DE102007053804A1

DE102007053804A1 - Tktl 1

Info

Publication number: DE102007053804A1
Application number: DE102007053804A
Authority: DE
Inventors: Kathrin Dr. rer. nat. Riemann; Kurt Werner Prof. Dr. med. Schmid; Winfried Prof. Dr. med. Siffert
Original assignee: Universitaet Duisburg Essen
Current assignee: Universitaet Duisburg Essen
Priority date: 2007-11-12
Filing date: 2007-11-12
Publication date: 2009-05-14

Abstract

In einem In-vitro-Verfahren sucht man nach einer oder mehreren Genveränderungen in der Promoterregion des Gens TKTL1 auf dem Humanchromosom Xq28.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft in-vitro-Verfahren zur Vorhersage von Krankheitsverläufen, Krankheitsrisiken, Arzneimittelrisiken und zum Auffinden von Drug Targets. Diese Verfahren beziehen sich insbesondere auf Krebserkrankungen, neurodegenerative Störungen und Stoffwechselerkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Es ist von medizinisch überaus hoher Relevanz, Prognosefaktoren für den Verlauf von Krebserkrankungen zu definieren, die Auskunft über das Ansprechen auf bestimmte Therapieformen geben oder die generell prädiktiv für das Auftreten von Metastasen, die Tumorprogression und das Überleben sind. Bislang werden in der Medizin dem Fachmann allgemein bekannte Prognosefaktoren eingesetzt. Hierzu gehören beispielsweise die Größe des Tumors, seine Eindringtiefe in das umgebende Gewebe, organüberschreitendes Wachstum, das Eindringen in Blut- oder Lymphgefäße oder in Lymphknoten, sowie der Differenzierungsgrad der Tumorzellen. Daneben existieren einige relativ unspezifische serologische Marker. Das Verfahren zur Klassifikation der Tumore wird allgemein als "Staging" und "Grading" bezeichnet. Generell gilt, dass das Vorhandensein von Fernmetastasen und ein geringer Differenzierungsgrad prognostisch sehr ungünstige Parameter darstellen. Dennoch ist es die allgemeine Erfahrung in der Medizin, dass Patienten bei gleichem Tumorstadium drastisch unterschiedliche Krankheitsverläufe aufweisen. Während man bei manchen Patienten eine schnelle Progression der Erkrankung und das Auftreten von Metastasen und Rezidiven beobachtet, kommt die Erkrankung bei anderen Patienten aus unklaren Gründen zum Stillstand. Metastasen können hierbei lokal, regional und fern der Muttergeschwulst auftreten. Dazu ist es notwendig, dass eine hohe Zahl von Geschwulstzellen über den Lymph- oder Blutweg durch einfache Fortschwemmung in Flüssigkeit oder durch Abklatschen in benachbartes Gewebe gelangt. Unter Rezidivneigung versteht man das erneute Auftreten einer Geschwulst nach operativer unvollständiger oder Teilentfernung des Tumors. Hierbei handelt es sich nicht um eine erneute maligne Transformation, sondern um das Nachwachsen eines nicht vollständig entfernten Tumorgewebes. Eine Rezidivbildung ist auch durch Metastasen möglich, die viele Jahre latent bleiben können. Unter Progression versteht man das Wiederauftreten eines Tumors mit höherem Grading (mehr Entdifferenzierung) oder das Neuauftreten von Metastasen.
Ganz offensichtlich gibt es eine Vielzahl individueller, unerkannter biologischer Variablen, die den Verlauf einer Tumorerkrankung unabhängig von Staging und Grading in hohem Maße determinieren. Zu solchen Faktoren gehören genetische Wirtsfaktoren.
Stoffwechsel bei Tumorerkrankungen
Genetische Veränderungen in Tumorzellen beeinflussen nicht nur Proliferation, Differenzierung und Apoptose, sondern sie können auch Stoffwechselwege modifizieren, die zu einem abnormalen Zellmetabolismus führen. Bereits 1924 stellten Warburg et al. eine Hypothese zur veränderten Energieproduktion in Tumoren auf (Warburg O, Posener K, Negelein E. Über den Stoffwechsel der Carcinomzelle. Biochem Z 152: 309–344, 1924). Der so genannte "Warburg-Effekt" bezieht sich auf metabolische Vorgänge, bei denen es zu einer anaeroben Degradierung von Glukose kommt, selbst unter Anwesenheit von Sauerstoff (aerobe Glykolyse), wodurch große Mengen an Laktat produziert werden. Demnach gibt es Tumore, die Glukose verbrennen und Tumore, die Glukose vergären. Letztere Energiegewinnung ist sehr ineffizient, weshalb 20 bis 30 mal mehr Glukose notwendig ist, um ebensoviel Energie zu erhalten wie über die Verbrennung. Obwohl der "Warburg-Effekt" kontrovers diskutiert wird, bestätigten aktuelle Studien, dass Tumorzellen weniger abhängig von der mitochondriellen ATP-Synthese als von der aeroben Glykolyse sind (Ramathan A, Wang C, Schreiber SL. Perturbational profiling of a cell-line model of tumorigenesis by using metabolic measurements. Proc Natl Acad Sci USA 102: 5992–5997, 2005). Ein erhöhter Glukoseverbrauch im Tumorgewebe und in Metastasen konnte mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) nachgewiesen werden (Kumar R, Mavi A, Bural G, et al. Fluorodeoxyglucose-PET in the management of malignant melanoma. Radiol Clin North Am 43: 23–33, 2005). Zudem existieren Hinweise über einen Zusammenhang zwischen Tumor-relevanten Genen und dem Glukosemetabolismus. Eine Aktivierung der Akt-Kinase führt zu einer erhöhten Glukoseaufnahme in Tumorzellen. Bei diesen Zellen kann durch Glukose-Entzug Apoptose induziert werden, da aktivierte Akt-Kinase die Oxidation der Fettsäuren beeinträchtigt (Elstrom RL, Bauer DE, Buzzai M, et al. Akt stimulates aerobic glycolysis in cancer cells. Cancer Res 64: 3892–3899, 2004). Außerdem konnte eine p53-vermittelte Abhängigkeit von Glukose auch für die Regulation des Zellzyklus' nachgewiesen werden (Jones RG, Plas DR, Kubek S. et al. AMP-activated Protein kinase induces a p53-dependent metabolic checkpoint. Mol Cell 18: 283–293, 2005). Trotz dieser wichtigen Erkenntnisse ist die Ursache für den erhöhten Glukoseverbrauch in Tumoren noch nicht gut verstanden.
