DE102007009131A1 - Macromolecule's presence detecting method, involves bringing aqueous medium into measuring volume, supplying measuring volume with electromagnetic wave with fixed frequency of preset Hertz via pair of electrodes, and measuring impedance - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum hochempfindlichen Nachweis des Vorhandenseins von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000 g/Mol, die in einem wässrigen Medium vorliegen.The The invention relates to a method for high-sensitivity detection the presence of macromolecules having a molecular weight of at least 1000 g / mol, which are present in an aqueous medium.
Aus
der
Die
Diese Vorrichtung eignet sich insbesondere gut für kleine Kationen und Anionen, während Makromoleküle aufgrund ihrer niedrigen Beweglichkeit und ihrer geringen Anzahl von Ladungen pro Masseneinheit hierfür wenig geeignet sind. Vor allem biologische Makromoleküle, die in der Praxis in der Regel in sehr geringen Mengen hochempfindlich nachgewiesen werden sollen, sind einer elektrischen Detektion kaum zugänglich. Andererseits dient die überwiegende Mehrzahl der kommerziell durchgeführten Kapillarelektrophoresen der Analyse von DNA.These Device is particularly well suited for small cations and anions, while macromolecules due to their low mobility and its small number of charges per Mass unit are less suitable for this purpose. Especially biological Macromolecules, which in practice usually in very small Quantities are to be detected highly sensitive, are an electrical Detection barely accessible. On the other hand, the vast majority serves Majority of commercially performed capillary electrophoreses the analysis of DNA.
Demnach liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zum hochempfindlichen Nachweis des Vorhandenseins von Makromolekülen, die ein Molekulargewicht von mindestens 1000 g/Mol aufweisen und die in einem wässrigen Medium vorliegen, vorzuschlagen, das die genannten Nachteile und Einschränkungen nicht aufweist. Insbesondere soll ein derartiges Verfahren eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu bekannten Verfahren aufweisen.Therefore It is the object of the present invention to provide a method for the highly sensitive detection of the presence of macromolecules, which have a molecular weight of at least 1000 g / mol and which are present in an aqueous medium, to propose which does not have the mentioned disadvantages and limitations. Especially should such a method a higher sensitivity have in comparison to known methods.
Diese Aufgabe wird durch die Schritte des Anspruchs 1 gelöst. Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.These The object is achieved by the steps of claim 1. The subclaims describe advantageous embodiments the invention.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum hochempfindlichen Nachweis des Vorhandenseins von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000 g/Mol, die in einem wässrigen Medium vorliegen, umfasst die nachfolgend im Einzelnen erläuterten Schritte a) bis e).The inventive method for highly sensitive Detecting the presence of macromolecules with a Molecular weight of at least 1000 g / mol, which in an aqueous medium be present, includes the below explained in detail Steps a) to e).
Zunächst wird gemäß Schritt a) das wässrige Medium, das die Makromoleküle enthält, in ein Probevolumen eingebracht.First is the aqueous medium according to step a), containing the macromolecules in a sample volume brought in.
Hieran anschließend werden gemäß Schritt b) die Makromoleküle, die sich im wässrigen Medium befinden, in Bruchstücke zerlegt. Das Zerlegen erfolgt entweder mittels eines Eintrags von Energie in das Probevolumen oder mittels einer Behandlung der Makromoleküle mit einem chemischen Agens, das sich zur Fragmentierung der betreffenden Makromoleküle eignet.thereto subsequently, according to step b) the macromolecules that are in the aqueous medium, disassembled into fragments. The disassembly is done either by means an entry of energy into the sample volume or by means of a Treatment of macromolecules with a chemical agent, that is the fragmentation of the macromolecules concerned suitable.
In einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt der Energieeintrag in das Probevolumen, indem das Probevolumen durch eine zweite elektromagnetische Welle mit einer Wellenlänge von 5 pm bis 1 mm, besonders bevorzugt mit einer Wellenlänge von 50 nm bis 100 μm, beaufschlagt wird.In In a preferred embodiment, the energy input into the Sample volume by passing the sample volume through a second electromagnetic wave with a wavelength of 5 pm to 1 mm, particularly preferred with a wavelength of 50 nm to 100 microns, applied becomes.
Hierfür eignen sich insbesondere
- – optische Frequenzen, einschließlich Ultraviolett und Infrarot,
- – Röntgenstrahlung mit einer Wellenlänge von 5 pm bis 10 nm,
- – Mikrowelle mit einer Frequenz von 0,3 GHz bis 300 GHz.
- - optical frequencies, including ultraviolet and infrared,
- X-radiation with a wavelength of 5 pm to 10 nm,
- - Microwave with a frequency of 0.3 GHz to 300 GHz.
Wird für die zweite elektromagnetische Welle eine Wellenlänge von 50 nm bis 100 μm gewählt, so wird hierfür in einer bevorzugten Ausgestaltung ein Laser, der Strahlung der betreffenden Wellenlänge erzeugt, eingesetzt.Becomes one wavelength for the second electromagnetic wave chosen from 50 nm to 100 microns, so will this In a preferred embodiment, a laser, the radiation of the wavelength generated used.
