DE102007001347A1

DE102007001347A1 - Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen

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Publication number: DE102007001347A1
Application number: DE102007001347A
Authority: DE
Inventors: Susanne Dipl.-Biol. Dreyer; Udo Prof. Dr. Kragl
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2007-01-04
Filing date: 2007-01-04
Publication date: 2008-07-10

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen, das als Flüssig-Flüssig-Extraktion mit zwei nicht mischbaren Phasen durchgeführt wird. Als eine Phase im Zweiphasensystem wird erfindungsgemäß eine ionische Flüssigkeit (IL) verwendet. Vorzugsweise wird eine IL verwendet, die ein quarternäres Ammoniumkation umfasst, das mit mindestens einer Oligoethylenglykol-Einheit funktionalisiert ist. Die Verwendung der ionischen Flüssigkeit erfolgt bevorzugt in Kombination mit mindestens einem wasserlöslichen Salz oder mit einem inkompatiblen Polymer, vorzugsweise einem Dextran.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen, das als Flüssig-Flüssig-Extraktion mit zwei nicht mischbaren Phasen durchgeführt wird. Als eine Phase im Zweiphasensystem wird erfindungsgemäß eine ionische Flüssigkeit (IL) verwendet. Vorzugsweise wird eine IL verwendet, die ein quarternäres Ammoniumkation umfasst, das mit mindestens einer Oligoethylenglykol-Einheit funktionalisiert ist. Die Verwendung der ionischen Flüssigkeit erfolgt bevorzugt in Kombination mit mindestens einem wasserlöslichen Salz oder mit einem inkompatiblen Polymer, vorzugsweise einem Dextran.
Für die Entwicklung effizienter und ökonomischer Aufarbeitungsprozesse für Biomoleküle, wie z. B. Proteine und Enzyme ist die Etablierung einer aktivitätsschonenden Aufreinigungsmethode vonnöten. Der Einsatz organischer Lösungsmittel zur Extraktion hat bereits eine breite Anwendung in der organisch- und anorganisch-chemischen Industrie gefunden. In Hinblick auf die Verwendung organischer Lösungsmittel für die Extraktion von Proteinen/Enzymen stehen jedoch zum einen die häufig beobachtete Denaturierung der Biokatalysatoren durch das Lösungsmittel und zum anderen die stringenten Umwelt- und Sicherheitsregulationen einem technischen Einsatz im Wege. Aufgrund dessen haben sich in der Biotechnologie alternative Methoden zur Aufreinigung entwickelt. Die konventionellen Techniken für die Produktgewinnung wie z. B. Präzipitation und Säulenchromatographie sind jedoch nicht nur teuer, sondern resultieren oftmals auch in geringen Ausbeuten. Des Weiteren entstehen bei Fest-flüssig-Separationen durch Zentrifugation oder Filtration einige technische Schwierigkeiten wie Filter Fouling oder viskose Aufschlämmung. Daher besteht ein anhaltendes Interesse für die Etablierung neuer, schneller, kosteneffektiver, umweltfreundlicher und einfacher Auftrennungstechniken. Aufgrund dessen eröffnete die Entwicklung wässriger Zweiphasen-Systeme in der Mitte der fünfziger Jahre eine attraktive Alternative für die Separation von Biomolekülen, da sie die oben gestellten Anforderungen und Kriterien für industrielle, kompatible Arbeitsverfahren erfüllen. Wässrige Zweiphasen-Systeme werden zunehmend in Biochemie und Zellbiologie als biokompatibles Extraktionssystem eingesetzt^1-3. Das große Interesse an diesen wässrigen Systemen resultiert aus ihren einzigartigen Auftrennungs-Möglichkeiten und den milden Konditionen während des Separationsprozesses. Diese Eigenschaften machen das System sehr interessant für Industrie-Anwendungen im großen Maßstab.
