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Die
Erfindung betrifft einen Gelträger zur Durchführung
des COMET-Assays mit Automatisierungsmöglichkeit im Roboter-gestützten
Analysebetrieb zur Realisierung eines Hochdurchsatz-Verfahrens,
umfassend eine Trägerplatte, deren Plattenoberseite mindestens
eine Trägerfläche zum Aufbringen des Gels aufweist.
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Der
COMET-Assay, auch als Einzelzellgelelektrophorese oder SCGE, nämlich
Single Cell Gel Electrophoresis, bezeichnet, ist eine Technik, durch die
es ermöglicht wird, DNA-Schädigungen in einzelnen
Zellen festzustellen.
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Entwickelt
wurde die methodische Grundlage für den Assay 1978 von
Rydberg und Johanson, die DNA-Strangbrüche nach Einbettung
von Einzelzellen in Agarosegele und Anfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen
untersuchten. Der Assay wurde 1984 von Östling und Johanson
durch Einführung eines Elektrophorese-Schrittes entscheidend
in seiner Sensitivität und Aussagekraft verbessert. Mit
der Weiterentwicklung durch Singh im Jahre 1988 konnten durch die
Verwendung von alkalischen Puffern zusätzlich auch DNA-Einzelstrangbrüche
festgestellt werden.
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Das
Prinzip des COMET-Assays beruht darauf, dass Zellen in Agarose-Gel
eingebettet, lysiert und einem elektrischen Feld, der so genannten
Elektrophorese, ausgesetzt werden. Während der Elektrophorese
wandert die negativ geladene DNA zum Pluspol, wobei sich aufgrund
des Agarose-Gels die Bruchstücke der Größe nach
auftrennen, da die kleineren Bruchstücke in bestimmter
Zeit eine weitere Strecke zurücklegen als die größeren.
Chromosomale DNA ist jedoch zu groß um als Ganzes im elektrischen
Feld zu wandern. Nur geschädigte, bruchstückhafte
DNA ist hier in der Lage, aus dem Zellkern herauszuwandern.
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Unter
dem UV-Mikroskop erscheinen die beschädigten Zellen, welche
vorher mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Ethidiumbromid behandelt worden sind,
nun mit einem Schweif aus DNA-Bruchstücken, welcher ihnen
das Aussehen eines Kometen gibt. Beim COMET-Assay können
prinzipiell alle Zellen verwendet werden, welche einen Zellkern
besitzen.
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Ausgewertet
wird die Zahl der Zellkerne mit beschädigter und unbeschädigter
DNA unter dem Fluoreszenzmikroskop entweder durch Zählung
und Zuweisung von Schädigungs-Klassen oder unter Einsatz
von Computer-gestützter Bildanalyse.
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Die
Durchführung des gebräuchlichen COMET-Assays wird
in der Beschreibungseinleitung der
DE 10 2004 046 364 A1 beschrieben.
Hierbei werden üblicherweise Gelträger in Form
von Objektträgern aus Glas der Größe
76 × 26 mm mit einer Dicke von etwa 1 bis 2 mm verwendet.
Die gesamte Objektträgeroberseite bildet hierbei die Trägerfläche
zum Aufbringen des Gels. Nachteilig daran ist, dass immer nur ein
Gel aufgebracht und mithin immer nur eine Probe analysiert werden
kann.
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Dieser
Nachteil wird auch in der
DE 10 2004 046 364 A1 erkannt. Um die Durchführung
des Verfahrens bei der Untersuchung von mehreren Proben zu vereinfachen
und eine schnelle Untersuchung mehrerer Proben zu ermöglichen,
wird gemäß
DE 10 2004 046 364 A1 das herkömmliche
Standard-Verfahren für die Durchführung des COMET-Assays durch
Verwendung eines dort näher erläuterten Vielkammer-Behälters
modifiziert. Hierbei wird jede Kammer mit einer Probe versehen,
wobei wenigstens vor Durchführung der erforderlichen Gelelektrophorese
und der gegebenenfalls daran anschließenden Verfahrensschritte
die Wände des Vielkammer-Behälters entfernt werden.
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Weiterhin
sind Glasträgerplatten bekannt, die auf ihrer Oberfläche
einen ausgeformten Farbaufdruck aufweisen und so einen Auftrag mehrerer
physikalisch getrennter Gele und somit Proben auf einer einzigen
Trägerplatte ermöglichen sollen. Derartige Glasträgerplatten
werden derzeit beispielsweise von der Firma Trevigen® unter
der Bezeichnung COMETSlide HT oder FLARESlide angeboten.
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Zwar
wird in den zuvor genannten Fällen zunächst eine
physikalische Trennung der Gele und somit der Proben auf einer Trägerplatte
erreicht, so dass eine schnelle Untersuchung mehrerer Proben möglich
erscheint, jedoch hat sich gezeigt, dass bei der Vielzahl der bei
der Durchführung des COMET-Assays erforderlichen Verfahrensschritte
die Haftung der Einzelgele bzw. der Proben auf der Trägerplatte
unzureichend ist. Es kommt dadurch zum Ablösen der Gele
und zum Verlust des Probenmaterials. Ein solches Ablösen
erfolgt nicht, wenn der COMET-Assay mit einer Trägerplatte
durchgeführt wird, deren Plattenoberseite mit nur einem
Gel und somit nur einer Probe vollflächig bedeckt ist.
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Ausgehend
von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde,
einen Gelträger zur Durchführung des COMET-Assays
mit Automatisierungsmöglichkeit im Roboter-gestützten Analysebetrieb
zur Realisierung eines Hochdurchsatz-Verfahrens, nämlich
zur schnellen und zuverlässigen Untersuchung mehrerer Proben,
bereitzustellen.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Gelträger,
der eine Trägerplatte umfasst, deren Plattenoberseite mindestens
eine Trägerfläche zum Aufbringen des Gels aufweist,
dadurch gelöst, dass die Trägerfläche
einen Haftbereich umfasst, der derart ausgebildet ist, dass das
auf der Trägerfläche aufgebrachte Gel in diesem
Bereich an der Plattenoberseite haftet, und einen Analysenbereich
umfasst, der derart ausgebildet ist, dass eine Analyse in diesem Bereich
durchführbar ist.
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Erfindungsgemäß umfasst
jede Trägerfläche somit zwei funktionell unterschiedlich
ausgebildete Bereiche, nämlich einen Haftbereich und einen
Analysebereich, die von einem Gel und somit von einer zu untersuchenden
Probe bedeckt sind. Jedes auf der Trägerplatte aufgebrachte
Gel wird für sich auf der Trägerplatte gehalten,
da jede Trägerfläche einen Haftbereich aufweist,
der sich vom Analysenbereich unterscheidet. Dadurch wird ein Ablösen
der Gele und somit der Proben von der Trägerplatte während der
Vielzahl der vorgenannten erforderlichen Verfahrensschritte sicher
verhindert.
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Bei
mehreren zu untersuchenden Proben ist durch eine voneinander beabstandete
Anordnung der Trägerflächen auf der Trägerplatte
auch eine physikalische Trennung der Gele und somit der Proben möglich.
Dies ist insbesondere im Hinblick auf das Hochdurchsatz-Verfahren
von entscheidender Bedeutung.
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Nach
Durchführung der Gelelektrophorese sowie gegebenenfalls
erforderlicher Spül-, Färbe- und/oder Trocknungsschritte
können die einzelnen Proben mit einem verfahrbaren Mikroskop
abgefahren und die ermittelten Bilder ausgewertet werden. Bevorzugt
erfolgt dies voll automatisch.
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Im
Fall des COMET-Assays ist der Haftbereich zumindest derart ausgebildet,
dass die Haftung des Gels in diesem Bereich auf der Plattenoberseite über
einen ausreichenden Zeitraum von mindestens 2 bis 24 Stunden in
hochalkalischer Lösung stabil ist. Darüber hinaus
ist der Haftbereich vorzugsweise derart ausgebildet, dass auch weitere
Verfahrensschritte, insbesondere Spül- und Färbeschritte
sowie ganz speziell Trocknungsschritte, nicht zu einer Ablösung des
Gels von der Plattenoberseite führen. Der Analysenbereich
ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass das in diesem Bereich
vorliegende Gel auch unter Fluoreszenzbedingungen mikroskopierbar
ist.
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Vorteilhaft
ist der erfindungsgemäße Gelträger hierbei
gegenüber dem Stand der Technik nicht derart modifiziert,
dass er nicht mehr mit den Standard-Verfahren für die Durchführung
des COMET-Assays kompatibel ist.
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Die
Aufbringung des Gels auf der Trägerfläche ist
technisch einfach durch Pipettieren möglich. Hierfür
können Multipipetten oder Roboter verwendet werden.
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Der
erfindungsgemäße Gelträger macht die Herstellung
einer hohen Anzahl physikalisch getrennter Gele auf einer gemeinsamen
Oberfläche bei gleichzeitiger Einhaltung der festen Haftung
jedes Gels auf der Oberfläche möglich. Ferner
erlaubt der Gelträger die Durchführung eines Roboter-gestützten
Hochdurchsatz-Verfahrens. Insbesondere wird dadurch ein Abarbeiten
der COMET-Präparate nach dem folgenden Ablauf möglich:
- – Erzeugung der Zellen für
die Durchführung des COMET-Assays
- – Automatisiertes Aufbringen einer hohen Anzahl von
Spots (= COMET-Proben) auf einen einzigen Gelträger (z.
B. 96 Proben auf der Fläche einer Mikrotiterplatte)
- – Überführung des Gels/Gelträgers
in eine Elektrophorese-Einheit zur Lyse, Unwindung und Elektrophorese
- – Entnahme aus der Elektrophorese-Einheit, ggf. Roboter-gestützte
Spülschritte und Färbung
- – Trocknung der Gele
- – Überführung zur mikroskopischen
Auswertung
- – Automatisierte Analyse der COMET-Spots
- – Entfernen des Gels vom Träger durch einfaches Quellen/Waschen
in Wasser und Wiederverwendung oder Archivierung des Gels für
langfristige Dokumentation
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Dies
kann in vollständiger Kompatibilität mit den Standard-Methoden
für den COMET-Assay durchgeführt werden.
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Durch
Einsatz des erfindungsgemäßen Gelträgers
lässt sich der erreichbare Probendurchsatz im Vergleich
zum Standard-Verfahren unter Material- und Zeitersparnis erheblich
erhöhen.
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Eine
Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass der Haftbereich den
Analysenbereich einrahmt.
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Dadurch
wird erreicht, dass das Gel auch in getrockneter Form der mikroskopischen
Analyse zuführbar ist, ohne dass zu befürchten
ist, dass sich das Gel aufgrund der Trocknung verformt und somit
nicht mehr plan auf dem Gelträger liegt. Der einen Rahmen
bildende Haftbereich wirkt den beim Trocknen des Gels auftretenden
Spannungen im Randbereich des Gels entgegen und hält das
Gel auf der Plattenoberseite. Dadurch wird eine automatisierte Auswertung
erheblich erleichtert und es wird eine unter diesen Voraussetzungen
zuvor nicht vorhandene Archivierbarkeit ermöglicht.
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Vorzugsweise
ist der Haftbereich ringförmig ausgebildet. Die Ringform
hat sich bewährt, da das mittels einer Pipette aufgetragene
Gel nach dem Auftragen eine Kreisform aufweist.
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Die
Trägerplatte des Gelträgers besteht gemäß einer
vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung aus Glas.
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Eine
solche Trägerplatte ist, insbesondere vor dem Hintergrund
eines Hochdurchsatz-Verfahrens, kostengünstig herstellbar.
Zudem ist der Gelträger nach einem Reinigungsvorgang wieder
verwendbar.
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Es
können standardmäßige Flachglasmaterialien
zur Herstellung der Trägerplatte verwendet werden, wobei
das Material im Analysenbereich auch eine ausreichende Transmission
im benötigten Wellenlängenbereich von 350–600
nm erlauben muss, wenn der Gelträger für den COMET-Assay
eingesetzt ist.
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Der
Analysenbereich wird vorzugsweise durch eine plane Glasoberfläche
mit freiem Lichtdurchgang zur mikroskopischen Auswertung des in diesem
Bereich befindlichen Gels gebildet.
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Die
Größe des Gelträgers wird in Abhängigkeit
der Automatisierungsmöglichkeiten gewählt. Eine
geeignete Größe entspricht beispielsweise dem Format
einer Mikrotiterplatte mit einer Länge von etwa 128 mm
und einer Breite von etwa 85 mm oder auch eines Standard-Objektträgers
mit einer Länge von etwa 76 mm und einer Breite von etwa
26 mm. Eine geeignete Dicke beträgt vorzugsweise etwa 1 bis
2 mm.
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Eine
Trägerplatte in der Größe eines Standard-Objektträgers,
welcher nach dem Stand der Technik für nur ein einziges
Gel und somit nur für eine einzige Probe zuverlässig
nutzbar ist, kann erfindungsgemäß beispielsweise
zwölf Trägerflächen aus jeweils einem
Haft- und einem Analysebereich aufweisen. Damit wären zwölf
so genannte Gel-Spots und mithin zwölf Proben untersuchbar.
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Bevorzugt
ist die Ausbildung eines Gelträgers mit 96 Trägerflächen.
Auch andere Größen sind problemlos herstellbar,
bevorzugt solche mit 12, 24, 48 oder 192 Trägerflächen.
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Eine
Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass die Plattenoberseite
im Haftbereich jeder Trägerfläche aufgeraut ist.
Dadurch wird eine erhöhte Haftung die Plattenoberseite
zum Gel realisiert.
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Die
vorgesehenen Haftbereiche können vorzugsweise durch Sandstrahlen
oder andere geeignete Verfahren hergestellt werden. Vorteilhaft
wird hierbei im Haftbereich Material von der Plattenoberseite abgetragen,
ohne dass die benachbarte Oberfläche, insbesondere der
Analysenbereich, beschädigt wird. Eine genaue Trennung
zwischen Haftbereich und Analysenbereich, also in diesem Fall zwischen
bearbeiteter und unbearbeiteter Oberfläche, ist möglich.
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Der
Abtrag der Oberfläche hat dabei so zu geschehen, dass im
abgetragenen Bereich eine Fläche von ausreichender Tiefe
und Rauheit entsteht. Dies kann beispielsweise durch die Wahl des
Strahlmittels und die Dauer des Sandstrahlens definiert werden.
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Eine
ausreichende Haftung im Haftbereich wird gemäß einer
Weiterbildung der Erfindung durch Aufbringen von geeigneten Beschichtungen,
vorzugsweise mit stark hydrophilem Charakter, insbesondere Farbbeschichtungen,
erreicht, die dann vorteilhaft nicht lichtdurchlässig sein
müssen. Ausreichende Haftung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass
sich das Gel während der vorgegebenen Verfahrensschritte
nicht von der Plattenoberseite löst.
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Eine
vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die Plattenoberseite
im Haftbereich mit Silanen chemisch vorbehandelt ist. Auch dadurch
wird eine erhöhte Haftung die Plattenoberseite zum Gel
realisiert.
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Eine
Weiterbildung der Erfindung sieht vor, dass der Gelträger
mit dem oder den Analysenbereichen einer Bildgebenden Auswertung
mittels Mikroskop oder einem anderen geeigneten Auswerteverfahren,
beispielsweise mittels Mikrotiterplatten-Reader, zugänglich
ist.
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Es
versteht sich, dass der erfindungsgemäße Gelträger
zwar besonders vorteilhaft auf dem Gebiet des COMET-Assays eingesetzt
werden kann, sich jedoch auch anderweitig verwenden lässt.
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Bei
alledem werden die geschilderten Vorzüge mit einer sehr
einfachen Maßnahme erzielt, da das Herstellen der Haftbereiche
mit verhältnismäßig geringen Kosten verbunden
ist.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert,
dass in der Zeichnung dargestellt ist. In dieser zeigen
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1 schematisch
eine Draufsicht auf einen erfindungsgemäßen Gelträger
und
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2 schematisch
eine Seitenansicht auf den in 1 dargestellten
Gelträger im Längsschnitt.
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Der
in 1 und 2 schematisch dargestellte Gelträger 10 ist
insbesondere zur Durchführung des bekannten COMET-Assays,
speziell für einen automatischen Roboter-gestützten
Analysebetrieb zur Realisierung eines Hochdurchsatz-Verfahrens,
geeignet.
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Der
Gelträger 10 umfasst eine Trägerplatte 12,
deren Plattenoberseite 14 zwölf Trägerflächen aufweist,
auf denen jeweils ein Gel 16 und somit eine zu untersuchende
Probe aufgebracht wird.
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Jede
Trägerfläche umfasst erfindungsgemäß einen
Haftbereich 18, der derart ausgebildet ist, dass das auf
der Trägerfläche aufgebrachte Gel 16 in
diesem Bereich 18 an der Plattenoberseite 14 haftet, und
einen Analysenbereich 20, der derart ausgebildet ist, dass
eine Analyse in diesem Bereich 20 durchführbar
ist.
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Vorzugsweise
ist der Haftbereich 18 ringförmig ausgebildet
und umgibt somit den Analysenbereich 20 rahmenartig.
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Die
Trägerplatte 12 besteht aus Glas. Die ringförmigen
Haftbereiche 18 werden durch Sandstrahlen hergestellt,
wobei Glasmaterial von der Plattenoberseite 14 abgetragen
wird.
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Der
vom Haftbereich 18 eingerahmte Analysenbereich 20 ist
dagegen unbeschädigt und eignet sich für eine
Analyse des Gels 16 mittels eines hier nicht dargestellten
Mikroskops
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Der
erfindungsgemäße Gelträger 10 weist zwölf
Trägerflächen mit jeweils einem so genannten Gel-Spot 16 auf,
wobei jede Trägerfläche zwei Funktionsbereiche
umfasst, nämlich einen Bereich 20 mit unbeschädigter
Glasoberfläche zur mikroskopischen Analyse und einen Bereich 18,
der vorzugsweise durch physikalische Vertiefungen in Kombination
mit einer ausreichenden Rauheit der dortigen Oberfläche oder
eine geeignete dauerhafte Beschichtung eine stabile Haftung des
jeweiligen Gel-Spots 16 sichert.
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- 10
- Gelträger
- 12
- Trägerplatte
- 14
- Plattenoberseite
- 16
- Gel
- 18
- Haftbereich
- 20
- Analysenbereich
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 102004046364
A1 [0007, 0008, 0008]