DE102007011702A1

DE102007011702A1 - Aptamer-basierte Reagenzien

Info

Publication number: DE102007011702A1
Application number: DE102007011702A
Authority: DE
Inventors: Günter Dr. Mayer; Alexander Dr. Heckel; Bernd Prof. Dr. Pötzsch
Original assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn
Current assignee: RHEINISCHE FRIEDRICH-WILHELMS-UNIVERSITAET BON, DE
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2007-03-08
Publication date: 2008-09-11
Also published as: WO2008107489A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Aptamer-basiertes Reagens, umfassend wenigstens ein an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül, mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität bindendes Aptamer, wobei wenigstens eine Base des Aptamers wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist; und wenigstens einen Linker am 5'-Ende, 3'-Ende, an einer der Nukleobasen und/oder am Ribosephosphatrückgrat des Aptamers, wobei die Linker wenigstens eine weitere photolabile Schutzgruppe und wenigstens eine Abgangsgruppe zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül aufweist, sowie Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, erhalten aus der Umsetzung des Aptamer-basierten Reagens mit einem Zielmolekühl, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem Aptamer-basierten Reagens und dem Zielmolekül unter Abspaltung der Abgangsgruppe zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül ausbildbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft Aptamer-basierte Reagenzien und Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, die geeignet sind das Hämostasesystem gezielt zu modulieren und zur Behandlung von Erkrankungen wie Tumorkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen oder Blutungen geeignet sind.
Das System der Blutgerinnung ist ein Teil der körpereigenen Abwehrmechanismen und schützt den Körper nach einer Verletzung vor unkontrolliertem Blutverlust. Gleichzeitig ist der Prozess der Gerinnungsaktivierung durch endogene Inhibitionsmechanismen derart reguliert, dass die Gerinnselbildung auf die verletzte Gefäßwand begrenzt bleibt. Bei einer angeborenen oder erworbenen Fehlfunktion des Hämostasesystems kann es zu Blutungen oder zu einer Thromboseneigung kommen.
In Abhängigkeit von der Lokalisation und der Ausdehnung eines operativen Eingriffs kann es als Folge eines Operationstraumas zu verstärkten Nachblutungen kommen, die das Operationsergebnis unmittelbar gefährden und für den Patienten zu bleibenden Schäden führen können. In diesen Fällen kann durch eine gezielte Stimulation des Hämostasesystems, wie zum Beispiel durch die Gabe von Hämostyptika wie rekombinanter Faktor VIIa oder Desamino-8D-Argininovasopressin eine Blutstillung induziert werden. Im Fall von arteriellen Blutungen kann eine Blutstillung durch gezielte Unterspritzung der Gefäße mit adstringierenden und lokal embolisierenden Agenzien erreicht werden. Dieses Vorgehen ist ein Routineverfahren in der Behandlung von akut blutenden gastrointestinalen Ulcera.
Im Stand der Technik bekannt ist eine gezielte Unterbrechung der Gefäßzirkulation durch eine Katheter-assistierte lokale intravasale Applikation von chemischen Embolisatoren oder des gerinnungsaktiven Thrombins, die beispielsweise in der Behandlung von soliden Tumoren und zum Verschluss von rupturgefährdeten Aneurysmen, beispielsweise im cerebralen Gefäßsystem eingesetzt wird. Nachteilig hierbei ist insbesondere die erhebliche Ungenauigkeit der Applikationen. So sind die Lage des Katheters und lokale Strömungseigenschaften des Blutes entscheidend für die Genauigkeit der Okklusion.
Weiterhin sind Fehlinjektionen, beispielsweise verursacht durch vorher nicht erkannte Gefäßanastomosen, mit der Gefahr verbunden, eine Embolisation von Gefäßarealen, die gesundes Gewebe versorgen, herbeizuführen. Da die chemischen Embolisatoren zu einer irreversiblen Reaktion führen, können Fehlinjektionen nicht korrigiert werden.
Ein weiterer Nachteil aller kathetergestützten Embolisationsverfahren besteht in der Notwendigkeit eines interventionellen Eingriffs.
Im Stand der Technik ist weiterhin die Verwendung von Aptameren als Arzneimittel bekannt. Beispielsweise offenbart die Schrift WO 03/002592 die Verwendung von Aptameren, die an Thrombin binden, als Arzneimittel zur Behandlung von Thrombosen.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das wenigstens einen der vorgenannten Nachteile des Standes der Technik überwindet. Insbesondere bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das eine gezielte Aktivierung des Hämostasesystems oder einzelner Komponenten des Hämostasesystems ermöglicht.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Aptamer-basiertes Reagens, umfassend:

– wenigstens ein an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität bindendes Aptamer, wobei wenigstens eine Base des Aptamers wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist; und
– wenigstens einen Linker am 5'-Ende, 3'-Ende, an einer der Nucleobasen und/oder am Ribosephosphatrückgrat des Aptamers, wobei der Linker wenigstens eine weitere photolabile Schutzgruppe und wenigstens eine Abgangsgruppe, zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül, aufweist.

Ein weiterer Gegenstand betrifft einen Aptamer-Zielmolekül-Komplex erhalten aus der Umsetzung des erfindungsgemäßen Aptamer-basierten Reagens mit einem Zielmolekül, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem Aptamer-basierten Reagens und dem Zielmolekül unter Abspaltung der Abgangsgruppe zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül ausbildbar ist, wobei das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend an der Hämostase beteiligte Zielmoleküle mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Es wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäßen Aptamer-basierten Reagenzien die überraschende Eigenschaft besitzen, nur geringe oder vernachlässigbare Toxizität aufweisen. Insbesondere wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäßen Aptamer-basierten Reagenzien eine ungezielte Freisetzung eines gebundenen Zielmoleküls verhindern oder zumindest deutlich vermindern können.
Unter dem Begriff "Reagens" ist im Sinne der Erfindung eine reaktive Spezies zu verstehen, die geeignet ist, eine kovalente Bindung mit einem Zielmolekül einzugehen. Unter dem Begriff "Aptamer-basiertes Reagens" ist im Sinne der Erfindung ein Aptamer zu verstehen, das eine photolabile Schutzgruppe aufweist und mit einem Linker umfassend eine photolabile Schutzgruppe und eine Abgangsgruppe zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit einem Zielmolekül, modifiziert ist.
Eine lediglich nicht-kovalente Bindung des Aptamers an ein Zielmolekül kann eine nicht ausreichende Stabilität aufweisen und/oder steht stets im Gleichgewicht mit einem Anteil von freiem Aptamer und freiem Zielmolekül, wodurch eine systemische Freisetzung des Zielmoleküls möglich ist. Dies kann beispielsweise im Fall, dass das Zielprotein Thrombin ist, welches eine Gerinnung auslöst, eine systemische Gerinnungsaktivierung hervorrufen.
In vorteilhafter Weise kann das Aptamer-basierte Reagens eine nicht kovalente photospaltbare Bindung und eine kovalente photospaltbare Bindung an ein Zielmolekül zur Verfügung stellen.
Der Vorteil der Aptamer-basierten Reagenzien ergibt sich insbesondere dadurch, dass diese ein Zielmolekül spezifisch über das Aptamer erkennen und nicht-kovalent binden können und das Aptamer-basierte Reagens zusätzlich kovalent an das Zielmolekül binden kann, wobei die kovalente Bindung über die eine kovalente Bindung an das Zielmolekül vermittelnde Gruppe des Aptamer-basierten Reagens ausgebildet wird. Eine kovalente Bindung des Aptamer-basierten Reagens an das Zielmolekül kann vermeiden, oder zumindest das Risiko vermindern, dass das Aptamer vom Zielmolekül dissoziiert und das Zielmolekül ungezielt im Körper freigesetzt wird. Dies ermöglicht, dass Aptamer-Zielmolekül-Komplexe systemisch verabreicht werden können.
Erfindungsgemäße Aptamer-basierte Reagenzien und Aptamer-Zielmolekül-Komplexe umfassen wenigstens eine photolabile Schutzgruppe an wenigstens einer Base des Aptamers und wenigstens eine weitere photolabile Schutzgruppe, die Teil des Linkers ist, mit dem das Aptamer mit dem Zielmolekül verbunden ist.
Die photolabile Schutzgruppe am Aptamer ermöglicht, dass sich das Aptamer nach deren Abspaltung umfaltet, und dadurch die Bindung des Aptamers an das Zielmolekül gelöst wird.
Der Vorteil der weiteren photolabilen Schutzgruppe am Linker liegt insbesondere darin, dass durch deren photoinduzierte Abspaltung die kovalente Bindung des Aptamers an das Zielmolekül ebenfalls spaltbar ist. Hierbei ist die Spaltung der nicht kovalenten Bindung und der kovalenten Bindung des Aptamer-Zielmolekül-Komplexes vorzugsweise gleichzeitig, beispielsweise in einem gemeinsamen photo- oder lichtinduzierten Spaltvorgang spaltbar.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Aptamer-basierten Reagenzien liegt darin, dass diese eine sichere Bindung des Aptamers an ein Zielmolekül zur Verfügung stellen können.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe liegt darin, dass diese eine systemische Verabreichung eines ansonsten aktiven Zielmoleküls oder Zielproteins in Form eines inaktiven Aptamer-Zielmolekül-Komplexes ermöglichen können.
Unter dem Begriff "Aptamer" sind im Sinne dieser Erfindung einzelsträngige Nukleinsäuren zu verstehen, die nicht kovalent an ein Zielmolekül, insbesondere Zielprotein binden.
Vorzugsweise bindet das Aptamer mit hoher Affinität und Spezifität an Bindungsbereiche des Zielmoleküls, die für das Zielmolekül einzigartig sind oder lediglich bei einer kleinen Gruppe von Zielmolekülen selektiv auftreten. Dies ermöglicht eine gezielte Beeinflussung der Funktion der Zielmoleküle, insbesondere eine Regulation deren Aktivität. Beispielsweise kann durch Bindung eines Aptamers eine Inhibition der Aktivität des Zielmoleküls erreicht werden, beispielsweise indem das katalytische Zentrum eines Enzyms sterisch inhibiert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Aptamer spezifisch für an der Hämostase beteiligte Zielmoleküle mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität. Zielmoleküle sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend thrombozytenaktivierende Phospholipide, thrombozytenaktivierende Nukleotide und/oder an der Hämostase beteiligte Proteine.
Ein bevorzugtes thrombozytenaktivierendes Phospholipid ist beispielsweise der Plättchenaktivierende Faktor (Platelet-activating factor, PAF). Bevorzugte thrombozytenaktivierende Nukleotide sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adenosintriphosphat (ATP) und/oder Adenosindiphosphat (ADP).
Vorzugsweise ist das Zielmolekül ein Zielprotein. Vorzugsweise ist das Aptamer spezifisch für ein an der Hämostase beteiligtes Zielprotein. Zielproteine sind vorzugsweise an der Hämostase insbesondere der Blutgerinnung beteiligte Proteine, insbesondere gerinnungsspezifische Proteine, bevorzugt Gerinnungsfaktoren.
Besonders bevorzugt ist das Aptamer spezifisch für an der Hämostase beteiligte Zielproteine ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