Es existieren zwei mögliche Abbauwege der Glukose, zum einen der Embden-Meyerhof-Weg (Glykolyse) und zum anderen der Pentosephosphatweg. Letzterer führt zur Bildung von Ribo se-5-phosphat, welches ein Substrat der Nukleotidbiosynthese ist, und stellt NADPH für reduktive Biosynthesen zur Verfügung. Der nicht-oxidative Teil des Pentosephosphatwegs wird von Thiamin-abhängigen Transketolasereaktionen kontrolliert und verbindet beide Abbauwege miteinander, da aus den Endprodukten Glukose resynthetisiert werden kann. Die Wichtigkeit der Transketolasen für den Tumorzellmetabolismus bewiesen spezifische Transketolase-Inhibitoren, die die Proliferation von Tumorzellen drastisch reduzierten (Rais B, Comin B, Puigjaner J, et al. Oxythiamine and dehydroepiandrosterone induce a G1 phase cycle arrest in Ehrlich's tumour cells through inhibition of the pentose cycle. FERS Lett 456: 113–118, 1999). Dagegen konnte durch Stimulation der Transketolasen mit Thiamin das Tumorwachstum beschleunigt werden (Comin-Anduix B, Boren J, Martinez S, et al. The effect of thiamine supplementation an tumour proliferation. A metabolic control analysis study. Eur J Biochem 268: 4177–4182, 2001).
Stoffwechsel bei Neurodegenerativen Erkrankungen
Im Gegensatz zum gesteigerten Glukosemetabolismus in Tumoren wurde bei neurodegenerativen Erkrankungen ein verringerter zerebraler Glukosemetabolismus festgestellt. Durch PET-Analysen konnte sogar gezeigt werden, dass dieses Merkmal bereits vor dem Ausbruch von klinischen Symptomen nachweisbar ist, z. B. bei Patienten mit Morbus Alzheimer (Reimann EM, Chen K, Alexander GE, et al. Functional brain abnormalities in Young adults at genetic risk for late-onset Alzheimer's dementia. Proc Natl Acad Sci USA 101: 284–289, 2004). In Verbindung mit dem Glukosemetabolismus wurde v. a. sog. advanced glycation end products (AGE) bei Alzheimer-Patienten untersucht. Dabei handelt es sich um posttranslationale Veränderungen an Proteinen, die durch eine nicht-enzymatische Reaktion mit Zuckern hervorgerufen werden. Diese AGE konnten vorwiegend in senilen Plaques dieser Patienten detektiert werden (Choei H, Sasaki N, Takeuchi M, et al. Glyceraldehyde-derived advanced glycation end products in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol 108: 189–193, 2004). Zudem wurden Veränderungen der Transketolase-Aktivität im Gehirn und im peripheren Gewebe bei Patienten mit dieser Erkrankung gezeigt. Eine verringerte Enzymaktivität konnte also mit dem verringerten Glukosemetabolismus korreliert werden (Gibson GE, Sheu KF, Blass JP, et al. Reduced activities of thiamine-dependent enzymes in the brains and peripheral tissues of patients with Alzheimer's disease. Arch Neurol 45: 836–840, 1988).
Stoffwechsel bei Diabetes mellitus
Diabetes mellitus gehört zu den häufigsten Stoffwechselerkrankungen weltweit. Diabetes wird durch eine Hyperglykämie hervorgerufen, die zu Komplikationen wie Retinopathie, Nephropathie oder peripherer Neuropathie führen kann. Die Zellen, die durch den hyperglykämischen Zustand geschädigt werden, sind nicht dazu in der Lage, den Glukosetransport herabzuregulieren, wenn sie einer extrazellulären Hyperglykämie ausgesetzt werden. Es konnten bisher drei Reaktionskaskaden identifiziert werden, die bei einer hyperglykämischen Zellschädigung involviert sind: der Hexosaminweg, die Bildung von AGE und der Diacylglyzerol(DAG)-Proteinkinase C(PKC)-Weg. Durch diese Reaktionen entstehen vermehrt glykolytische Metabolite, die als Ausgansprodukt für den Transketolase-abhängigen PPP genutzt werden können. Allerdings ist die Transketolase-Aktivität ähnlich wie bei den neurodegenerativen Erkrankungen hier auch nur gering verglichen mit Tumoren.
Bedeutung der Transketolase-like 1
Bisher sind drei Transketolase-Enzyme und ihre kodierenden Gene bekannt: Transketolase (TKT) sowie die erst kürzlich identifizierten Transketolase-like 1 (TKTL1) und Transketolase-like 2 (TKTL2) (Coy JF, Dubel S, Kioschis P, et al. Molecular cloning of tissue-specific transcripts of a transketolase-reiated gene: Implications for the evolution of new vertebrate genes. Genomics 32: 309–316, 1996; Coy JF, Dressler D, Wilde J, et al. Mutations in the transketolase-like gene TKTL1: Clinical implications for neurodegenerative diseases, diabetes and cancer. Clin Lab 51: 257–273, 2005). Es konnte gezeigt werden, dass TKTL1 Tumor-spezifisch überexprimiert wird, während TKT und TKTL2 im Tumorgewebe nicht hochreguliert sind. Zudem wurde die TKTL1-Überexpression mit einem reduzierten Überleben bei Patienten mit Urothel- und Kolonkarzinom