In einer alternativen Ausgestaltung erfolgt der Energieeintrag in das Probevolumen, indem das Probevolumen einer Wärmebehandlung unterzogen wird.In an alternative embodiment, the energy input into the Sample volume, adding the sample volume of a heat treatment is subjected.
In einer weiteren Ausgestaltung erfolgt der Energieeintrag in das Probevolumen, indem das Probevolumen mittels einer ionisierenden Strahlung, insbesondere Alpha-, Beta- oder Gammastrahlung, beaufschlagt wird.In In another embodiment, the energy input into the sample volume, by the sample volume by means of an ionizing radiation, in particular Alpha, beta or gamma radiation is applied.
Als chemisches Agens, das zur Fragmentierung der Makromoleküle in Frage kommt, eignen sich in erste Linie Katalysatoren oder Enzyme für das gewählte Makromolekül.When chemical agent responsible for the fragmentation of macromolecules is suitable, are primarily catalysts or enzymes for the chosen macromolecule.
In einer besonderen Ausgestaltung wird der Energieeintrag über die Zeit variiert, wodurch sich charakteristische Brüche für die betreffende Molekülsorte erzeugen lassen. Bei geeigneter Wahl des zeitlichen Verlaufs des Energieeintrags kann auf diese Weise ein Spektrum der Bruchstücke der untersuchten Molekülsorte erhalten werden.In a particular embodiment, the energy input is varied over time, which can generate characteristic breaks for the particular type of molecule. With a suitable choice of the time In the course of the energy input, a spectrum of the fragments of the examined type of molecule can be obtained in this way.
Danach wird gemäß Schritt c) das wässrige Medium, das die nachzuweisenden Bruchstücke der Makromoleküle enthält, in ein Messvolumen eingebracht, das ein Volumen von 10 fl bis 1 μl, bevorzugt von 10 pl bis 1 nl, besitzt.After that in step c), the aqueous medium, the fragments of the macromolecules to be detected contains, introduced into a measuring volume, which is a volume from 10 μl to 1 μl, preferably from 10 μl to 1 μl.
Hieran anschließend wird zumindest das Messvolumen, in dem sich das wässrige Medium mit den nachzuweisenden Bruchstücken der Makromoleküle befindet, gemäß Schritt d) mit einer ersten elektromagnetischen Welle einer festen Frequenz, für die ein Wert von 10 kHz bis 10 MHz gewählt wird, beaufschlagt.thereto then at least the measuring volume, in which the aqueous medium with the fragments to be detected the macromolecule is located, according to step d) with a first electromagnetic wave of a fixed frequency, for which is a value of 10 kHz to 10 MHz is applied.
Das Einbringen der ersten elektromagnetischen Welle in das Messvolumen erfolgt über ein oder mehrere Elektrodenpaare, die durch eine Isolationsschicht, deren Dicke vorzugsweise einen Wert von 0,1 μm bis 1 mm aufweist, vom wässrigen Medium getrennt angebracht sind. Hierbei liegt an den Elektrodenpaaren eine Messspannung an, die vorzugsweise eine Feldstärke des elektrischen Feldes im Messvolumen von 0,1 V/mm bis 100 kV/mm erzeugt.The Introducing the first electromagnetic wave into the measuring volume takes place via one or more pairs of electrodes passing through an insulating layer whose thickness is preferably a value of 0.1 μm to 1 mm, from the aqueous medium are attached separately. This is due to the electrode pairs a measuring voltage, preferably a field strength of the electric field in the measuring volume of 0.1 V / mm to 100 kV / mm generated.
In einer bevorzugten Ausgestaltung dient das Probevolumen gleichzeitig als Messvolumen. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung erfolgt hierbei zeitlich zuerst die Zerlegung der Makromoleküle gemäß Schritt b) und erst danach die Beaufschlagung des identischen Volumens mit einer elektromagnetischen Welle einer festen Frequenz gemäß Schritt d).In In a preferred embodiment, the sample volume serves simultaneously as measuring volume. In a particularly preferred embodiment, this takes place temporally first the decomposition of the macromolecules according to step b) and only then the admission of the identical volume with an electromagnetic wave of a fixed frequency according to step d).
Schließlich wird gemäß Schritt e) die Impedanz bei ein, zwei, drei oder auch mehr festen Frequenzen als Antwort des Systems aus den Bruchstücken der Makromoleküle und des wässrigen Mediums auf dessen Beaufschlagung mit der ersten elektromagnetischen Welle aufgenommen und ausgewertet.After all according to step e), the impedance at one, two, three or more fixed frequencies as the system response the fragments of the macromolecules and the aqueous Medium on its exposure to the first electromagnetic Wave recorded and evaluated.