– gerinnungsaktive Serinproteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombin, aktivierter Faktor VII (FVIIa), aktivierter Faktor IX (FIXa) und/oder aktivierter Faktor X (FXa);
– Kofaktoren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gewebethromboplastin (TF) und Faktor Va (FVa) und/oder Faktor VIII (FVIIIa);
– Transglutaminasen wie aktivierter Faktor XIII (FXIIIa); und/oder
– fibrinolytische Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Plasmin und/oder gewebespezifischer Plasminogenaktivator (tissue-type plasminogen activator, t-PA).

Bevorzugte Zielproteine sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombin, aktivierten Faktor VII (FVIIa), Gewebethromboplastin (TF), aktivierter Faktor X (FXa), aktivierter Faktor IX (FIXa), aktivierter Faktor XI (FXIa), aktivierter Faktor XIII (FXIIIa), Kofaktor V (FVa) und/oder Kofaktor FVIII und/oder Plasmin.
Vorzugsweise ist das Aptamer spezifisch für Thrombin. Bevorzugte Aptamere sind entsprechend Thrombinaptamere. Weiter bevorzugt ist das Aptamer spezifisch für einen extrinsischen die Gerinnung aktivierenden Komplex aus Serinprotease Faktor VIIa (FVIIa) und Kofaktor Gewebethromboplastin (TF).
Aptamere mit den gewünschten Eigenschaften, insbesondere gewünschter Spezifität, können entsprechend üblichen Selektionsverfahren, beispielsweise dem so genannten SELEX^®(Systematic Evolution of Ligands by EX-ponential Enrichment)-Verfahren, beispielsweise beschrieben in US 5,475,096 , US 5,270,163 und EP 0 533 838 , auf die hiermit Bezug genommen wird, selektioniert werden. Insbesondere bevorzugt können Aptamere mit den gewünschten Eigenschaften mit einem modifizierten Verfahren, dem so genannten Counter-SELEX^®-Verfahren selektioniert werden. Weiterhin kann vorgesehen sein, Aptamere mit bekannter Struktur mit herkömmlichen Methoden der Nukleinsäuresynthese und/oder Vervielfaltigung herzustellen.
Geeignete Aptamere wirken vorzugsweise inhibitorisch auf das Zielmolekül oder Zielprotein, beispielsweise Thrombin. Ein Aptamer-Zielmolekül-Komplex umfasst entsprechend vorzugsweise ein Zielmolekül, das durch ein gebundenes inhibierendes Aptamer in inaktivierter Form vorliegt. Dies ermöglicht, dass Aptamer-Zielmolekül-Komplexe systemisch verabreicht werden können, ohne dass das Zielmolekül eine systemische Wirkung entfaltet. Dies kann beispielsweise bei der Verabreichung eines Thrombinaptamer-Thrombin-Komplexes vermeiden, dass eine systemische Blutgerinnung ausgelöst wird.
Geeignete Aptamere können eine Sequenzlänge im Bereich von ≥ 10 Basen bis ≤ 150 Basen, vorzugsweise im Bereich von ≥ 15 Basen bis ≤ 60 Basen, bevorzugt im Bereich von ≥ 20 Basen bis ≤ 30 Basen, aufweisen.
Ein Aptamer-basiertes Reagens weist wenigstens ein an ein Zielmolekül bindendes Aptamer auf. Vorzugsweise weist ein Aptamer-basiertes Reagens ein Aptamer oder zwei Aptamere, die spezifisch für ein Zielmolekül sind, auf. Es kann bevorzugt sein, dass ein Aptamer-basiertes Reagens mehrere gleiche oder verschiedene Aptamere aufweist, beispielsweise zwei gleiche oder verschiedene Aptamere, oder drei gleiche oder verschiedene Aptamere.
Beispielsweise kann das Aptamer-basierte Reagens ein weiteres Lokalisatormolekül, beispielsweise ein weiteres Aptamer und/oder einen spezifischen Antikörper aufweisen, das selektiv an bestimmte Zelloberflächen bindet, beispielsweise an Tumorgewebe. Dies kann den Vorteil zur Verfügung stellen, dass ein Aptamer-basiertes Reagens und/oder ein Aptamer-Zielmolekül-Komplex selektiv bestimmte Gewebe oder Organe erkennen und/oder binden kann.
Aptamere weisen wenigstens einen Sequenzabschnitt auf, der spezifisch an das Zielmolekül bindet. Verwendbare Aptamere sind vorzugsweise mit wenigstens einem Sequenzabschnitt modifiziert, der zu wenigstens einem spezifisch an das Zielmolekül bindenden Sequenzabschnitt des Aptamers komplementär ist, vorzugsweise mit einem Antisenseabschnitt. Dieser kann über Ausbildung einer Wechselwirkung zu dem spezifisch bindenden Sequenzabschnitt eine Umfaltung des Aptamers in eine inaktive Form bewirken.
Geeignete Modifikationen durch derartige Antisenseabschnitte ergeben sich aus der Sequenz des spezifisch an das Zielmolekül bindenden Sequenzabschnitts des Aptamers.
Ein Antisenseabschnitt kann am 5'- und/oder 3'-Ende oder innerhalb der Sequenz eingefügt sein. Vorzugsweise wird der Antisenseabschnitt am 5'-Ende der Sequenz eingefügt. Die Länge des Antisenseabschnitts ist variabel, vorzugsweise liegt die Länge im Bereich von ≥ 2 Basen bis ≤ 15 Basen, bevorzugt im Bereich von ≥ 4 Basen bis ≤ 8 Basen.
Eine Länge des Antisenseabschnitts im Bereich von ≥ 2 Basen bis ≤ 15 Basen kann insbesondere dazu führen, dass die Effizienz der Inaktivierung des Aptamers erhöht werden kann.
Wenigstens eine Base des Aptamers weist wenigstens eine photolabile Schutzgruppe auf, wobei die Basen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin und/oder Uracil. Vorzugsweise ist die wenigstens eine Base, die wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist, eine Base des Antisenseabschnitts des Aptamers.
In auch bevorzugten Ausführungsformen kann das Aptamer an ein bis 4 Basen, bevorzugt an 2 bis 3 Basen photolabile Schutzgruppen aufweisen, wobei eine Base eine bis drei photolabile Schutzgruppen, vorzugsweise wenigstens eine photolabile Schutzgruppe oder zwei photolabile Schutzgruppen aufweisen kann. Die Basen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanin, Cytosin, Adenin, Thymin und/oder Uracil können hierbei gleiche oder verschiedene photolabile Schutzgruppen aufweisende Basen sein. Die photolabilen Schutzgruppen können hierbei gleiche oder verschiedene photolabile Schutzgruppen sein. Vorzugsweise sind die Basen, die eine oder mehrere photolabile Schutzgruppen aufweisen, Basen des Antisenseabschnitts des Aptamers.
Die photolabile Schutzgruppe an der oder den Basen des Antisenseabschnitts können verhindern, dass der Antisenseabschnitt an die das Zielmolekül bindende Konfiguration bindet, und das Aptamer inaktivieren würde. Eine Abspaltung der photolabilen Schutzgruppe ermöglicht, dass der Antisenseabschnitt an die das Zielmolekül bindende Konfiguration bindet, und/oder eine Umfaltung des Aptamers bewirkt, und das Aptamer seine Fähigkeit an das Zielmolekül zu binden, verliert.
Vorzugsweise weist das Aptamer an wenigstens einer Cytosin-Base wenigstens eine photolabile Schutzgruppe auf. Vorzugsweise ist die photolabile Schutzgruppe an die NH₂-gruppe der Base gebunden. Weiter bevorzugt kann das Aptamer an wenigstens einer Cytosin-Base zwei photolabile Schutzgruppen aufweisen. Zwei photolabile Schutzgruppen an einer Cytosin-Base können den Vorteil zur Verfügung stellen, dass die Base eine stärkere sterische Veränderung aufweist. Eine verstärkte sterische Modifikation der Base kann vorteilhafter Weise dazu führen, dass eine Faltung des Aptamers in seine inaktive Form verstärkt verhindert oder zumindest verstärkt vermindert werden kann.
Weiter bevorzugt weist das Aptamer an wenigstens einer Adenin-Base wenigstens eine photolabile Schutzgruppe auf. Vorzugsweise ist die photolabile Schutzgruppe an die NH₂-gruppe des Adenins gebunden. Weiter bevorzugt kann das Aptamer an wenigstens einer Adenin-Base zwei photolabile Schutzgruppen aufweisen. Zwei photolabile Schutzgruppen an einer Adenin-Base können den Vorteil zur Verfügung stellen, dass das Adenin eine stärkere sterische Veränderung aufweist. Eine verstärkte sterische Modifikation des Adenins kann vorteilhafter Weise dazu führen, dass eine Faltung des Aptamers in seine inaktive Form verstärkt verhindert oder zumindest verstärkt vermindert werden kann.
