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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft den Bereich des genetic engineering. Es werden
ein Gen-Konversionskonstrukt
und ein Verfahren zur Vererbung von Genmobilität von einer Zelle auf die Tochterzelle
sowie verschiedene Verwendungen des Gen-Konversionskonstruktes bereitgestellt.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ortsspezifische (site-specific) selfish Gene,
dabei insbesondere mobile Introns der Gruppe II (group II introns).
Gruppe II Introns sind natürlich
vorkommende Gene, welche die Fähigkeit
besitzen, sich in bestimmte Sequenzen der Wirts-DNA hineinzukopieren
und sich dadurch, unter Umgehung der Mendelschen Vererbungsregeln, rasch
in Populationen auszubreiten. Ihre Mobilität beruht sowohl auf Eigenschaften
der Intron-RNA als auch des multifunktionalen Proteins (intron encoded protein
= IEP), das durch die Intron-RNA kodiert wird. Das Protein besitzt
Maturase-, reverse Transkriptase-, und DNA-Endonuklease-Aktivitäten.
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Stand der Technik
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Die
Transposition des Introns wird als „homing" bezeichnet, weil der Ziellocus stets
mit dem Ausgangslocus, in welchen das Intron zunächst eingefügt ist, identisch ist. Nach
der Translation des durch das Intron kodierten Proteins (intron
encoded protein = IEP) bewirkt das Protein das Spleißen der RNA,
vermutlich chaperon-ähnlich
indem die Formierung der katalytisch aktiven Form der Intron-RNA
erleichtert wird. Protein und Intron-RNA bilden daraufhin einen
Ribonukleoprotein-Komplex
(RNP). Hierauf fügt
sich die Intron-RNA durch reverses Spleißen in den sense-Strang des
erkannten DNA-Abschnittes ein, worauf das Intron kodierte Protein
den antisense-Strang versetzt schneidet und unter Nutzung dessen
3'-Ende als Primer
die Intron-RNA-Matritze reverse transkribiert. Die resultierende
cDNA wird durch Reparatur- oder Rekombinationsmechanismen in die
Wirts-DNA integriert. Die homing-Frequenzen erreichen hierbei 100%.
Die Erkennungssequenzen sind ca. 20-30 Basenpaare lang, wobei die Erkennung
hauptsächlich
auf RNA-DNA-Basenpaarung
beruht (Belfort et al., (2002)).
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Es
können
neue Gruppe II Introns hergestellt werden, die beliebige neue Ziel-(Target)-Sequenzen erkennen
und sich in diese inserieren. Dies geschieht durch Angleichen der
Intron-RNA-Sequenz an die Sequenz der jeweiligen DNA-Zielsequenz. Diese Verfahren
sind in der internationalen Patentanmeldung WO 02/059362 und wissenschaftlichen
Veröffentlichungen
diskutiert (Guo et al., (2000), Frazier et al., (2003), Perutka
et al., (2004), Zhong et al., (2003) und Karberg et al., (2001)).
Die weiteren Patentanmeldungen bzw. Patentschriften WO 01/29059, US2003/104352,
WO 98/54353,
US 6,001,608 und
US 5,698,421 unterrichten
grundsätzlich über den Stand
der Technik. Computergestützt
können
heute Gruppe II Introns hergestellt werden, die sich in jeden erdenklichen
Genlocus inserieren (Perutka et al., 2004)). Die Funktionalität von Gruppe
II Introns auf eukaryonter Ebene wurde kürzlich nachgewiesen (WO 2005/123937
A und WO 2005/123962 A).
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Die
nutzbaren Anwendungen dieser Möglichkeit
sind bislang zunächst
das Erzielen der Unterbrechung von Wirtsgenen als auch das Einführen fremder
Gene ins Wirtsgenom. Normalerweise unterbrechen Gruppe II Introns
die Wirtsgene nicht funktionell, weil sie sich auf RNA-Ebene selbst
heraus spleißen.
Um eben dies zu verhindern wurden Gruppe II Introns entwickelt,
die eine Deletion in dem offenen Leseraster (ORF) besitzen, der
für das
Intron kodierte Protein kodiert. Das Intron kodierte Protein wird
getrennt vom Intron exprimiert. Somit wird eine dauerhafte Genunterbrechung
auf der Grundlage eines Introns erreicht, welches die Fähigkeit
des Selbst-Spleißens
und damit verbunden auch die der eigenständigen Mobilität verloren
hatte (Frazier et al., (2003), Perutka et al., (2004), Zhong et
al., (2003), Karberg et al., (2001)).
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Es
wurde auch versucht, die Genunterbrechung durch Expression des Intron
kodierten Proteins in trans aufzuheben, doch waren die Ergebnisse unbefriedigend.