assoziiert (Langbein S, Zerilli M, zur Hausen A, et al. Expression of transketolase TKTL1 predicts colon and urothelial cancer Patient survival: Warburg effect reinterpreted. Brit J Cancer 94: 578–585, 2006). Eine erhöhte Expression von TKTL1 und ungünstige Prognose fand man zudem beim Magenkarzinom (Steiger WI, Coy JF, Grobholz R, et al. Expression of the mutated transketolase TKTL1, a molecular marker in gastric cancer. Oncol Rep 16: 657–661, 2006), Ovarialkarzinom (Krockenberger M, Honig A, Rieger L, et al. Transketolase-like 1 expression correlates with subtypes of ovarian cancer and the presence of distant metastases. Int J Gynecol Cancer 17: 101–106, 2007) und Mammakarzinom (Foldi M, Stickeier E, Bau L, et al. Transketolase Protein TKTL1 overexpression: A potential biomarker and therapeutic target in breast cancer. Oncol Rep 17: 841–845, 2007). Damit könnte das TKTL1-Expressionsniveau ein potentieller Biomarker für den Krankheitsverlauf bei Krebspatienten sein. Das TKTL1-Enzym wird zudem als ein viel versprechendes Zielprotein für neue Anti-Tumor-Behandlungsstrategien angesehen. Jedoch sind die Ursachen für die Tumorspezifisch erhöhte Genexpression völlig unbekannt.
Ein wesentlicher Aspekt bei der Behandlung von Krebserkrankung ist zunächst das Erstellen einer genauen Diagnose. Dies führt zu Kenntnissen darüber, in welchem Stadium sich die Krebserkrankung befindet, was auch über die nachfolgenden Therapiemodalitäten entscheidet, z. B. chirurgische Entfernung des Tumors mit ggf. Bestrahlung und pharmakologischer Therapie, eventuell auch unter Einsatz physikalischer Verfahren (z. B. Hyperthermie), Umstellung der Ernährung im Sinne einer spezifischen Ernährung für Krebspatienten. Das klassische Verfahren zur Diagnosestellung beinhaltet das sog. "Staging" und "Grading". Das Staging beschreibt die Tumorgröße und die Invasivität und untersucht, ob Lymphknoten befallen sind und ob Fernmetastasen vorhanden sind (z. B. TMN-System). Beim Grading werden die Tumorzellen histologisch untersucht, wobei hoch differenzierten Tumorzellen ein niedrigeres Malignitätspotential zugeordnet wird als schwach oder entdifferenzierten Zellen. Obwohl dieses System sich in der Praxis bewährt hat, ist die individuelle Vorhersagekraft für den einzelnen Patienten limitiert, und es entspricht der klinischen Erfahrung, dass Patienten mit gleichem Tumorstadium deutlich unterschiedliche Krankheitsverläufe zeigen und unterschiedlich auf eine Therapie ansprechen, was sich letztendlich in drastisch unterschiedlichen Oberlebenszeiten zeigt. Aus diesem Grunde ist es für die klinische Praxis erforderlich, zusätzliche und präzisere Marker bereitzustellen, die eine verbesserte Individualprognose einer Krebserkrankung erlauben. Dies kann geschehen über die Einbeziehung histochemischer Marker, wie dies beispielsweise beim Mammakarzinom im Rahmen der Untersuchung der Expression von Östrogenrezeptoren erfolgt. Ein alternativer Weg ist die Suche nach Gendefekten, z. B. somatischen Mutationen in Tumorsuppressorgenen. Neuere Ansätze versuchen den Krankheitsverlauf mit Hilfe von Genexpressionsprofilen vorherzusagen. Ein weiteres Problem bei der Krebsbehandlung ist die Vorhersage der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten und spezifischen Ernährungsregimen, der individuell optimalen Dosierung bzw. Therapiedauer, aber auch die Vorhersage des Auftretens schwerwiegender und bedrohlicher Nebenwirkungen. Beispielsweise können genetische Polymorphismen im Gen UGT1A1 dafür verantwortlich gemacht werden, dass bei einigen Patienten unter Therapie mit Irinotecan schwerwiegende Nebenwirkungen auftreten. Eine vorherige Genanalyse kann solche Patienten vor Therapiebeginn identifizieren und eine Dosisanpassung ermöglichen. Daneben sind Therapien mit in biotechnologischen Verfahren hergestellten Medikamenten teuer und werden zukünftig auf die Patienten beschränkt werden, bei denen eine Wirksamkeit auf Grund der individuellen Disposition wahrscheinlich erscheint.
Auch bei Stoffwechselstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen ist eine spezifische Individualprognose mangels geeigneter aussagekräftiger Marker nicht möglich. Obwohl eine genetische Komponente bei diesen Erkrankungen vermutet wird, bezieht sich diese wahrscheinlich nur auf die familiär auftretenden Krankheiten. Für sporadisch auftretende Fälle ohne familiären Hintergrund sind prädiktive Faktoren, die über den Verlauf der Erkrankung eine Aussage treffen können, nicht immer zuverlässig oder gar nicht vorhanden. Besonders Patienten, die an sporadischen neurodegenerativen Erkrankungen leiden, würden vom Vorhandensein eines molekularen Markers profitieren, der eine individuelle Prognose und Therapiestrategie erlauben würde, da hier nachweislich Krankheitsvorbeugende Arzneimittel fehlen.
Bislang erfolgt der Nachweis einer Überexpression von TKTL1 mittels Immunhistochemie an frischen Gewebeschnitten oder an z. B. in Paraffin eingebettetem Gewebe mit Antikörpern. Es ist jedoch zu erwähnen, dass dieses Verfahren viele Fragen offen lässt und dass auch das Verfahren problembehaftet ist. Hierzu sollen die folgenden Umstände Erwähnung finden:

1. Bislang ist unklar, welche Patienten TKTL1 überexprimieren oder warum manche Patienten im Tumorgewebe TKTL1 überexprimieren, andere hingegen nicht.
2. Die Diagnostik ist nur bei Vorhandensein von Tumormaterial durchführbar.
3. Die Diagnostik kann falsch positive und falsch negative Ergebnisse liefern, da üblicherweise, insbesondere bei großen Tumoren, nicht das gesamte Gewebe gefärbt und durchgemustert wird.
4. Die Diagnostik ist störanfällig, da subjektiv durch den Untersucher festgestellt wird, welcher Prozentansatz der Tumorzellen als TKTL1-positiv gilt. Ferner ist die Kategorisierung der Expression in "hoch", "mittel" und "niedrig/fehlend" willkürlich und damit auch die darauf basierend Vorhersage des Überlebens bzw. Therapieansprechen bei Ernährungsumstellung bzw. Gabe von TKTL1-Inhibitoren.

Kurzbeschreibung der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, das eine bessere Diagnose und Prognose des natürlichen Verlaufs einer Krebserkrankung, einer Stoffwechsel- oder neurodegenerativen Erkrankung und des Ansprechens dieser Erkrankungen auf Therapieformen erlaubt. Insbesondere sollen auch genetische Marker bereitgestellt werden, die prädiktiv für das Auftreten von Tumoren sind. Solche Marker erfüllen die Funktion, die betroffenen Individuen frühzeitig weiteren Screeningmaßnahmen (Serologie, Röntgen, Ultraschall, NMR) zuzuführen. Damit könnten Krebserkrankungen im Frühstadium erkannt und therapeutisch angegangen werden, wobei die Heilungs- und Überlebenschancen bei Tumoren im Frühstadium wesentlich besser sind als bei fortgeschrittenen Tumoren.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein in vitro-Verfahren zur Vorhersage von Krankheitsrisiken, Krankheitsverläufen, Arzneimittelrisiken und zum Auffinden von Drug Targets, in dem man nach einer oder mehreren Genveränderung/en in der Promotorregion des Gens TKTL1 auf dem Humanchromosom Xq28 sucht. Dabei wird insbesondere nach einem 25 Basenparen umfassendem Repeat gesucht und ermittelt ob dieses auftritt und wie häufig dieses in der Promotorregion des Gens TKTL1 auftritt.
Die Erfindung zielt also darauf ab,

a. Polymorphismen bereitzustellen, die geeignet sind, generell Krankheitsrisiken und – verläufe vorherzusagen,
b. Polymorphismen bereitzustellen, die geeignet sind, generell das Ansprechen auf Pharmaka und Krebstherapien, insbesondere TKTL1-Inhibitoren, und Nebenwirkungen vorherzusagen,
c. Polymorphismen bereitzustellen, die geeignet sind, generell die Wirkung anderer Therapieformen vorherzusagen (Ernährung, Bewegung, nicht medikamentöse Therapie).

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
1 zeigt eine schematische Darstellung des Gens TKTL1 auf Chromosom Xq28.
2 zeigt eine schematische Darstellung des neu identifizierten 22 bp-Repeats im Promotor von TKTL1, das in 4, 5 oder 6 Wiederholungen vorliegen kann.
3 zeigt die die Sequenzen von drei Allelen des TKTL-Promotor-Repeats mit flankierenden Sequenzen.
4 zeigt den Nachweis des 22 bp-Repeats im Promotor von TKTL1 inklusive aller möglichen Allelkombinationen mittels PCR und Gelelektrophorese.
5 liefert eine Repeat-abhängige Darstellung (A) des Überlebens und (B) der Rezidivbildung als Kaplan-Meier-Kurven bei. Patienten mit Harnblasenkarzinom und einem Follow-up von 100 Monaten.
6 zeigt die Repeat-abhängige Darstellung des Überlebens als Kaplan-Meier-Kurven bei Patientinnen mit Mammakarzinom und einem Follow-up von 150 Monaten.
7 zeigt die Repeat-abhängige Darstellung des Überlebens als Kaplan-Meier-Kurven bei Patienten mit Cholangiozellulärem Karzinom und einem Follow-up von 75 Monaten.
Das humane Gen TKTL1 ist auf Chromosom Xq28 lokalisiert (Gene bank accession number NM_012253) und kodiert für ein 92 kDa großes Protein, das cytoplasmatisch exprimiert wird. An dieser Stelle soll darauf hingewiesen werden, dass das Gen sowohl die Bezeichnung "TKTL1" als auch die Bezeichnungen "TKR" oder "TKT2" trägt. Hier wird die Bezeichnung "TKTL1" verwendet. Eine schematische Darstellung der Genstruktur findet sich in 1.
Hauptgegenstand der Erfindung ist das Auffinden eines im Promotor von TKTL1 befindlichen Polymorphismus, der durch systematische Sequenzierung von DNAs von Menschen gefunden wurde. Hierzu wurden Gensequenzen, die vor dem Exon 1 von TKTL1 liegen, mittels PCR-Reaktionen amplifiziert und gemäß der Methode nach Sanger sequenziert. Die dazu erforderlichen Verfahren, z. B. das Ableiten von für die PCR-Reaktion erforderlichen Primerpaaren und die Auswahl von Sequenzier-Primern sind dem Fachmann geläufig. Hierbei wurde ein neuer Polymorphismus gefunden, wobei in der Promotorregion ausgehend von Position –9811 ein 22 bp-Repeat, das entweder aus vier (bis Position –9898), fünf (bis Position –9920) oder sechs Wiederholungen (bis Position –9942) besteht, vorliegt (2). In 3 ist dieses neu identifizierte Repeat mit seinen flankierenden Sequenzen dargestellt. Aus der Kombination dieser drei Allele ergeben sich insgesamt neun mögliche Genotypen, da TKTL1 auf dem X-Chromosom lokalisiert ist (Xq28): 4/4, 4/5, 4/6, 5/5, 5/6 und 6/6 für Frauen sowie die hemizygoten Genotypen 4/-, 5/- und 6/- für Männer. Alle Genotypen können reproduzierbar z. B. mittels PCR detektiert werden (4). Die Nummerierung der Position erfolgt in der Weise, dass dem Nukleotid A des Startkodons ATG die Nummer +1 zugeordnet wird. Da es der Konvention entsprechend die Nummer 0 nicht gibt, ist dem vor dem A des Startkodons ATG liegenden Nukleotid die Nummer –1 zugeordnet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Nutzung des zuvor dargestellten Polymorphismus zum Auffinden und Validieren weiterer genomischer Veränderungen in TKTL1 oder benachbarten Genen, die beispielsweise mit dem Gen TKTL1 im Kopplungsgleichgewicht stehen. Das können auch Gene sein, die auf dem Gen X liegen, aber entfernt vom Gen TKTL1 angeordnet sind. Dabei wird für bestimmte Phänotypen (zelluläre Eigenschaften, Krankheitszustände, Krankheitsverläufe, Arzneimittelansprechen) zunächst eine Assoziation mit den Genotypen des TKTL1-Repeats hergestellt. Für neu detektierte Genveränderungen in TKTL1 oder benachbarten Genen wird untersucht, ob bereits bestehende Assoziationen unter Verwendung oben beschriebener Genotypen verstärkt oder abgeschwächt werden.
Das 22 bp-Repeat im aktiven Promotorbereich der 5'UTR (untranslatierte Region) von TKTL1 umfasst die folgende Nukleotidsequenz
5'-CACCACCCCTGACACGTGCGG-3'
Der Nachweis dieser SNPs im Sinne ihrer erfindungsgemäßen Verwendung kann mit beliebigen, dem Fachmann geläufigen Verfahren nachgewiesen werden, wie direkte Sequenzierung, Fragmentanalyse/Genescan, PCR, PCR mit nachfolgender Restriktionsanalyse, reverse Hybridisierung, Dot-blot- oder Slot-blot-Verfahren, Massenspektrometrie, Taqman^®- oder Light-Cycler^®-Technologie, Pyrosequencing^®, Invader^®-Technologie, Luminex-Verfahren, DNA-Chips.
Verteilung des TKTL1-Promotor-Repeats