Ein Aptamer kann eine DNA- oder eine RNA-Sequenz aufweisen. Vorzugsweise geeignete Aptamere weisen eine DNA-Sequenz auf. Weiterhin geeignet sind Aptamere, die eine Sequenz umfassend 2'-modifizierte RNA, beispielsweise 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'- Amino-modifizierte RNA aufweisen. Weiterhin können Aptamere 2'-modifizierte RNA, beispielsweise 2'-Fluor-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte Nukleotide aufweisen.
Geeignet sind weiterhin Aptamere, die eine DNA-Sequenz aufweisen, die eine oder mehrere 2'-modifizierte Ribonukleotide, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin aufweisen. Auch geeignet sind Aptamere, die eine oder mehrere 2'-modifizierte Desoxyribonukleotide, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Thymidin aufweisen.
Ein Vorteil der Verwendung von Motiven 2'-modifizierter RNA, insbesondere 2'-modifizierte Ribonukleotiden ausgewählt aus der Gruppe umfassend 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, insbesondere in einer eingefügten Antisense-Sequenz eines Aptamers mit DNA-Sequenz kann den Vorteil einer erhöhten Stabilität des Aptamers zur Verfügung stellen.
Vorzugsweise ist das Aptamer ein an Thrombin bindendes Aptamer. In bevorzugten Ausführungsformen weist das Aptamer folgende Sequenz SEQ ID NO: 1 gemäß der Formel (1) wie nachstehend angegeben auf:
5'-N₁N₂N₃N₄AACCN₅N₆N₇N₈GGTTGGTGTGGTTGG-3' (1) (SEQ ID NO: 1)
worin:
N₁, N₂, N₃, N₄ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion;
N₅, N₆, N₇, N₈ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion, oder N₅, N₆, N₇, N₈ sind jeweils eine Ethylenglykoleinheit oder eine Deletion.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen weist das Aptamer folgende Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß der Formel (2) wie nachstehend angegeben auf:
5'-GGTTGGTGTGGTTGGN₈N₇N₆N₅CCAAN₄N₃N₂N₁-3' (2) (SEQ ID NO: 2)
worin:
N₁, N₂, N₃, N₄ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion;
N₅, N₆, N₇, N₈ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion, oder N₅, N₆, N₇, N₈ sind jeweils eine Ethylenglykoleinheit oder eine Deletion.
"C" steht vorliegend entsprechend dem üblichen hier verwendeten Ein-Buchstaben-Code der Nukleotide für Cytidin, entsprechend stehen "A" für Adenosin, "G" für Guanosin und "T" für Thymidin.
Vorzugsweise weist das Aptamer ein Motiv N₁N₂N₃N₄ oder N₄N₃N₂N₁ am 5'- oder am 3'-Ende der Aptamersequenz auf. Es kann auch vorgesehen sein, dass das Aptamer an beiden Enden ein Antisense-Motiv aufweist.
Es kann vorgesehen sein, dass die Motive N₁N₂N₃N₄ oder N₄N₃N₂N₁ insgesamt eine Deletion ist, so dass an der Stelle der Motive N₁N₂N₃N₄ oder N₄N₃N₂N₁ keine Nukleotide vorhanden sein können.
In diesen Ausführungsformen des Aptamers ist vorzugsweise ein Sequenzabschnitt, der an den das Zielmolekül bindenden Sequenzabschnitt des Aptamers binden kann, bevorzugt ein Antisenseabschnitt, umfassend die Basen N₁N₂N₃N₄AACC am 5'-Ende oder ein Antisenseabschnitt umfassend die Basen CCAAN₄N₃N₂N₁ am 3'-Ende der Aptamersequenz eingefügt. N₁, N₂, N₃, N₄ können auch eine Deletion sein, so dass an den Positionen N₁, N₂, N₃ und/oder N₄ keine Nukleotide vorgesehen sein können. Die Länge des Sequenzabschnitts liegt im Bereich von ≥ 4 Basen bis ≤ 8 Basen, vorzugsweise im Bereich von ≥ 4 Basen bis ≤ 6 Basen. Eine Länge im Bereich von ≥ 4 Basen bis ≤ 8 Basen kann insbesondere dazu führen, dass die Effizienz der Inaktivierung des Aptamers erhöht werden kann.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des Aptamers der Sequenzen SEQ ID NO: 1 gemäß der Formel (1) und SEQ ID NO: 2 gemäß der Formel (2) ist:
N₁ Cytidin, und/oder
N₂ Adenosin, und/oder
N₃ Cytidin, und/oder
N₄ Cytidin.
In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens ist N₁ Cytidin, und N₂ ist Adenosin und N₃ ist Cytidin und N₄ ist Cytidin.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen des Aptamers der Sequenzen SEQ ID NO: 1 gemäß der Formel (1) und SEQ ID NO: 2 gemäß der Formel (2) ist:
N₅ ist Guanosin; und/oder
N₆ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Thymidin, vorzugsweise Cytidin; und/oder
N₇ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin und/oder Adenosin; und/oder
N₈ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adenosin und/oder Thymidin, vorzugsweise Adenosin.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass die Motive N₅N₆N₇N₈ oder N₈N₇N₆N₅ insgesamt eine Deletion sind, so dass an der Stelle der Motive N₅N₆N₇N₈ oder N₈N₇N₆N₅ keine Nukleotide oder Ethylenglycol-Einheiten vorhanden sein können.
Es ist bevorzugt, dass das Motiv N₅N₆N₇N₈, sofern es Nukleotide umfasst, ein Motiv GNRA ist, wobei N ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Thymidin, und R ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Guanosin und/oder Adenosin. Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Motiv N₅N₆N₇N₈ ein Motiv ausgewählt aus der Gruppe umfassend GCGA, GAAA und/oder GCAT aufweist.
Es ist weiter bevorzugt, dass das Motiv N₈N₇N₆N₅, sofern es Nukleotide umfasst, ein Motiv GNRA ist, wobei N ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Thymidin, und R ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Guanosin und/oder Adenosin. Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Motiv N₈N₇N₆N₅ ein Motiv ausgewählt aus der Gruppe umfassend GCGA, GAAA und/oder GCAT aufweist.
Vorzugsweise können die Motive N₅N₆N₇N₈ oder N₈N₇N₆N₅ im Bereich von 1 Ethylenglykol-Einheiten bis 4 Ethylenglykol-Einheiten aufweisen, bevorzugt im Bereich von 2 bis 3 Ethylenglykol-Einheiten. Vorzugsweise verwendbar sind lineare Ethylenglykol-Einheiten HO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH mit n ist eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 4, bevorzugt im Bereich von 0 bis 1.
In sehr bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens bilden N₅, N₆, N₇ und N₈ eine oder zwei Ethylenglykoleinheiten aus.
Ein Vorteil der Verwendung von Ethylenglykoleinheiten liegt darin, dass diese keine Wechselwirkung mit dem Aptamer ausbilden. Von Vorteil ist dabei insbesondere, dass die Aktivität des Aptamers durch einen Einbau von Ethylenglykoleinheiten nicht gegenüber der Aktivität des nicht-modifizierten Aptamers vermindert wird.
Ein Vorteil, der insbesondere durch ein Motiv N₅N₆N₇N₈ ausgewählt aus der Gruppe umfassend GCGA, GAAA, GCAT oder ein Motiv N₈N₇N₆N₅ ausgewählt aus der Gruppe umfassend GAAA und/oder GCAT und/oder eine oder zwei Ethylenglykoleinheiten zur Verfügung gestellt werden kann, ist, dass das Aptamer eine Aktivität aufweisen kann, die ebenso hoch wie die des nicht-modifizierten Aptamers ist, oder lediglich eine geringe Verringerung der Aktivität aufweist.
In weiter besonders bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens weist das Aptamer folgende DNA-Sequenz SEQ ID NO: 3 gemäß der Formel (3) wie nachstehend angegeben auf:
5'-AACCGAAAGGTTGGTGTGGTTGG-3' (3) (SEQ ID NO: 3),
wobei die Basen Cytosin und/oder Adenin an den Positionen 1, 2, 3 und/oder 4 der Sequenz mit einer oder zwei photolabilen Schutzgruppe(n) modifiziert sind.
Es ist bevorzugt, dass wenigstens eine der Basen Cytosin oder Adenin an den Positionen 1, 2, 3 und/oder 4 der Sequenz wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist. Es ist insbesondere bevorzugt, dass wenigstens eine der Basen Cytosin an den Positionen 3 und/oder 4 der Sequenz wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist. Weiter bevorzugt können zwei Basen Cytosin und/oder Adenin jeweils wenigstens eine gleiche oder unterschiedliche photolabile Schutzgruppe aufweisen. Besonders bevorzugt können die Basen Cytosin und/oder Adenin mit zwei gleichen oder unterschiedlichen photolabilen Schutzgruppe(n) modifiziert sein.