Es wurde ein Niveau der Genexpression erreicht, das gegenüber dem
Wildtyp bei nur ca. 21 % lag. Diese generelle Verminderung der Effizienz des
Spleißvorgangs
bei der Bereitstellung des Intron kodierten Proteins in trans wurde
auch auf die Trennung des Intron kodierten Proteins von der eigentlichen
Lage in der mRNA zurückgeführt, weil
hierdurch die richtige Formierung und Funktion des RNP-Komplexes beeinträchtigt werden
kann (Frazier et al., (2003).
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Durch
den Einbau in die Domäne
IV des Introns konnten bereits erfolgreich neue Gene wie Kanamycin-(Matsuura
et al., (1997)), und Tetracyclin-Resistenzmarker sowie ein Phagenresistenzgen (abiD)
(Frazer et al., (2003)) ins Wirtsgenom eingeführt werden, ohne dass hierdurch
die homing-Aktivität
des Konstruktes zerstört
wurde.
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Nachteilig
am bisherigen Stand der Technik ist insbesondere, dass im Unterschied
zu Transposons für
Gruppe II Introns noch kein Konstrukt entwickelt wurde, welches
die Möglichkeit
der Gen-Unterbrechung bzw. Gen-Neueinführung mit der Erhaltung der
Mobilität
nach erstmaliger Transposition ins Wirtsgenom verbindet. Dies bedeutet,
dass es bislang nicht möglich
ist, die Fähigkeit
der Mobilität
und die damit verbundene Gen-Konversion an die Tochtergeneration
zu vererben. Eine Vererbung, in Sinne einer Erhaltung und Weitergabe
der Funktion an die nächste
Zellgeneration ist aber für
jedes Populations-Engineering notwendig, ohne dass hierdurch die Gen-Unterbrechung
bzw. Gen-Konversion aufgehoben wird.
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Des
Weiteren ist bislang nicht bekannt, mittels selfish DNA, und insbesondere
mittels Gruppe II Introns, eine komplett reversible, konditionale Gen-Unterbrechung bzw.
-Neueinführung
zu etablieren, weil bisher die Effizienz des Spleißens in
zu großem
Maße durch
Modifikationen am Gruppe II Intron vermindert wird. Ein unbeeinträchtigter
Spleißvorgang
bewirkt die Exzision der Intron- mRNA
aus dem unterbrochenen Exon-mRNA-Bereich und kann somit den Gen-Knockout vollkommen
rückgängig machen
solange der Spleißvorgang
aktiviert ist.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, ein
Gen-Konversionskonstrukt auf
der Basis einer selfish DNA und insbesondere eines modifizierten
Gruppe 11 Intron zu schaffen, das eine stabile Vererbung der Genmobilität auf die nächste Zellgeneration
erlaubt. Das Intron soll in der Lage sein, Wirtsgene zu unterbrechen
bzw. fremde Gene ins Wirtsgenom einzuführen, ohne hierdurch die Fähigkeit
der eigenen Mobilität
zu verlieren. Außerdem
soll das Gen-Konstrukt
vollkommen reversible, für
beliebige Dauer bestehende Gen-Unterbrechungen
bzw. -neueinführungen
erlauben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In
einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Gen-Konversionskonstrukt
zur Vererbung von Genmobilität
von einer Zelle auf die Tochterzelle bereit, das
- (a)
ein Vektorkonstrukt mit einem ersten Promotor zur Transkription
von RNA, und
- (b) eine selfish DNA mit einem offenen Leserahmen (ORF), der
ein Protein kodiert, und einen zweiten Promotor, der zur Expression
des Proteins mit der selfish DNA funktional verknüpft ist, wobei
der offene Leserahmen (ORF) an den Enden Nukleotidsequenzen aufweist,
die mit einer zellulären
Zielsequenz übereinstimmen,
und die selfish DNA in dem Vektorkonstrukt invertiert angeordnet
ist,
wobei der erste und der zweite Promotor zum Zeitpunkt
der Genmobilität
gleichzeitig aktiv sind, umfasst.
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In
einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung einen Kit umfassend das
Gen-Konversionskonstrukt sowie
gegebenenfalls biologische und/oder chemische Klonierungsreagenzien
bereit.
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Ferner
betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur
Vererbung von Genmobilität
von einer Zelle auf die Tochterzelle, wobei das Verfahren die Schritte
umfasst:
- (i) Einführen eines erfindungsgemäßen Gen-Konversionskonstruktes
und/oder eines RNP Partikels umfassend ein erfindungsgemäßes Gen-Konversionskonstrukt,
wobei die Nukleotidsequenzen an den Enden der selfish DNA mit Zielsequenzen
der Zelle übereinstimmen;
- (ii) Einstellen von Kulturbedingungen, welche die gleichzeitige
Aktivität
des ersten und des zweiten Promotors erlauben;
- (iii) Aufrechterhalten von Kulturbedingungen, die Spalten der
Zielsequenzen der Zelle erlauben, um das Gen-Konversionskonstrukt
an der Zielsequenz in die zelluläre
Nukleinsäure
einzuführen; sowie
- (iv) Selektion von Zellen, die das Gen-Konversionskonstrukt
enthalten.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des
Gen-Konversionskonstrukts
zur Herstellung eines Arzneimittels.