Das wässrige Zweiphasen-System besteht üblicherweise aus zwei inkompatiblen Polymeren, z. B. Polyethylenglykol (PEG) und Dextran oder aus einem Polymer (PEG) und einer hohen Konzentration von Salz. Oberhalb kritischer Konzentrationen dieser Komponenten findet eine spontane Phasentrennung (Phänomen der „Inkompatibilität") statt. In den zwei entstehenden Phasen, die jeweils 70–90% Wasser enthalten, liegen die jeweiligen Komponenten in angereicherter Form vor. Eine Anwendung der Polymer-Salz-Systeme resultiert zwar ggf. in einer hohen Selektivität der Verteilung von Proteinen zwischen den Phasen, soll jedoch die Aufreinigung und Stabilisierung mit einer Enzymkatalysierten Reaktion gekoppelt werden, ergeben sich Probleme aus der geringen Löslichkeit bzw. Unlöslichkeit zahlreicher pharmazeutisch-interessanter Substrate im wässrigen Milieu sowie aus dem Auftreten unerwünschter Nebenreaktionen, welche durch die Verwendung organischer Lösungsmittel oftmals unterdrückt werden können.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, geeignete Verbindungen zu finden, die in einem geeigneten Verfahren zum einen die biokompatible Aufreinigung von Biomolekülen gestatten, zum anderen eine zusätzliche Stabilisierung dieser gewährleisten und darüber hinaus eine Erhöhung der Löslichkeit pharmazeutisch interessanter Substrate ermöglichen.
Die Aufgabe konnte mit einem Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen gelöst werden, das als Flüssig-Flüssig-Extraktion mit zwei nicht mischbaren Phasen durchgeführt wird, wobei erfindungsgemäß als ein Phasenbildner im Phasensystem eine ionische Flüssigkeit (IL) verwendet wird. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß eine IL verwendet, welche ein quarternäres Ammoniumkation umfasst, das mit mindestens einer Oligoethylenglykol-Einheit funktionalisiert ist. Unter Oligoethyleneinheiten werden im Sinne der Erfindung polymere Kettenlängen bis zu 100 Einheiten verstanden.
Als zweiter Phasenbildner werden vorzugsweise mindestens ein wasserlösliches Salz oder zur verwendeten IL inkompatible Polymere, wie z. B. Dextrane eingesetzt.
Unter ionischen Flüssigkeiten wird eine Stoffgruppe verstanden, die sehr gute Löslichkeiten für eine große Anzahl organischer, anorganischer und polymerer Substanzen besitzen. Sie wurden von Welton 1999 in Chem. Rev., 99, 2071–2083, als Salze definiert, welche bei Raumtemperatur flüssig sind. Darüber hinaus sind sie in der Regel nicht brennbar, nicht korrosiv und wenig viskos und zeichnen sich durch einen kaum nachzuweisenden Dampfdruck aus.
Geeignet sind im Sinne der Erfindung solche ionischen Flüssigkeiten, die in einer Gesamtkonzentration von 5 bis 95 Mol.-%, bevorzugt 5 bis 50 Mol.-% zu einer Veränderung des Trennfaktors der Zielkomponenten untereinander verschieden von eins führen.
Bevorzugt wird eine ionische Flüssigkeit verwendet, die ein Ammoniumkation mit der folgenden Formel I umfasst,
wobei
R = H oder CH₃
R¹ = -CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OH oder einen C₁ bis C₄-Alkylrest, vorzugsweise Methyl oder Ethyl,
R² = einen C₁ bis C₄-Alkylrest, vorzugsweise Methyl oder Ethyl,
R³ = einen C₁ bis C₄-Alkylrest, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, oder einen höheren Fettsäurerest, vzw. C₈ bis C₁₈, oder deren Gemische;
m und n = 4 bis 60 bedeuten.
Bevorzugte Anionen sind ausgewählt aus Halogenid (vorzugsweise Cl, F), Alkylsulfat (C₁ bis C₄), Nitrat, Tetrachloraluminat, Hexafluorphosphat, Dicyanamid, Saccharinat, Dihydrogenphosphat.
Insbesondere werden als ionische Flüssigkeiten Verbindungen verwendet, die Ammoniumkationen der allgemeinen Formel I umfassen, in denen mindestens einer der Reste R¹, R² oder R³ = Methyl ist und m und n = 4 bis 25 bedeuten.
Ganz besonders bevorzugt werden ionische Flüssigkeiten verwendet, die ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I umfassen, in der
R¹ = CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OH oder Ethyl;
R² = Methyl;
R³ = Ethyl oder einen gesättigten Fettsäurerest (C₈–C₁₈) oder deren Gemische und
m und n = 4 bis 25 bedeuten,
in Kombination mit Chlorid oder einem Methylsulfat-Anion.
Als besonders geeignete Verbindungen haben sich ionische Flüssigkeiten erwiesen, die

a) ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I umfassen, in der R = H, R¹ = CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OH; R² = Methyl; R³ = einen Cocos-Fettsäurerest und m und n = 4 bis 14 bedeuten, und die ein Methylsulfat-Anion aufweisen;
(Verbindung Ia) die
b) ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I umfassen, in der R = H; R¹ = CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OH; R² = Methyl; R³ = einen Cocos-Fettsäurerest und m und n = 14 bis 25 bedeuten, und die ein Chlorid-Anion aufweisen;
(Verbindung Ib) bzw. die
c) ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I umfassen, in der R = CH₃; R¹ = Ethyl; R² = Methyl; R³ = Ethyl und n = 5 bis 15 bedeuten, und die ein Chlorid-Anion aufweisen
(Verbindung Ic).

Als inkompatible Verbindungen zu den ionische Flüssigkeiten werden entweder Polymere, wie z. B. Dextrane oder Salze in hohen Konzentrationen eingesetzt.
Bevorzugt erfolgt die erfindungsgemäße Verwendung der ionischen Flüssigkeit in einer Ausführungsform der Erfindung in Kombination mit Kalium- oder Natriumsalzen, vzw. Kaliumsulfat, -phosphat, Dikaliumhydrogendphosphat und/oder Kaliumdihydrogenphosphat, oder Dinatriumhydrogendphosphat und/oder Natriumdihydrogenphosphat, Citrate, Natriumcarbonat.
Besonders bevorzugt erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren in einem Zweiphasen-System unter Verwendung einer o. g. ionischen Flüssigkeit mit einem Salzgemisch von Dikaliumhydrogendphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogendphosphat und Natriumdihydrogenphosphat.
Das Verfahren ist vorzugsweise weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Salz in einer Konzentration von 10 bis 40 Gew.-% bezogen auf die Gesamtkonzentration des Systems. Die ionische Flüssigkeit wird vorzugsweise in einer Gesamtkonzentration von 5 bis 95 Vol.-% bezogen auf das flüssige Medium eingesetzt, bevorzugt 5 bis 50 Vol.-%, besonders bevorzugt 10 bis 20 Vol.-%.
Die beiden nicht mischbaren Phasen IL:Salz werden bevorzugt in einem Gewichtsverhältnis eingesetzt, das 1:10 bis 10:1 beträgt, bevorzugt 1:1 bis 1:4. Die Temperatur liegt bevorzugt zwischen –10 und 120°C, vorzugsweise bei 4 bis 35°C.
Das erfindungsgemäß verwendete System mit den verwendeten definierten ionischen Flüssigkeiten als einem Phasenbildner ermöglicht die Verbesserung der Enzymanreicherung und -stabilität wesentlich.
So konnte überraschend festgestellt werden, dass sich im Vergleich zu klassischen Zweiphasensystemen bestehend aus PEG/Salzsystemen, das Protein nicht in der salzhaltigen Phase anreichert, sondern in der IL-Phase.
Es kommt zur Ausbildung eines Zweiphasen-Systems mit einer IL-angereicherten Oberphase und einer Salz-angereicherten Unterphase. Je nach Zusammensetzung des Systems findet eine Anreicherung des zu extrahierenden Proteins/Enzyms in der IL-haltigen Oberphase statt. Die ionische Flüssigkeit wirkt dabei stabilisierend oder aktivierend auf das Biomolekül und ggf. gleichzeitig als Löslichkeitsvermittler für schwer lösliche Substrate der enzymatischen Reaktion. Somit können die Aufarbeitung des gewünschten Enzyms und die durch dieses Enzym katalysierte Reaktion in einem Schritt kombiniert werden.