Ein Vorteil eines Aptamers der DNA-Sequenz gemäß der Formel (3) SEQ ID NO: 3, wobei die Basen Cytosin und/oder Adenin an den Positionen 1, 2, 3 und/oder 4 der Sequenz mit einer oder zwei photolabilen Schutzgruppe(n) modifiziert sind, ist, dass dieses nach photoinduzierter Abspaltung der photolabilen Schutzgruppe(n) eine spontane Umfaltung des Aptamers in eine inaktive Form zur Verfügung stellen kann.
In auch bevorzugten Ausführungsformen weist das Aptamer folgende Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß der Formel (4) wie nachstehend angegeben auf:
5'-N₉N₁₀N₁₁N₁ ₂TACCN₁₃N₁₄N₁₅N₁₆GGTTGGGCAGGTTGG-3' (4) (SEQ ID NO: 4)
worin:
N₉, N₁₀, N₁₁, N₁₂ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion;
N₁₃, N₁₄, N₁₅, N₁₆ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion, oder N₅, N₆, N₇, N₈ sind jeweils eine Ethylenglykoleinheit oder eine Deletion.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen des Aptamers der Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß der Formel (4) ist:
N₉ Cytidin, und/oder
N₁₀ Adenosin, und/oder
N₁₁ Cytidin, und/oder
N₁₂ Cytidin.
In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens ist N₉ Cytidin, und N₁₀ ist Adenosin und N₁₁ ist Cytidin und N₁₂ ist Cytidin.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen des der Sequenz SEQ ID NO: 4 gemäß der Formel (4) ist:
N₁₃ ist Guanosin; und/oder
N₁₄ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Thymidin, vorzugsweise Cytidin; und/oder
N₁₅ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin und/oder Adenosin; und/oder
N₁₆ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adenosin und/oder Thymidin, vorzugsweise Adenosin.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass das Motive N₉N₁₀N₁₁N₁₂ und/oder N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆ insgesamt eine Deletion sind, so dass an der Stelle der Motive Motive N₉N₁₀N₁₁N₁₂ und/oder N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆ keine Nukleotide oder Ethylenglykol-Einheiten vorhanden sein können.
Es ist bevorzugt, dass das Motiv N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆, sofern es Nukleotide umfasst, ein Motiv GNRA ist, wobei N ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Thymidin, und R ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Guanosin und/oder Adenosin. Es ist weiterhin bevorzugt, dass das Motiv N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆ ein Motiv ausgewählt aus der Gruppe umfassend GAAA, GCAT und/oder GTGA aufweist.
Vorzugsweise kann das Motiv N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆ im Bereich von 1 Ethylenglykol-Einheiten bis 4 Ethylenglykol-Einheiten aufweisen, bevorzugt im Bereich von 2 bis 3 Ethylenglykol-Einheiten. Vorzugsweise verwendbar sind lineare Ethylenglykol-Einheiten HO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH mit n ist eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis 4, bevorzugt im Bereich von 0 bis 1.
In sehr bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens bilden N₁₃, N₁₄, N₁₅ und N₁₆ eine oder zwei Ethylenglykoleinheiten aus.
Es ist bevorzugt, dass wenigstens eine der Basen Cytosin, Thymin oder Adenin an den Positionen 5, 6, 7 und/oder 8 der Sequenz (SEQ ID NO: 4) wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist. Es ist insbesondere bevorzugt, dass wenigstens eine der Basen Cytosin an den Positionen 7 und/oder 8 der Sequenz wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist. Weiter bevorzugt können zwei Basen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cytosin, Thymin und/oder Adenin jeweils wenigstens eine gleiche oder unterschiedliche photolabile Schutzgruppe aufweisen. Besonders bevorzugt können die Basen Cytosin und/oder Adenin mit zwei gleichen oder unterschiedlichen photolabilen Schutzgruppe(n) modifiziert sein.
Verwendbare Aptamere, die an Thrombin binden, sind beispielsweise offenbart in der Schrift WO 03/002592 , auf die in vollem Umfang Bezug genommen wird. Weiter verwendbare Aptamere, die an Faktor IXa oder Faktor VIIa binden, sind beispielsweise offenbart in Rusconi CP, Scardino E, Layzer J, Pitoc GA, Ortel TL, Monroe D, Sullenger BA. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa. Nature. 2002 Sep 5; 419(6902): 90–4; und Rusconi CP, Yeh A, Lyerly HK, Lawson JH, Sullenger BA. Blocking the initiation of coagulation by RNA aptamers to factor VIIa. Thromb Haemost. 2000 Nov; 84(5): 841–8.).
Es ist bevorzugt, dass bei einer Verwendung mehrerer photolabiler Schutzgruppen, diese gleich sind. Dies ermöglicht, die photolabilen Schutzgruppen mittels Bestrahlung einer Wellenlänge, vorzugsweise in einem Bestrahlungsvorgang abgespalten werden können.
Bevorzugte photolabile Schutzgruppen sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen gemäß der nachstehenden Formeln (I), (II), (III), (IV), (V) und/oder (VI):
worin:
R¹ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, Methyl, COOH und/oder CF₃;
R² ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H und/oder OCH₃, oder
beide Gruppen R² bilden gemeinsam -CH₂OCH₂- aus;
R³ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H und/oder Br;
R⁴ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend OH, OCH₃ und/oder N(CH₃)₂.
Ein besonderer Vorteil der photolabilen Schutzgruppen liegt darin, dass diese mittels UV-Strahlung und/oder Strahlung im Infrarot-Bereich von den Aptamer-Zielmolekül-Komplexen abspaltbar sind. Vorteilhafter Weise ermöglicht dies, die photolabilen Schutzgruppen abgespalten werden können, während sich die Aptamer-Zielmolekül-Komplexe im menschlichen Körper befinden, ohne dass die Strahlung eine Schädigung des Körpers verursacht. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass keine operativen Eingriffe oder Verabreichung von spaltenden Substanzen zur Abspaltung notwendig sind. Ein ganz besonderer Vorteil kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, dass eine strahlungsinduzierte Abspaltung eine gezielte und lokal begrenzbare Aktivierung des Aptamer-Zielmolekül-Komplexes in bestimmbaren Körpergeweben, -organen und/oder -bereichen ermöglicht.
Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass eine Bestrahlung für den Patienten schmerzfrei ist.
Beispielsweise ist die photolabile Schutzgruppe gemäß der Formel (I) mittels Strahlung im UVA-Bereich abspaltbar. Strahlung im UVA-Bereich kann den Vorteil zur Verfügung stellen, dass bei einer Bestrahlung des Körpers keine DNA-Schäden verursacht werden.
Besonders bevorzugte photolabile Schutzgruppen sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen gemäß der Formeln (II), (III), (IV), (V) und/oder (VI).
Ein besonderer Vorteil photolabiler Schutzgruppen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen gemäß der Formeln (II), (III), (IV), (V) und/oder (VI) liegt darin, dass diese Spaltprodukte ausbilden, die keine oder nur eine vernachlässigbare Toxizität aufweisen. Insbesondere sind diese Verbindungen in Arzneimitteln verwendbar, ohne dass toxische Nebenwirkungen aufgrund der Abspaltprodukte zu erwarten sind.
Vorteilhafterweise sind photolabile Schutzgruppen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen gemäß der Formeln (II), (III), (IV), (V) und/oder (VI) mittels Strahlung im Infrarot-Bereich abspaltbar. Strahlung im Infrarot-Bereich kann den Vorteil zur Verfügung stellen, dass eine höhere Eindringtiefe in das Gewebe ermöglicht wird. Dies ermöglicht, eine gezielte Abspaltung der photolabilen Schutzgruppen in tief liegenden Geweben und/oder Organen, beispielsweise im Magen oder Darm.