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In
einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung
des Gen-Konversionskonstruktes
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten,
Krebserkrankungen, Tumoren, Trinukleotid-Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen
und/oder erblich bedingten Erkrankungen, insbesondere monogen bedingten
erblichen Erkrankungen. Das Gen-Konversionskonstrukt kann insbesondere
verwendet werden, um Infektionserkrankungen einzugrenzen, zu eliminieren
oder einzudämmen.
Die Genkonversion kann sowohl auf der Ebene der Erreger, wie beispielsweise
bei Plasmodien oder Leishmania, oder auf der Ebene der Vektoren,
wie beispielsweise bei Anopheles stattfinden.
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Außerdem betrifft
die Erfindung die Verwendung des Gen-Konversionskonstruktes als
Forschungswerkzeug, insbesondere als molekularbiologisches Forschungswerkzeug
zur Herstellung von genetisch veränderten Zellen, sowie die Verwendung des
Gen-Konversionskonstruktes zur Herstellung genetisch veränderter
Bak terien, Viren, Protozoen, Pilze, Pflanzen und Tieren, insbesondere
genetisch veränderten
nicht humanen Säugetieren.
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Schließlich betrifft
die Erfindung die Verwendung des Gen-Konversionskonstruktes in der
Schädlingsbekämpfung.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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1 ist
eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des Gen-Konversionskonstruktes,
in der die Invertierung des offenen Leserahmens, der für das Intron
kodierte Protein kodiert, dargestellt ist.
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2 ist
eine schematische Darstellung des möglichen Vorgehens, durch das
eine Gen-Konversion im Wirtsorganismus mittels des Gen-Konversionskonstrukts
erreicht werden kann.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Zunächst stellt
die Erfindung ein Gen-Konversionskonstrukt zur Vererbung von Genmobilität von einer
Zelle auf die Tochterzelle, umfassend
- (a) ein
Vektorkonstrukt mit einem ersten Promotor zur Transkription von
RNA, und
- (b) eine selfish DNA mit einem offenen Leserahmen (ORF), der
ein Protein kodiert, und einem zweitem Promotor, der zur Expression
des Proteins mit der selfish DNA funktional verknüpft ist, wobei
die selfish DNA an den Enden Nukleotidsequenzen aufweist, die mit
einer zellulären
Zielsequenz übereinstimmen,
und der offene Leserahmen (ORF) in dem Vektorkonstrukt invertiert
angeordnet ist,
wobei der erste und der zweite Promotor
zum Zeitpunkt der Genmobilität
gleichzeitig aktiv sind, bereit.
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Im
Stand der Technik besteht das Problem, dass bei Gruppe II Introns
die Mobilität
an das Spleißen
der mRNA gekoppelt ist, d. h. in dem Moment, in welchem das Intron „springt", wird die Intron-RNA
gespleißt
und somit die Genunterbrechung bzw. -neueinführung aufgehoben. Um dennoch
eine dauerhafte Unterbrechung des Wirts-Genlocus auch bei erhaltener
Transpositionsfähigkeit
des Gruppe II Introns zu erreichen, haben die Erfinder das Homing
auf einen klar begrenzten Zeitraum beschränkt, d.h. die Expression des
Intron kodierten Proteins, welches die Mobilität katalysiert, wurde von der
Transkription der mRNA entkoppelt.
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Erfindungsgemäß wurde
der offene Leserahmen, welcher für
das Intron kodierte Protein kodiert, nicht deletiert, sondern invertiert
und somit in der Intron-DNA belassen. Diese Inversion bedingt, dass das
offene Leseraster nicht mehr in der ursprünglichen Richtung, d.h. vom
ersten Promotor (= Promotor des Exons) ausgehend, sondern jetzt
in der Gegenrichtung vom zweiten Promotor gelesen werden kann. Der
erste Promotor (= Exon-Promotor) und der zweite Promotor (= neu
eingeführter,
spezifischer Promotor) müssen
gleichzeitig aktiv sein. Der Vorgang des Homings und das verbundene
Spleißen
ist damit auf frei wählbare
Zeiträume
beschränkt,
das betreffende Wirtsgen ist also für den Rest der Zeit unterbrochen
und es verbleibt das etwaige neu eingeführte, fremde Gen ungespleißt in der
mRNA.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist mindestens der zweite Promotor, vorzugsweise beide Promotoren
induzierbar. Eine induzierende Substanz aktiviert den Promotor,
das Intron kodierte Protein wird konsekutiv translatiert, das Spleißen der
Intron-RNA findet statt, und damit wird die Genunterbrechung auf
RNA-Ebene aufgehoben.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist der zweite Promotor ein gewebespezifischer oder entwicklungsphasenspezifischer,
zum Beispiel ein meiosespezifischer Promotor. Das Intron kodierte
Protein wird, je nach dem Zweck, welchen der genetische Eingriff
erfüllen
soll, unter die Kontrolle eines entweder für gewisse Entwicklungsstadien oder
Zelldifferenzierungen spezifischen Promotors gestellt. Einen solchen
Promotor kann der Fachmann mit Programmen wie „tess" (http://www.cbil.upenn.edu/tess/) oder
dem „Genomatix" System auffinden.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die selfish DNA ein Gruppe II Intron (group II introns).