Alternativ wird eine erfindungsgemäß verwendete ionische Flüssigkeit vorzugsweise mit einem inkompatiblen Polymer, wie z. B. Dextran als weiterer Komponente eingesetzt. Das Dextran wird bevorzugt in einer Konzentration von 10–80 Gew.-% bezogen auf die Gesamtkonzentration verwendet. Die ionische Flüssigkeit wird vorzugsweise in einer Gesamtkonzentration von 5 bis 95 Vol.-% bezogen auf das flüssige Medium eingesetzt, bevorzugt 5 bis 50%. Die Temperatur liegt bevorzugt zwischen –10 und 120°C.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den großen Vorteil, dass es eine Steigerung der volumetrischen Aktivität auf bis zu ca. 400% im Vergleich zum einphasigen System bewirkt. Für einen industriellen Einsatz ist diese Größe von enormer Bedeutung.
Die Anwendung des Zweiphasen-Systems unter Verwendung der erfindungsgemäß verwendeten ionischen Flüssigkeit resultiert in einer hohen Selektivität der Verteilung von Proteinen zwischen den Phasen, und erlaubt die Extraktion eines angereicherten Produktes mit hohen Ausbeuten. Weiterhin kann unter Verwendung der ionischen Flüssigkeiten eine Erhöhung der Löslichkeit hydrophober Substrate erreicht werden.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass sich wesentlich die Anzahl an initialen Aufreinigungsschritten verringert und die Klärung, Konzentrierung und teilweise Aufreinigung in einem Schritt integriert. Des Weiteren sind Maßstabsvergrößerungen und kontinuierliche Betriebsweise mit stationärer oder instationärer Fahrweise mit dem vorliegenden wässrigen Zweiphasen-System einfach durchzuführen. Die Aufreinigung von Biokatalysatoren mit wässrigen Zweiphasen-Systemen erlaubt eine selektive Anreicherung im wässrigen System.
Im folgenden wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert ohne dass sie darauf beschränkt werden soll.
Beispiel 1
Proteinverteilung im wässrigen Zweiphasen-System
Folgendes System wurde eingesetzt:
Verbindung Ic als ionische Flüssigkeit;
ein Salzgemisch von Dikaliumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat; Rinderserum Albumin (BSA) diente als Standardprotein.
Mit der ionischen Flüssigkeit wurden die Proteinkonzentrationen über den Bradford-Test bestimmt. Bei Zugabe von 20% K₂HPO₄/KH₂PO₄ zu einer 10%igen Lösung der o. g. ionischen Flüssigkeit in Puffer bildete sich ein stabiles Zweiphasen-System aus, welches aus einer Oberphase besteht, in welcher die ionische Flüssigkeit angereichert ist, und aus einer Unterphase, in welcher sich das Salz anreichert. Für ein wässriges System dieser Zusammensetzung entsteht reproduzierbar ein Verhältnis der Ober- zur Unterphase von ca. 1:5 (21,4% Oberphase und 78,6% Unterphase). Untersuchungen in Bezug auf den Anteil der ionischen Flüssigkeit ergaben, dass die Oberphase zu ca. 36% aus der ionischen Flüssigkeit besteht. Dies entspricht einer Verteilung der ionischen Flüssigkeit zu 60,1% in die Oberphase und zu 39,9% in die Unterphase.