Bevorzugte Wellenlängen für die Photoaktivierung der photolabilen Schutzgruppe liegen im UV-A Bereich bis Infrarot-Bereich, vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich von 315 nm bis 1100 nm. Bevorzugt ist eine Wellenlänge im Bereich von 315 nm bis 400 nm, vorzugsweise im Bereich von 350 nm bis 380 nm, besonders bevorzugt ist eine Wellenlänge von 366 nm. Bevorzugt ist weiterhin eine Wellenlänge im Bereich von 670 nm bis 1100 nm. Besonders bevorzugt ist weiter ein Wellenlängenbereich von 670 nm bis 750 nm.
Vorteilhafter Weise liegt die Bestrahlungsdauer im Bereich von 10 Sekunden bis 1 Minute, vorzugsweise im Bereich von 10 Sekunden bis 30 Sekunden.
Erfindungsgemäße Aptamer-basierte Reagenzien umfassen neben dem an das Zielmolekül bindenden Aptamer wenigstens einen Linker, welcher wenigstens eine weitere photolabile Schutzgruppe und wenigstens eine Abgangsgruppe, zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül, aufweist
Vorzugsweise ist der Linker über eine kovalente Bindung mit dem 5'- oder 3'-Ende des Aptamers verbunden. Weiter vorzugsweise ist die photolabile Schutzgruppe über eine kovalente Bindung mit dem Linker verbunden. Weiter bevorzugt ist die Abgangsgruppe über eine kovalente Bindung mit der photolabilen Schutzgruppe verbunden.
Der Linker kann den Vorteil zur Verfügung stellen, dass die die kovalente Bindung an das Zielmolekül vermittelnde Abgangsgruppe des Aptamer-basierte Reagenziens nach einer Bindung des Aptamers in das Zielmolekül entropisch begünstigt mit dem Zielmolekül reagieren und dieses binden kann.
Vorteilhafter Weise ist der Linker im Blut löslich. Dies stellt den Vorteil zur Verfügung, dass nach der Abspaltung der an das Aptamer gebundene Linker über den Blutkreislauf aus dem Körper entfernbar ist.
In bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens ist der Linker ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polyethylenglykol(e), peptidische Linker und/oder unverzweigtes oder verzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes C₁-C₁₀₀-Alkyl.
Vorzugsweise weist ein Polyethylenglykol-Linker im Bereich von 1 Polyethylenglykol-Einheiten bis 100 Polyethylenglykol-Einheiten, bevorzugt im Bereich von 1 bis 25 Polyethylenglykol-Einheiten, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 4 Polyethylenglykol-Einheiten auf.
Vorzugsweise verwendbar für den Linker sind lineare Polyethylenglykol(PEG)-Einheiten HO-(CH₂CH₂O)_n-H, wobei n ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 100, bevorzugt im Bereich von 1 bis 25, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 4.
In bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens ist der Linker ein peptidischer Linker, wobei der peptidische Linker Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe umfassend Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Valin, Arginin, Histidin, Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Prolin, Cystein, Asparagin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und/oder Glutamin umfassen kann. Vorzugsweise sind die Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glycin, Alanin, Leucin, Valin, Isoleucin, Prolin und/oder Phenylalanin. Vorzugsweise umfasst der peptidische Linker β-Alanin-Einheiten.
Vorzugsweise umfasst der peptidische Linker im Bereich von 1 bis 24 Aminosäuren, bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 Aminosäuren, besonders bevorzugt im Bereich von 2 bis 4 Aminosäuren. Vorzugsweise umfasst der peptidische Linker im Bereich von 1 bis 12β-Alanin-Einheiten, bevorzugt 2 bis 4β-Alanin-Einheiten.
Vorzugsweise ist der Linker funktionalisiert, wobei der Linker bevorzugt Thiolgruppen und/oder Protease- und/oder Lipase-Schnittstellen aufweisen kann. Protease- und/oder Lipase-Schnittstellen können den Vorteil zur Verfügung stellen, dass der Linker durch Proteasen und/oder Lipasen spaltbar ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst der peptidische Linker Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 5) und/oder Gly-Phe-Ala-Leu (SEQ ID NO: 6).
In weiter bevorzugten Ausführungsformen des Aptamer-basierten Reagens ist der Linker eine unverzweigte oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte C₂-C₄₈-Alkylgruppe, bevorzugt C₆-C₂₄-Alkyl, besonders bevorzugt C₁₂-C₁₈-Alkyl. Vorzugsweise ist der Linker eine Alklgruppe -(CH₂)_n- wobei n ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 100, bevorzugt im Bereich von 2 bis 48, auch bevorzugt im Bereich von 6 bis 24, besonders bevorzugt im Bereich von 12 bis 18, ganz besonders bevorzugt ist n = 2, 6, 12 oder 18.
Vorzugsweise ist die eine kovalente Bindung an das Zielmolekül vermittelnde Abgangsgruppe ausgewählt aus der Gruppe N-Hydroxy-succinimid, N-Hydroxy-succinimid-Derivate, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sulfo-N-Hydroxy-succinimid- und/oder N-Hydroxy-succinimidester, insbesondere Pentafluorphenyl-, Imidazol-, Methyl-, Ethyl- und/oder Propylester, N-Hydroxy-phthalimid, N-Hydroxy-phthalimid-Derivate, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sulfo-N-Hydroxy-phthalimid und/oder N-Hydroxy-phthalimidester, insbesondere Pentafluorphenyl-, Imidazol-, Methyl-, Ethyl- und/oder Propylester.
Die Abgangsgruppen, insbesondere N-Hydroxy-succinimid und N-Hydroxy-phthalimid können den Vorteil zur Verfügung stellen, dass diese kovalente Bindung zwischen dem Aptamer und Amin- und/oder Hydroxy-Gruppen des Zielmoleküls oder Zielproteins ausbilden können, wobei die Abgangsgruppe abgespalten wird.
Vorzugsweise können kovalente Bindungen zu Amingruppen des N-Terminus und Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe umfassend Lysin, Threonin, Arginin, Serin, Tyrosin und/oder Cystein, vorzugsweise zu Lysin, ausgebildet werden.
Ein besonderer Vorteil liegt weiterhin darin, dass die Abgangsgruppen wie N-Hydroxy-succinimid und N-Hydroxy-phthalimid entfernbar sind, ohne dass Teile der Verbindung am Zielmolekül verbleiben und dessen Aktivität behindern oder gar verhindern würden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Aptamer-basierten Reagens weist die nachstehende allgemeine Formel (VII) auf:
wobei:
C^NPE die nachstehende Formel (IX)
aufweist.
Das Aptamer des Aptamer-basierten Reagens weist hierbei eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 auf.
Ein besonderer Vorteil der Aptamer-basierten Reagenzien, insbesondere beispielsweise des Aptamer-basierten Reagens gemäß der Formel (VII), ist die Fähigkeit, zum Zielmolekül eine kovalente Bindung über eine Carbamatfunktion herzustellen. Von besonderem Vorteil ist hierbei, dass nach Belichtung und Bindungsspaltung eine Decarboxylierung erfolgt, welche das unmodifizierte Zielmolekül freisetzt. Ein ganz besonderer Vorteil des Aptamer-basierten Reagens kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, dass ein unmodifiziertes Zielmolekül ohne verbleibende Reste des Aptamer-basierten Reagens an dem bestimmten Wirkungsort freigesetzt werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Aptamer-basierten Reagenzien, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.
Vorzugsweise sind Aptamer-basierte Reagenzien, insbesondere Thrombinaptamer-Reagenzien, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend kardiovaskuläre Erkrankungen und/oder Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, insbesondere als Blutgerinnungshemmer geeignet.
Ein weiterer Gegenstand betrifft einen Aptamer-Zielmolekül-Komplex erhalten aus der Umsetzung des erfindungsgemäßen Aptamer-basierten Reagens mit einem Zielmolekül, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem Aptamer-basierten Reagens und dem Zielmolekül unter Abspaltung der Abgangsgruppe zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül ausbildbar ist, wobei das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend an der Hämostase beteiligte Zielmoleküle mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Aptamer-Zielmolekül-Komplex umfassend:

– wenigstens ein erfindungsgemäßes Aptamer-basiertes Reagens, und
– ein kovalent gebundenes Zielmolekül,

Bevorzugte Zielmoleküle sind an der Hämostase beteiligte Zielproteine ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

– gerinnungsaktive Serinproteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombin, aktivierten Faktor VII (FVIIa), aktivierten Faktor IX (FIXa) und/oder aktivierten Faktor X (FXa);
– Kofaktoren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gewebethromboplastin (TF) und Faktoren Va (FVa) und/oder Faktor VIIIa (FVIIIa);
– Transglutaminasen wie aktivierten Faktor XIII (FXIIIa); und/oder
– fibrinolytische Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Plasmin und/oder gewebespezifischer Plasminogenaktivator (tissue-type plasminogen activator, t-PA).

Es wird hierbei für die Beschreibung des Zielmoleküls, des Aptamers, des Linkers, der photolabilen Schutzgruppen und des Aptamer-basierten Reagens in vollem Umfang auf die vorstehende Beschreibung Bezug genommen.
Ein besonderer Vorteil des Aptamer-Zielmolekül-Komplexes ergibt sich dadurch, dass aktive und/oder aktivierende Zielmoleküle, beispielsweise Gerinnungsaktivatoren wie Thrombin, durch erfindungsgemäße Aptamer-Zielmolekül-Komplexe in inhibierter Form verabreichbar und gezielt für eine lokal begrenzte Gerinnungsaktivierung verwendbar sind.
Der Aptamer-Zielmolekül-Komplex weist das Zielmolekül vorteilhafter Weise in nicht aktiver Form auf, indem dieses kovalent und nicht-kovalent an ein das Zielmolekül inhibierenden Aptamer-basiertes Reagenz gebunden ist. Eine kovalent und nicht-kovalente Bindung ist vorzugsweise im Sinne einer gleichzeitigen kovalenten und nicht-kovalenten Bindung zwischen Aptamer-basiertem Reagens und Zielmolekül zu verstehen.
Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexes liegt darin, dass dieser eine systemische Applikation bei gleichzeitig möglicher begrenzter lokaler Aktivierung der Wirksamkeit zur Verfügung stellen kann.
Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexes ergibt sich daraus, dass vorzugsweise keine systemischen Wirkungen des Zielmoleküls auftreten. Der erfindungsgemäße Aptamer-Zielmolekül-Komplex ist entsprechend systemisch nebenwirkungsarm oder sogar nebenwirkungsfrei verabreichbar.
Ein Vorteil des Aptamer-Zielmolekül-Komplexes ergibt sich insbesondere dadurch, dass das Zielmolekül spezifisch über das Aptamer nicht-kovalent gebunden ist und zusätzlich kovalent, wobei die kovalente Bindung über die eine kovalente Bindung an das Zielmolekül vermittelnde Abgangsgruppe des Aptamer-basierten Reagens ausgebildet ist.
Der Aptamer-Zielmolekül-Komplex ist vorteilhafter Weise photoaktivierbar, insbesondere ist das Zielmolekül photoinduziert freisetzbar.
Unter dem Begriff der "photoinduzierten" Freisetzung wird im Sinne dieser Erfindung verstanden, dass bei Bestrahlung mit geeigneter Wellenlänge, beispielsweise mit UV- oder IR-Strahlung das Zielmolekül aus dem Aptamer-Zielmolekül-Komplex freigesetzt wird und seine Aktivität aufnehmen kann.
Von besonderem Vorteil ist hierbei, dass die nicht-kovalente Bindung des Aptamers ebenso wie die kovalente Bindung an das Aptamer-basierte Reagens durch Bestrahlung mit geeigneter Wellenlänge lösbar ist. Das Zielmolekül ist beispielsweise durch Bestrahlung mit UV- oder IR-Strahlung in bestrahlten Geweben, Organen oder Regionen des Körpers gezielt freisetzbar, ohne dass an anderer Stelle systemisch verabreichter Aptamer-Zielmolekül-Komplex aktiviert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist beispielsweise eine lichtinduzierte Freisetzung von Thrombin aus einem Thrombin-Thrombinaptamerkomplex erzielbar.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist der Aptamer-Zielmolekül-Komplex die nachstehende allgemeine Formel (VIII) auf:
wobei:
C^NPE die nachstehende Formel (IX)
aufweist.
Die erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe sind entsprechend üblichen Methoden verabreichbar, beispielsweise durch eine orale Verabreichung oder durch Injektion. Bevorzugt ist eine Verabreichung mittels Injektion.
Ein weiterer Gegenstand betrifft die Verwendung der Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur photoinduzierten Freisetzung der Zielmoleküle, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend an der Hämostase beteiligte Zielmoleküle mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität, vorzugsweise an der Hämostase beteiligte Zielproteine ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

– gerinnungsaktive Serinproteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombin, aktivierten Faktor VII (FVIIa), aktivierten Faktor IX (FIXa) und/oder aktivierten Faktor X (FXa);
– Kofaktoren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gewebethromboplastin (TF) und Faktoren Va (FVa) und/oder Faktor VIIIa (F VIIIa);
– Transglutaminasen wie aktivierten Faktor XIII (FXIIIa); und/oder
– fibrinolytische Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Plasmin und/oder gewebespezifischer Plasminogenaktivator (tissue-type plasminogen activator, t-PA).