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In
einer weiteren Ausführungsform
weisen die Nukleotidsequenzen an den Enden der selfish DNA eine
Länge von
ungefähr
20 bis 30 Basenpaaren auf, wobei Längen größer 14 Basenpaare verwendet
werden können.
Bevorzugt sind Längen
von mindestens 25 Basenpaaren.
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In
einer alternativen Ausführungsform
weist der Vektor eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion einer
interessierenden DNA auf. Die multiple Klonierungsstelle kann Schnittstellen
für verschiedene Restriktionsenzyme
aufweisen, die bevorzugt den Vektor nur an dieser Stelle spalten.
Die interessierende DNA ist bevorzugt zur Expression mit ihrem homologen
Promotor funktional verknüpft.
So wird eine gewebe- oder entwicklungsstadienspezifische Expression
exakt sichergestellt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
weist der Vektor einen Selektionsmarker auf. In 2 ist der
Selektionsmarker als Ampicillin-Resistenzgen (Amp) dargestellt.
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Besonders
bevorzugt ist die verwendete Zelle eine eukaryonte Zelle.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit
umfassend das erfindungsgemäße Gen-Konversionskonstrukt
und gegebenenfalls biologische und/oder chemische Klonierungsreagenzien
bereit. Unter biologischen und/oder chemischen Klonierungsreagenzien
werden vor allem Polymerasen, Puffer, Salze, Restriktionsenzyme
etc. verstanden.
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Besonders
für das
Populationsengineering ist die Erfindung von großem Nutzen, weil sich auf der
einen Seite künstlich
erzeugte Mutanten in der Natur nur schwer bzw. sehr langsam ausbreiten,
auf der anderen Seite jedoch die rapide Verbreitungstendenz von
Gruppe II Introns bislang aufgrund der nicht möglichen Vererbung der Mobilität nicht
für die
genetische Manipulation von Populationen genutzt werden konnten.
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Es
gibt grundsätzlich
vier Modifikationstypen, welche die Erfindung ermöglicht.
- 1. Unterbrechung eines Gens und Ausrottung
einer Population falls der Knockout rezessiv und essentiell ist
Die
Rezessivität
des Knock-outs führt
zu dessen Ausbreitung in der Population, obwohl das ausgeschaltete
Gen essentiell ist, da nur homozygote Knock-outs lebensunfähig sind.
Bei der richtigen Wahl des Promotors steigt zunächst nur die Frequenz der heterozygoten
Knock-out Träger
an, die lebensfähig
sind. Später
erhöht
sich die Frequenz der homozygoten Knockouts, was schließlich zur
Auslöschung
(Eradikation) führt.
Die Wahl des geeigneten Promotors wird weiter unten erläutert.
- 2. Einführung
eines neuen Gens durch sein Einfügen
in die Domäne
IV des modifizierten Gruppe II Introns
Das Konstrukt muss sich
hierfür
in einen nicht kodierenden Bereich des Genoms hineinkopieren (z.B.
selfish DNA (LINES, SINES), Promotoren, repetitive Bereiche, CpY
islands, Mikrosatelliten oder strukturelle DNA).
- 3. Indirekte Einführung
eines neuen Gens
Hierbei wird die Wildtyp-Population durch
Attackierung eines essentiellen Gens ausgerottet, um synchron die
bevorzugte Mutante durch Koppelung des neuen Gens an eine Variante
des essentiellen Gens, welche durch das Intron nicht erkant wird,
einzuführen.
Diese Variante besteht im einfachsten Fall aus einer Inversion,
wobei auch durch Ausnutzung der Degeneration des genetischen Kodes
weitere Varianten erzeugt werden können. Der Knockout muss hierbei
rezessiv und der Promotor rein meiose- bzw. keimbahnspezifisch gewählt werden.
- 4. Ersatz eines Gens durch ein anderes
Das zu ersetzende
Gen wird vom modifizierten Gruppe II Intron anvisiert und das neue
Gen in dessen Domäne
IV eingefügt.
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Um
eine möglichst
effiziente Ausbreitung eines neuen Genotyps zu erreichen, sollte
ein Promotor gewählt
werden, der in folgenden Entwicklungsstadien bzw. Zellarten aktiv
ist:
- – Diploide
Taxa: erste Entwicklungsstadien der Zygote (z.B. Promotoren von
Oct-Genen); die Genkonversion
nach der Befruchtung der Eizelle führt zu homozygoten Individuen
- – Vornehmlich
haploide Organismen, zum Beispiel Plasmodien: postmeiotische Synzytialphase
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Aufgrund
dieser Wahl befinden sich sofort ausschließlich homozygote Merkmalsträger unter den
Nachkommen der modifizierten, diploiden Organismen bzw. sind alle
Nachkommen der veränderten, vornehmlich
haploiden Organismen, zum Beispiel Plasmodien Merkmalsträger bezüglich der
Veränderung.
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Eine
andere Anwendung ist die vollkommen reversible, konditionale Gen-Unterbrechung besonders
bei Bakterien, aber auch bei beliebigen anderen Organismen. Das
heißt
dass Gene durch Verwendung eines induzierbaren Promotors, der die
Transkription des Intron kodierten Proteins kontrolliert, beliebig
an- und ausgeschaltet werden. Letzteres bedingt seinerseits das
Spleißen
der Intron-mRNA
und hebt somit die Genunterbrechung bzw. die Genneueinführung auf.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vererbung
von Genmobilität von
einer Zelle auf die Tochterzelle, wobei das Verfahren die Schritte
umfasst:
- (i) Einführen eines erfindungsgemäßen Gen-Konversionskonstruktes
und/oder eines RNP Partikels umfassend das erfindungsgemäße Gen-Konversionskonstrukt,
wobei die Nukleotidsequenzen an den Enden der selfish DNA mit Zielsequenzen der
Zelle übereinstimmen;
- (ii) Einstellen von Kulturbedingungen, welche die gleichzeitige
Aktivität
des ersten und des zweiten Promotors erlauben;
- (iii) Aufrechterhalten von Kulturbedingungen, die Spalten der
Zielsequenzen der Zelle erlauben, um das Gen-Konversionskonstrukt
an der Zielsequenz in die zelluläre
Nukleinsäure
einzuführen; sowie
- (iv) Selektion von Zellen, die das Gen-Konversionskonstrukt
enthalten.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die Aktivität
mindestens des zweiten Promotors, vorzugsweise beider Promotoren
induzierbar.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des
erfindungsgemäßen Gen-Konversionskonstrukts
zur Herstellung eines Arzneimittels.
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Insbesondere
kann das erfindungsgemäße Gen-Konversionskonstrukt
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Infektionskrankheiten,
Krebserkrankungen, Tumoren, Trinukleotid-Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und/oder
erblich bedingten Erkrankungen, insbesondere monogen bedingten erblichen
Erkrankungen verwendet werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden die Infektionserkrankungen durch Viren, Bakterien, Pilze
und/oder Protozoen verursacht. Das Gen-Konversionskonstrukt kann
ferner zur Eindämmung
von Infektionserkrankungen durch Gen-Konversion sowohl einerseits des Erregers,
zum Beispiel von Plasmodien oder Leishmania, als auch möglicher
Vektoren, zum Beispiel Anopheles, verwendet werden.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird das Gen-Konversionskonstrukt zur Eindämmung von Malaria als auch
zur Malariabekämpfung
verwendet. So kann das Malariaproblem durch Verdrängung der
virulentesten Populationen (P.falciparum) durch neu eingeführte, mildere
Populationen begegnet werden. Wie gezeigt wurde, steht die Mortalität einer
Malaria tropica Infektion in engem Zusammenhang mit einer systemischen
und organspezifischen entzündlichen
Reaktion, die durch das Parasitentoxin Glycosylphosphatidylinositol
(GPI) ausgelöst
wird. Eigentlicher Auslöser
der Entzündungsreaktion
ist das Diacylglycerol, ein Bestandteil des GPIs bei P. falciparum.
So wird versucht Diacylglycerol durch Alkylacylglycerol, wie es
beispielsweise in menschlichen GPIs vorkommt, zu ersetzen. Zu diesem
Zweck werden die menschlichen Enzyme Alkylglyceronphosphat-synthase
(E.C.Nr: 2.5.1.26) und Alkylglycerophosphat-2-O-acetyltransferase (E.C.Nr: 2.3.1.105)
in die Domäne
IV integriert, wobei der Promotor, welcher die Prozessierung des
Intron kodierten Proteins reguliert, so gewählt wird, dass er besonders
in der postmeiotischen synzytischen Phase der Plasmodienentwicklung
aktiv ist. Der Gen-Konversionsvektor selbst wird so konstruiert, dass
er einen nicht kodierenden Bereich der Wirts-DNA erkennt. Das Resultat
der Strategie sind Plasmodien, welche in ihrer Virulenz stark abgeschwächt sind.
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Ferner
sind die viralen Infektionen bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus Infektionen mit humanen Immundefizienzviren (HIV), humanen Papillomviren
(HPV), Epstein Barr Virus (EBV), Herpesviren, insbesondere dem humanen
Herpesvirus Typ 8 (HHV8) und humanen T-Zell Leukämieviren (HTLV), insbesondere
HTLV 1.
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Einsetzbar
sind Gruppe II Introns in der HIV-Therapie. Es wird sowohl die Unterbrechung
des Genoms des Provirus als auch die Ausschaltung des CCR Chemo kin-
Rezeptors erreicht, was die Resistenz der betroffenen T-Lymphozyten
gegenüber
HIV bedingt, jedoch nicht mit einer Schädigung oder Funktionsbeeinträchtigung
der Zelle einhergeht.
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Das
Gen-Konversionskonstrukt wird entweder in einem geeigneten Vektor
(z.B. Adenoviren), welcher die Wirtszellen des H1-Virus befällt, in
den menschlichen Körper
eingebracht oder mittels Elektroporation dazu genutzt, Patienten-Lymphozyten durch
erwähntes
Vorgehen in vivo resistent zu machen. Die resistenten Zellen werden
sich daraufhin im menschlichen Körper
ungehindert vermehren.
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Ferner
sind die Krebserkrankungen und Tumoren bevorzugt ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Zervixkarzinom, Uteruskarzinom, Burkitt-Lymphom,
Nasopharynxkarzinom, Kaposisarkom und chronischer myeloischer Leukämie, die
vorzugsweise Philadelphiachromosom positiv ist.
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Das
erfindungsgemäße Gen-Konversionskonstrukt
ist für
die Krebstherapie geeignet. Die Einführung von Tumorsuppressorgenen
(z.B. p53) sowie die Ausschaltung von Onkogenen (z.B. k-ras) wirken der
Pathogenese verschiedenster Tumorerkrankungen entgegen. Es können Gruppe
II Introns verwendet werden, welche entweder in ihrer Domäne IV bestimmte
Tumorsuppressorgene tragen (die ihrerseits durch die Wahl eines
geeigneten Promotors mehr oder weniger stark exprimiert werden)
und nicht kodierende Bereiche des menschlichen Genoms erkennen oder
sich in Onkogene inserieren, die bei einem Patientenkollektiv überexprimiert
sind und somit die assoziierten pathophysiologischen Konsequenzen rückgängig machen.
Das veränderte
Gruppe II Intron kann mittels eines geeigneten Vektors (Adenoviren etc.)
in die entartete Zellpopulation eingebracht werden.
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Die
Auswahl der in Frage kommenden Gene muss an die pathogenetischen
Ursachen des jeweiligen Tumors angepasst werden. Der große Vorteil dieser
Behandlungsmethode gegenüber
einer konservativen Therapie (Bestrahlung, Chemothe rapie) ist das
Fehlen einschlägiger
Nebenwirkungen dieser konservativen Therapien für den behandelten Patienten.
Aus diesem Grunde kann das Verfahren auch in der Kombination mit
konservativen Therapiemöglichkeiten
angewendet werden, da hierdurch die oft gravierenden Nebenwirkungen
verringert werden. Eine geringere Dosis des konservativen Behandlungsschemas
sollte in diesem Fall keine Einbuße des Therapieerfolgs bedingen.
Dies könnte
eine deutliche Verbesserung bei der Behandlung von bisher schlecht
zu therapierenden Tumoren, wie Gliome, primäre hepatozelluläre Karzinome
und Pankreaskarzinome bedingen.
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Bestimmte
virusassoziierte Tumoren sind für die
Therapie durch Gruppe II Introns besonders geeignet. Hierzu zählen u.a.
T-Zell-Leukämie
(HTLV1 und 2); zervikale intraepitheliale Neoplasie, bowenoide Papulose,
Larynxpapillom, Riesenkondylom, Condyloma planum, Condyloma acuminatum,
Epidermodysplasia verruciformis und eine große Zahl gutartiger Wucherungen
(HPV); Burkitt-Lymphom, Nasopharynxkarzinom (EBV, Zugangs-Nr.: NC 001345);
Kaposi-Sarkom (HHV8, Zugangs-Nr.: NC 003409 und HIV, Zugangs-Nr.:
NC 001802). Der geeignete Therapieansatz ist hierbei wiederum die
Unterbrechung des viralen bzw. proviralen Genoms an geeigneter Stelle
(z.B. bei HPV im Bereich des Leserahmens E6, E7 [z.B. gi:21464523,
gi:66933401 etc.] bzw. bei anderen Viren im Bereich einer DNA-Polymerase
[z.B. bei EBV gi: 28566757]). Es werden zur Einführung der Gen-Konversionskonstrukte
vorzugsweise die Viren als Vektoren verwendet, die bekämpft werden
sollen. Hierzu müssen
die Viruspartikel zunächst
vollkommen oder teilweise frei von Erbsubstanz sein. Auf diese Weise
kann beispielsweise HPV mit HPV behandelt werden. Dasselbe gilt
auch für
HIV und andere extrem virulente Viren, wobei weitere Sicherheitsmaßnahmen
notwendig sind. Denkbar sind die Verwendung von nur Hüllprotein
und Adhäsionsrezeptor
ohne Virus-RNA bzw. vollständige Diagnose;
Minimierung der Risiken von gefährlichen Rekombinationen
durch geeignete Deletionen etc.
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Außerdem möglich ist
die Therapie der meisten Fälle
(90 %) von chronisch myeloischer Leukämie. Die Unterbrechung des
Philadelphia-Translokationschromosoms im Bereich des für die Tyrosinkinase
kodierenden Locus wird die gängigen
Behandlungsmöglichkeiten
in ihrer Wirksamkeit übertreffen.
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Die
Trinukleotid-Erkrankungen sind vorzugsweise ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Chorea Huntington und Friedreich Ataxie,
während die
Stoffwechselerkrankungen bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend
aus Phenylketonurie, Albinismus und Glykogenose.
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Trinukleotid-Erkrankungen,
wie z.B. Chorea Huntington oder Friedreich-Ataxie können beispielsweise
durch den Einsatz eines Gruppe II Introns, welches den pathologischen
Gen-Ort unterbricht und gleichzeitig das „gesunde" Gen mit sich führt, therapiert werden. Als
Folge werden sich keine pathologischen Proteine – Huntingtin bzw. Frataxin – mehr ansammeln,
sondern das physiologische Genprodukt wird gebildet.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung sind die erblich bedingten Erkrankungen, insbesondere
die monogen bedingten erblichen Erkrankungen bevorzugt ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Mukoviszidose, monogener Hypercholesterinämie, Marfan-Syndrom,
Hämophilie
A und progressiver Muskeldystrophie.
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Als
Beispiel für
eine Stoffwechselerkrankung wird Phenylketonurie genannt. Die effiziente
Einführung
des intakten Gens (gi:18765884), welches für das bei der Erkrankung defekte
Enzym kodiert (Phenylalaninhydroxylase), steht für die erfolgreiche Therapie
der Erkrankung. Ebenso kann Albinismus durch die Einführung des
intakten Tyrosinase-Gens (Genbank gi: 12656242) behandelt werden.
Mukoviszidose kann mit dem Ersatz des defekten Chlorid-Kanals durch
das intakte Protein therapiert werden.
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In
einer alternativen Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Gen-Konversionskonstrukt als
Forschungswerkzeug, insbesondere als molekularbiologisches Forschungswerkzeug
zur Herstellung von genetisch veränderten Zellen verwendet werden.
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Durch
das erfindungsgemäße Konstrukt
können
Gene gezielt an- und ausgeschaltet werden, indem ein induzierbarer
Promotor für
die Transkription des Intron kodierten Proteins verwendet wird.
Ein Wirtsgen wird durch die Integration des Gruppe II Introns ausgeschaltet
und durch dessen Spleißen
nach Induktion des Promotors auf mRNA-Ebene wieder angeschaltet.
Gleiches gilt für
ein neu eingeführtes Gen,
nur mit dem Unterschied, dass dieses durch den Spleißvorgang
exzidiert und somit ausgeschaltet wird. Ein solcher On/Off-Mechanismus
wird bislang nur durch das Tet-System erreicht. Der große Vorteil des
erfindungsgemäßen Konstruktes
ist jedoch die Tatsache, dass es in genetisch unveränderten
Wildtyporganismen oder -zellen verwendet werden kann. Die Herstellung
bestimmter Stoffe (z.B. Humaninsulin oder Erythropoetin) kann somit
auf klar bestimmte Zeiträume
festgelegt werden.
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Um
zu Versuchszwecken bei bestimmten Organismen einen Knockout zu etablieren,
wird derzeit das Cre- bzw. Lox-Rekombinase-System verwendet. Hierbei
muss jedoch das auszuschaltende Gen zunächst mit flankierenden Rekombinase-Sequenzen versehen
werden. Das erfindungsgemäße System kommt
ohne jegliche vorhergehende Modifikation des Wirtsorganismus aus
und ermöglicht
außerdem die
Einführung
neuer Gene.
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In
einer weiteren alternativen Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Gen-Konversionskonstrukt
zur Herstellung genetisch veränderter
Bakterien, Viren, Protozoen, Pilze, Pflanzen und Tiere, insbesondere
genetisch veränderter
nicht humaner Säugetiere
verwendet werden.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die genetische Veränderung
reversibel.
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In
einer alternativen Ausführungsform
kann schließlich
das erfindungsgemäße Gen-Konversionskonstrukt
in der Schädlingsbekämpfung eingesetzt
werden. Eine solche Schädlingsbekämpfung betrifft
auch die genetische Modifikation bzw. Ausrottung von Spezies, die
durch den Menschen in Lebensräume
eingeführt
wurden, die nicht die natürlichen
Lebensräume
darstellen. Ein Beispiel ist die Flockenblume in den USA.
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Im
Folgenden wird die Erfindung anhand des Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme
auf die beigefügten
Figuren näher
erläutert.
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Ausführungsbeispiel
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Die
Erfindung wird anhand des bekannten Gruppe II Introns L1.LtrB von
Lactococcus lactis erläutert. 1 zeigt
das Intron und stellt die Erfindung dar. Das Intron wird mit Restriktionsendonukleasen gespalten,
und das Konstrukt wird mittels PCR hergestellt. So wird auch die
richtige Orientierung des einzufügenden
DNA-Stückes
sichergestellt. Standard-Klonierungstechniken sind dem Fachmann
bekannt, siehe z.B. „PCR" von M. J. McPherson,
S. Moller Springer-Verlag Telos (Oktober 2000) oder Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 3 Vol. von Joseph Sambrook, David W. Russell
Cold Spring Harbor Laboratory Press (Januar 2001), Cold Spring Harbor, N.Y.
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2 stellt
beispielhaft die Ausführung
der genetischen Manipulation einer Zielpopulation dar, wobei im
Speziellen die Einführung
eines neuen Gens in die Wirts-DNA
realisiert wurde. Dargestellt ist wiederum ein Gruppe II Intron,
dessen Domäne
IV modifiziert wurde. Diese enthält
eine Inversion des ORF des Intron kodierten Proteins, das als LtrA
ORF bezeichnet wird (vgl. auch 1). Es steht
unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors. Das neu einzuführende Fremdgen steht
optional unter der Kontrolle des eigenen, homologen Promotors, um
Einfluss auf das Expressionsprofil des neuen Gens zu nehmen. Die
Intronsequenzen, welche durch RNA-DNA-Basenpaarungen verantwortlich
sind für die
Erkennung der Ziel-DNA, wurden derart abgewandelt, dass die beabsichtigte
Sequenz erkannt werden kann. Das Konstrukt wird in ein Plasmid integriert,
und es wird in E. coli prozessiert. Das veränderte Intron wird gesäumt von
den flankierenden Exonsequenzen E1 und E2 aus dem Zielgen. Das Plasmid verfügt außerdem über den
Resistenzmarker Ampicillin, welcher für die Selektion der das Plasmid
tragenden Bakterien notwendig ist. Mit diesem Konstrukt können RNP-Partikeln
hergestellt werden, die verpackt in Liposomen durch Elektroporation
in die Wirtszelle eingebracht werden, wo sie die Einführung des
fremden Gens ins Wirtsgenom bewirken. Dies bedeutet, dass für den letzten
Schritt kein Vektor notwendig ist.
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Der
Fachmann kann je nach genutztem Zelltyp das Konstrukt und den Vektor
mit Standardtechniken herstellen oder modifizieren, etwa mit zusätzlicher
Lokalisationssequenz, verbesserter Expression oder verbesserter
Codonusage.
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Literaturzitate
-
- 1. Belfort, M., Derbyshire, V., Parker, M.,M.,
Cousineau, B. & Lambowitz,
A. M. 2002 Mobile introns: pathways and proteins. In Mobile DNA
II (Hrsg.: N. L. Craig, R. Craigie, M. Geliert & A. M. Lambowitz), S. 761-783. Washington,
DC: ASM Press.
- 2. Guo H, Karberg M, Long M, Jones JP d. Dritte, Sullenger B,
Lambowitz AM. Group II introns designed to insert into therapeutically
relevant DNA target sites in human cells. Science. 2000 Jul 21;289(5478):452-7.
- 3. Frazier CL, San Filippo J, Lambowitz AM, Mills DA. Genetic
manipulation of Lactococcus lactis by using targeted group II introns:
generation of stable insertions without selection. Appl Environ
Microbiol. 2003 Feb;69(2):1121-8.
- 4. Perutka J, Wang W, Goerlitz D, Lambowitz AM. Use of computer-designed
group II introns to disrupt Escherichia coli DExH/D-box protein
and DNA helicase genes. J Mol Biol. 2004 Feb 13;336(2):421-39.
- 5. Zhong J, Karberg M, Lambowitz AM. Targeted and random bacterial
gene disruption using a group II intron (targetron) vector containing
a retrotransposition-activated selectable marker. Nucleic Acids
Res. 2003 Mar 15;31(6):1656-64.
- 6. Karberg M, Guo H, Zhong J, Coon R, Perutka J, Lambowitz AM.
Group II introns as controllable gene targeting vectors for genetic
manipulation of bacteria. Nat Biotechnol. 2001 Dec;19(12):1162-7.
- 7. Matsuura M, Saldanha R, Ma H, Wank H, Yang J, Mohr G, Cavanagh
S, Dunny GM, Betfort M, Lambowitz AM. A bacterial group II intron
encoding reverse transcriptase, maturase, and DNA endonuclease activities:
biochemical demonstration of maturase activity and insertion of
new genetic information within the intron. Genes Dev. 1997 Nov 1;11(21):2910-24.
- 8. Burt A. Site-specific selfish genes as tools for the control
and genetic engineering of natural populations. Proc Biol Sci. 2003
Mai 7;270(1518):921-8.
- 9. PCR von M. J. McPherson, S. Moller Springer-Verlag Telos
(Oktober 2000)
- 10. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Vol. von Joseph
Sambrook, David W. Russell Cold Spring Harbor Laboratory Press (Januar
2001), Cold Spring Harbor, N.Y.