur im Messstrahlengang beschränkt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, stärker vergrößernde Objektive mit höherer Öffnung einzusetzen, um zumindest denselben Oberflächenabschnitt der Probe, der von dem bekanntermaßen maximal einsetzbaren 20-fach Objektiv gemessen werden kann, beispielsweise eine Kreisfläche mit einem Durchmesser von etwa 10 µm, mit nun höherer Genauigkeit und Empfindlichkeit zu messen. Bevorzugt werden dazu 60-fach Objektive eingesetzt.
  • Die Erfindung sieht dazu bevorzugt die mikrophotographische und/oder spektroskopische Voruntersuchung der Probe vor, um insbesondere die Inhomogenität des zu untersuchenden Flächen-/Volumenabschnitts und Verteilung der „hot spots” abzuschätzen. In bevorzugter Ausführung sieht die Erfindung im Zusammenhang mit der Analyse von SERS-Oberflächen vor, dass mindestens ungefähr 10 bis ungefähr 100 und gegebenenfalls mehr optisch aktive „hot spots” innerhalb des zu analysierenden Flächen-/Volumenabschnitts lokalisierbar sind. Dadurch kann ein verbessertes Signal-Rauschverhältnis für die Erfassung eines repräsentativen Emissionsspektrums der Probe innerhalb einer möglichst kurzen Messzeit erreicht werden.
  • Eine bevorzugte Größe eines Scanbereichs zur Registrierung eines repräsentativen Emissionsspektrums einer SERS-Oberfläche beträgt bevorzugt von 5 bis 200 µm2, bevorzugt in Form eines etwa quadratischen Scanbereichs von etwa 2 µm × 2 µm bis etwa 14 µm × 14 µm. Besonders bevorzugt hat der Scanbereich eine Größe von etwa 100 µm2, insbesondere die Abmessungen 10 µm × 10 µm (x- und y-Richtung; zweidimensionales Scanfeld).
  • Eine bevorzugte Variante der Erfindung sieht vor, die Bewegung des Fokusvolumens des Messstrahlengangs in drei Raumrichtungen (x-, y- und z-Richtung) so zu steuern, dass die Oberfläche einer partikulären, insbesondere sphärischen Probe „abgetastet” wird, nicht jedoch ihr Inneres. Dies ist vorzugsweise für solche Fälle sinnvoll, in denen optisch aktive Bereiche, ausschließlich oder überwiegend auf der Oberfläche der partikulären Probe vorhanden sind. Auf diese Weise lässt sich insbesondere der Signal/Rausch-Abstand des registrierten Signals vergrößern. Bevorzugte Anwendungsgebiete für die Oberflächenanalyse dreidimensionaler Proben sind funktionalisierte Partikel, insbesondere funktionalisierte Nanopartikel („beads”). Es kann so gewährleistet werden, dass nur die funktionalisierten Bereiche dieser Strukturen abgetastet und dort repräsentative Spektren aufgenommen werden. Insbesondere findet die erfindungsgemäße Methode Anwendung bei der Raman-spektroskopischen Analyse von SERS-Zonen
  • Ebenso sieht die Erfindung bevorzugt vor, eine automatisierte Anpassung der Größe des Scanbereichs vorzunehmen, um das Mess ergebnis zu verbessern. In einer vereinfachten optionalen Ausführung wird auf die automatische Anpassung der Größe des Scanbereichs verzichtet. Hier wird der Scanbereich aufgrund von Voranalysen gefundenen Abschätzungen vor der Messung fest eingestellt.
  • In einer besonders bevorzugten Variante sieht die Erfindung die, bevorzugt automatische, Anpassung der Form des Scanbereichs an die Form/den Umriss der partikulären Probe, insbesondere der biologischen Zelle, vor. Diese werden bevorzugt eingesetzt, um dreidimensionale partikuläre Proben, besonders biologische Zellen, Nanopartikel und ähnliche, besonders deren Oberfläche, zu analysieren.
  • Die Erfindung sieht bevorzugt auch konkrete Bewegungsmuster oder Bewegungsabfolgen vor, die das Fokusvolumen während des Messintervalls über den Flächen-/Volumenabschnitt beschreiben kann. In einer bevorzugten Ausführung überstreicht das Fokusvolumen des Messstrahlengangs geometrisch definiert geformte zwei- oder dreidimensionale Flächen- oder Volumenabschnitte. Bevorzugt sind dies kreisscheibenförmige, ellipsoide oder kalottenförmige Abschnitte oder Abschnitte ähnlicher Form.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung findet bei der zeitlichen Integration eine Gleichgewichtung aller vom Fokusvolumen innerhalb des abgescannten Flächen-/Volumenabschnitts der Messung statt. Vorzugsweise wird dazu das ortsvariable Fokusvolumen mit konstanter Geschwindigkeit über den Scanbereich geführt, so dass die Verweildauer des Fokusvolumens in jedem Bereich des gescannten Flächen- oder Volumenabschnitts gleich groß ist. In erster Näherung, wonach für kleine Ablenkungswinkel tanα ungefähr gleich α ist, bedeutet dies zweckmäßigerweise eine konstante Winkelgeschwindigkeit des ablenkenden optischen Elements (Scanners). Um dies auf einfache Weise zu erreichen, wird am Scanner zunächst eine größere Winkelamplitude einer harmonischen Schwingung (Sinusschwingung) für die Ablenkung eingestellt. Die Auslenkung (Amplitude) wird so gewählt, dass nur der annähernd lineare Bewegungsanteil des Fokusvolumens aus der harmonischen Sinusschwingung über den Flächen- oder Volumenabschnitt streicht und zur Messung herangezogen wird. Dies erfolgt in bevorzugter Ausführung indem der Anregungsstrahl kurzzeitig ausgeblendet oder insbesondere der Anregungslaser abgeschaltet wird (blanking), wenn und solange sich das sich ortsvariable Fokusvolumen im oder nahe dem Umkehrpunkt seiner insbesondere sinusförmigen Bewegung befindet. In einer alternativen Variante sieht die Erfindung dazu vor, den Scanbereich größer als die zu untersuchende Probe beziehungsweise den zu untersuchenden Flächen-/Volumenabschnitt zu wählen, besonders in denjenigen Fällen, in denen außerhalb des zu untersuchenden Flächen-/Volumenabschnitts keine Emissionen zu erwarten sind. Dies ist beispielsweise an einer vereinzelten biologischen Zelle der Fall, bei welcher außerhalb der Zellbegrenzungen gar keine emittierenden Strukturen mehr vorliegen.