Vorteilhafter Weise sind die Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, deren pharmakologisch akzeptable Salze, Derivate und/oder Konjugate, zur Herstellung eines Arzneimittels verwendbar.
Von besonderem Vorteil ist hierbei, dass das Arzneimittel systemisch beispielsweise über Injektionen verabreichbar ist. Dieses kann selektiv in bestimmten Bereichen des Körpers durch Bestrahlung aktiviert werden.
Noch ein Gegenstand betrifft die Verwendung von Aptamer-Zielmolekül-Komplexen, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Tumorkrankungen, insbesondere solide maligne Tumore, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen und/oder Blutungen.
Solide maligne Tumore sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Karzinome, Sarkome und/oder Blastome, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend kolorektale Adenokarzinome, maligne Melanome und andere solide Tumore der Haut und Hautanhangsorgane, Lebermetastasen von malignen soliden Tumoren und Gallengangskarzinomen.
Kardiovaskuläre Erkrankungen können insbesondere thromboembolische Erkrankungen sein, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend akute periphere und zentrale arterielle und venöse Gefäßverschlüsse.
Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen können ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend hereditäre Blutgerinnungsstörungen vorzugsweise umfassend hämorrhagische und thrombophile Diathesen.
Blutungen können ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend perioperative Blutungen und spontane Organblutungen vorzugsweise umfassend mikrovaskuläre intra- und postoperative Blutungen bei chirurgischen Eingriffen in gefäßreichen Organen wie zum Beispiel in der Leber- und Gehirnchirurgie.
Beispielsweise sind Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, umfassend ein Zielprotein, dass eine Blutgerinnung auslösen kann, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend gerinnungsaktive Serinproteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombin, aktivierten Faktor VII (FVIIa), aktivierten Faktor IX (FIXa) und/oder aktivierten Faktor X (FXa); Kofaktoren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gewebethromboplastin (TF) und Faktoren Va (FVa) und/oder Faktor VIIIa (FVIIIa); Transglutaminasen wie aktivierten Faktor XIII (FXIIIa), zur Blutstillung, insbesondere als Hämostyptikum verwendbar. Vorteilhafter Weise sind insbesondere Thrombinaptamer-Thrombin-Komplexe als lokales Hämostyptikum verwendbar.
Vorteilhafter Weise sind Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, umfassend ein Zielmolekül, dass eine Blutgerinnung auslösen kann, zur kontrollierten und lokal begrenzten Gerinnungsaktivierung verwendbar.
Vorteilhafter Weise sind Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, umfassend ein Zielmolekül, dass eine Blutgerinnung auslösen kann, weiterhin zur homogenen Thrombosierung von kleineren oder größeren bestrahlten Gewebebereichen oder Gefäßbezirken verwendbar.
Von besonderem Vorteil ist, dass die erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe einen Verschluß von kleinen oder auch großen Körper- Gewebe-, oder Organbereiche, oder Gefäße erfolgreich auslösen können und eine Verwendung mit keinen oder nur sehr geringen systemischen Nebenwirkungen verbunden ist. Insbesondere können angrenzende Körper-Gewebe-, oder Organbereiche, oder Gefäße von einer durch die erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe ausgelösten Embolie verschont bleiben.
Vorteilhafter Weise sind die Aptamer-Zielmolekül-Komplexe weiterhin nach Operationen zur Blutstillung oder in der postoperativen Behandlung von Nachblutungen verwendbar, beispielsweise bei diffusen Blutungen oder nach endoskopisch unterstützen Operationen. Insbesondere können Blutungen durch eine lokale, gezielte Aktivierung der Aptamer-Zielmolekül-Komplexe durch Bestrahlung gestillt werden. Insbesondere wird die Möglichkeit eröffnet, eine Blutstillung in ausgewählten Geweben oder Organen herbeizuführen. So kann eine Blutstillung gezielt in Blutgefäßen erreicht werden. Insbesondere in kleinen Blutgefäßen und Mikrogefäßen ist dies von besonderem Vorteil, da diese anderen Behandlungsmöglichkeiten nur schwer zugänglich sind.
Beispielsweise können gastrointestinale Blutungen durch gezielte endoskopische Bestrahlung und dadurch induzierter Freisetzung von gerinnungsaktivierenden Zielmolekülen beispielsweise Thrombin in den betroffenen Arealen gestillt werden. Von Vorteil ist insbesondere, dass die Gerinnungsaktivierung auf die blutenden Gewebebezirke begrenzt werden kann.
Weiterhin sind Gefäßaneurysmen der zerebralen Zirkulation durch eine gezielte lokal begrenzte Aktivierung der Gerinnung in den betroffenen Blutgefäßen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe behandelbar. Insbesondere ermöglichen die systemisch verabreichbaren Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, dass diese über das Blut gehirngängig sein können und dort gezielt und lokal begrenzt aktivierbar sind.
Ein ganz besonderer Vorteil der Aptamer-Zielmolekül-Komplexe kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, dass diese die Behandlung von soliden Primärtumoren und Tumormetastasen durch eine gezielte Unterbrechung des tumorversorgenden Gefäßsystems ermöglichen. Die Effektivität ist dabei in vorteilhafter Weise nicht von der Tumorentität abhängig.
Insbesondere ermöglichen die erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, insbesondere umfassend ein Zielprotein, dass eine Blutgerinnung auslösen kann, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend gerinnungsaktive Serinproteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombin, aktivierten Faktor VII (FVIIa), aktivierten Faktor IX (FIXa) und/oder aktivierten Faktor X (FXa); Kofaktoren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gewebethromboplastin (TF) und Faktoren Va (FVa) und/oder Faktor VIIIa (FVIIIa); Transglutaminasen wie aktivierten Faktor XIII (FXIIIa), insbesondere Thrombinaptamer-Thrombin-Komplexe, Tumore versorgende Gefäße gezielt zu verschließen.
Von besonderem Vorteil ist, dass die erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe auch bei sehr großen Tumoren einen Verschluß oder Embolisierung des oder der versorgenden Gefäße erfolgreich auslösen können und eine Verwendung mit keinen oder nur sehr geringen systemischen Nebenwirkungen verbunden ist. Dies vermindert weiter deutlich das Blutungsrisiko bei einer operativen Entfernung von großen und gefäßreichen Tumoren.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, wird dadurch zur Verfügung gestellt, dass unerwünschte klinische Folgen von arteriellen oder venösen Thrombosen beispielsweise des umgebenden Gewebes durch ungezielte Aktivierung vermieden oder zumindest deutlich verringert werden können.
Weiterhin sind Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, wobei das Zielmolekül profibrinolytisch, beispielsweise Plasmin, oder antikoagulatorisch wirkt, zur Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe verwendbar. Insbesondere kann eine thrombusselektive Fibrinolyse erzielt werden und dadurch die Gefahr von Blutungskomplikationen als Folge einer systemischen fibrinolytischen Wirkung reduziert werden.
Weiterhin ist eine Behandlung von Varizen durch Aptamer-Zielmolekül-Komplexe, wobei das Zielmolekül eine Blutgerinnung induziert, beispielsweise Thrombin oder Faktor VIIa, möglich. Vorteilhafter Weise kann eine Behandlung von Varizen durch gezielte photoinduzierte Aktivierung auf die varikös veränderten Blutgefäße beschränkt werden. Von besonderem Vorteil ist hierbei, dass auch kleine Gefäße behandelbar sind.
Ein weitere Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel umfassend erfindungsgemäße Aptamer-Zielmolekül-Komplexe.
Wenn nicht anders ausgeführt, weisen die verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung auf, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und weiteren hier angegebenen Literaturangaben sind voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.
Beispiel 1
Herstellung eines Thrombinaptamer-basierten Reagens
Die Ausgangsverbindung 3-Ethyl-4-nitrophenol wurde hergestellt wie beschrieben in Chem. Commun. 1987, 753–755. Anschließend wurde die phenolische OH-Gruppe mit Toluol-4-sulfonsäure-2-(tert-butyl-diphenyl-silanyloxy)-ethylester (TBDPSOCH₂CH₂OTs) im Basischen zu tert-Butyl-[2-(3-ethyl-4-nitro-phenoxy)-ethoxy]-diphenyl-silan alkyliert und das Produkt durch säulenchromatographische Reinigung erhalten. Dann wurde tert-Butyl-[2-(3-ethyl-4-nitro-phenoxy)-ethoxy]-diphenyl-silan analog der entsprechenden Vorschrift aus J. Org. Chem. 1990, 55, 580–584 mit Triton B als Base und Paraformaldehyd in Dimethylsulfoxid (DMSO) unter Erhitzen zu 2-{5-[2-(tert-Butyl-diphenyl-silanyloxy)-ethoxy]-2-nitro-phenyl}-propan-1-ol umgesetzt, das durch anschließende chromatographische Reinigung erhalten wurde.
Zur Dimethoxytritylschützung wurde 2-{5-[2-(tert-Butyl-diphenyl-silanyloxy)-ethoxy]-2-nitro-phenyl}-propan-1-ol analog der entsprechenden Vorschrift aus Angew. Chem. 2005, 117, 475–477 in Pyridin suspendiert, Dimethoxytritylchlorid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. [2-(3-{2-[Bis-(4-methoxy-phenyl)-phenyl-methoxy]-1-methyl-ethyl}-4-nitro-phenoxy)-ethoxy]-tert-butyl-diphenyl-silan wurde nach säulenchromatographischer Aufreinigung erhalten. Zur Silylentschützung wurde [2-(3-{2-[Bis-(4-methoxy-phenyl)-phenyl-methoxy]-1-methyl-ethyl}-4-nitro-phenoxy)-ethoxy]-tert- butyl-diphenyl-silan anschließend analog der entsprechenden Vorschrift aus Chem. Eur. J. 2003, 9, 3353–3366 über Nacht mit Tetrabutylammoniumfluorid (Fluka) behandelt und anschließend säulenchromatographisch gereinigt.
Zum Aufbau des Phosphoramidites wurde das erhaltene 2-(3-{2-[Bis-(4-methoxy-phenyl)-phenyl-methoxy]-1-methyl-ethyl}-4-nitro-phenoxy)-ethanol analog der entsprechenden Vorschrift aus Angew. Chem. 2005, 117, 475–477 mit CEOPClNiPr₂ (Fluka) zur Reaktion gebracht. Nach wässriger Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung erhielt man Diisopropyl-phosphoramidsäure 2-(3-{2-[bis-(4-methoxy-phenyl)-phenyl-methoxy]-1-methyl-ethyl}-4-nitro-phenoxy)-ethylester 2-cyano-ethylester, welcher für eine Festphasensynthese zur Verfügung stand.
Diese wurde nach Standardbedingungen (Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., 2006, Appendix 3C) durchgeführt, wobei das Phosphoramidit des an Cytidin gebundenen Nitrophenylethyl (dCNPE) wie in Angew. Chem. 2006, 118, 6900–6902 beschrieben hergestellt und verwendet wurde.
Aus dem HPLC-gereinigten 2-(2-Nitrophenyl)-propan-1-ol-Vorläufer erhielt man das Aptamer-basierte Reagens gemäß der Formel (VII) schließlich durch Umsetzung mit Disuccinimidylcarbonat analog zur entsprechenden Vorschrift aus Chem. Eur. J. 2006, 12, 3655–3671 und anschließender Reinigung durch HPLC.
Beispiel 2
Herstellung eines Thrombinaptamer-Thrombin-Komplexes
Thrombin (Sigma, Cell Systems) wurde in 50 mM Borat Puffer pH 8,0 gelöst. Das Aptamer-basierte Reagens aus Beispiel 1 wurde im Überschuss zugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht wurde der Aptamer-Thrombin-Komplex gemäß Formel (VIII) durch Gelfiltration erhalten.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 03/002592 [0007, 0075]
- US 5475096 [0030]
- US 5270163 [0030]
- EP 0533838 [0030]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Rusconi CP, Scardino E, Layzer J, Pitoc GA, Ortel TL, Monroe D, Sullenger BA. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa. Nature. 2002 Sep 5; 419(6902): 90–4; und Rusconi CP, Yeh A, Lyerly HK, Lawson JH, Sullenger BA. Blocking the initiation of coagulation by RNA aptamers to factor VIIa. Thromb Haemost. 2000 Nov; 84(5): 841–8.) [0075]
- Chem. Commun. 1987, 753–755 [0146]
- J. Org. Chem. 1990, 55, 580–584 [0146]
- Angew. Chem. 2005, 117, 475–477 [0147]
- Chem. Eur. J. 2003, 9, 3353–3366 [0147]
- Angew. Chem. 2005, 117, 475–477 [0148]
- Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., 2006, Appendix 3C [0149]
- Angew. Chem. 2006, 118, 6900–6902 [0149]
- Chem. Eur. J. 2006, 12, 3655–3671 [0150]

