DE102006048693A1

DE102006048693A1 - Inhibition der PDE2A

Info

Publication number: DE102006048693A1
Application number: DE102006048693A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr. Ellinghaus; Andreas Dr. Wilmen; Martin Dr. Hendrix; Adrian Dr. Tersteegen
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2006-10-14
Filing date: 2006-10-14
Publication date: 2008-04-17
Also published as: CA2666355A1; WO2008043461A3; EP2124955A2; JP2010506561A; US20100035882A1; WO2008043461A2

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von PDE2A-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, akutem Myokardinfarkt, Myokardinfarktprophylaxe, Herzinsuffizienz, sowie Bluthochdruck und den Folgen der Atherosklerose sowie Gefäßerkrankungen, Erkrankungen der Niere, insbesondere Nierenversagen, entzündlichen Erkrankungen, Erektionsstörungen und Verhinderung des plötzlichen Herztodes.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von PDE2A-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzerkrankungen, insbesondere der Herzinsuffizienz und ihr zugrunde liegende Kardiomyopathien wie die dilatative Kardiomyopathie (DCM), die restriktive Kardiomyopathie (RCM), die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVCM), die Myokarditis und insbesondere die hypertrophische Kardiomyopathie (HCM). Darüber hinaus ist die Behandlung von Erektionsstörungen, Bluthochdruck und die Verhinderung der Arteriosklerose mit PDE2A Inhibitoren Gegenstand der Erfindung.
Die arterielle Hypertonie schädigt neben Gehirn, Nieren und Gefäßen vor allem auch das Herz. Vor Einführung der antihypertensiven Therapie war die arterielle Hypertonie die Hauptursache von Herzinsuffizienz und Myokardinfarkt. Auch heute noch ist das Risiko, herzinsuffizient zu werden und einen Herzinfarkt zu erleiden, selbst für einen antihypertensiv behandelten Hypertoniker größer als für einen Normotoniker. Die linksventrikuläre Hypertrophie ist der prinzipielle strukturelle Anpassungsmechanismus des Myokards an die chronische Druckbelastung im Verlauf der arteriellen Hypertonie. Das Ausmaß der Myokardhypertrophie nimmt mit der Höhe des Blutdruckes zu.
Im Frühstadium der arteriellen Hypertonie ist die systolische Wandspannung – die linksventrikuläre Nachlast – infolge der systolischen Druckbelastung, die auf der Ventrikelwand lastet, erhöht. Durch die sich entwickelnde Linksherzhypertrophie kommt es wieder zu einer Normalisierung der Wandspannung infolge Dickenzunahme der Myokardwände. In diesem Frühstadium der konzentrischen Linksherzhypertrophie ist der linke Ventrikel in der Lage, ein normales Herzzeitvolumen bei einem normalen kardialen Energieverbrauch pro Gewichtseinheit Myokard trotz hypertensiver systolischer Blutdruckwerte zu fördern. Bereits in diesem Stadium besteht eine Störung der diastolischen Funktion des linken Ventrikels.
Eine chronische Druckbelastung des linken Ventrikels führt zu einer abnormen Aktivierung fetaler Wachstumsfaktoren, die die Proteinbiosynthese und fetale Muskelgenprodukte verändern. Angiotensin II, Noradrenalin und andere Wachstumshormone haben eine wachstumsfördernde Wirkung auf das Myokard. Durch diese kommt es unabhängig von der systolischen Druckbelastung zu einer weiteren Stimulation der Entwicklung der Myokardhypertrophie. Abhängig vom Ausmaß der Wachstumshormone kann unter Umständen eine für die Blutdruckerhöhung überproportionale Myokardhypertrophie entstehen, die einer hypertrophen Kardiomyopathie ähnlich ist. Infolge der Tatsache, daß das adulte Myokardgewebe aufgrund der Blockade des Zellzyklus wenig oder gar nicht mehr zur Zellteilung fähig ist, resultiert auf molekularer Ebene eine pathologische Hypertrophiereaktion des Myokards. Eine Herzhypertrophie ist kein physiologischer Anpassungs mechanismus an die chronische Dauerbelastung. Sie ist ein eigenständiger Risikofaktor für kardiale Ereignisse wie Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz und plötzlicher Herztod [1].
Therapieverfahren und Wirkstoffe, die die Herzhypertrophie verhindern sind somit zur Behandlung von Symptomen der oben genannten Erkrankungen geeignet.
Die DNA-Sequenz, die für die humane PDE2A kodiert, wird im Sequenzprotokoll in der SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz der humanen PDE2A wird in der SEQ ID NO: 2 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Wie in 1 gezeigt, wurde überraschenderweise in einem zellulären Hypertrophie-Modell beobachtet, dass die Expression der PDE2A-mRNA bei Induktion der Hypertrophie erhöht wird. Hierzu wurde der Ratten-Kardiomyozyten-Zellinie H9c2 (ATCC-Nummer: CRL-1446) durch Arginin-Vasopressin ein Hypertrophie-Stimulus versetzt, der sich u. a. in einer erhöhten Expression von Markergenen für die Herzhypertrophie wie ANP (atriales natriuretisches Peptid) und MYHCB (myosin heavy chain beta-subunit) äußert [2]. Eine erhöhte Expression der cGMP-hydrolysierenden PDE2A kann den intrazellulären cGMP-Spiegel der Kardiomyozyten erniedrigen und dadurch die antihypertrophe Wirkung von cGMP supprimieren [3, 4]. Aus der vorliegenden Beobachtung kann abgeleitet werden, dass die erhöhte Expression der PDE2A in hypertrophen H9c2-Zellen auch in vivo zur Pathogenese der Herzhypertrophie beiträgt, und eine Inhibition der PDE2A-Aktivität durch ein „small molecule drug" einen positiven Effekt auf die Herzhypertrophie hat, da der cGMP-Spiegel in den Kardiomyozyten hoch und somit die anti-hypertrophe Wirkung von cGMP erhalten bleibt [5]. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden H9c2-Zellen mit Arginin-Vasopressin stimuliert und mit dem PDE2-Inhbitor BAY 60-7550 [6] inkubiert. Bei BAY 60-7550 handelt es sich um die Substanz 2-(3,4-Dimethoxybenzyl)-7-[1-(1-hydroxyethyl)-4-phenylbutyl]-5-methylimidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-one mit der Strukturformel:
Wie in 2 gezeigt, kann der PDE2A-Inhibitor BAY 60-7550 den Anstieg des Hypertrophie-Markergens MYHCB dosis-abhängig supprimieren. Zur Verifizierung, dass die Inkubation der H9c2-Zellen mit dem PDE2A-inhbitor BAY 60-7550 auch zur Erhöhung des intrazellulären cGMP-Spiegels führt und hierdurch antihypertroph wirkt, wurde der intrazelluläre cGMP-Gehalt nach Stimulation der cGMP-Synthese durch ANP in Gegenwart des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550 mittels EIA bestimmt. Wie in 3 zu erkennen, erhöht BAY 60-7550 dosis-abhängig den intrazellulären cGMP-Gehalt in H9c2-Zellen. Zur Verifizierung der in vitro-Befunde wurde die antihypertrophe Wirkung des PDE2-Inhibitors BAY 60-7550 in vivo in einem Maus-Hypertrophie-Modell untersucht. Hierzu wurde Mäusen vom Stamm C57BL6 einmal täglich 2 mg/kg Isoprenalin subkutan appliziert sowie als Positivkontrolle zusätzlich zum Isoprenalin 10 mg/kg Enalapril über das Trinkwasser verabreicht. BAY 60-7550 wurde parallel zur Isoprenalin-Injektion 2x täglich mit einer Dosis von 10 mg/kg i. p. appliziert. Wie aus 4 zu erkennen, erhöht die Infusion von Isoprenalin das Herzgewicht der Tiere in Relation zum Körpergewicht. Ebenso wie die Positivkontrolle Enalapril führte die Gabe des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550 in beiden Dosisgruppen zu einer deutlichen Verringerung des Verhältnisses von Herzgewicht zu Körpergewicht.
Aus den Daten ergibt sich, das eine PDE2A-Inhibition auch beim Menschen eine Herzhypertrophie verhindern könnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von PDE2A-Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der Prophylaxe der folgenden Krankheiten: koronare Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, akuter Myokardinfarkt, Myokardinfarktprophylaxe, plötzlicher Herztod, Herzinsuffizienz, sowie Bluthochdruck und die Folgen der Atherosklerose, sowie Gefäßerkrankungen, Erkrankungen der Niere, und Erektionsstörungen.
Antagonisten im Sinne der Erfindung sind alle Substanzen, die eine Inhibition der biologischen Aktivität der PDE2A bewirken. Besonders bevorzugte Antagonisten sind Nukleinsäuren inklusive „locked nucleic acids", „peptide nucleic acids" und „Spiegelmere", Proteine inklusive Antikörper und niedermolekulare Substanzen, ganz besonders bevorzugte Antagonisten sind niedermolekulare Substanzen.
Die Erfindung betrifft:

1. Verwendung eines PDE2A Polypeptides oder einer Nucleinsäure, welche ein PDE2A Polypeptid kodiert in einem Testsystem für die Auffindung von Inhibitoren der PDE2A geeignet für die Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz und der ihr zugrunde liegenden Kardiomyopathien. Bei einer Nukleinsäure, die ein PDE2A-Polypeptid kodiert, handelt es sich um eine Nukleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 sowie funktionelle Fragmente derselben umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz sowie funktionelle Fragmente derselben umfassen;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche die biologische Funktion einer PDE2A aufweisen, wobei man eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen in einer wässrigen Lösung, die 0,2 × SSC (1 × standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68°C durchführt (Sambrook et al., 1989); und
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden. Ein PDE2A Polypeptid im Sinne der Erfindung ist ein Polypeptid, welches von einer der unter a)–d) genannten Nukleinsäuren kodiert wird. Insbesondere ist ein Polypeptid umfassend die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 oder umfassend ein Fragment derselben, welches PDE2A-Aktivität aufweist, ein PDE2A Polypeptid.
2. Verwendung gemäß Punkt 1, wobei es sich um ein zellfreies Testsystem handelt.
3. Verwendung gemäß Punkt 1, wobei es sich um ein Testsystem unter Verwendung ganzer Zellen, die eine Nukleinsäure enthalten, welche eine PDE2A kodiert. Dabei kann die Nukleinsäure endogen vorhanden oder rekombinant eingebracht worden sein.
4. Verwendung gemäß Punkten 1–3, wobei eine PDE2A Aktivität gemessen wird.
5. Verwendung gemäß Punkt 4, wobei der cGMP bzw der GMP Spiegel gemessen wird.
6. Verwendung gemäß Punkten 1–3, wobei die Expression der PDE2A gemessen wird.
7. Verwendung gemäß Punkten 1–6, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelöste Herzinsuffizienz handelt, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
8. Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels einer der Verfahren gemäß Punkten 1–7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
9. Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels einer der Verfahren gemäß Punkten 1–7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
10. Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense-Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
11. Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense-Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM). Eine siRNA ist eine „short interfering RNA". Dem Fachmann sind Methoden bekannt, PDE2A spezifische antisense-Oligonukleotide, Antikörper oder siRNAs bereit zu stellen. Geeignete antisense-Oligonukleotide, siRNAs oder Antikörper führen letztendlich zu einer Inhibition der PDE2A Aktivität. Dies kann über einen Mechanismus erfolgen, der direkt das PDE2A Protein involviert, oder aber auf Ebene der Transkription oder Translation der PDE2A ansetzt.
12. Verwendung von PDE2A-Inhibitor zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
13. Verwendung gemäß Punkt 12, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardio myopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
14. Verwendung nach Punkten 12 oder 13, wobei der PDE2A-Inhibitor einen IC₅₀-Wert von weniger als 1 μM hat.
15. Verwendung nach Punkten 12 oder 13, wobei der PDE2A-Inhibitor einen IC₅₀-Wert von weniger als 100 nM hat.