Zum Nachweis einer effizienten Anreicherung des Zielproteins in der IL-reichen Oberphase des Systems diente als Zielgröße die Ausbeute des Proteins in der Oberphase. Zur Untersuchung der Verteilung des Proteins auf die Ober- und Unterphase des Systems wurde die Zugabe des Standardproteins Rinderserum Albumin (BSA) untersucht. In den Versuchen konnte nachgewiesen werden, dass unter ausgewählten Bedingungen ein nahezu vollständiger Übergang des Proteins BSA in die IL-reiche Oberphase vorliegt. Es wurde eine Anreicherung bis zum 6-fachen der eingesetzten Proteinkonzentration erreicht. Tabelle 1: Verteilung des Proteins BSA im Zweiphasen-System mit 10% Verbindung Ic und 20% K₂HPO₄/KH₂PO₄

Proteinkonzentration im Gesamtansatz [μg/mL]	Proteinkonzentration in Oberphase [μg/mL]	Protein in Oberphase [%]	Anreicherungsfaktor [–]
2	12,3 ± 0,3	101,2 ± 2,4	6,1
4	25,3 ± 0,5	101,3 ± 1,9	6,3
6	36,2 ± 0,1	99,6 ± 0,1	6,0

Beispiel 2
Aktivität der LB-ADH in Gegenwart der ionischen Flüssigkeit gemäß Beispiel 1
Auswirkung der in Beispiel 1 genannten ionischen Flüssigkeit auf die Aktivität der Alkoholdehydrogenase von Lactobacillus brevis (LB-ADH)
Um die Aktivität des Enzyms über einen einfachen photometrischen Assay bestimmen zu können, wurde die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol durch die Alkoholdehydrogenase als Standardassay ausgewählt und der Verbrauch von NADPH bei 340 nm verfolgt gemäß folgendem Schema.
Schema: Durch LB-ADH katalysierte Reduktion von Acetophenon
Die Alkoholdehydrogenase wurde unter Zugabe verschiedener Konzentrationen der ionischen Flüssigkeit bei 30°C gelagert und die Aktivität über einen Zeitraum von 9 Tagen verfolgt. Die Lagerung des Enzyms bei 30°C unter Zusatz verschiedener Konzentrationen dieser ionischen Flüssigkeit führte zum einen zu einer Aktivitätserhöhung und zum anderen zu einer Stabilisierung des Enzyms. Die Zugabe von Verbindung Ic zur Lagerung der Alkoholdehydrogenase führte zu einer Steigerung der Ausgangsaktivität auf 125,4% nach Zugabe von 10% Verbindung Ic und auf 131,2% nach Zugabe von 30% Verbindung Ic. Weiterhin kann durch Zugabe dieser ionischen Flüssigkeit die Halbwertszeit des Enzyms stark erhöht werden (Tabelle 2). Tabelle 2: Halbwertszeiten der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis nach Zugabe der ionischen Flüssigkeit Verbindung Ic

Ionische Flüssigkeit [%] Halbwertszeit mit Verbindung Ic [d]

4°C 30°C

0 20,9 0,6

1 43,9 1,2

5 94,9 2,6

10 94,9 3,0

15 46,8 4,1

20 45,6 5,5

30 165,0 5,9
Beispiel 3
Verteilung der LB-ADH im wässrigen Zweiphasen-System

Verteilung der Alkoholdehydrogenase im wässrigen Zweiphasen-System unter Verwendung eines Zellextrakts von Escherichia coli, welcher zur rekombinanten Produktion der ADH aus Lactobacillus brevis zum Einsatz kommt. Tabelle 3: Wässriges Zweiphasen-System mit IL gemäß Beispiel 1 unter Zugabe eines Zellextraktes mit LB-ADH

Ansatz	Phase	Protein [%]	Aktivität [U/mL]	tot. Aktivität [U]	Restaktivität [%]	Vol. Aktivität [%]	spez. Aktivität [U/μg] Protein]
Zellextrakt	-	100	15,75	63,01	100	100	2,29
10% IL,	Oberphase	62,8	65,64	38,35	60,86	416,7	2,22
20% Salz	Unterphase	37,2	0	0	0	0	0
15% IL,	Oberphase	99,2	28,90	36,13	57,34	183,3	1,30
20% Salz	Unterphase	0,8	0	0	0	0	0
20% IL,	Oberphase	99,8	21,00	31,81	50,47	133,3	0,97
20% Salz	Unterphase	0,2	0	0	0	0	0
25% IL,	Oberphase	99,9	13,13	22,55	35,791	83,3	0,58
20% Salz	Unterphase	0,1	0	0	0	0	0
10% IL,	Oberphase	64,8	21,00	13,74	21,80	133,3	0,77
30% Salz	Unterphase	35,2	0	0	0	0	0
20% IL,	Oberphase	74,8	10,50	12,15	19,28	66,7	0,59
30% Salz	Unterphase	25,2	0	0	0	0	0
30% IL,	Oberphase	7,6	2,63	4,02	6,38	16,7	1,92
30% Salz	Unterphase	92,4	0	0	0	0	0

Die Ergebnisse verdeutlichen, dass das im Zellextrakt enthaltene Protein in Abhängigkeit von der gewählten Zusammensetzung des Systems nahezu vollständig in der IL-haltigen Oberphase wieder gefunden werden kann. Damit einher geht eine Steigerung der volumetrischen Aktivität auf bis zu 416% im Vergleich zum einphasigen System. Für einen industriellen Einsatz ist diese Größe von enormer Bedeutung.
Die Enzymaktivität konnte alleinig in der Oberphase nachgewiesen werden und es war möglich, im System mit 10% IL und 20% Salz 61% der eingesetzten totalen Aktivität in der Oberphase wiederzufinden.

Durch weitere Variation der Systemzusammensetzung können diese Ergebnisse weiter optimiert werden. So konnte für ein wässriges Zweiphasensystem der Zusammensetzung 11,3% Verbindung Ic und 19,2% Salz eine Erhöhung der spezifischen Aktivität auf 133% erreicht werden (Tabelle 4). Demzufolge ist eine selektive Extraktion der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis in die IL-haltige Oberphase möglich. Tabelle 4: Verteilung und Aktivität der LB-ADH in einem wässrigen Zweiphasensystem mit 11,3% Verbindung Ic und 19,2% Salz

Ansatz	Protein [%]	vol. Aktivität [U/mL]	tot. Aktivität [%]	spez. Aktivität [U/μg Protein]
0% IL/0% Salz	100 ± 0,3	32,8 ± 1,9	100 ± 1,2	1,8 ± 0,1
11,3% IL/19,2% Salz	49,7 ± 4,4^a	99,8 ± 3,7¹	67,1 ± 2,3^a	2,4 ± 0,1^a

¹ Angaben für die IL-haltige Oberphase des Systems

Beispiel 4
Erhöhung der Löslichkeit von Acetophenon
Um zu untersuchen, ob ein löslichkeitsvermittelnder Effekt durch die ionische Flüssigkeit Verbindung Ic ermöglicht und somit für die durch LB-ADH katalysierte Reaktion verwendet werden kann, wurden unterschiedliche Konzentrationen der ionischen Flüssigkeit in Wasser bzw. in dem zur Enzymreaktion verwendeten Kaliumphosphatpuffer gelöst und anschließend Acetophenon als zweite Phase hinzugegeben. Die Ansätze wurden schüttelnd über 24 h inkubiert und anschließend die Konzentration des Acetophenon in der wässrigen Phase mittels HPLC bestimmt. Der löslichkeitsvermittelnde Effekt der ionischen Flüssigkeit Verbindung Ic wird aus 1 deutlich ersichtlich. Nach Zugabe von 70% v/v der ionischen Flüssigkeit sind bereits 1,75 mol/L Acetophenon in Wasser gelöst. Oberhalb dieser Konzentration der ionischen Flüssigkeit ist es nicht mehr möglich, durch Zugabe von Acetophenon eine Phasenseparation zu erhalten. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass unter Verwendung des Kaliumphosphat-Puffers eine weitere Steigerung der Löslichkeit des Acetophenons im wässrigen Milieu erreicht werden kann. So liegen bei Zugabe von 70% v/v der ionischen Flüssigkeit Verbindung Ic bereits 1,93 mol/L Acetophenon in Puffer gelöst vor. Bei Anwendung eines wässrigen Zweiphasensystems mit 10% Verbindung Ic und 20% Salz sind in der Oberphase ca. 36% der ionischen Flüssigkeit enthalten. Demzufolge kann in dieser Phase die Löslichkeit des Substrates Acetophenon von 0,038 mol/L (im wässrigen Puffer) auf ca. 0,16 mol/L (in Anwesenheit von 36% der Verbindung Ic) angehoben werden.
Literatur:

1 ALBERTSSON, P. A. (1956): Chromatography and partition of cells and cell fragments. Nature, 177, 771–774
2 ALBERTSSON, P. A., ANDERSSON, B., LARSSON, C., AKERLUND, H. E. (1982): Phase partition--a method for purification and analysis of cell organelles and membrane vesicles. Methods Biochem. Anal., 28, 115–150
3 WALTER, H., BROOKS, D. E., FISHER, D. (1987): Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology. Orlando: Academic Press

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Welton 1999 in Chem. Rev., 99, 2071–2083 [0007]
- ALBERTSSON, P. A. (1956): Chromatography and partition of cells and cell fragments. Nature, 177, 771–774 [0036]
- ALBERTSSON, P. A., ANDERSSON, B., LARSSON, C., AKERLUND, H. E. (1982): Phase partition--a method for purification and analysis of cell organelles and membrane vesicles. Methods Biochem. Anal., 28, 115–150 [0036]
- WALTER, H., BROOKS, D. E., FISHER, D. (1987): Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology. Orlando: Academic Press [0036]

