DE102006009885A1

DE102006009885A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung des Volumenanteils von elektrisch isolierenden partikulären Stoffen in einer Flüssigkeit

Info

Publication number: DE102006009885A1
Application number: DE200610009885
Authority: DE
Inventors: Norman Dipl.-Ing. Werner
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2007-09-06

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Bestimmung des Volumenanteils von elektrisch isolierenden partikulären Stoffen, insbesondere von biologischen Zellen, in einer elektrisch leitfähigen Flüssigkeit, mit der die partikulären Stoffe eine Suspension bilden. Bei dem Verfahren werden die elektrische Leitfähigkeit der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe und die elektrische Leitfähigkeit der Suspension oder eine Größe, die ein Maß für einen Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, bei Gleichspannung oder bei einer Wechselspannungsfrequenz direkt oder indirekt gemessen. Der Volumenanteil der partikulären Stoffe wird dann auf Basis des Unterschiedes der beiden elektrischen Leitfähigkeiten bestimmt. Das Verfahren und die Vorrichtung ermöglichen eine einfache und preiswerte Messung des Volumenanteils bzw. der Konzentration von partikulären Stoffen auch bei hohen Konzentrationen.

Description

Technisches Anwendungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Bestimmung des Volumenanteils von elektrisch isolierenden partikulären Stoffen, insbesondere von biologischen Zellen, in einer elektrisch leitfähigen Flüssigkeit, mit der die partikulären Stoffe eine Suspension bilden.
Die Bestimmung des Volumenanteils und somit der Konzentration von partikulären Stoffen in einer Flüssigkeit spielt in vielen technischen Bereichen eine Rolle. Beispiele hierfür sind die Bestimmung der Farbpartikelkonzentration in Wandfarben, die Bestimmung der Algenbelastung oder des Planktongehalts von Gewässern oder die Bestimmung des Zelluloseanteils der Pulpe während der Papierherstellung. Ein Hauptanwendungsgebiet der vorliegenden Erfindung besteht in der Bestimmung der Zellkonzentration in Bioreaktoren oder Fermentern. Die Stoffumwandlung in derartigen Reaktoren ist u.a. von der Anzahl lebender Zellen abhängig, so dass die Kenntnis des Volumenanteils bzw. der Konzentration der Zellen in der vorhandenen Suspension für den Prozess wesentlich ist.

Stand der Technik

Zur Bestimmung der Zellkonzentration von biologischen Zellen in einer Suspension ist es bekannt, die optische Transparenz der Suspension zu messen und anschließend auf eine Referenzmessung zu kalibrieren. Bei einem weiteren bekannten Verfahren zur Bestimmung der Zellkonzentration in einer Suspension wird eine Ultraschallmessung eingesetzt. Aus der Absorption und Streuung der in die Suspension eingekoppelten Ultraschallwellen können dann die Zelldichte und die Zellgröße bestimmt werden. Beide Verfahren lassen sich jedoch nicht unmittelbar bei hohen Zelldichten einsetzen und erfordern in diesem Fall vielmehr eine Verdünnung der Probe.

Weiterhin sind sogenannte Partikelzähler bekannt, mit denen Größe und Anzahl der biologischen Zellen bestimmt werden können. Diese Zählgeräte nutzen den hohen elektrischen Widerstand der Zellen, der beim Durchgang der Zellen durch eine an die Zellgröße angepasste Apertur detektiert wird, um die Zellen zu zählen.

Eine weitere bekannte Technik zur Bestimmung der Zellkonzentration in Suspensionen besteht in der Anwendung der Impedanzspektroskopie. Zellsuspensionen zeigen unterschiedliche Wechselstromwiderstände bei unterschiedlichen Messfrequenzen. Bei geringen Frequenzen wirken die biologischen Zellen als elektrische Isolatoren, bei sehr hohen Frequenzen wie elektrische Leiter. Aus dem mittels Impedanzspektroskopie gewonnenen Spektrum kann dann die Zelldichte berechnet werden. Die EP 1 138 758 A1 zeigt ein Beispiel für die Anwendung der Impedanzspektroskopie zur Bestimmung niedriger Zellkonzentrationen in einer Suspension. Die Messung erfolgt bei zumindest zwei voneinander verschiedenen Wechselspannungsfrequenzen zwischen 1 kHz und 20 MHz. Durch eine Referenzmessung an der Flüssigkeit der Suspension ohne die darin suspendierten Zellen kann die Messgenauigkeit erhöht werden.

Die letztgenannten Techniken der Zellzählung sowie der Impedanzspektroskopie erfordern jedoch in der Regel sehr aufwändige Geräte zur Messung und/oder Auswertung.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein einfaches Verfahren sowie eine für die Durchführung des Verfahrens ausgebildete Vorrichtung zur Bestimmung des Volumenanteils von biologischen Zellen in einer Zellsuspension anzugeben, die auch uneingeschränkt zur Messung bei hohen Zelldichten eingesetzt werden können.

Darstellung der Erfindung

Die Aufgabe wird mit dem Verfahren sowie der Vorrichtung gemäß den Patentansprüchen 1 und 6 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sowie der Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche oder lassen sich der nachfolgenden Beschreibung sowie den Ausführungsbeispielen entnehmen.

Bei dem vorliegenden Verfahren wird der Volumenanteil von elektrisch isolierenden partikulären Stoffen, insbesondere von biologischen Zellen, in einer elektrisch leitfähigen Flüssigkeit bestimmt, mit der die partikulären Stoffe eine Suspension bilden. Bei dem Verfahren werden, vorzugsweise gleichzeitig, die elektrische Leitfähigkeit der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe und die elektrische Leitfähigkeit der Suspension – oder eine Größe, die ein Maß für einen Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert – bei Gleichspannung oder bei einer Wechselspannungsfrequenz direkt oder indirekt gemessen. Auf Basis des Unterschieds der beiden elektrischen Leitfähigkeiten wird dann der Volumenanteil der partikulären Stoffe bestimmt. Die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe wird im Folgenden auch als Referenzmessung bezeichnet.

Hierbei wird ausgenutzt, dass die elektrisch isolierenden partikulären Stoffe die elektrische Leitfähigkeit der Suspension beeinflussen. Je höher der Anteil der partikulären Stoffe in der Suspension ist, desto geringer ist die elektrische Leitfähigkeit der Suspension. Das Gesamtvolumen der Suspension setzt sich aus dem Volumenanteil der partikulären Stoffe, im Folgenden als Zellvolumen bezeichnet, und dem Volumenanteil der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit zusammen, im Folgenden als Flüssigkeitsvolumen bezeichnet. Aufgrund der elektrisch isolierenden Wirkung der partikulären Stoffe ist die elektrische Leitfähigkeit κ der Suspension proportional zum relativen Flüssigkeitsanteil:
κ ~ Flüssigkeitsvolumen/Gesamtvolumen

Die Zellkonzentration läßt sich dann in folgender Weise bestimmen: Zellvolumen/Gesamtvolumen = (κref – κ)/κref = 1 – κ/κref wobei κ_ref der elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe, im Folgenden auch als Referenzflüssigkeit bezeichnet, entspricht.

Die obigen Formeln dienen der Veranschaulichung der grundsätzlichen Verhältnisse beim vorliegenden Verfahren. Die beim dem Verfahren durchgeführten Berechnungen können abhängig von der eingesetzten Technik der Leitfähigkeitsmessung jedoch auch von diesen Formeln abweichen.

Das Verfahren erfordert lediglich die Durchführung von zwei elektrischen Leitfähigkeitsmessungen (oder die Messung Größe, die ein Maß für den Unterschied dieser Leitfähigkeiten ist; vgl. z.B. die obige Gleichung) bei fester Wechselspannungsfrequenz (Messfrequenz), wobei auch eine Messung bei Gleichspannung möglich ist. Der für die Durchführung der Messung erforderliche technische Aufwand ist daher gering. Das Verfahren erfordert keine aufwendigen Geräte, insbesondere keine teure HF-Elektronik, und lässt sich auch für die Bestimmung des Volumenanteils bei hohen Konzentrationen der partikulären Stoffe ohne weiteres einsetzen.

Mit dem vorliegenden Verfahren und der zugehörigen Vorrichtung lassen sich in vorteilhafter Weise Zellkonzentrationen biologischer Zellen in Zellsuspensionen mit geringem technischen Aufwand bestimmen, da die Zellen aufgrund der elektrisch isolierenden Zellmembran/Zellwand als elektrische Isolatoren wirken. Dies gilt vor allem für Messfrequenzen unterhalb von etwa 100 kHz, wobei diese Grenze von der Art der Zellen abhängig ist. Vorzugsweise erfolgt die Messung beim vorliegenden Verfahren bei Wechselspannungsfrequenzen unterhalb von 1 kHz.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird die Referenzflüssigkeit direkt aus der zu vermessenden Suspension gewonnen. Dies kann beispielsweise durch Zellaufschluss, Sedimentation oder Filterung erfolgen. Die Referenzmessung sollte hierbei möglichst unter identischen Bedingungen erfolgen wie die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Suspension selbst. Diese Bedingungen betreffen die Messfrequenz, das Material sowie die Geometrie der Elektroden zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit, die Temperatur sowie das elektrische Verhalten und die Leitungsführung bei der elektrischen Leitfähigkeitsmessung.

Vorzugsweise werden die Referenzmessung und die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Suspension gleichzeitig oder unmittelbar nacheinander durchgeführt, so dass Temperaturschwankungen die Bestimmung des Volumenanteils der partikulären Stoffe nicht beeinträchtigen. Dies gilt auch für Schwankungen in der Zusammensetzung, insbesondere der Ionenkonzentration, der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit, wenn die Referenzflüssigkeit bei der Messung nur durch einen Filter für die suspendierten partikulären Stoffe von der Suspension getrennt wird.

Die vorliegende Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfasst einen Träger, auf dem zwei Elektrodenanordnungen zur räumlich getrennten Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Referenzflüssigkeit (Referenzmessung) und der elektrischen Leitfähigkeit der Suspension – oder einer Größe, die ein Maß für den Unterschied dieser Leitfähigkeiten repräsentiert – angeordnet sind, und eine Auswerteeinrichtung, die den Volumenanteil der partikulären Stoffe auf Basis des Unterschieds der beiden elektrischen Leitfähigkeiten bestimmt, insbesondere berechnet. Die Elektrodenanordnungen sind mit einer Messeinrichtung verbunden, mit der die beiden Leitfähigkeitsmessungen oder die Messung der genannten Größe bei Gleichspannung oder bei einer Wechselspannungsfrequenz durchgeführt werden können.

Die beiden Elektrodenanordnungen sind hierbei, insbesondere hinsichtlich des Elektrodenmaterials sowie der Elektrodengeometrie, vorzugsweise identisch ausgebildet. In der bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung ist eine der beiden Elektrodenanordnungen von einem Filter umschlossen, der ein Eindringen der zu vermessenden partikulären Stoffe verhindert.

Die beiden Elektrodenanordnungen können beispielsweise als Zwei- oder als Vierelektrodenanordnungen ausgebildet sein. Bei den Elektroden kann es sich beispielsweise um nadel- oder ringförmige Elektroden handeln.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Vorrichtung werden zwei Vierelektrodenanordnungen eingesetzt, wobei zwei von den für die Stromführung eingesetzten Elektroden jeder Elektrodenanordnung elektrisch miteinander verbunden sind. Dadurch verringert sich zum einen die Anzahl elektrischer Anschlüsse. Zum anderen kann bei dieser Ausgestaltung auf eine Strommessung verzichtet werden, da der gleiche Strom sowohl für die Messung an der Suspension als auch für die Referenzmessung genutzt wird und sich somit auf das Endergebnis nicht auswirkt.

Die direkten oder indirekten Leitfähigkeitsmessungen lassen sich beim vorliegenden Verfahren auch mit anderen Vorrichtungen oder Messtechniken durchführen, beispielsweise mit der Technik der induktiven Leitfähigkeitsmessung. Die Messung kann grundsätzlich bei beliebiger Frequenz durchgeführt werden, wobei die Impedanz von Zellen mit steigender Messfrequenz, abhängig von der Art der Zellen etwa ab 100 kHz, abnimmt, so dass dann entsprechende Korrekturen durchgeführt werden müssen.

Neben der separaten Widerstands- bzw. Leitfähigkeitsmessung in der Suspension und der Referenzflüssigkeit und den anschließenden Berechungen aus diesen Werten sind auch andere Techniken einsetzbar, beispielsweise die Erfassung einer Größe, die ein Maß für den Unterschied der elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, über eine elektrische Brückenschaltung oder über eine Verstärkerschaltung, deren Verstärkung mit dem Quotienten der beiden elektrischen Widerstände der Suspension und der Referenzflüssigkeit variiert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das vorliegende Verfahren und die zugehörige Vorrichtung werden nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen nochmals kurz erläutert. Hierbei zeigen:
1 ein Beispiel für eine Messanordnung zur Bestimmung des Volumenanteils von Zellen in einer Zellsuspension gemäß dem vorliegenden Verfahren;
2 ein Beispiel für eine Vierelektrodenanordnung zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit; und
3 ein Beispiel für eine Ausgestaltung der beiden Elektrodenanordnungen der vorliegenden Vorrichtung.
Wege zur Ausführung der Erfindung
1 zeigt ein Beispiel für eine Messanordnung zur Bestimmung des Volumenanteils von Zellen in einer Zellsuspension 1, die sich in diesem Beispiel in einem Behältnis 2 befindet. Für die Bestimmung des Volumenanteils der Zellen in der Zellsuspension 1 wird in diesem Beispiel ein Messsensor 3 eingesetzt, der zwei Elektrodenanordnungen 5, 6 auf einem Träger 4 aufweist. Die erste Elektrodenanordnung 5 dient der Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Zellsuspension 1. Die zweite Elektrodenanordnung 6 dient der Referenzmessung in der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit der Suspension 1 ohne die darin suspendierten Zellen. Zu diesem Zweck ist die zweite Elektrodenanordnung 6 von einem Filter 7 vollständig umschlossen, der die Zellen der Zellsuspension 1 zurückhält. In dem durch den Filter 7 eingeschlossenen Volumen befindet sich daher nur die elektrische leitfähige Flüssigkeit der Zellsuspension 1, d.h. die Referenzflüssigkeit. Die Messung der elektrischen Leitfähigkeiten erfolgt durch Anlegen einer Spannung mit einer geeigneten Messfrequenz an die beiden Elektrodenanordnungen. Diese Elektrodenanordnungen sind hierfür über das Anschlußkabel 8 des Messsensors 3 mit einer Messeinrichtung 14 verbunden.
Aus der Messung der beiden elektrischen Leitfähigkeiten, der Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Suspension 1 sowie der Referenzmessung, kann dann in einer Auswerteeinrichtung 15 der Volumenanteil der Zellen in der Zellsuspension 1 berechnet werden. Da im vorliegenden Beispiel die Messungen gleichzeitig und in dem gleichen Medium erfolgen, wirken sich bei der Messung der elektrischen Leitfähigkeiten andere Einflussfaktoren, wie Schwankungen der Temperatur oder der Ionenkonzentration, auf beide Messungen in gleicher Weise aus und kompensieren sich somit zumindest annähernd.
2 zeigt ein Beispiel für eine typische Vierelektrodenanordnung, wie sie als erste und zweite Elektrodenanordnung beim Beispiel der 1 eingesetzt werden kann. Bei einer derartigen Elektrodenanordnung mit vier Elektroden 12, 13 wird durch die Stromquelle 9 ein Strom in die zu vermessende Zellsuspension zwischen den beiden äußeren Elektroden 12 eingeprägt und über eine Strommesseinrichtung 10 gemessen. Die zwischen den beiden inneren Elektroden 13 dann anliegende Spannung wird über eine Spannungsmesseinrichtung 11 hochohmig gemessen. Aus dieser Spannungsmessung kann dann der spezifische Widerstand der Zellsuspension oder, bei der Referenzmessung, der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit bestimmt werden.
Bei dem Einsatz eines Messsensors 3 wie dem der 1 ist es von Vorteil, die beiden Elektrodenanordnungen 5 und 6 geeignet miteinander zu verschalten, wie dies in der 3 angedeutet ist. In diesem Beispiel sind zwei der äußeren Elektroden 12 für die der beiden Elektrodenanordnungen 5, 6 miteinander verbunden. Auf diese Weise ist eine separate Strommessung nicht mehr erforderlich, da sowohl für die Referenzmessung als auch für die Messung in der Suspension der gleiche Strom genutzt wird. Weiterhin werden durch eine derartige Anordnung elektrische Anschlüsse eingespart, da in diesem Fall nur sechs statt der sonst erforderlichen acht Anschlüsse vorgesehen werden müssen.

1: Zellsuspension
2: Behältnis
3: Messsensor
4: Träger
5: erste Elektrodenanordnung
6: zweite Elektrodenanordnung für Referenzmessung
7: Filter
8: Anschlusskabel
9: Stromquelle
10: Strommesseinrichtung
11: Spannungsmesseinrichtung
12: äußere Elektroden
13: innere Elektroden
14: Messeinrichtung
15: Auswerteeinrichtung

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Volumenanteils von elektrisch isolierenden partikulären Stoffen, insbesondere von biologischen Zellen, in einer elektrisch leitfähigen Flüssigkeit, mit der die partikulären Stoffe eine Suspension (1) bilden, bei dem eine elektrische Leitfähigkeit der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe und eine elektrische Leitfähigkeit der Suspension oder eine Größe, die ein Maß für einen Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, bei Gleichspannung oder bei einer Wechselspannungsfrequenz direkt oder indirekt gemessen werden und der Volumenanteil der partikulären Stoffe auf Basis des Unterschiedes der beiden elektrischen Leitfähigkeiten bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden elektrischen Leitfähigkeiten gleichzeitig gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch leitfähige Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe durch Filterung aus der Suspension (1) erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterung in der Suspension (1) erfolgt, so dass die elektrisch leitfähige Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe und die Suspension bei der Messung der beiden elektrischen Leitfähigkeiten oder der Größe, die ein Maß für den Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, durch einen Filter voneinander getrennt sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass für die Messung der elektrischen Leitfähigkeiten oder der Größe, die ein Maß für den Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, ein Messsensor (3) eingesetzt wird, auf dem sowohl Elektroden (12, 13) für die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe als auch Elektroden (12, 13) für die Messung der elektrischen Leitfähigkeit der Suspension (1) oder der Größe, die ein Maß für den Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, angeordnet sind.
Vorrichtung zur Bestimmung des Volumenanteils von elektrisch isolierenden partikulären Stoffen, insbesondere von biologischen Zellen, in einer elektrisch leitfähigen Flüssigkeit, mit der die partikulären Stoffe eine Suspension (1) bilden, mit – einem Träger (4), auf dem zwei Elektrodenanordnungen (5, 6) zur räumlich getrennten Messung einer elektrischen Leitfähigkeit der elektrisch leitfähigen Flüssigkeit ohne die partikulären Stoffe und einer elektrischen Leitfähigkeit der Suspension (1) oder einer Größe, die ein Maß für einen Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, angeordnet sind, – einer Messeinrichtung (14) zur direkten oder indirekten Messung der beiden elektrischen Leitfähigkeiten oder der Größe, die ein Maß für den Unterschied der beiden elektrischen Leitfähigkeiten repräsentiert, mit den Elektrodenanordnungen (5, 6) bei Gleichspannung oder bei einer Wechselspannungsfrequenz und – einer Auswerteeinrichtung (15), die den Volumenanteil der partikulären Stoffe auf Basis des Unterschieds der beiden elektrischen Leitfähigkeiten bestimmt.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine der beiden Elektrodenanordnungen (5, 6) von einem Filter (7) umschlossen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Elektrodenanordnungen (5, 6) als Vierelektrodenanordnungen ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zwei einer Stromführung dienende Elektroden (12) der beiden Elektrodenanordnungen (5, 6) elektrisch miteinander verbunden sind.