Die PDE2A-Inhibition kann z.B. im unten beschriebenen PDE2A-Inhibitionstest gemessen werden.
Dabei werden solche PDE2A-Antagonisten bevorzugt, die im unten angegebenen PDE2A-Inhibitionstest mit einem IC₅₀ von 1 μM, bevorzugt mit einem IC₅₀ von weniger als 0,1 μM inhibieren.
Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen PDE2A-Inhibitoren die Blut/Hirn Schranke nicht passieren und wirken systemisch und nicht zentral.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
worin
R¹ Phenyl, Naphthyl, Chinolinyl oder Isochinolinyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy, Halogen, Cyano, -NHCOR⁸, -NHSO₂R⁹, -SO₂NR¹⁰R¹¹, -SO₂R¹², und -NR¹³R¹⁴ substituiert sein können, bedeutet,
worin
R⁸, R¹⁰, R¹¹, R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl sind, und
R⁹ und R¹² unabhängig voneinander (C₁-C₄)-Alkyl sind,
oder
R¹⁰ und R¹¹ zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol-1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-1-yl- oder Morpholin-1-yl-Rest bilden,
oder
R¹³ und R¹⁴ zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol-1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-1-yl- oder Morpholin-1-yl-Rest bilden,
R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Fluor bedeuten,
R⁴ (C₁-C₄)-Alkyl bedeutet,
R⁵ (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet,
R⁶ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,
R⁷ Phenyl, Thiophenyl, Furanyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy, Halogen und Cyano substituiert sein können, oder (C₅-C₈)-Cycloalkyl bedeutet,
L Carbonyl oder Hydroxymethandiyl bedeutet, und
M (C₂-C₅)-Alkandiyl, (C₂-C₅)-Alkendiyl oder (C₂-C₅)-Alkindiyl bedeutet,
und deren physiologisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
(C₁-C₄)-Alkyl und (C₁-C₃)-Alkyl stehen im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 bzw. 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, i-, s-, t-Butyl. Bevorzugt sind Methyl und Ethyl.
(C₂-C₅)-Alkandiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkandiylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt Ethylen, Propan-1,3-diyl, Propan-1,2-diyl, Propan-2,2-diyl, Butan-1,3-diyl, Butan-2,4-diyl, Pentan-2,4-diyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger (C₂-C₅)-Alkan-1,ω–diyl-Rest. Beispielsweise seien genannt Ethylen, Propan-1,3-diyl, Butan-1,4-diyl, Pentan-1,5-diyl. Besonders bevorzugt sind Propan-1,3-diyl und Butan-1,4-diyl.
(C₂-C₅)-Alkendiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkendiylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt Ethen-1,2-diyl, Ethen-1,1-diyl, Propen-1,1-diyl, Propen-1,2-diyl, Prop-2-en-1,3-diyl, Propen-3,3-diyl, Propen-2,3-diyl, But-2-en-1,4-diyl, Pent-2-en-1,4-diyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger (C₂-C₅)-Alken-1,ω-diyl-Rest. Beispielsweise seien genannt Ethen-1,2-diyl, Prop-2-en-1,3-diyl, But-2-en-1,4-diyl, But-3-en-1,4-diyl, Pent-2-en-1,5-diyl, Pent-4-en-1,5-diyl. Besonders bevorzugt sind Prop-2-en-1,3-diyl, But-2-en-1,4-diyl und But-3-en-1,4-diyl.
(C₂-C₅)-Alkindiyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkindiylrest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt Ethin-1,2-diyl, Ethin-1,1-diyl, Prop-2-in-1,3-diyl, Prop-2-in-1,1-diyl, But-2-in-1,4-diyl, Pent-2-in-1,4-diyl. Bevorzugt ist ein geradkettiger (C₂-C₅)-Alken-1,ω-diyl-Rest. Beispielsweise seien genannt Ethin-1,2-diyl, Prop-2-in-1,3-diyl, But-2-in-1,4-diyl, But-3-in-1,4-diyl, Pent-2-in-1,5-diyl, Pent-4-in-1,5-diyl. Besonders bevorzugt sind Prop-2-in-1,3-diyl, But-2-in-1,4-diyl und But-3-in-1,4-diyl.
(C₁-C₄)-Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielsweise seien genannt: Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, t-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy. Bevorzugt sind Methoxy und Ethoxy.
(C₅-C₈)-Cycloalkyl steht im Rahmen der Erfindung für Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl. Bevorzugt seien genannt: Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cyclohepyl.
Halogen steht im Rahmen der Erfindung im allgemeinen für Fluor, Chlor, Brom und Jod. Bevorzugt sind Fluor, Chlor und Brom. Besonders bevorzugt sind Fluor und Chlor.
Als Salze sind im Rahmen der Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen können Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Stoffe mit Mineralsäuren, Carbonsäuren oder Sulfonsäuren sein. Besonders bevorzugt sind z.B. Salze mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure oder Benzoesäure.
Als Salze können aber auch Salze mit üblichen Basen genannt werden, wie beispielsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- oder Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- oder Magnesiumsalze) oder Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen wie beispiels weise Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Dihydroabietylamin, 1-Ephenamin oder Methyl-piperidin.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Erfindung betrifft sowohl die Enantiomeren oder Diastereomeren oder deren jeweilige Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.
Bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei R¹ Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy und -SO₂NR¹⁰R¹¹ substituiert sind, bedeutet, und R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R¹⁰, R¹¹, L und M die oben angegebene Bedeutung haben zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Unter den meta- und para-Positionen des Phenylringes sind diejenigen Positionen zu verstehen, die meta bzw. para zur CR²R³-Gruppe stehen. Diese Positionen können durch die folgende Strukturformel (Ic) veranschaulicht werden:
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (Ic), in welchen die para- und eine meta-Position des Phenylrestes substituiert sind, und die zweite meta-Position unsubstituiert ist zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Ebenso bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei R⁷ Phenyl bedeutet und R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, L und M die oben angegebene Bedeutung haben zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
wobei
R¹ Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy und -SO₂NR¹⁰R¹¹ substituiert sind, Naphthyl oder Chinolinyl bedeutet,
worin R¹⁰ und R¹¹ unabhängig voneinander Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl sind,
R¹ und R² Wasserstoff bedeuten,
R⁴ Methyl oder Ethyl bedeutet,
R⁵ Methyl bedeutet,
R⁶ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,
L Carbonyl oder Hydroxymethandiyl bedeutet, und
M geradkettiges (C₂-C₅)-Alken-1,ω-diyl, geradkettiges (C₂-C₅)-Alken-1,ω-diyl oder geradkettiges (C₂-C₅)-Alkin-1,ω-diyl bedeutet zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Ebenso bevorzugt ist die Verwendung der Substanz 2-(3,4-Dimethoxybenzyl)-7-[1-(1-hydroxyethyl)-4-phenylbutyl]-5-methylimidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-one mit der Strukturformel:
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz.
Bevorzugt ist auch die oben beschriebene Verwendung der oben offenbarten Strukturformeln, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
Die vorgehend beschriebenen Verbindung, ihre Wirkung als PDE2-Inhibitoren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus WO 02/050078 A1 bekannt.
Beschreibung der Figuren:

1: Vergleich der relativen Expression der PDE2A-RNA in H9c2-Zellen nach 72 h Inkubation mit 1 micromol Arginin-Vasopressin. Dargestellt ist die Expression der PDE2A relativ zu L32 ribosomal Protein (rE) in H9c2-Rattenkardiomyozyten. Die Ergebnisse sind tabellarisch dargestellt (Mittelwert der relativen Expression rE aus einer Dreifachbestimmung. Mittelwert der Ct-Werte für PDE2A und L32).

	Ctr-PDE2A	Ctr-L32	rE	MW	STABW
Control	29,35	17,35	160,90	159,73	12,15
Control	29,47	17,35	147,03
Control	29,48	17,01	171,25
Vasopressin 1 μM	30,89	16,31	584,07	613,64	228,15
Vasopressin 1 μM	32,38	16,23	401,71
Vasopressin 1 μM	31,14	16,55	855,13

2: Relative Expression des Hypertrophiemarkers MYHCB in H9C2-Ratten-Zellen nach Stimulation durch Vasopression ± PDE2A-Inhibitor BAY 60-7550.

Dargestellt ist die Expression von ANP und MYHCB relativ zu L32 ribosomalem Protein in H9C2-Zellen nach 72 h Inkubation mit Vasopressin (0,1 micromol, 1 micromal, 10 micromol). Es zeigt sich, dass die gleichzeitige Gegenwart des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550 dosis-abhängig die Induktion des Hypertrophiemarkers MYHCB durch Vasopressin supprimiert. Folgend sind die Ergebnisse tabellarisch aufgelistet. (Mittelwert der relativen Expression rE aus einer Doppelbestimmung).

	Ctr-MYHCB	Ctr-L32	rE	MW	STABW
Control	34,99	16,07	0,53
Control	34,77	15,69	0,47	0,50	0,03
Vasopressin 1 μM	30,01	16,29	19,43
Vasopressin 1 μM	30,21	16,12	15,03	17,23	2,20
Vasopressin 1 μM + 0,1 μM BAY 60-7550	31,97	17,14	9,00
Vasopressin 1 μM + 0,1 μM BAY 60-7550	30,46	16,45	15,89	12,44	3,44
Vasopressin 1 μM + 1 μM BAY 60-7550	32,76	17,16	5,28
Vasopressin 1 μM + 1 μM BAY 60-7550	31,12	16,68	11,79	8,54	3,26
Vasopressin 1 μM + 10 μM BAY 60-7550	32,72	16,91	4,56
Vasopressin 1 μM + 10 μM BAY 60-7550	33,75	17,34	3,01	3,79	0,78

