DE102008056733A1

DE102008056733A1 - Verfahren für den Gentransfer in eukaryotische Zellen mit Pyridinium-Dendrimeren

Info

Publication number: DE102008056733A1
Application number: DE200810056733
Authority: DE
Inventors: Dirk Bongard
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2008-11-11
Publication date: 2010-05-27

Abstract

Dendrimere, die Pyridinium-Einheiten enthalten, werden aufgrund ihrer persistenten positiven Ladung für den Transport von Oligonukleotiden, Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren in eukaryotische Zellen verwendet. Die pH unabhängige Ladung der Dendrimere ermöglicht eine stabile Komplexbildung mit DNA Plasmiden und macht eine Anwendung in den üblichen Zellwachstumsmedien (wie DMEM oder OptiMEM) möglich. Die Dendrimere sind Dendrimere erster und zweiter Generation und besitzen eine unterschiedliche Anzahl von Methylengruppen zwischen den Pyridinium-Einheiten. Die folgende Abbildung zeigt die allgemeine Formel eines Pyridinium-Dendrimers erster Generation, mit n = 1-4, und R1 = -(CH2)n-NH2 oder -(CH2)n-COOH, Gegenionen: Cl- $F1

Description

Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA, RNA oder Oligonucleotiden in eukaryotische Zellen. Die Expression der durch die Fremd-DNA codierten Proteine können therapeutisch oder biotechnologisch genutzt werden. Es gibt verschiedene physikalische, chemische und biologische Methoden für die Transfektion, die bisher aber vor allen in vitro angewendet werden.
Zu den physikalischen Methoden gehört z. B. die Mikroinjektion, die Elektroporation und die ballistische Transfektion („Particle gun”). Die biologische Methode ist die virale Transfektion mit Retro- oder Adenoviren.
Zu den chemischen Verfahren gehört die Calcium-Phosphat-Präzipitation und alle kationischen oder polykationischen organischen Verbindungen, die in der Lage sind mit der negativ geladenen DNA oder RNA stabile Komplexe zu bilden. Man unterscheidet drei Klassen von Substanzen kationische Lipide, kationische Polymere und als neueste Klasse kationische Dendrimere.
Bei den Dendrimeren lassen sich zwei Klassen unterscheiden, Dendrimere mit pH abhängigen Protonierungsgrad und somit veränderlicher kationischer Ladung wie z. B. Polyamidoamindendrimere (PAMAM) und Polyethylenimin-dendrimere (PEI)
und Dendrimeren die eine persistente kationische Ladung an quarternären Stickstoffatomen besitzen. Zu der letzten Gruppe gehören die Pyridinium-dendrimere, die ihre Ladung an den Stickstoffatomen der Pyridin-einheiten tragen.
In 1 ist die Gentransfektion schematisch dargestellt (A: Komplexbildung zwischen Plasmid-DNA und Dendrimer, B: Absorption an der Zelloberfläche, C: endocytotische Aufnahme in die Zelle, D: endosomale Freisetzung der DNA/Dendrimer Komplexe, E: Enzymatischer Abbau von DNA und Dendrimer, F, H: möglicher Weitertransport in den Zellkern.
Diese drei Substanzklassen sind in der Lage die negativ geladene DNA zu binden und durch die Zellmembran in Zellen und eventuell anschließend durch die Zellkernmembran in den Zellkern zu transportieren. Je nach Verbindungsklasse gibt es unterschiedliche endocytotische Mechanismen die den Transport erklären oder erklären sollen.
Der Transport von DNA in Zellen ist nur eine Anwendung von Dendrimeren, es gibt schon Anwendungen als Wirtmoleküle für therapeutische oder diagnostische Zwecke.
Die angegebenen Strukturformeln sind drei Beispiele für Carboxy-terminierte Pyridinium-Dendrimere mit verschieden langen Methylengruppen zwischen den Pyridiniumeinheiten und den benzylischen Verknüpfungspunkten (Anhang).
Eine allgemeine Strukturformel ist in der Zusammenfassung dargestellt. Die unterschiedliche Flexibilität macht eine Komplexbildung mit den Plasmiden (zirkulare DNA) möglich und Besitzt eine ausreichende Stabilität in dem Zellwachstumsmedium das während der Transfektion eingesetzt wird. Das Schema eines Transfektionsversuches ist in Schema 1, im Vergleich zu dem kommerziell erhältlichen Superfect, dargestellt. Das Plasmid gelöst in TE-Puffer wird mit 1 bis 12 mikrogramm Dendrimer gemischt, 15 Minuten ruhen gelassen und dann auf die vorbereiteten Zellen aufgetragen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird die Komplexlösung abgesaugt, die Zellen mit Phosphatpuffer gewaschen und anschließend das kommerziell erhältliche Zellwachstumsmedium (DMEM, OptiMEM) aufgetragen. Nach Ablauf von 24 bis 48 Stunden lässt sich die erfolgreiche Transfektion durch das mit im Plasmid befindliche Reportergen-System detektieren. Erfolgreich transfizierte CHO Zellen sind in einer Abbildung im Anhang dargestellt. (2)
Meistens kommen zwei Reportersysteme zum Einsatz das grün-fluoreszierende Protein (eGFP) aus der Quallenart Aequoria victoria und das Luciferase enthaltende, luminiszierende System des Leuchtkäfers Photinus pyralis. In 2 sieht man das grün-fluoreszierende Protein (eGFP) in den CHO Zellen.
Schema 1:

Transfektionsverfahren CHO Zellen

Pyridinium-Dendrimere	Superfect
• 2–4 wells Zelldichte: 2 × 10⁵ Zellen	• 2–4 wells Zelldichte: 2 × 10⁵ Zellen
• 1 μg plasmid-DNA in 10 mM TE-Puffer	• 1 μg plasmid-DNA in 10 mM TE-Puffer und 50 μl DMEM
• 2–4 μg Dendrimer 10 sek. Vortexting 10 min Komplexbildung	• 6 μl Superfect 10 sek. Vortexting 10 min Komplexbildung
• Vorbereitete, PBS gewaschene Zellen 200 μl Saccharose, Inkubation: 3h oder 400 μl OptiMEM	• vorbereitete, PBS gewaschene Zellen 400 μl DMEM, Inkubation: 3 h
• 500 μl frisches Medium (DMEM plus)	• 500 μl frisches Medium (DMEM plus)

Lässt sich unter dem Mikroskop, nachdem die Zellen fixiert wurden eines der beiden Erscheinungen Lumineszenz oder Fluoreszenz beobachten ist eine transiente Transfektion, eine Transfektion durch die Zellmembran in das Cyctoplasma bestätigt.
Problem:
Das Ziel ist das Einbringen der Fremd-DNA und die anschließende Isolierung der exprimierten Proteine, ein Verfahren das im größeren Maßstab durchgeführt zu den Biotechnologischen Produktverfahren gehören kann.
Für die Durchführung im Labormaßstab werden in den meisten Fällen mitotische, unsterbliche Krebszell-Linien verwendet (CHO, PC 12, NIH 3T3 usw.), neben postmitotischen Nervenzellen um Krankheitsursachen und Therapiemöglichkeiten zu untersuchen.
Ein wesentlicher Unterschied zu Transfektionsverfahren mit kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzien (Superfect, Qiagen; Metafectene Biontex) ist das Medium, das wir während der Inkubationszeit benutzen. Die Pyridiniumdendrimere benötigen ein elektrolytarmes Medium wie OptiMEM oder Saccharose um die Plasmid DNA stabil zu komplexieren, während das auf Polyamidoamin-Dendrimere basierende Superfect z. B. in kommerziell erhältlichen Zellwachstumsmedien (DMEM) stabil ist.
Erreichte Vorteile:
Transfektionsversuche mit Pyridinium-Dendrimeren zeigen eine gute Transfektions-Effizienz für die oben aufgeführten Zelllinien und sind im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Dendrimeren pH-unabhängig. Aufgrund ihrer chemischen Struktur sind sie im Vergleich zu Aminogruppen enthaltenden Produkten nicht toxisch und auch für in vivo Anwendungen sicher geeignet.
Literatur:

[1] Kabanov A. V., Astafyeva I. A., Chikindas M. L., Rosenblat G. F., Kiselev V. I., Severin E. S., Kabanov V. A. Biopolymers, Vol. 31 (1991), 1437–1443
[2] Izumrudov V. A., Zhiryakova M. V. Macromol. Chem. Phys. 200 (1991), 2533–2540
[3] Kabanov A. V., Astafieva I. V., Maksimova I. V., Lukanidin E. M., Georgiev G. P., Kabanov V. A. Bioconjugate Chem. 4 (1993), 448–454
[4] van der Woude I., Wagenaar A., Meekel A. A. P., ter Beest M. B. A., Ruiters M. H. J., Engberts J. B. F. N., Hoekstra D. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1997), 1160–1165
[5] Ilies M. A., Johnson B. H., Makori F., Miller A., Seitz W. A., Thompson E. B., Balaban A. T. Archives of Biochemistry and Biophysics 435, (2005), 217–226
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Anhang:
Strukturtypen der Pyridinium-Dendrimere 1. Generation für Transfektionen in eukaryotischer Zellen
A. Tetramethylen-(butylen)-verbrückte Pyridiniumdendrimere
B. Trimethylen-(propylen)-verbrückte Viologendendrimere
C. Hexamethylen(hexylen)-verbrückte Pyridiniumdendrimere

Beispiele mit Carboxyl-endruppen, mit Chlorid-Gegenionen (nicht aufgeführt)

Claims

Es wird beansprucht den Einsatz von Pyridinium-dendrimeren 1., 2. oder höherer Generation für den Transport von Oligonucleotiden, Ribonukleinsäuren RNA und einzel oder doppelsträngiger DNA in eukaryotische Zellen zu schützen. 1. Für Anwendungen, die in vitro durchgeführt werden 1.1 im großen, biotechnologischen Maßstab 1.2. als Labormethode für Forschungszwecke und Untersuchungsmethoden 2. Für Anwendungen, die in vivo durchgeführt werden 2.1. im großen, biotechnologischen Maßstab (Tieren) 2.2. für therapeutische Methoden bei Menschen und Tieren Allgemeine Formel eines Pyridinium-dendrimers 1. Generation: Mit n = 1–4, und R₁ = -(CH₂)_n-NH₂ oder -(CH₂)_n-COOH, Gegenionen: Cl^–