  • In einer bevorzugten Variante ist eine gewichtete, insbesondere eine mittengewichtete, Registrierung vorgesehen. Die Gewichtung eines bestimmten Bereichs des Flächen- oder Volumenabschnitts der Probe wird erfindungsgemäß bevorzugt durch Erhöhung der Aufenthaltswahrscheinlichkeit beziehungsweise Aufenthaltsdauer des sich bewegenden Fokusvolumens in diesem Bereich, bei mittengewichteter Registrierung im Zentrum des zu messenden Flächen-/Volumenabschnitts während der Messung erreicht.
  • In einer bevorzugten Variante ist es vorgesehen, durch gezielte Modulation der Wanderbewegung des Fokusvolumens während der Messung bestimmte Bereiche innerhalb des Flächen-/Volumenabschnitts stärker zu gewichten und gegebenenfalls andere Bereiche auszublenden. In einer bevorzugten Variante ist vorgesehen, durch mikrophotographische Voruntersuchungen, beispielsweise durch Bildanalyse, innerhalb der Probe oder des zu analysierenden Flächen-/Volumenabschnitts der Probe optisch hochaktive Zonen zu identifizieren und diese interessanten Bereiche dann gewichtet oder selektiv in der Messung zu berücksichtigen. Zur Registrierung von Emissionen kreisrunder oder sphärischer Flächen- oder Volumenabschnitte sind Bewegungsabläufe, die zu einer mittengewichteten Registrierung der Emissionen führen, besonders bevorzugt.
  • Das „Ausblenden” uninteressanter oder für die Registrierung repräsentativer Emissionen störender Strukturen innerhalb der Probe erfolgt bevorzugt auf Grundlage ein oder mehrerer der folgenden Grundprinzipien: a) der auszublendende Bereich wird durch Begrenzung des Scanbereichs nicht von Fokusvolumen überstrichen; b) die Aufenthaltszeit des Fokusvolumens im auszublendenden Bereich ist gering, vor allem erreicht durch hohe Wandergeschwindigkeit des Fokusvolumens beim Überstreichen des Bereichs, so dass der Anteil der Signale aus diesem Bereich bei der zeitlichen Integration des Gesamtsignals der Emissionsmessung möglichst minimal ist; c) in Zeitabschnitten, in denen das Fokusvolumen den auszublendenden Bereich überstreicht, wird die Anregungsstrahlung abgeschaltet, so dass dort keine Emission oder Hintergrundstrahlung erzeugt wird (blanking).
  • Die erfindungsgemäß vorgesehene Bewegung des Fokusvolumens innerhalb des Messintervalls ist bevorzugt durch eine hohe Geschwindigkeit, das heißt eine hohe Schnelle, gekennzeichnet. Die Amplitude der Bewegung wird gewählt oder automatisch eingestellt abhängig von dem zu messenden Flächen-/Volumenabschnitt. Sie beträgt vorzugsweise von 1 µm bis 100 µm. Im Zusammenhang mit der Messung von biologischen Zellen sind Amplituden von 1 µm bis 20 µm, besonders 2 µm bis 10 µm bevorzugt. Die Erfindung sieht bevorzugt eine automatische Anpassung der Amplitude an jede einzelne zu messende Zelle vor. Wie vorstehend näher erläutert, erfolgt die Anpassung bevorzugt automatisch durch Bildanalyse der mikrophotographischen Aufnahme der Zelle.
  • Bevorzugt wird die Bewegung in Form einer Oszillation periodisch durchgeführt oder besitzt mindestens eine periodische Komponente. Das Abscannen eines Flächen- oder Volumenabschnitts in x- und y-Richtung erfolgt im einfachsten Fall bevorzugt durch die Überlagerung einer bevorzugt gleichförmigen schnellen Scanbewegung in x-Richtung (fast scanning) mit einer bevorzugt gleichförmigen langsameren Scanbewegung in y-Richtung (slow scanning). Dabei bestimmt die Frequenz der slow scanning-Achse die „Bildwiederholrate” und die Frequenz der fast scanning-Achse die Geschwindigkeit des Fokus und damit die „Messzeit” der einzelnen Flächenabschnitte innerhalb des gescannten Flächen-/Volumenabschnitts. In einer besonders bevorzugten Variante wird die Geschwindigkeit der Scanbewegung in y-Richtung so gewählt, dass nach Durchlaufen einer Scanbewegung in y-Richtung durch schrittweise Verschieben des Fokusvolumens in x-Richtung eine bevorzugt benachbarte „Scanspur” gewählt wird, die nun ebenfalls durch die dem Fokusvolumen aufgeprägte Ablenkung in y-Richtung abgescannt wird (zeilenweise Abscannen). Dabei beträgt die Frequenz der Bewegung in x-Richtung, die bevorzugt mit der Bewegung in y-Richtung synchronisiert ist, Quotient aus der Frequenz der Bewegung in y-Richtung durch die Anzahl der Scanzeilen. Davon abweichende Scanverfahren und -muster sind möglich, ohne dass dadurch die erfindungsgemäße Lehre verlassen werden würde.
  • Die Frequenz der Bewegung oder Oszillation, insbesondere die Grundfrequenz einer periodischen Bewegung in mindestens einer Raumrichtung beträgt 1 bis 1000 Hz, bevorzugt 2 bis 200 Hz, besonders bevorzugt von 5 bis 100 Hz. Die Frequenz der Bewegung oder Oszillation des Fokusvolumens wird erfindungsgemäß so gewählt, dass die in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung zu analysierende partikuläre Probe oder biologische Zelle im Anregungsstrahlengang zwar festgehalten wird, aber den erfindungsgemäß schnellen Scanbewegungen des Strahls nicht folgen kann. Auf diese Art und Weise können, wie vorstehend beschrieben, die Vorteile der optischen Pinzette ausgenutzt und gleichzeitig eine hochempfindliche Messung der Probe oder biologischen Zelle angefertigt werden. Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Prinzips kann der Fachmann die dazu jeweils günstige oder optimale Ablenkfrequenz individuell für jedes zu messende Objekt festlegen oder abstimmen. Hier kann auf die Erfahrungen und Kenntnisse auf dem Gebiet der optischen Pinzette in der Mikroskopie und Mikrospektroskopie zurückgegriffen werden.
  • Im Falle der Messung von biologischen Zellen, worin, wie vorstehend dargestellt, einzelne Zellstrukturen nach dem Prinzip der „optischen Pinzette” nachteilhafterweise im Anregungsstrahlengang damit im Fokusvolumen des Messstrahlengangs festgehalten werden können, muss die Scangeschwindigkeit zumindest so hoch gewählt werden, dass der vorstehend beschriebene nachteilige Effekt der Sogwirkung von Strukturen in den Anregungsstrahl nicht auftritt oder unterdrückt wird. Zur Abschätzung der nötigen Minimalgeschwindigkeit, um beispielsweise Zellorganellen nicht mitzuziehen kann die „escape force” eines Partikels in einer optischen Pinzette, also die Kraft, die eine optische Pinzette bei gegebener Laserleistung aufbringen kann, um ein Partikel zu halten, in bekannter Weise berechnet oder gemessen werden, beispielsweise über Anlegen eines querenden Flüssigkeitsstroms, welcher eine entsprechende Stokes'sche Reibung vermittelt, bis das Partikel abreißt. Im Folgenden sind praktische Überlegungen dargestellt, die dem Fachmann ermöglichen, die für den entsprechenden Fall notwendige minimale Bewegungsgeschwindigkeit des den Scanbereich überstreichenden Fokusvolumens zu berechnen.
  • Vornehmlich im Falle der spektroskopischen Messung einer SERS-Oberfläche oder bei anderen Proben, worin die emittierenden optisch aktiven Strukturen auf der Oberfläche der Probe im allgemeinen ortsfest fixiert sind, treten die nachteiligen Effekte der „optischen Pinzette” nicht auf.
  • In bevorzugter Ausführung wird, bei gegebener Messzeit, die Oberfläche mehrmals, das heißt mindestens zweimal abgescannt. Bei einer Messzeit von beispielsweise einer Sekunde beträgt die slow scanning-Frequenz bevorzugt 5 Hertz oder mehr.
  • Die Bewegung oder Oszillation des Fokusvolumens innerhalb des Messintervalls erfolgt vorzugsweise in geordneten, und besonders periodischen Bewegungsabläufen. Die Erfindung versteht darunter solche Bewegungsmuster, die unter den Begriff „Scanning” fallen. Alternativ sind quasi-stochastische oder stochastische Bewegungsabläufe vorgesehen. Nicht deterministische Bewegungsmuster werden unter dem Begriff „Wobble” verstanden.
  • Die Erfindung stellt auch eine Vorrichtung oder Messanordnung zur Registrierung elektromagnetischer Strahlung, welche innerhalb eines Volumen- oder Flächenabschnitts einer Probe emittiert wird, bereit. Diese Messanordnung ist primär dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders geeignet und dazu ausgebildet ist. Die Anordnung weist erfindungsgemäß zumindest folgende Komponenten auf:
    • – Mikroskop-optische Anordnung, insbesondere ein Mikroskop, bevorzugt mit Anregungsstrahlungsquelle mit Anregungsstrahlengang zur Anregung elektromagnetischer Strahlung, beson ders Raman-Strahlung, Fluoreszenz oder ähnliche, in einer Probe und
    • – mindestens eine Messeinrichtung mit Messstrahlengang zur Registrierung der von der Probe emittierten elektromagnetischen Strahlung, wobei zumindest der Messstrahlengang eine numerische Apertur und ein Fokusvolumen, innerhalb dessen die emittierte Strahlung registriert werden kann, aufweist,
    wobei die Vorrichtung bevorzugt dadurch gekennzeichnet ist, dass das Fokusvolumen um ein Mehrfaches kleiner ist als der in der Messung zu analysierende Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe und dass das Fokusvolumen während der Messung über den Flächen-/Volumenabschnitt, insbesondere oszillierend, bewegbar ist.
  • Bevorzugt ist die Vorrichtung so ausgebildet, dass im Fokusvolumen über den Verlauf der Messung vom Flächen- oder Volumenabschnitt registrierte emittierte Strahlung zeitlich zu einem Summensignal integrierbar ist.
  • In einer bevorzugten Ausführung enthält die Vorrichtung zumindest noch mindestens eine Analyseeinheit, die geeignet ist zur spektralen Analyse der Anregungszone von der Probe im Flächen-/Volumenabschnitt emittierten Strahlung, besonders Raman-Streustrahlung und/oder Fluoreszenz.
  • In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Messeinrichtung, das heißt die optischen Mittel zur Registrierung der emittierten elektromagnetischen Strahlung, mit einer Scanning-Einheit zur Erzeugung der Wanderbewegung des Fokusvolumens während der Messung in Verbindung gebracht. Diese Scanning-Einheit (Scanner) lenkt den Messstrahlengang und bevorzugt den bevorzugt koaxialen Anregungsstrahl in seiner Ausbreitungsrichtung (Winkelablenkung) und/oder in der Strahllage (Parallelverschiebung) ab, so dass der Fokus des Messstrahlengangs, zumindest innerhalb des Messintervalls, zumindest über den zu messenden Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe bewegt werden kann.
  • Einschwing- oder Ausschwingvorgänge der Ablenkmittel im Scanner am Anfang oder am Ende der eigentlichen Messung werden in einer bevorzugten Variante aus der eigentlichen Messphase ausgeschlossen.
  • Geeignete Scanner-Einheiten sind mit optischen Elementen, bevorzugt Spiegel, Prisma oder ähnlichen bekannten Mitteln zur Strahlablenkung ausgestattet. Dieses optische Element ist vorzugsweise ein sowohl für Anregungs-, als auch für Emissionslicht reflektierendes Element, also insbesondere ein Spiegel. Bevorzugt ist ein piezoelektrisch gesteuerter Strahlteiler, beispielsweise ein halbdurchlässiger Spiegel. In einer alternativen bevorzugten Variante ist das optische Element ein Vollspiegel mit 100% Reflektivität. Bevorzugt ist das optische Element bevorzugt in mindestens einer Achse, vorzugsweise in zwei Achsen, drehbar. Es ist bevorzugt im parallelen Strahlengang der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroskop-optischen Einrichtung angeordnet.
  • Über das optische Element wird bevorzugt der Anregungsstrahl von der bevorzugt ortsunveränderlichen Anregungsstrahlungsquelle in ein sich bevorzugt scannend über den Flächen- oder Volumenabschnitt bewegendes also ortsveränderliches Lichtbündel umgewandelt (Scanning). Die von der Probe im Lichtkegel dieses Anregungsstrahls emittierte Strahlung wird im erfindungsgemäß während der Messung ortsveränderlichen Fokusvolumen des Messstrahlengangs registriert und der Messstrahl in Richtung des Messsensors an einem, bevorzugt demselben, optischen Element abgelenkt (Descanning), und zwar so, dass die Bewegung des Fokusvolumens kompensiert wird und der Messstrahl der emittierten Strahlung am Messsensor ortsunveränderlich wird.
  • Bevorzugt ist die optische Anordnung so ausgestaltet, dass der Messstrahlengang der Messeinrichtung und der Anregungsstrahlengang der Anregungsstrahlungsquelle dieselbe optische Achse besitzen; das Fokusvolumen des Messstrahlengangs liegt zentriert zum Anregungsstrahl. Anregungsstrahlung und Fokusvolumen bewegen sich daher bevorzugt gleichartig „scannend”, wohingegen sowohl die Anregungsstrahlungsquelle als auch der Detektor der Messeinrichtung in der Mikroskop-optischen Anordnung stillstehen, das heißt dort ortsfest fixiert sind.
  • Es versteht sich, dass analoge Systeme und Scaneinrichtungen zur Ablenkung von elektromagnetischer Strahlung, insbesondere von emittierter Strahlung und bevorzugt auch von Anregungslicht, ebenfalls eingesetzt werden können, sofern sie die Bedingungen an die erfindungsgemäß gewählte Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens während der Messung erzielen können. Alternative Scaneinrichtungen sind zum Beispiel aus dem Bereich der elektromechanischen Bildfernübertragung, Spiegelrad etc. bekannt. Der Fachmann kennt alternative Verwirklichungsmöglichkeiten der Strahlablenkung. Im Falle eines drehbar gelagerten Strahlteilers oder Spiegel ist es außerdem bevorzugt, die Drehachse möglichst nahe an das fokussierende Objektiv zu platzieren, um die konstante Ausleuchtung des Objektivs auch bei größeren Scanwinkeln zu gewährleisten.
  • Im Falle eines zweidimensionalen Scanning erfolgt die Bewegung des Fokusvolumens in zwei Raumrichtungen (x- und y-Richtung), bevorzugt in der primären Ausbreitungsebene des zu untersuchenden Präparats/Probe. Dazu sind bevorzugt ein mindestens in zwei nicht parallelen, bevorzugt senkrecht ineinander angeordneten Drehachsen drehbares optisches Element oder alternativ mindestens zwei optische Elemente mit jeweils mindestens einer Drehachse, die bevorzugt senkrecht zu einander stehen, zur Ablenkung des Strahlengangs und zur Erzeugung der Scanbewegung vorgesehen. Diese Vereinfachung ist für die meisten Messungen ausreichend genau, da praktischerweise das Fokusvolumen in der dritten Raumrichtung (z-Richtung), das heißt in Richtung der optischen Achse des Messstrahlengangs in der Regel um das zwei- bis vierfache weiter ausgedehnt ist als in x- und y-Richtung, das heißt in der Ebene des Flächenabschnitts der Probe.
  • In einer weiteren bevorzugten Variante findet die Ablenkung des Fokusvolumens über den Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe in allen drei Raumrichtungen statt (dreidimensionales Scanning). Neben der Ablenkung in x- und y-Richtung in der primären Ausbreitungsebene der Probe wird durch zusätzliche Maßnamen eine Ablenkung des Fokusvolumens in z-Richtung, das heißt in Richtung der optischen Achse des Messstrahlengangs, erreicht. Die Ablenkung in z-Richtung erfolgt in an sich bekannter Weise. Durch den dreidimen sionalen Scan können insbesondere dreidimensional ausgestaltete Oberflächen oder partikuläre Proben wie biologische Zellen, welche in der Regel eine sphärische oder ellipsoide Auszählung haben, verbessert erfasst und analysiert werden.