3: Änderung der intrazellulären cGMP-konzentration in H9c2-Rattenkardiomyozyten nach Stimulation mit ANP in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des PDE2A-Inhbitors BAY 60-7550. Dargestellt ist der cGMP-Gehalt in den Zellen nach 15 min Inkubation mit ANP sowie den angegeben Dosierungen des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550. Es zeigt sich, das der PDE2A-inhbitor BAY 60-7550 dosis-abhängig und synergistisch den intrazelluären cGMP-Spiegel in den H9c2-Zellen erhöht.
4: Veränderung des Herzgewichtes im Vergleich zum Körpergewicht (HW:BW) durch subkutane Isoprenalingabe (2 mg/kg/d) und der Einfluss von Enalapril als Positivkontrolle 810 mg/kg/d im trinkwasser) bzw. des PDE2A-Hemmers BAY 60-7550. Dargestellt ist der Quotient aus Herzgewicht:Körpergewicht in Abhängigkeit von der Behandlung. Es zeigt sich, das der PDE2A-Hemmer BAY 60-7550 in zwei unabhängigen Tiergruppen bei 10 mg/kg/d (i. p.) für 5 Tage gegeben die Isoprenalin-induzierte Herzgewichtszunahme nahezu so gut supprimieren kann, wie die Positivkontrolle Enalapril.
5: 5 zeigt die cDNA-Sequenz der humanen PDE2A (Accession-No. NM_002599, SEQ ID NO: 1).
6: 6 zeigt die Aminosäure-Sequenz der humanen PDE2A (Accession-No. NP_002590, SEQ ID NO: 2).
Untersuchungen PDE2A-Expression und der MYHCB-Expression in H9c2-Rattenzellen.
Die relative Expression der PDE2A in H9c2-Rattenzellen wird durch die Quantifizierung der mRNA mittels der Echtzeit-Polymerasekettenreaktion ermittelt [7]. Gegenüber der klassischen PCR bietet die Echtzeit-PCR den Vorteil einer genaueren Quantifizierung durch Einführung eines zusätzlichen, fluoreszenzmarkierten Oligonucleotides. Diese sogenannte Sonde enthält am 5'-Ende den Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-Carboy-Fluorescein) und am 3'-Ende den Fluoreszenzquencher TAMRA (6-Carboxy-tetramethylrhodamin). Während der Polymerasekettenreaktion wird in der TaqMan-PCR durch die 5'-Exonukleaseaktivtät der Taq-Polymerase der Fluoreszenzfarbstoff FAM von der Sonde abgespalten und dadurch das vorher gequenchte Fluoreszenzsignal erhalten. Als sog. Schwellenwert [treshold cyle (Ct-Wert)] wird die Zyklenzahl aufgezeichnet, bei der die Fluoreszenzintensität ca. 10 Standardabweichungen über der Hintergrund-Fluoreszenz liegt.
Aus den H9c2-Rattenkardiomyozyten wird aus einem 6-well (ca. 4 × 10⁵ Zellen) die Gesamt-RNA mittels eines RNeasy Kits (Qiagen Hilden) isoliert. Je 1 μg Gesamt-RNA je Gewebe wird zur Entfernung von Kontaminationen mit genomischer DNA mit 1 Einheit DNase I (Fa. Invitrogen) für 15 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Inaktivierung der Dnase I erfolgt durch Zugabe von 1 μl EDTA (25 mM) und nachfolgendes Erhitzen auf 65°C (10 min).
Anschließend wird im selben Reaktionsansatz die cDNA-Synthese gemäß der Anleitung zum „SUPERSCRIPT-II RT cDNA synthesis kit" (Fa. Invitrogen) durchgeführt und das Reaktionsvolumen mit destilliertem Wasser auf 200 μl aufgefüllt. Für die PCR wird zu je 5 μl der verdünnten cDNA-Lösung 7,5 μl Gemisch von Primer und Sonde sowie 12,5 μl TaqMan-Reaktionslösung (qPCR-Mastermix, Fa. Eurogentec) gegeben. Die Endkonzentration der Primer ist jeweils 300 nM, die der Sonde 150 nM. Die Sequenz des „forward"- und „reverse"-Primers für die Ratten-PDE2A lautet: 5'-CCAAATCAGGGACCTCATATTCC-3' (SEQ ID NO: 3) bzw. 5'-GGTGTCCCACAAGTTCACCAT-3' (SEQ ID NO: 4), die Sequenz der fluoreszierenden Sonde 5'-6FAM-AACAACTCGCTGGATTTCCTGGA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 5). Die Sequenz des „forward"- und „reverse"-Primers für r-MYHCB lautet:: 5'-TGGAGAACGACAAGCAGCAG-3' (SEQ ID NO: 6) bzw. 5'-CCTGGCGTTGAGTGCATTTA-3' (SEQ ID NO: 7), die Sequenz der fluoreszierenden Sonde 5'-6FAM-TGGATGAGCGACTCAAAAAGAAGGACTTTG-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 8).
Die PCR erfolgt auf einem ABI-Prism-SDS-7700-Gerät (Fa. Applied Biosystems) gemäß der Anleitung des Herstellers. Dabei werden 40 Zyklen durchgeführt. Der Ct-Wert (s. o.) der für das jeweilige Gen in der betreffenden cDNA erhalten wird, entspricht dem Zyklus, in dem die Fluoreszenzintensität der freigesetzten Sonde ca. 10 Standardabweichungen über dem Hintergrundsignal liegt. Je niedriger der Ct-Wert, umso früher beginnt also die Vervielfältigung, d. h. je mehr mRNA ist in der ursprünglichen Probe enthalten. Zum Ausgleich eventueller Schwankungen bei der cDNA-Synthese wird in allen untersuchten Proben auch die Expression eines sog. „Haushaltsgenes" analysiert, welches unabhängig von der Behandlung der Zellen immer gleich stark exprimiert werden sollte. Für die Normierung der PDE2A-Expression in H9c2-Zellen wird L32 ribosomales Protein verwendet. Die Sequenz des „forward"- bzw. „reverse" Primers für Ratten-L32 ist 5'-GAAAGAGCAGCACAGCTGGC-3' (SEQ ID NO: 9), und 5'-TCATTCTCTTCGCTGCGTAGC-3' (SEQ ID NO: 10), die Sequenz der Sonde 5'-6FAM-TCAGAGTCACCAATCCCAACGCCA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 11). Die Auswertung der Daten wird folgendermaßen durchgeführt: Für jede RNA wird der dCt-Wert berechnet. Der dCt-Wert ist die Differenz zwischen dem Ct-Werte für das Kandidatengen (also: MYHCB oder PDE2A) und dem Ct-Wert des Haushaltsgens im jeweiligen Gewebe. Aus diesem Wert wird nach folgender Formel eine relative Expression rE berechnet: rE = 2(18-dCt).