Hierzu wurden unterschiedliche DNA-Proben von Kaukasiern (n = 300) und Afroamerikanern (n = 196) genotypisiert. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1: Verteilung des TKTL1-Repeats in verschiedenen Ethnien

Repeat	Geschlecht	Kaukasier	Afroamerikaner
4/4	weiblich	7	8
4/5	weiblich	34	31
4/6	weiblich	9	5
5/5	weiblich	45	35
5/6	weiblich	12	11
6/6	weiblich	2	0
4/	männlich	49	27
5/	männlich	120	61
6/	männlich	22	18

Die Verteilung der Genotypen in Kaukasiern und Afroamerikanern ist nicht statistisch signifikant unterschiedlich, was für eine hohe evolutionäre Konservierung spricht.
Verwendung von Genveränderungen in TKTL1 zur Vorhersage von Erkrankungsrisiken und Krankheitsverläufen
Aufgrund der Schlüsselfunktion von TKTL1 für den Metabolismus von Tumoren und den Glukosemetabolismus im Allgemeinen ist es ein wesentlicher Bestandteil der Erfindung, dass unter Verwendung von Genveränderungen in TKTL1 generell Erkrankungsrisiken und Krankheitsverläufe vorhergesagt werden können.
Die Multisteg-Entwicklung von Krebs spiegelt nicht nur die Akkumulation genetischer Veränderungen wider, die zur Transformation von normalen Zellen zu Krebszellen und von normalem Gewebe zu benignen und evtl. malignen, invasiven Tumoren führen. Auch der Zellmetabolismus innerhalb des Tumors verändert sich, um die proliferierenden Mechanismen zu unterstützen. Da TKTL1 eine zentrale Rolle für die Erhaltung dieser metabolischen Vorgänge besitzt, ist unmittelbar zu erwarten, dass der Verlauf vielfältiger und ganz unterschiedlicher Tumorerkrankungen von einer unterschiedlichen Repeatzahl beeinflusst wird. Daneben werden auch Antworten auf Pharmaka in besonderer Weise beeinflusst. Hiervon sind erwünschte, aber auch unerwünschte Arzneimittelwirkungen betroffen.
Während aus der zitierten Literatur eindeutig hervorgeht, dass man ganz allgemein davon auszugehen hat, dass eine Expressionsänderung von TKTL1 den Verlauf von Erkrankungen beeinflusst, so wurde ein Zusammenhang mit genomischen Varianten im Gen TKTL1 mit Erkrankungsrisiken in der Literatur weder beschrieben noch vermutet.
Als Erkrankungen, die mit einer Genveränderung in TKTL1 einhergehen, können genannt werden:

– Neoplasien jedes Ursprungsgewebes,
– Endokrinologische und Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2 Diabetes mellitus, das metabolische Syndrom, Adipositas, Schilddrüsenerkrankungen wie Hyper- und Hypothyreose und M. Basedow, Hyper- und Hypoparathyreodismus, Morbus Cushing,
– Neurologische Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, multiple Sklerose, Epilepsien.

Somit ist die Bereitstellung diagnostisch relevanter Genveränderungen im Gen TKTL1 als Prognosefaktor für Tumorerkrankungen des Menschen ein wesentlicher Bestandteil der Erfindung.
Generell können alle Zellen des menschlichen Körpers maligne entarten und zu einer Krebserkrankung führen. Die hier und im Weiteren gemachten Ausführungen beschreiben generelle Mechanismen der Tumorprogression, der Metastasierung und des therapeutischen Ansprechens. Insofern gelten die hier beschriebenen Mechanismen und Ansprüche für alle Tumore des Menschen. Beispielhaft genannt werden:

Tumoren des Urogenitaltrakts: Hier sind zu nennen das Harnblasenkarzinom, das Nierenzellkarzinom, das Prostatakarzinom und das Seminom.
Tumoren der weiblichen Geschlechtsorgane: Das Mammakarzinom, das Korpuskarzinom, das Ovarialkarzinom, das Zervixkarzinom.
Tumoren des Gastrointestinaltraktes: Das Mundhöhlenkarzinom, das Ösophaguskarzinom, das Magenkarzinom, das Leberkarzinom, das Gallengangskarzinom, das Pankreaskarzinom, das Kolonkarzinom, das Rektumkarzinom.
Tumore des Respirationstraktes: das Kehlkopfkarzinom, das Bronchialkarzinom.
Tumore der Haut: das maligne Melanom, das Basaliom, das T-Zell-Lymphom.
Tumorerkrankungen des blutbildenden Systems: Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphome, akute und chronische Leukämien, Plasmozytom.
Tumorerkrankungen des Gehirns oder des Nervengewebes: Glioblastom, Neuroblastom, Medulloblastom, meningeales Sarkom, Astrozytom.
Weichteiltumore, beispielsweise Sarkome und Kopf-Hals-Tumore.
Nicht nur in Tumoren wurden eine anormale TKTL1-Expression bzw. eine anormale TKTL1-Aktivität nachgewiesen. Allerdings ist im Gegensatz zu den Tumoren bei neurodegenerativen Erkrankungen und Diabetes mellitus eine geringere Enzymaktivität gezeigt worden als im Vergleich zu normalem Gewebe. Dasselbe Phänomen wird auch im Wernicke-Korsakoff-Syndrom (WKS), einer Thiamin-Defizienz, festgestellt. Durch den Thiamin-Mangel kommt es zu einer Zerstörung der Nervenzellen und somit zu klinischen und pathophysiologischen Charakteristiken, die sich bei WKS und Morbus Alzheimer überlappen. Die wichtigsten Enzyme im Thiamin-Metabolismus sind die Transketolasen. So wurde bei Patienten mit Alzheimer nachgewiesen, dass die Transketolase-Aktivität um bis zu 90% reduziert ist (Blass JP, Sheu KF, Cooper AJ, et al. Thiamin and Alzheimer's disease. J Nutr Sci Vitaminol: 401–404, 1992). Des Weiteren wurde in Patienten mit Diabetes eine verringerte Transketolase-Aktivität in den Erythrozyten nachgewiesen (Saito N, Kimura M, Kuchiba A, et al. The relationship between blond thiamine levels and dietary thiamine content in diabetic outpatients and healthy subjects. J Nutr Sci Vitaminol 33: 431–438, 1987). Eine Aktivierung der Transketolasen scheint somit eine attraktive therapeutische Intervention für diese Erkrankungen zu sein.
Inhibierung des Pentosephosphatwegs
Es wurde bereits gezeigt, dass Tumore eine hohe Rate an aerober Glykolyse besitzen und somit große Mengen an Laktat produzieren. Diese metabolische Adaptation der Krebszellen ist essentiell für ihre Fähigkeit, in einer hypoxischen Umgebung im Tumor unreguliert zu proliferieren. Es zeigt auch, dass Krebszellen sehr robust sind und somit auch eine Therapieresistenz entwickeln können. Allerdings werden diese adaptiven Mechanismen durch verschiedene Signaltransduktionskaskaden, wie den Pentosephosphatweg (PPP) gesteuert, die inhibiert werden können. Somit stellen diese Prozesse Angriffspunkte für neue Therapien dar, die auch TKTL1 mit einschließen, das ein essentieller Teil des PPP ist.
Die Wichtigkeit der Transketolasen für den Tumorzellmetabolismus bewiesen spezifische Transketolase-Inhibitoren, wie Oxythiamin, die die Proliferation von Tumorzellen drastisch reduzierten (Rais B, Commn B, Puigjaner J, et al. Oxythiamine and dehydroepiandrosterone induce a G1 phase cycle arrest in Ehrlich's tumour cells through inhibition of the pentose cycle. FERS Lett 456: 113–118, 1999). Dagegen konnte durch Stimulation der Transketolasen mit Thiamin das Tumorwachstum beschleunigt werden (Comin-Anduix B, Boren J, Martinez S, et al. The effect of thiamine supplementation an tumour proliferation. A metabolic control analysis study. Eur J Biochem 268: 4177–4182, 2001). Des Weiteren zeigen bestimmte pflanzliche Produkte eine starke Inhibierung der Transketolasen. Genistein, ein pflanzliches Isoflavonoid, beeinflusst nicht nur die Nukleinsäuresynthese, sondern auch den Glukosemetabolis mus in Tumorzellen, wodurch die Tumorzellvermehrung verringert wird (Borns LG, Bassilian S. Lim S. et al. Genistein inhibits nonoxidative ribose synthesis in MIA pancreatic adenocarcinoma cells: a new mechanism of controlling tumor growth. Pancreas 22: 1–7, 2001). Zudem inhibieren fermentierte Weizenkeime (Avemar^®) die Tumorproliferation und Metastasierung durch die Induktion von Apoptose über die Aktivierung der PPP-Enzyme. Dabei wurden keine toxischen Effekte beobachtet (Comin-Anduix B, Borns LG, Marin S, et al. Fermented wheat germ extract inhibits glycolysis/pentose cycle enzymes and induces apoptosis through poly(ADP-ribose) polymerase activation in Jurkat T-cell leukemia tumor cells. J Biol Chem 277: 46408–46414, 2002).
Es wird diskutiert, dass diejenigen Patienten, die TKTL1 im Tumorgewebe überexprimieren, eine glukose- und kohlenhydratarme Ernährung bekommen sollen, die aber reich an Ketonkörpern, Fetten und Ölen ist, da viele Tumore die letztgenannten Stoffe nicht verwerten können.
Aktivierung des Pentosephosphatwegs
Bei neurodegenerativen Erkrankungen und Diabetes mellitus wurden verringerte Transketolase-Aktivitäten nachgewiesen. Die Aktivierung der Transketolasen durch Benfotiamin, einem Thiaminderivat, führte in Diabetes-Tiermodellen zur Inhibierung des Hexosaminwegs, des DAG-PKC-Wegs und einer reduzierten Bildung von AGE. Diese Fähigkeit von Benfotiamin könnte klinisch nutzbar sein zur Prävention von Komplikationen bei Diabetes (Rammes HP, Du X, Edelstein D, et al. Benfotiamine blocks three major pathways of hyperglycemic damage and prevents experimental diabetic retinopathy. Nat Med 9: 294–299, 2003). Somit können auch Nahrungsergänzungsmittel, die zu einer Aktivitätssteigerung der TKTL1 führen, sich protektiv auf hyperglykämische Schäden und Neurodegeneration auswirken.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Das Prinzip der Erfindung wird an ausgewählten Beispielen erläutert, welche die generelle Verwendbarkeit demonstrieren.
Beispiele
Beispiel 1 – Harnblasenkarzinom
Blasenkrebs ist ein bösartiger Tumor der Schleimhaut der Harnblase und tritt am häufigsten zwischen dem 60. und 70. Lebensjahr auf. Männer sind davon dreimal so häufig betroffen wie Frauen. Bei Männern ist Blasenkrebs nach Lungen- und Prostatakrebs die dritthäufigste Krebsform. Blasenkrebs kann durch äußere Einflüsse hervorgerufen werden. Zu den Risikofaktoren gehören, Rauchen, ständige Belastung des Organismus durch Chemikalien, wie Farbstoffe oder Schmerzmittelmissbrauch. Bei vielen Patienten ergeben die Untersuchungen, dass es sich um einen oberflächlichen Tumor handelt. Dieser kann operativ mit Hilfe des Zystoskops entfernt werden. Mehr als 70% der Patienten, die wegen eines oberflächlichen Blasenkarzinoms behandelt wurden, zeigen im Verlauf ein Tumorrezidiv. Dabei kommen in mehr als der Hälfte Rezidivtumoren mit nicht-muskelinvasiver Erkrankung vor. Diese können durch transurethrale Resektion kurativ behandelt oder kontrolliert werden. Es ist deshalb wichtig, diese Läsionen frühzeitig zu erkennen und den Patienten regelmäßig und engmaschig nachzusorgen. In regelmäßigen Intervallen dienen Ausscheidungsurogramme zur Kontrolle möglicher Tumormanifestationen in Nierenbecken und Harnleitern. Bislang gibt es kaum valide Marker, die für den weiteren Verlauf der Erkrankung prädiktiv sind. Derzeit werden daher die klassischen Faktoren wie Eindringtiefe, Differenzierungsgrad, Metastasierung, Lymphknotenbefall für die Prognose herangezogen. Genetische Marker für Überlebenswahrscheinlichkeit und Therapieansprechen würden die Betreuung von Patienten mit Harnblasenkarzinom wesentlich verbessern. Aufgabe der Erfindung ist es zu zeigen, dass die Verwendung von Genveränderungen in TKTL1 dazu geeignet ist, den weiteren Verlauf der Erkrankung vorherzusagen.