  • Anstelle aufwändiger Scanningeinheiten, die eine zu jedem Zeitpunkt der Messung weitgehend kontrollierte Bewegung des Fokusvolumens ermöglichen, können auch weniger aufwändige Einrichtungen verwendet werden. Dies sind beispielsweise einfache Spiegel oder Prismen, die mittels piezoelektrischen oder elektrodynamischem Prinzip zur Schwingung angeregt werden. Dabei können Resonanzen der mechanischen Kopplungen gezielt ausgesucht werden. In einer bevorzugten Variante werden die systembedingten Tiefpasseigenschaften der mechanischen Kopplungen innerhalb der zur Erzeugung der Fokusvolumen-Bewegungen eingesetzten Scanningeinheit gezielt eingesetzt und gegebenenfalls modifiziert, um eine gewichtete Registrierung zu ermöglichen.
  • In einer besonders einfachen Ausgestaltung der Erfindung wird die Bewegung des Fokusvolumens (Scanning) auf eine Raumrichtung beschränkt (eindimensionales Scanning). In diesem Fall braucht das zur Strahlablenkung verwendete optische Element nur in einer Drehachse gelagert sein.
  • In einer bevorzugten vereinfachten Ausführung wird das optische Element zur Erzeugung der Scanbewegung mit einer Sinusschwingung beauftragt. Die dabei auftretenden zeitlichen Ungleichgewichte bei der Integration der Messung über das Scanfeld mit stärkerer Gewichtung der Emissionen im Bereich der Umkehrpunkte der Bewegung des Fokusvolumens wird in dieser Variante vernachlässigt.
  • Bevorzugt weist die erfindungsgemäße Anregungsstrahlungseinheit mindestens eine Lichtquelle zur Erzeugung der Anregungsstrahlung auf. Bevorzugt ist diese Lichtquelle mindestens ein Laser mit quasi monochromatischem Emissionsspektrum. Alternativ ist die Lichtquelle eine Gasentladungslampe und/oder eine Glühemissionslampe, beispielsweise Wolframlampe oder Nernst-Stift, wobei bevorzugt zur Einengung des Emissionsspektrums dieser Lampen ein geeigneter Monochromator, beispielsweise ein optisches Gitter oder eine Kom bination mehrerer optischer Gitter vorgeschaltet ist. Bevorzugt weist die Anregungsstrahlungseinheit so genannte Plasmalinefilter oder entsprechende Mittel zum Filtern der Hauptwellenlänge auf. Weiter bevorzugt weist die Anregungsstrahlungseinheit mindestens einen so genannten Bandpassfilter oder entsprechende Mittel zur Parallelisierung von Laserlicht auf.
  • In einer bevorzugten Variante weist die Anregungsstrahlung insbesondere für die Messung biologischer Proben/Zellen eine spektrale Verteilung im nahen Infrarot-Bereich auf. Bevorzugt sind Wellenlängen von 700 bis 1200 nm. Besonders bevorzugt weist die Anregungsstrahlung eine Wellenlänge von etwa 785 ± 60 nm, bevorzugter 785 ± 30 nm, 785 ± 10 nm und am meisten bevorzugt von etwa 785 nm auf. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, weist dieser Wellenlängenbereich für die Raman-Spektroskopie lebender biologischer Zellen in flüssigen Medien oder in Zellverbänden oder Geweben eine Reihe von Vorteilen auf: Die Absorption der Anregungsstrahlung im flüssigen Medium ist tolerierbar gering, die unerwünschte Emission von Fluoreszenzstrahlung ist tolerierbar gering, der schädigende Einfluss auf Struktur und Lebensfunktion der bestrahlten lebenden Zellen ist minimal. Gleichzeitig erleichtert die in diesem Wellenlängenbereich angeregte Raman-Streustrahlung die Aufnahme zellspezifischer Raman-Spektren (so genannter „fingerprint”-Bereich).
  • In einer weiteren Variante der Erfindung ist eine Anregungsstrahlung im UV-Bereich vorgesehen. Bevorzugte Wellenlängen sind 300 ± 100 nm, besonders bevorzugt 300 ± 50 nm. Die nachfolgenden Ausführungen gelten somit auch für die UV-Raman-Spektroskopie, wobei Strahlungsintensitäten, Materialauswahl der optischen Medien und Detektorenempfindlichkeiten gegenüber einer IR-Spektroskopie entsprechend angepasst werden.
  • Zur Erzeugung der Anregungsstrahlung ist bevorzugt Hochenergielaser mit einer Anregungsenergie von mehr als 50 mW, besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 mW, vorgesehen. In einer bevorzugten Variante wird ein Laser mit etwa 100 mW verwendet. Bevorzugt sind Diodenlaser. Der Fachmann erkennt, dass die auf die bestrahlte Probe effektiv wirkende Strahlungsenergie vom konkret verwendeten optischen System und der optischen Anordnung abhängt. Je nach optischem Aufbau sind gegebenenfalls Lichtquellen mit höherer oder entsprechend niederer Strahlungsenergie erforderlich. Die auf die biologische Zelle während der Messung eingestrahlte Strahlungsenergie ist nach unten hin begrenzt durch die je nach Anwendungsgebiet nicht verlängerbare Messzeit (Integrationszeit) am Sensor/Detektor und dessen Signal/Rausch-Verhältnis Sie ist nach oben hin begrenzt durch die bei höherer Energie einsetzenden nachteiligen Auswirkungen auf die Probe, vor allem auf die Integrität und Lebensfunktion einer bestrahlten Zelle. Bevorzugt betragen Strahlungsenergien (berechnet für den Ort der bestrahlten Zelle und integriert über die Bestrahlungsdauer) für den NIR-Bereich mindestens etwa 0,1 J bis maximal etwa 10 J, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 5 J.
  • Das in der Analyseeinheit zur Registrierung/Detektion und Analyse der emittierten Raman-Streustrahlung vorgesehene CCD-Array (CCD-Chip) ist vorzugsweise so ausgeführt, dass es für den nahinfraroten Bereich beziehungsweise für einen Spektralbereich von Wellenzahl 200 bis 3500 cm–1 besonders empfindlich ist. Der Fachmann sieht hierfür an sich bekannte Maßnahmen vor. Bevorzugt sind Ausführungen von CCD-Arrays mit schneller Messzeit (Integrationszeit) bei gutem Signal/Rausch-Verhältnis, besonders ist dies eine so genannte „open electrode”-CCD, rückgedünnte CCD, Tiefentladungs-CCD („deep depletion”-CCD) oder eine Elektronenvervielfacher-CCD. Um das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern, wird das CCD-Array bevorzugt gekühlt; bevorzugte Kühltemperaturen sind etwa –50°C bis etwa –100°C.
  • Die erfindungsgemäß registrierte elektromagnetische Strahlung kann in an sich bekannter Weise registriert und gegebenenfalls spektrophotometrisch analysiert werden. Zur Spektroskopie findet bevorzugt eine räumliche Auftrennung der Spektralanteile der emittierten Strahlung statt. Übliche Verfahren sind die Beugung am Gitter, am Spalt sowie die Verwendung von Prismen. Räumlich aufgetrennte Spektren können beispielweise durch geeignete CCD-Arrays oder durch wandernde Fotozellen aufgezeichnet werden. Im Falle der CCD-Arrays beträgt das Messintervall des erfindungsgemäßen Verfahrens weniger oder gleich der Integrationszeit der CCD-Zellen.
  • Typische Messintervalle betragen bevorzugt 0,1 bis 1 sek. In einer bevorzugten Variante der Erfindung werden mehrere Messungen „gemittelt”, um die Rauschanteile im Messsignal zu verringern. Für besonders empfindliche Messungen können hier in an sich bekannter Weise CCD-Zellen mit langsamer Integrationszeit verwendet werden. Für die Aufzeichnung von Infrarotsignalen sind hier vorzugsweise NIR optimierte und bevorzugt Peltier-gekühlte CCD-Kameras vorgesehen.
  • Gemäß eines Aspekts der Erfindung weist die Vorrichtung vorzugsweise mindestens eine mikroskop-optische Einheit oder Vorrichtung, das heißt Mikroskopeinheit, zur bildgebenden mikroskopischen oder mikrophotographischen Analyse der Probe. Bevorzugt ist diese optische Einheit ein Durchlichtmikroskop mit bevorzugt Wahlweise zuschaltbarer, Phasenkontrastoptik, vorzugsweise für die differentielle Interphasenkontrast-Mikroskopie (DIS), besonders bevorzugt ein Fluoreszenzmikroskop.
  • Bevorzugt weist die Mikroskopeinheit Optiken auf, die eine ausreichende Durchlässigkeit im Wellenlängenbereich der Anregungsstrahlung und im Wellenlängenbereich der emittierten Raman-Streustrahlung besitzen, besonders für diese Wellenlängenbereiche optimiert ist. Vorzugsweise wird die Anregungsstrahlungseinheit über geeignete Maßnahmen in den Strahlengang der Mikroskopeinheit, eingekoppelt. Beispielsweise ist die an einem Fluoreszenzmikroskop herkömmlicher Weise vorgesehene Lichtquelle zur Erzeugung von Fluoreszenz durch die erfindungsgemäße Anregungsstrahlungseinheit ersetzt oder ergänzt.
  • Durch geeignete optische Maßnahmen, insbesondere Sperrfilter wird bevorzugt gewährleistet, dass in der Mikroskopeinheit die Anregungsstrahlung vom Beobachtungsstrahlengang und vom Beleuchtungsstrahlengang des bildgebenden Teils der Mikroskopeinheit und vom Strahlengang der emittierten und vorzugsweise mittels der Mikroskopeinheit Raman-Streustrahlung oder Fluoreszenz getrennt wird. So wird es möglich, die erfindungsgemäße Vorrichtung in üblichen, konfektionierten Mikroskopsystemen zu integrieren. Bevorzugt wird dazu auch die zur Analyse der spektralen Verteilung der Raman-Streustrahlung geeignete Analyseeinheit in die Mikroskopeinheit in tegriert. Dies wird vorzugsweise dadurch realisiert, dass die Analyseeinheit in den Beobachtungsstrahlengang, zum Beispiel Kameraanschluss, in geeigneter Weise eingekoppelt wird.
  • Neben der Anregungsstrahlungseinheit kann an der Mikroskopeinheit vorzugsweise zusätzlich mindestens eine weitere Beleuchtungsquelle zur Herstellung der mikroskopischen Bilder, besonders eine Lichtquelle für die Fluoreszenzmikroskopie. Dies ist typischerweise eine Hochdruckquecksilberdampflampe. Die Mikroskopeinheit ist demgemäß vorzugsweise mit an sich bekannten Filtern zur Durchführung der Fluoreszenzmikroskopie ausgestattet.
  • Weiter ist die Mikroskopeinheit zur Registrierung und späteren Analyse der von den in der Messzone der Vorrichtung angeordneten Partikeln oder biologischen Zeilen gewonnenen mikroskopischen Bildern mit mindestens einer Bildregistriereinheit, vorzugsweise einer CCD-Kamera mit geeigneter Optik, ausgestattet. Besonders bevorzugt ist die Bildregistriereinheit mit einer bevorzugt vorgesehenen Recheneinheit verbunden, die geeignet ist, gegebenenfalls mittels geeigneter Bildanalysealgorithmen, die mit der Mikroskopeinheit aufgenommenen mikroskopischen Bilder der Partikel oder biologischen Zellen zu analysieren und die Ergebnisse der Analyse anzuzeigen und/oder zu speichern.
  • In einer bevorzugten Ausführung weist die Vorrichtung mindestens ein Rechengerät auf. Dies ist bevorzugt zumindest mit der Analyseeinheit zur Analyse der emittierten Raman-Streustrahlung oder Fluoreszenz verbunden. Das Rechengerät ist auch geeignet zur Bestimmung von Kennwerten der aufgenommenen Raman-Spektren (Spektrum-Kennwerte) und der Kennwerte der aufgenommenen mikroskopischen Bilder der Partikel (Bild-Kennwerte). Das Rechengerät ist weiter geeignet zum Vergleich der ermittelten Spektrum-Kennwerte beziehungsweise Bild-Kennwerte mit hinterlegten, vorzugsweise vorbestimmten Spektrum-Kennwerten beziehungsweise Bild-Kennwerten.
  • Die Figuren zeigen:
  • 1 Abhängigkeit der lateralen Fokusgröße (lateralen Halbwertsbreite, FWHM) von der gewählten numerischen Apertur (NA) bei einer Wellenlänge von 785 nm
  • 2 Abhängigkeit des Raumwinkels von der gewählten numerischen Apertur (NA)
  • 3 Schematische Darstellungen des Fokusvolumens zur Registrierung von emittierter Strahlung einer biologischen Zelle; 3A: kleines Fokusvolumen und großer Raumwinkel bei hoher NA, es wird viel Signalanteil von einem sehr kleinen Volumenabschnitt der Probe registriert; 3B: großes Fokusvolumen und kleiner Raumwinkel bei kleiner NA, es wird nur ein geringer Signalanteil von einem großen Volumenabschnitt der Probe registriert; 3C (erfindungsgemäß): kleines Fokusvolumen und großer Raumwinkel bei hoher NA, das während der Messung über die Probe bewegt wird (hier: geordnetes Bewegungsmuster, Scanning), es kann viel Signalanteil von einem großen Volumenabschnitt der Probe registriert werden.
  • 4 Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen optischen Anordnung. Diese enthält eine mikroskopoptische Einheit (Mikroskop) (100) eine Anregungsstrahlungsquelle (200), einen Messsensor (300) und eine optische Einheit (400) zur Ablenkung des Anregungsstrahlengangs (250) und des bevorzugt koaxialen Messstrahlengangs (350). Das Mikroskop (100) weist bevorzugt mindestens eine Kamera (110) für die mikrophotographische Erfassung der zu untersuchenden Probe (500), mindestens eine abbildende Tubuslinse (120) und mindestens ein Objektiv (140) auf. Zusätzlich ist mindestens ein Strahlteiler/Spiegel (130) im Strahlengang des Mikroskops (100) vorgesehen, über welchen der Anregungsstrahlengang (250) und der bevorzugt koaxiale Messstrahlengang (350) eingekoppelt werden. Zur Trennung/Vereinigung von Anregungsstrahlengang (250) und Messstrahlengang (350) ist bevorzugt mindestens ein Strahlteiler/Kantenfilter (230) vorgesehen. Die Anordnung zur Erzeugung der Anregungsstrahlung weist bevorzugt mindestens eine Tubuslinse (220) und bevorzugt mindestens eine Lochblende/Pinhole (210) auf. Die Messanordnung zur Registrierung der emittierten Strahlung weist bevorzugt mindestens eine Tubuslinse (320) und bevorzugt mindestens eine Lochblende/Pinhole (310) auf. Zur Bevorzugt spektralen Analyse der emittierten Strahlung weist die Messanordnung ein frequenz-/wellenlängenselektives strahlablenkendes Element (340) insbesondere ein Gitter, auf sowie bevorzugt mindestens eine Optik (330) und bevorzugt mindestens eine abbildende Optik (360) zur Abbildung der vom Element (340) räumlich getrennten Spektralverteilung auf dem bevorzugt zweidimensionalen Messsensor (300).
  • Ausführungsbeispiel: Abschätzung der minimalen Scangeschwindigkeit
  • Zur beispielsweise Berechnung der minimalen Scangeschwindigkeit, das heißt der Bewegungsgeschwindigkeit der Anregungsstrahlung, die benötigt wird, um das unerwünschte Festhalten von Probenstrukturen, insbesondere Zellkerne an der optischen Achse des Anregungsstrahlengangs zu verhindern, soll die „escape force”, d. h. die Kraft, die eine „optische Pinzette” bei gegebener Laserleistung maximal aufbringen kann, um das Partikel zu halten, für ein Polystyren bead mit 1 µm Durchmesser in Wasser als Modell für eine Zellorganelle bei einer Laserleistung von 50 mW nach Tlusty T., Meller A., and Bar-Ziv R., Optical gradient forces of strongly localized fields, Phys. Rev. Lett. 81, 1738–1741 (1998), berechnet werden. Es ergibt sich eine „escape force” von ca. 10 pN.
  • Im Fall von Stokesscher Reibung: Fesc = 6πηrνesc ergibt sich eine „escape” Geschwindigkeit von 530 µm/s, um der optischen Pinzette zu entkommen. Damit sollte in erster Näherung die Bewegung des Laserfokus schneller sein als dieser Wert, um ein Partikel abreißen zu lassen.
  • Die folgenden genaueren theoretischen (Tlusty et al. aaO) und experimentell bestätigten (Simmons RM, Finer JT, Chu S, Spudich JA. Quantitative measurements of force and displacement using an optical trag. Biophys. J. 70(4): 1813–22 (1996)). Zusammenhänge bei Variation der Größe des Partikels bzw. der Laserleistung erlaubt eine einfache Abschätzung der nötigen Geschwindigkeit bei veränderten Bedingungen:
    Figure 00350001
  • Da νesc ∝ Fesc gelten die Proportionalitäten auch direkt für die nötige Geschwindigkeit des Fokus. Bei einer Verdoppelung der Laserleistung muss also eine doppelte Fokusgeschwindigkeit genutzt werden, um ein Mitziehen zu verhindern.
  • Die escape-Kraft Fesc hat bei gegebenen Werten für Laserleistung I0, Fokusdurchmesser ω und Verhältnis der Dielektrizitätskonstanten α eine obere Grenze unabhängig von Durchmesser und Exzentrizität der Partikel (Simmons et al. aaO): Fesc ≤ αI0ω22π
  • Berechnet man mit obiger Stokes'scher Reibung eine minimale Scangeschwindigkeit, so ist man im Experiment für alle Bedingungen auf der sicheren Seite. Damit ergibt sich für den Fall
    Figure 00350002
    eine maximale „escape force” von 100 pN und dann eine minimal nötige Fokusgeschwindigkeit von 50 mm/s.
  • Man beachte, dass es sich hierbei um eine Rechnung mit sehr starkem Unterschied in den Brechungsindices handelt. Bei biologischen Zellen finden sich in der Literatur deutlich kleinere Unterschiede (z. B.. Kemmler et al.: Kemmler M, Fratz M, Giel D, Saum N, Brandenburg A, and Hoffmann Ch. Noninvasive time-dependent cytometry monitoring by digital holography. J. Biomed. Opt. 12: 064002 (2007)), mit einem resultierenden α von 0.06 und somit einem Faktor 5 kleinerem Fesc bzw. νesc, so dass 10 mm/s für alle Partikelgrößen ausreichen.
  • Die obige Abschätzung stellt sicher, dass auch sehr große Strukturen im Bereich mehrerer Fokusdurchmesser nicht mitgezogen werden. Die bei Zellorganellen relevanten Größenbereiche liegen im Bereich von 1 bis 2 Fokusdurchmessern. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, liegt die „escape force” bekanntermaßen (Tlusty et al. aaO) um ca. einen Faktor 5 niedriger, so dass bei biologischen Proben im Allgemeinen eine Scangeschwindigkeit von 2 mm/s ausreichend ist.
  • Im Hinblick auf die technische Realisierung, wo der Aufwand der Realisierung mit der Höhe der zu realisierenden Geschwindigkeit skaliert, ist man damit deutlich auf der sicheren Seite. Entsprechende Geschwindigkeiten lassen sich mit Galvano- oder Piezoscannern leicht erreichen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Tlusty T., Meller A., and Bar-Ziv R., Optical gradient forces of strongly localized fields, Phys. Rev. Lett. 81, 1738–1741 (1998) [0106]
    • - Tlusty et al. aaO [0108]
    • - Simmons RM, Finer JT, Chu S, Spudich JA. Quantitative measurements of force and displacement using an optical trag. Biophys. J. 70(4): 1813–22 (1996) [0108]
    • - Simmons et al. aaO [0110]
    • - Kemmler et al.: Kemmler M, Fratz M, Giel D, Saum N, Brandenburg A, and Hoffmann Ch. Noninvasive time-dependent cytometry monitoring by digital holography. J. Biomed. Opt. 12: 064002 (2007) [0112]
    • - Tlusty et al. aaO [0113]

Claims (13)

  1. Verfahren zur spektroskopischen Analyse eines Flächen- oder Volumenabschnitts einer Probe in einer Messanordnung mit Anregungsstrahlengang und Messstrahlengang, wobei über den Anregungsstrahlengang in der Probe Strahlungsemission angeregt und emittierte Strahlung von einem Fokusvolumen des Messstrahlengangs innerhalb eines zeitlichen Messintervalls aufgefangen wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Fokusvolumen über den Flächen- oder Volumenabschnitt, welcher einem Mehrfachen des Fokusvolumens entspricht, bewegt wird und die im bewegten Fokusvolumen über die Dauer des Messintervalls registrierte Strahlung integriert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fokusvolumen durch eine in der Messeinrichtung vorgesehene optische Scannereinheit bewegt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Fokusvolumen zumindest über die Dauer des Messintervalls in zumindest einer Raumrichtung periodisch bewegt wird.
  4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Fokusvolumen zumindest über die Dauer des Messintervalls nach einem strukturierten Muster geordnet bewegt wird (Scanning).
  5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Fokusvolumen zumindest über die Dauer des Messintervalls stochastisch oder quasi-stochastisch bewegt wird (Wobble).
  6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Grundfrequenz der Bewegung des Fokusvolumens zumindest über die Dauer des Messintervalls 5 bis 1000 Hz beträgt.
  7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Amplitude der Grundfrequenz der Bewegung des Fokusvolumens zumindest über die Dauer des Messintervalls 1 bis 100 µm beträgt.
  8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens zumindest über die Dauer des Messintervalls stets 2 mm/s oder mehr beträgt.
  9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Geometrie und/oder Position des Flächen- oder Volumenabschnitt anhand mikrophotographischer Daten der Probe automatisch festgelegt werden.
  10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Anregungsstrahl die Probe zumindest für die Dauer der Messung ortsfest hält.
  11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die spektroskopische Analyse ausgewählt ist aus: Fluoreszenz-Spektroskopie, Raman-Spektroskopie, SERS, IR-Spektroskopie und verwandten oder davon abgeleiteten spektroskopischen Verfahren.
  12. Vorrichtung, geeignet zur Durchführung des Verfahrens der spektroskopischen Analyse eines Flächen- oder Volumenabschnitts einer Probe nach einem vorstehenden Ansprüche, enthaltend: Mikroskop-optische Anordnung, Anregungsstrahlungsquelle mit Anregungsstrahlengang zur Anregung von Strahlungsemission in einer Probe und Messeinrichtung mit Messstrahlengang zur Registrierung von von der Probe emittierter Strahlung, wobei der Messstrahlengang ein Fokusvolumen aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der zu analysierende Flächen- oder Volumenabschnitt der Probe einem Mehrfachen des Fokusvolumens entspricht und dass das Fokusvolumen während der Messung über zumindest den gesamten Flächen- oder Volumenabschnitt bewegbar ist.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 12, derart ausgestaltet, dass die Geschwindigkeit der Bewegung des Fokusvolumens zumindest über die Dauer des Messintervalls stets 2 mm/s oder mehr beträgt.
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