Bestimmung des cGMP-Gehaltes in H9c2-Zellen nach Präinkubation mit dem PDE2A-inhibitor BAY 60-7550
Die Bestimmung des intrazellulären cGMP-Gehaltes in H9c2-Zellen erfolgte mit dem Biotrak (EIA) Immunoassay der Fa. Amersham (Katalog-Nr. RPN 226) entsprechend dem Herstellerprotokoll. Hierzu werden 105 H9c2-Zellen/well über Nacht in 12 well-Platten ausgesät und nach dem Waschen mit 1 × PBS (1 ml) für 15 min bei Raumtemperatur mit 800 μl Medium ohne FCS und den angegeben Konzentrationen des PDE2A-Inhibitors BAY 60-7550 sowie ANP inkubiert. Die Überstände warden verworfen und die Zellen mit 500 ml eiskaltem 70%igen Ethanol versetzt. Nach 2 min Schütteln bei Raumtemperatur (150 u/min) werden die Platten bei –20°C über Nacht gefroren und die lysierten Zellen nach dem Auftauen in Eppendorfgefäße überführt. Nach dem Verdampfen des Ethanols in einer Speed-Vac (3 h bei 35°C) werden die Proben in 200 μl "assay buffer” rekonstituiert und wie in der Kitbeschreibung angegeben aufgearbeitet. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt bei 450/570 nm in einem Tecan Spectrafluor-Photometer. Die erhaltenen OD-Werte werden anhand der Standard-eichkurve gemäß der kitanleitung in fmol/well umgerechnet.
Test der PDE2A-Inhibition
PDE2A-Asssay Formate zur Identifizierung von PDE2A Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt. Ein Beispiel für ein mögliches PDE2A-Aktivitäts Testsystem-Format wird im Folgenden beschrieben.
Humane PDE2A (GenBank/EMBL Accession Number: NM 002599, Rosman et al. Gene 1997 191, 89–95) wird in Sf9 Insektenzellen mit Hilfe des Bac-to-BacTM Baculovirus Expressionssystems exprimiert. 48 h nach der Infektion werden die Zellen geerntet und in Lysispuffer (20 mL/1 L Kultur, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mM EDTA, 10% Glycerin, 20 μL Protease Inhibitor Cocktail Set III [CalBiochem, La Jolla, CA USA]) suspendiert. Die Zellen werden bei 4°C für mit Hilfe von Ultraschall aufgeschlossen und anschließend für 30 Minuten bei 4°C bei 15000 × g zentrifugiert. Der Überstand (PDE2A Präparat) wurde gesammelt und bei –80°C aufbewahrt.
Die Testsubstanzen werden zur Bestimmung ihrer in vitro Wirkung an PDE2A in 100% DMSO aufgelöst und seriell verdünnt. Typischerweise werden Verdünnungsreihen von 200 μM bis 1.6 μM hergestellt (resultierende Endkonzentrationen im Test: 4 μM bis 0,032 μM). Jeweils 2 μL der verdünnten Substanzlösungen werden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Isoplate; Wallac Inc., Atlanta, GA) vorgelegt. Anschließend werden 50 μL einer Verdünnung des oben beschriebenen PDE2A Präparates hinzugefügt. Die Verdünnung des PDE2A Präparates wird so gewählt, dass während der späteren Inkubation weniger als 70% des Substrates umgesetzt wird (typische Verdünnung: 1:200 000; Verdünnungspuffer: 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 8,3 mM MgCl2; 1,7 mM EDTA, 0,2% BSA). Das Substrat, [5',8-3H] adenosine 3',5'-cyclicphosphate (1 μCi/μL; Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ), wird 1:2000 mit Assaypuffer (50 mM Tris/HCl pH 7,5; 8,3 mM MgCl2; 1,7 mM EDTA) auf eine Konzentration von 0,0005 μCi/μL verdünnt und cGMP (1 μM Endkonzentration im Assay), das der Stimulation der PDE2 dient, zugesetzt. Durch Zugabe von 50 μL (0,025 μCi) dieser Substrat-Lösung wird die Enzymreaktion schließlich gestartet. Die Testansätze werden für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 25 μL einer Suspension mit 18 mg/mL Yttrium Scintillation Proximity Beads (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ.) gestoppt. Die Mikrotiterplatten werden mit einer Folie versiegelt und für 60 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend werden die Platten für 30 s pro Vertiefung in einem Microbeta Szintillationzähler (Wallac Inc., Atlanta, GA) vermessen. IC50-Werte werden anhand der graphischen Auftragung der Substanzkonzentration gegen die prozentuale Inhibition bestimmt.