5A zeigt das Überleben in Abhängigkeit von der Repeatlänge. Hierbei sind statistisch signifikante Unterschiede für das Überleben der Patienten zu sehen (p = 0.017). Patientinnen mit dem 4/6-Genotyp und Patientinnen und Patienten mit dem 6/6- bzw. 6/-Genotypzeigen zeigen das beste Überleben. Die mediane Zeit bis zum Tod beträgt 57 Monate beim 5/6-Genotyp und dagegen 66 Monate beim 4/5-Genotyp, während bei den restlichen Patienten keine mediane Zeit angegeben werden kann, da bis zum Ende der Studie weniger als die Hälfte dieser Patienten verstarben. Eine ähnliche Beziehung wird gefunden, wenn die Rezidivbildung der Patienten untersucht wird (5B). Der Kurvenverlauf ist für die Genotypen signifikant verschieden (p = 0.013), wobei den 6/6-Genotypen der günstigere Verlauf zugeordnet wird.
Beispiel 2 – Mammakarzinom
Das Mammakarzinom ist der häufigste Tumor der weiblichen Bevölkerung in Europa und den USA. Es betrifft 7–10% aller Frauen und macht 25% der gesamten weiblichen Krebsmortalität aus. Die Ätiologie des Mammakarzinoms ist noch nicht bekannt, jedoch sind Risikofaktoren beschrieben, wie eine familiäre Disposition, Strahlenexposition oder Östrogeneinfluss. Bei den meisten Patientinnen ergeben die Untersuchungen, dass es sich um ein invasives Karzinom handelt. Mit wenigen Ausnahmen wird jedes operable Mammakarzinom selbst nachgewiesener Fernmetastasierung chirurgisch behandelt. Die unterschiedlich radikale operative Erstversorgung hat Variationen der lokoregionären Rezidivrate, nicht aber der langfristigen Überlebenschance zur Folge. Zudem können Rezidive oder Fernmetastasen nicht selten erst nach 5 oder sogar 10 Jahren manifest werden. Es ist deshalb wichtig, diese Läsionen frühzeitig zu erkennen und die Patientinnen engmaschig nachzusorgen. Nachsorgeuntersuchungen werden in regelmäßigen Intervallen durchgeführt, bei zwischenzeitlichem Verdacht auch bis zu 10 Jahre postoperativ. Bislang gibt es kaum valide Marker, die für den weiteren Verlauf der Erkrankung prädiktiv sind. Derzeit werden daher die klassischen Faktoren wie Tumorgröße, Metastasierung, Lymphknotenbefall, Hormonrezeptorstatus etc. für die Prognose herangezogen. Genetische Marker für Überlebenswahrscheinlichkeit und Therapieansprechen würden die Betreuung von Patientinnen mit Mammakarzinom wesentlich verbessern. Aufgabe der Erfindung ist es zu zeigen, dass die Verwendung von Genveränderungen in TKTL1 dazu geeignet ist, den weiteren Verlauf der Erkrankung vorherzusagen.
6 zeigt das Überleben in Abhängigkeit von der Repeatlänge. Hierbei sind statistisch signifikante Unterschiede für das Überleben der Patienten zu sehen (p = 0.048). Patientinnen mit dem 5/5-Genotyp zeigen das beste Überleben. Die mediane Zeit bis zum Tod beträgt 132 Monate beim 5/5-Genotyp und dagegen nur 37,5 Monate beim 4/4-Genotyp.
Beispiel 3 – Cholangiozelluläres Karzinom
Das primäre Leberzellkarzinom stellt in Asien und Afrika einen der häufigsten Tumore dar, ist aber dagegen in Mitteleuropa mit weniger als 1% aller bösartigen Erkrankungen relativ selten. Zu den Risikofaktoren gehören vor allem Virusinfektionen der Leber. Histologisch wird das primäre Leberzellkarzinom unterschieden in Hepatozelluläres Karzinom, Cholangiozelluläres Karzinom, Hämangiosarkome und maligne Hämangioendotheliome. Die Tumore werden operativ entfernt und eine intensive Nachsorge betrieben. Die Nachsorge dient eher der Kontrolle von Therapieerfolgen als einer Rezidivdiagnostik, da die Möglichkeiten einer kurativen Sekundärtherapie kaum gegeben sind. Da die meisten Tumore oft erst spät entdeckt werden und die oft zugrunde liegende Leberzirrhose die therapeutischen Möglichkeiten limitiert, ist die Behandlung der Erkrankung nach wie vor schwierig und die Prognose ungünstig. Die mittlere Überlebensdauer bei Patienten mit nicht-resektablen Tumoren beträgt nur ca. 6–10 Monate. Bislang gibt es kaum valide Marker, die für den Verlauf der Erkrankung prädiktiv sind. Genetische Marker für Überlebenswahrscheinlichkeit und Therapieansprechen würden die Betreuung der Patienten wesentlich verbessern. Aufgabe der Erfindung ist es zu zeigen, dass die Verwendung von Genveränderungen in TKTL1 dazu geeignet ist, den weiteren Verlauf der Erkrankung vorherzusagen.
7 zeigt das Überleben in Abhängigkeit von der Repeatlänge. Hierbei sind statistisch signifikante Unterschiede für das Überleben der Patienten zu sehen (p = 0.050). Patientinnen mit dem 5/6-Genotyp und Patientinnen mit dem 4/5-Genotyp zeigen das beste Überleben. Die mediane Zeit bis zum Tod wird hier nicht erreicht, da bis zum Ende der Studie weniger als die Hälfte dieser Patientinnen verstarben. Die mediane Überlebenszeit für den 4/4-Genotyp beträgt nur 7 Monate, für den 6/6-Genotyp dagegen 45 Monate.
Die Verwendbarkeit von Genveränderungen im Gen TKTL1 zur Vorhersage von Krankheitsverläufen und Therapieansprechen wurde exemplarisch für drei unterschiedliche Karzinome gezeigt: Harnblasenkarzinom, Mammakarzinom und cholangiozelluläres Karzinom. Diese Daten belegen eindeutig die Verwendbarkeit der Genveränderungen im Gen TKTL1 für den hier beschriebenen Zweck. Diese Erkrankungen stehen a priori in keinerlei Zusammenhang.
Beispiel 4 – Wirksamkeit oraler Anti-Diabetika zur Verbesserung der Insulinsensitivität
Das Polycystische Ovarsyndrom (PCOS) ist eine häufige endokrine Erkrankung, die durch chronische Anovulation und Hyperandrogenismus charakterisiert ist. Etwa 5% aller prämenopausalen Frauen sind davon betroffen. Die meisten Frauen mit PCOS haben eine Insulinresistenz und damit ein erhöhtes Risiko für ein metabolisches Syndrom (Adipositas, Typ-2 Diabetes, Fettstoffwechselstörung und Hypertonie). Die Behandlung von PCOS-Patientinnen mit Metformin verbessert die Fertilität, den Androgenlevel, reduziert die Insulinresistenz und erleichtert eine Gewichtsreduktion. Hier wurden Frauen mit PCOS über 4 Monate mit Metformin behandelt. Dabei wurden verschiedene Labor-diagnostische Messungen zu Beginn der Therapie und nach 4 Monaten Therapie durchgeführt, die verschiedene hormonelle Systeme umfassen. Dazu gehören die Bestimmung der Insulinsensitivität mittels des Matsuda-Index (= WBIS, whole body insulin sensitivity) und mittels des Gennett-Index sowie Triglyceride und HDL (High-density Lipoprotein) für den Lipoproteinstoffwechsel und viele mehr.

Während vor Beginn der Therapie nur Genotyp-abhängige Unterschiede bei den Werten für die Triglyceride und Cortisol festzustellen sind (Tabelle 2), kann nach 4 Monaten Therapie ein statistisch signifikanter Unterschied im Matsuda-Index, im Gennett-Index und bei den HDL-Werten nachgewiesen werden (Tabelle 3). Patientinnen mit dem genotyp 4/4 weisen nun die höchsten Werte im Matsuda- und bennett-Index auf, wodurch eine bessere Insulinsensitivität beschrieben wird. Damit ist gezeigt, dass Genveränderungen im Gen TKTL1 dazu verwendet werden können, die Wirksamkeit oraler Antidiabetika vorherzusagen. Dazu gehören neben Metformin die sog. Glitazone, Tolbutamid, Sulfonylharnstoffe und seine Derivate, Glinide sowie Arcabose. Tabelle 2: Triglycerid- und Cortisol-Werte abhängig vom TKTL1-Repeat bei PCOS-Patientinnen vor Beginn der Therapie mit Metformin

Repeat	Triglyceride [mg/dl]	p-Wert	Cortisol [nmol/l]	p-Wert
4/4	109.54		468.45
4/5	125.61		363.82
4/6	369.50		461.49
5/5	132.13		498.09
5/6	134.25		459.53
6/6	50.00	0.014	397.89	0.037

Tabelle 3: Triglycerid- und Cortisol-Werte abhängig vom TKTL1-Repeat bei PCOS-Patientinnen nach viermonatiger Therapie mit Metformin

Repeat	Matsuda-Index	p-Wert	Gennett-Index	p-Wert	HDL [mg/dl]	p-Wert
4/4	22.72		0.18		67.00
4/5	4.16		0.15		53.95
4/6	8.17		0.16		76.00
5/5	2.37		0.15		55.86
5/6	0.94	< 0.0001	0.14	0.038	41.00	0.026

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

In vitro-Verfahren zur Vorhersage von Krankheitsrisiken, Krankheitsverläufen, Arzneimittelrisiken, des Ansprechens von Therapeutika und zum Auffinden von Drug Targets, dadurch gekennzeichnet, dass man nach einer oder mehreren Genveränderung/en in der Promotorregion des Gens TKTL1 auf dem Humanchromosom Xq28 sucht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Patientenprobe nach einem Polymorphismus ausgehend von Position –9811 bestehend aus einem 22 bp-Repeat sucht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Krankheitsrisiko das Risiko einer Krebserkrankung, einer neurodegenerativen Erkrankung, einer Stoffwechselerkrankung, einer Diabetes Typ II oder Adipositas ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittelrisiko durch Krebstherapeutika oder durch Pharmaka zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen oder Stoffwechselerkrankungen verursacht wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittelrisiko durch Hemmstoffe der Tranketolase-like 1 oder Hemmstoffe des Pentosephosphatzyklus verursacht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das man das Therapieansprechen von Krebstherapeutika, von Pharmaka zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen oder zur Behandlung von Stoffwechselerkrankungen vorhersagt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Therapieansprechen von Therapieverfahren für Diabetes Typ II oder Adipositas vorhersagt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Genotypen des Polymorphismus in der Promotorregion des Gens TKTL1 auf dem Humanchromosom Xq28 zum Auffinden weiterer relevanter Polymorphismen und Haplotypen verwendet.