Claims

Aptamer-basiertes Reagens umfassend: – wenigstens ein an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität bindendes Aptamer, wobei wenigstens eine Base des Aptamers wenigstens eine photolabile Schutzgruppe aufweist; und – wenigstens einen Linker am 5'-Ende, 3'-Ende, an einer der Nucleobasen und/oder am Ribosephosphatrückgrat des Aptamers, wobei der Linker wenigstens eine weitere photolabile Schutzgruppe und wenigstens eine Abgangsgruppe, zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül, aufweist.
Aptamer-basiertes Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer spezifisch ist für an der Hämostase beteiligte Zielproteine ausgewählt aus der Gruppe umfassend: – gerinnungsaktive Serinproteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Thrombin, aktivierter Faktor VII (FVIIa), aktivierter Faktor IX (FIXa) und/oder aktivierter Faktor X (FXa); – Kofaktoren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gewebethromboplastin (TF) und Faktor Va (FVa) und/oder Faktor FVIII (FVIIIa); – Transglutaminasen wie aktivierter Faktor XIII (FXIIIa); und/oder – fibrinolytische Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Plasmin und/oder gewebespezifischer Plasminogenaktivator (tissue-type plasminogen activator, t-PA).
Aptamer-basiertes Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer an ein bis 4 Basen, bevorzugt an 2 bis 3 Basen photolabile Schutzgruppen aufweist, wobei eine Base ein bis drei photolabile Schutzgruppen, vorzugsweise wenigstens eine oder zwei photolabile Schutzgruppen aufweisen kann.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer folgende Sequenz SEQ ID NO: 1 gemäß der Formel (1) wie nachstehend angegeben aufweist: 5'-N₁N₂N₃N₄AACCN₅N₆N₇N₈GGTTGGTGTGGTTGG-3' (1) (SEQ ID NO: 1) worin: N₁, N₂, N₃, N₄ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion; N₅, N₆, N₇, N₈ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion, oder N₅, N₆, N₇, N₈ sind jeweils eine Ethylenglykoleinheit oder eine Deletion.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer folgende Sequenz SEQ ID NO: 2 gemäß der Formel (2) wie nachstehend angegeben aufweist: 5'-GGTTGGTGTGGTTGGN₈N₇N₆N₅CCAAN₄N₃N₂N₁-3' (2) (SEQ ID NO: 2) worin: N₁, N₂, N₃, N₄ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion; N₅, N₆, N₇, N₈ sind gleich oder unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin, Thymidin, 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifiziertes Ribonukleotid ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Uridin, oder eine Deletion, oder N₅, N₆, N₇, N₈ sind jeweils eine Ethylenglykoleinheit oder eine Deletion.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass N₁ ist Cytidin, und/oder N₂ ist Adenosin, und/oder N₃ ist Cytidin, und/oder N₄ ist Cytidin.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass N₅ ist Guanosin; und/oder N₆ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin, Cytidin, Adenosin und/oder Thymidin, vorzugsweise Cytidin; und/oder N₇ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guanosin und/oder Adenosin; und/oder N₈ ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adenosin und/oder Thymidin, vorzugsweise Adenosin.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer folgende Sequenz SEQ ID NO: 3 gemäß der Formel (3) wie nachstehend angegeben aufweist: 5'-AACCGAAAGGTTGGTGTGGTTGG-3' (3) (SEQ ID NO: 3), wobei die Basen Cytosin und/oder Adenin an den Positionen 1, 2, 3 und/oder 4 der Sequenz mit einer oder zwei photolabilen Schutzgruppe(n) modifiziert sind.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die photolabile Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Verbindungen gemäß der nachstehenden Formeln (I), (II), (111), (IV), (V) und/oder (VI):
worin R¹ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H, Methyl, COOH und/oder CF₃; R² ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H und/oder OCH₃, oder beide Gruppen R² bilden gemeinsam -CH₂OCH₂- aus; R³ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend H und/oder Br; R⁴ ist gleich oder jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend OH, OCH₃ und/oder N(CH₃)₂.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge für die Photoaktivierung der photolabilen Schutzgruppe im UV-A Bereich bis Infrarot-Bereich liegt, vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich von 315 nm bis 1100 nm, bevorzugt in einem Wellenlängenbereich von 350 nm bis 380 nm, besonders bevorzugt in einem Wellenlängenbereich von 670 nm bis 750 nm, und/oder die Bestrahlungsdauer im Bereich von 10 Sekunden bis 1 Minute, vorzugsweise im Bereich von 10 Sekunden bis 30 Sekunden liegt.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Polyethylenglykol(e), peptidische Linker und/oder unverzweigtes oder verzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes C₁-C₁₀₀-Alkyl.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker lineare Polyethylenglykol(PEG)-Einheiten HO-(CH₂CH₂O)_n-H, wobei n ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 100, bevorzugt im Bereich von 1 bis 25, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 4, aufweist.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der peptidische Linker Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glycin, Alanin, Leucin, Valin, Isoleucin, Prolin und/oder Phenylalanin umfasst, vorzugsweise umfasst der peptidische Linker im Bereich von 2 bis 4 Aminosäuren, besonders bevorzugt umfasst der peptidische Linker Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 5) und/oder Gly-Phe-Ala-Leu (SEQ ID NO: 6).
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine unverzweigte oder verzeigte, gesättigte oder ungesättigte C₂-C₄₈-Alkylgruppe ist, bevorzugt C₆-C₂₄-Alkyl, besonders bevorzugt C₁₂-C₁₈-Alkyl.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die eine kovalente Bindung an das Zielprotein vermittelnde Abgangsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend N-Hydroxy-succinimid, N-Hydroxy-succinimid-Derivate, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sulfo-N-Hydroxy-succinimid- und/oder N-Hydroxy-succinimidester, insbesondere Pentafluorphenyl-, Imidazol-, Methyl-, Ethyl- und/oder Propylester, N-Hydroxy-phthalimid, N-Hydroxy-phthalimid-Derivate, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Sulfo-N-Hydroxy-phthalimid und/oder N-Hydroxy-phthalimidester, insbesondere Pentafluorphenyl-, Imidazol-, Methyl-, Ethyl- und/oder Propylester.
Aptamer-basiertes Reagens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer-basierte Reagens die nachstehende allgemeine Formel (VII) aufweist:
wobei: C^NPE die nachstehende Formel (IX)
aufweist.
Verwendung von Aptamer-basierten Reagenzien nach einem der vorherigen Ansprüche, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendung von Aptamer-basierten Reagenzien nach einem der vorherigen Ansprüche, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend kardiovaskuläre Erkrankungen und/oder Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen, insbesondere als Blutgerinnungshemmer.
Aptamer-Zielmolekül-Komplex, erhalten aus der Umsetzung des Aptamer-basierten Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 mit einem Zielmolekül, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem Aptamer-basierten Reagens und dem Zielmolekül unter Abspaltung der Abgangsgruppe zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül ausbildbar ist, wobei das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend an der Hämostase beteiligte Zielmoleküle mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität.
Aptamer-Zielmolekül-Komplex umfassend: – wenigstens ein Aptamer-basiertes Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 16, und – ein kovalent gebundenes Zielmolekül, wobei die kovalente Bindung zwischen dem Aptamer-basierten Reagens und dem Zielmolekül unter Abspaltung der Abgangsgruppe zur Herstellung einer kovalenten Verknüpfung mit dem Zielmolekül ausgebildet ist, wobei das Zielmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend an der Hämostase beteiligte Zielmoleküle mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität.
Aptamer-Zielmolekül-Komplex nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex die nachstehende allgemeine Formel (VIII) aufweist:
wobei: C^NPE die nachstehende Formel (IX)
aufweist.
Verwendung von Aptamer-Zielmolekül-Komplexen nach einem der vorherigen Ansprüche, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur photoinduzierten Freisetzung des Zielmoleküls ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend an der Hämostase beteiligte Zielmoleküle mit prokoagulatorischer, proaggregatorischer und/oder profibrinolytischer Aktivität.
Verwendung von Aptamer-Zielmolekül-Komplexen nach einem der vorherigen Ansprüche, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendung von Aptamer-Zielmolekül-Komplexen nach einem der vorherigen Ansprüche, deren pharmakologisch akzeptablen Salzen, Derivaten und/oder Konjugaten, zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Tumorkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Erkrankungen, die mit einer gestörten Blutgerinnung in Zusammenhang stehen und/oder Blutungen.
Arzneimittel umfassend Aptamer-Zielmolekül-Komplexe nach einem der vorherigen Ansprüche.