Inhibition der PDEs 1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 und 11 Rekombinante humane PDE3B (GenBank/EMBL Accession Number: NM 000922, Miki et al. Genomics 1996 36, 476–485), PDE4B (GenBank/EMBL Accession Number: NM 002600, Obernolte et al. Gene. 1993 129, 239–247), PDE7B (GenBank/EMBL Accession Number: NM 018945, Hetman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000 97, 472–476), PDE8A (GenBank/EMBL Accession Number: AF_056490, Fisher et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998 246, 570–577), PDE9A (GenBank/EMBL Accession Number: NM 002606, Fisher et al. J. Biol. Chem. 1998 273, 15559–15564), PDE10A (GenBank/EMBL Accession Number: NM_06661, Fujishige et al. J. Biol. Chem. 1999 274, 18438–45, PDE11A (GenBank/EMBL Accession Number: NM_016953, Fawcett et al. Proc. Natl. Acad. Sci 2000 97, 3702–3707) wurden mit Hilfe des pFASTBAC Baculovirus Expressionssystems (GibcoBRL) in Sf9 Zellen exprimiert. Bovine PDE1 wurde von Sigma-Aldrich bezogen (P 9529). PDE5 wurde aus humanen Blutplättchen durch Ultraschallbehandlung, gefolgt von einer Zentrifugation und Säulen-Chromatographie des Überstandes an Mono Q 10/10 (linearer NaCl-Gradient, Flution mit 0,2–0,3 M NaCl in 20 mM Hepes pH 7,2, 2 mM MgCl2) gereinigt.
Die in vitro Wirkung von Testsubstanzen an rekombinanter PDE3B, PDE4B, PDE7B, PDE8A, PDE10A und PDE11A wird nach dem oben für PDE2A beschriebenen Testprotokoll bestimmt, wobei dem Assay nicht das für die Stimulation von PDE2A verwendete cGMP zugesetzt wird. Für die Bestimmung einer entsprechenden Wirkung an PDE1, PDE5 und PDE9A wird das Protokoll darüber hinaus wie folgt modifiziert: Bei PDE1 werden zusätzlich Calmodulin 10–7 M und CaCl2 3 mM zum Reaktionsansatz gegeben. Bei PDE5 und PDE9A findet als Substrat [8-3H] cGMP (1 μCi/μL; Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ) in oben genannter Verdünnung Verwendung. Um die PDE9A-Reaktion zu stoppen werden 25 μl eines in Assay-Puffer gelösten PDE9A-Inhibitors (z.B. BAY 73-6691, 5 μM Endkonzentration) direkt vor Hinzufügen der Yttrium Scintillation Proximity Bead-Suspension zugegeben.
Inhibitoren der PDE2A können auch auf Ebene der Transkription oder Translation der PDE2A angreifen. Testsysteme zur Auffindung entsprechender Inhibitoren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Test der PDE2A-Inhibitoren auf anti-hypertrophe Wirkung in vivo:
Zur Testung der antihypertrophen Wirkung des PDE2A-inhbitors BAY 60-7550 wird das sogenannte Maus-Isoprenalin-Modell verwendet []. Hierbei wird 8 Mäusen (Stamm C57b1/6) je Dosisgruppe Isoprenalin mit einer Dosis von 2 mg/kg/d für 5 Tage subkutan appliziert während die Kontrollgruppe als Vehikelkontrolle eine Kochsalzlösung erhielt. Als Positivkontrolle wurde zu sätzlich zum Isoprenalin einer Gruppe der ACE-Hemmer Enalapril über das Trinkwasser in einer Dosis von 10 mg/kg/d verabreicht während zwei weiteren Gruppen zusätzlich zu Isoprenalin der PDE2A-Inhibitor BAY 60-7550 intraperitoneal mit einer Dosis von 10 mg/kg/d verabreicht wurde. Als Gradmaß für die Herzhypertrophie wird der Quotient aus Herzgewicht/Körpergewicht (HW:BW) nach 5 d bestimmt und die Wirkung der Substanzen in Relation zur Wirkung des Isoprenalins gesetzt.
PDE2A-Inhibitoren Formulierungen
Die PDE2A-Inhibitoren können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht toxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei soll die therapeutisch wirksame Verbindung jeweils in einer Konzentration von 0,5 bis 90 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein, d.h. in Mengen, die ausreichend sind, um den angegebenen Dosierungsspielraum zu erreichen.
Die Formulierungen werden beispielsweise hergestellt durch Strecken der Wirkstoffe mit Lösungsmitteln und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei z.B. im Fall der Benutzung von Wasser als Verdünnungsmittel gegebenenfalls organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden können.
Die Applikation erfolgt in üblicher Weise, vorzugsweise oral, transdermal, intravenös oder parenteral, insbesondere oral oder intravenös. Sie kann aber auch durch Inhalation über Mund oder Nase, beispielsweise mit Hilfe eines Sprays erfolgen, oder topisch über die Haut.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Mengen von etwas 0,001 bis 10 mg/kg, bei oraler Anwendung vorzugsweise etwa 0,005 bis 3 mg/kg Körpergewicht zur Erzielen wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des Applikationsweges, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art von dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchen die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Literatur