Die zuvor erfolgte Zerlegung der Makromoleküle in Bruchstücke resultiert in höheren Leitfähigkeiten und damit niedrigeren Impedanzen, da im Vergleich zu den unzerlegten Makromolekülen die Bruchstücke eine höhere Beweglichkeit und eine größere An zahl von Ladungen pro Masseneinheit zum elektrischen Ladungstransport bereit stellen. Damit wird die Nachweisgrenze für Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von mindestens 1000 g/Mol erheblich erniedrigt.The Previous decomposition of macromolecules into fragments results in higher conductivities and thus lower impedances compared to the undecomposed macromolecules the fragments have a higher mobility and a larger number of charges per unit mass to provide electrical charge transport. This will be the Detection limit for macromolecules with a molecular weight of at least 1000 g / mol significantly reduced.
In einer besonderen Ausgestaltung werden hieran anschließend die Bruchstücke einer weiteren Analyse zugeführt. Aus den Größen der Bruchstücke lassen sich z. B. Rückschlüsse auf Bindungen im Makromolekül ziehen.In a particular embodiment will follow this the fragments are sent for further analysis. Leave from the sizes of the fragments z. B. conclusions about bonds in the macromolecule pull.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Makromoleküle in Form ihrer Bruchstücke elektrisch mit höherer Empfindlichkeit nachweisen. Dieser Nachweis kann z. B. am Ende einer Auftrennung der Makromoleküle, insbesondere bei DNA, mittels Kapillarelektrophorese erfolgen.With The process according to the invention can be macromolecules in the form of their fragments electrically higher Detect sensitivity. This proof can z. B. at the end of a Separation of macromolecules, especially in DNA by means Capillary electrophoresis done.
Der Nachweis erfolgt in Echtzeit, da der Detektor kurze Ansprechzeiten besitzt. Zur Vermeidung von elektrochemischen Wechselwirkungen mit den nachzuweisenden Bruchstücken der Makromoleküle erfolgt die Messung insofern kontaktlos, da die Elektrodenpaare so angeordnet sind, dass sie nicht in Kontakt mit dem wässrigen Medium treten können.Of the Detection takes place in real time as the detector has short response times has. To avoid electrochemical interactions with the fragments to be detected of the macromolecules takes place the measurement so far contactless, since the pairs of electrodes arranged so are that they are not in contact with the aqueous medium can occur.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.The Invention will be described below with reference to an embodiment explained in more detail.
Jeweils eine Lösung mit verschieden langen DNA-Fragmenten, die auch als DNA-Leiter bezeichnet wird, wurde als Probe bzw. als Referenzprobe druckgetrieben durch eine Kapillare in eine Messzelle zur kontaktlosen Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit bewegt.Each a solution with different length DNA fragments, the Also referred to as DNA ladder, was pressure-driven as a sample or as a reference sample through a capillary into a measuring cell for contactless determination the electrical conductivity moves.
Die Konzentration der eingesetzten DNA-Leiter betrug 0,5 μg/μl, was einer Verdünnung der DNA im Puffer von 1 zu 2000 entspricht.The Concentration of the DNA ladder used was 0.5 μg / μl, which corresponds to a dilution of the DNA in the buffer from 1 to 2000.
Um eine Erwärmung, die in der Kapillare durch Anlegen der Trennspannung an ein hoch leitfähiges Trenn-Gel bei der Trennung auftreten kann, zu simulieren, wurde die Kapillare mit der Probe beheizt, während in einem weiteren Versuch die Referenzprobe unbehandelt blieb.Around a warming in the capillary by applying the Separation voltage to a highly conductive separation gel in the Separation may occur, simulating the capillary with heated the sample, while in another experiment the Reference sample left untreated.
Bei einer Geometrie der Messzelle von 250 μm·50 μm·50 μm, entsprechend einem Volumen von 6,25·10–13 m3, wurde lediglich eine Energie von 2,6·10–6 J pro Erhöhung der Temperatur um 1 K benötigt, um die dort befindliche wässrige Lösung mit der Probe zu erwärmen.With a geometry of the measuring cell of 250 μm × 50 μm × 50 μm, corresponding to a volume of 6.25 × 10 -13 m 3 , only an energy of 2.6 × 10 -6 J was required per increase of the temperature by 1 K. to heat the aqueous solution there with the sample.
Zur Untersuchung wurden anschließend die DNA-Leitern mittels Gel-Elektrophorese jeweils in ihre Einzelfragmente aufgetrennt.to Subsequently, the DNA ladders were examined by means of Gel electrophoresis each separated into their individual fragments.
Im Vergleich zur unbehandelten Referenzprobe zeigte sich, dass in der wärmebehandelten Probe die Anzahl der Fragmente mit hoher Molekülmasse geringer war und die Anzahl der Fragmente mit geringerer Molekülmasse zunahm. Außerdem wurde ein durch die Wärmebehandlung neu entstandenes Fragment nachgewiesen.in the Comparison to the untreated reference sample showed that in the heat-treated sample the number of fragments with high Molecular mass was lower and the number of fragments with lower molecular weight increased. It was also a newly created by the heat treatment fragment demonstrated.
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