Claims

Verfahren zur Extraktion von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass es als Flüssig-Flüssig-Extraktion mit zwei nicht mischbaren Phasen durchgeführt wird, wobei als eine Phase im Zweiphasensystem eine ionische Flüssigkeit (IL) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeit eine Verbindung verwendet wird, die ein quarternäres Ammoniumkation umfasst, das mit mindestens einer Oligoethylenglykol-Einheit funktionalisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeit eine Verbindung verwendet wird, die ein Ammoniumkation mit der folgenden Formel I umfasst,
wobei R = H oder CH₃ R¹ = -CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OH oder einen C₁ bis C₄-Alkylrest, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, R² = einen C₁ bis C₄-Alkylrest, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, R³ = einen C₁ bis C₄-Alkylrest, vorzugsweise Methyl oder Ethyl, oder einen höheren Fettsäurerest, vzw. C₈ bis C₁₈, oder deren Gemische; m und n = 4 bis 60 bedeuten; und ein Anion ausgewählt aus Halogenid (vorzugsweise Cl, F), Alkylsulfat (C₁ bis C₄), Nitrat, Tetrachloraluminat, Hexafluorphosphat, Dicyanamid, Saccharinat, Dihydrogenphosphat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeiten Verbindungen eingesetzt werden, die Ammoniumkationen der allgemeinen Formel I umfassen, in denen mindestens einer der Reste R¹, R² oder R³ = Methyl ist und m und n = 4 bis 25 bedeuten.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeit ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I eingesetzt wird, in der R¹ = CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OH oder Ethyl; R² = Methyl; R³ = Ethyl oder einen gesättigten Fettsäurerest (C₈–C₁₈) oder deren Gemische und m und n = 4 bis 25 bedeuten, in Kombination mit Chlorid oder einem Methylsulfat-Anion.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeit eine Verbindung eingesetzt wird, die ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I umfasst, in der R = H, R¹ = CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OH; R² = Methyl; R³ = einen Cocos-Fettsäurerest und m und n = 4 bis 14 bedeuten, sowie ein Methylsulfat-Anion.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeit eine Verbindung eingesetzt wird, die ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I umfasst, in der R = H; R¹ = CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂-)_m-OR' mit R' = H; R² = Methyl; R³ = einen Cocos-Fettsäurerest und m und n = 14 bis 25 bedeuten, sowie ein Chlorid-Anion.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als ionische Flüssigkeit eine Verbindung eingesetzt wird, die ein Ammoniumkation der allgemeinen Formel I umfasst, in der R = CH₃; R¹ = Ethyl; R² = Methyl; R³ = Ethyl und n = 5 bis 15 bedeuten, sowie ein Chlorid-Anion.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit in Kombination mit mindestens einem wasserlöslichen Salz als zweiter Phase eingesetzt wird, vorzugsweise mit Kalium- oder Natriumsalzen, vzw. Kaliumsulfat, -phosphat, Dikaliumhydrogendphosphat und/oder Kaliumdihydrogenphosphat, oder Dinatriumhydrogendphosphat und/oder Natriumdihydrogenphosphat, Citrate, Natriumcarbonat.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz als Gemisch von Dikaliumhydrogendphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat oder Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz in einer Konzentration von 10 bis 40 Gew.-% bezogen auf das Gesamtsystem eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit in einer Gesamtkonzentration von 5 bis 95 Vol.-% bezogen auf das flüssige Medium eingesetzt wird, bevorzugt 5 bis 50 Vol.-%, besonders bevorzugt 10 bis 20 Vol.-%.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden nicht mischbaren Phasen IL:Salz in einem Gewichtsverhältnis eingesetzt werden, das 1:10 bis 10:1 beträgt, bevorzugt 1:1 bis 1:4.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur zwischen –10 und 120°C liegt, vorzugsweise bei 4 bis 35°C.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit in Kombination mit einem inkompatiblen Polymer, vorzugsweise Dextran als zweiter Phase eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Dextran in einer Konzentration von 10 bis 80 Gew.-% bezogen auf die Gesamtkonzentration eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die ionische Flüssigkeit in einer Gesamtkonzentration von 5 bis 95 Vol.-% bezogen auf das flüssige Medium eingesetzt wird, bevorzugt 5 bis 50 Vol.-%.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur zwischen –10 und 120°C liegt.