1. Scherer, CR, Dissertation Univ. Frankfurt, 2002.
2. Brostrom MA, Reilly BA, Wilson FJ, Brostrom CO. Vasopressin-induced hypertrophy in H9c2 heart-derived myocytes. Int J Biochem Cell Biol. 2000 Sep; 32(9): 993–1006.
3. Calderone A, Thaik CM, Takahashi N, Chang DL, Colucci M., Nitric oxide, atrial natriuretic peptide, and cyclic GMP inhibit the growth-promoting effects of norepinephrine in cardiac myocytes and fibroblasts. J. Clin Invest. 1998 Feb 15; 101(4): 812–8.
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8. Hassan MA, Ketat AF., Sildenafil citrate increases myocardial cGMP content in rat heart, decreases its hypertrophic response to isoproterenol and decreases myocardial leak of creatine kinase and troponin T, BMC Pharmacol. 2005 Apr 6; 5(1): 10.

SEQUENCE LISTING
Abkürzungen

ANP

Atriales natriuretisches Peptid

AVP:

Arginin-Vasopressin

BW:

Körpergewicht (body weight)

Ct:

Schwellenwert (threshold cycle)

HW:

Herzgewicht (heart weight)

MYHCB:

Myosin schwere Kette, Beta-Untereinheit (myosin heavy chain beta-subunit)

PBS

Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate-buffered saline)

rE:

relative Expression

SD:

Standardabweichung

Claims

Verwendung eines PDE2A Polypeptides oder einer Nucleinsäure, welche für ein PDE2A Polypeptid kodiert in einem Testsystem für die Auffindung von Inhibitoren der PDE2A geeignet für die Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz und der ihr zugrunde liegenden Kardiomyopathien, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich um ein zellfreies Testsystem handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich um ein Testsystem unter Verwendung ganzer Zellen, die eine Nukleinsäure enthalten, welche eine PDE2A kodiert.
Verwendung gemäß Ansprüchen 1–3, wobei eine PDE2A Aktivität gemessen wird.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der cGMP bzw der GMP Spiegel gemessen wird.
Verwendung gemäß Ansprüchen 1–3, wobei die Expression der PDE2A gemessen wird.
Verwendung gemäß Ansprüchen 1–6, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelöste Herzinsuffizienz handelt, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels eines der Verfahren gemäß Ansprüchen 1–7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung eines PDE2A-Inhibitors, welcher mittels eines der Verfahren gemäß Ansprüchen 1–7 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechts ventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense-Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung eines PDE2A-spezifischen Antikörpers, eines PDE2A-spezifischen antisense-Oligonukleotides oder einer PDE2A spezifischen siRNA zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
Verwendung von einem PDE2A-Inhibitor zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).
Verwendung einer Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
worin R¹ Phenyl, Naphthyl, Chinolinyl oder Isochinolinyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy, Halogen, Cyano -NHCOR⁸, -NHSO₂R⁹, -SO₂NR¹⁰R¹¹, -SO₂R¹², und -NR¹³R¹⁴ substituiert sein können, bedeutet, worin R⁸, R¹⁰, R¹¹, R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl sind, und R⁹ und R¹² unabhängig voneinander (C_l-C₄)-Alkyl sind, oder R¹⁰ und R¹¹ zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol-1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-1-yl- oder Morpholin-1-yl-Rest bilden, oder R¹³ und R¹⁴ zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen Azetidin-1-yl-, Pyrrol-1-yl-, Piperid-1-yl-, Azepin-1-yl, 4-Methyl-piperazin-1-yl- oder Morpholin-1-yl-Rest bilden, R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Fluor bedeuten, R⁴ (C₁-C₄)-Alkyl bedeutet, R⁵ (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet, R⁶ Wasserstoff oder Methyl bedeutet, R⁷ Phenyl, Thiophenyl, Furanyl, die bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy, Halogen und Cyano substituiert sein können, oder (C₅-C₈)-Cycloalkyl bedeutet, L Carbonyl oder Hydroxymethandiyl bedeutet, und M (C₂-C₅)-Alkandiyl, (C₂-C₅)-Alkendiyl oder (C₂-C₅)-Alkindiyl bedeutet, und deren physiologisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung von Verbindungen wie in Anspruch 14 definiert, wobei R¹ Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy und -SO₂NR¹⁰R¹¹ substituiert sind, bedeutet und worin R¹⁰ und R¹¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung von Verbindungen wir in Anspruch 14 oder 15 definiert, wobei R⁷ Phenyl bedeutet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung von Verbindungen wie in Anspruch 14 definiert, wobei R¹ Phenyl, dessen meta- und/oder para-Positionen bis zu dreifach gleich oder verschieden mit Resten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkoxy und -SO₂NR¹⁰R¹¹ substituiert sind, Naphthyl oder Chinolinyl bedeutet, worin R¹⁰ und R¹¹ unabhängig voneinander Wasserstoff oder (C₁-C₄)-Alkyl sind, R¹ und R² Wasserstoff bedeuten, R⁴ Methyl oder Ethyl bedeutet, R⁵ Methyl bedeutet, R⁶ Wasserstoff oder Methyl bedeutet, L Carbonyl oder Hydroxymethandiyl bedeutet, und M geradkettiges (C₂-C₅)-Alken-1,ω-diyl, geradkettiges (C₂-C₅)-Alken-1,ω-diyl oder geradkettiges (C₂-C₅)-Alkin-1,ω-diyl bedeutet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II),
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, L und M die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und deren Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung der Substanz 2-(3,4-Dimethoxybenzyl)-7-[1-(1-hydroxyethyl)-4-phenylbutyl]-5-methylimidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4(3H)-one mit der Strukturformel:
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe der Herzinsuffizienz, sowie von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, des akuten Myokardinfarkts, des plötzlichen Herztodes, des Bluthochdrucks, der Folgen der Atherosklerose, sowie von Gefäßerkrankungen, von Erkrankungen der Niere, und/oder von Erektionsstörungen.
Verwendung gemäß Ansprüchen 14–19, wobei es sich bei der Herzinsuffizienz um eine durch eine Kardiomyopathie ausgelösten Herzinsuffizienz, ausgewählt aus der Gruppe der Kardiomypathien bestehend aus der dilatativen Kardiomyopathie (DCM), der restriktiven Kardiomyopathie (RCM), der arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVCM), der Myokarditis und/oder der hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM).