DE102006004829A1

DE102006004829A1 - Gewinnung von Glucosinolaten aus Exsudaten von Capparales

Info

Publication number: DE102006004829A1
Application number: DE102006004829A
Authority: DE
Inventors: Iryna Smetanska; Monika Schreiner; Dietrich Knorr; Angelika Krumbein; Ilona Schonhof; Kersten Maikath
Original assignee: INST GEMUESE und ZIERPFLANZENB; Institut fur Gemuese- und Zierpflanzenbau Ev
Current assignee: INST GEMUESE und ZIERPFLANZENB; Institut fur Gemuese- und Zierpflanzenbau Ev
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2006-01-31
Publication date: 2007-08-09
Also published as: WO2007088024A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales, umfassend die Schritte: (a) Anzucht der Pflanze in einem erdfreien System; (b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt; (c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitors; (d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze. Daneben betrifft die Erfindung die nach dem Verfahren gewonnenen Glucosinolate sowie deren Verwendung zur Nahrungsergänzung, als Ausgangs- bzw. Rohstoff für Functional Food oder als Pharmazeutikum.

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das technische Umfeld der sekundären Pflanzenstoffe, insbesondere in Pflanzen erzeugte pharmazeutisch wertvolle Verbindungen, die als Arzneimittel oder Nahrungsergänzung verwendet werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat aus Pflanzen der Ordnung Capparales sowie die derart gewonnenen Glucosinolate und deren Verwendung zur Nahrungsergänzung oder als Pharmazeutikum.

Hintergrund der Erfindung

Pflanzen sind eine wertvolle Quelle für sekundäre Pflanzenstoffe bzw. sekundäre Metabolite, von denen viele als Nahrungsergänzung in so genanntem „fuctional food" ebenso wie als Ausgang- oder Rohstoffverbindungen für pharmazeutisch aktive Verbindungen (Pharmaceuticals) und gesundheitsfördernde Verbindungen verwendet werden können. (Mulabagal und Tsay, 2004; Borisjuk et al., 1999). Die Gewinnung von sekundären Metaboliten erfolgt herkömmlich aus pflanzlichem Rest- bzw. Abfallmaterial, das nicht für den Verzehr geeignet ist. Beispiele hierfür sind Brokkoli- oder Blumenkohlstiele, äußere Kohlblätter und Rübengrün, das mechanisch zerkleinert und aufgeschlossen wird, um die gewünschten Pflanzeninhaltsstoffe zu extrahieren. In diesem Pflanzenmaterial sind oft nur sehr geringe Konzentrationen an sekundären Pflanzenstoffen, so dass große Mengen Ausgangsmaterial verwendet werden müssen. Deshalb wurden Verfahren entwickelt, um sekundäre Metabolite aus einzelnen Pflanzenorganen zu extrahieren. Beispielsweise können sekundäre Metabolite aus Exsudaten von Pflanzen erhalten werden.

Aufgrund ihrer gesundheitsfördernden Wirkungen, insbesondere ihrer antikanzerogenen Eigenschaften sind Glucosinolate und ihre hydrolysierten Produkte pharmakologisch und ernährungsphysiologisch interessant (Talalay und Fahrey, 2001; Zhang, 2001). Glucosinolate sind eine Gruppe von pflanzlichen Verbindungen, die in der Ordnung der Capparales, zu der die landwirtschaftlich wichtigen Gemüsepflanzen der Familie Brassicaceae gehören, gefunden werden. Glucosinolate bestehen aus einer β-D-Thioglucose reduzierten Gruppe, einem sulfonierten Oximrest und einer variablen Seitenkette, die von Aminosäuren abgeleitet ist (Kneer et al., 1999). Basierend auf der chemischen Struktur ihrer Seitenketten werden die Glucosinolate in verschiedene Klassen wie aliphatische Glucosinolate, aromatische Glucosinolate und Indolglucosinolate eingeteilt (Bennett et al., 1994; Vallejo et al., 2003).

Die WO 98/27806 A1 beschreibt eine Brassica Pflanze, die einen künstlich erzeugten, gegenüber der Wildtyp Pflanze erniedrigten Glucosinolat Gehalt enthält. Hohe Mengen an Glucosinolaten werden aufgrund ihrer toxischen Nebenprodukte als unerwünscht erachtet, weil sie das Enzym Myrosinase negativ beeinflussen. Myrosinase ist jenes Enzym, das bei Aufschluss der Brassica Pflanze freigesetzt wird und den Abbau der Glucosinolate zu Glucose, Thiocyanaten, Isothiocyanaten und Nitrilen katalysiert.

Die WO 94/19929 A2 betrifft ebenfalls Brassica Pflanzen mit verringertem Glucosinolat Gehalt. Es werden Brassica Samen mit einem reduzierten Glucosinolat Gehalt von maximal 3,4 mmol pro Gramm Samen erzeugt. Diese Samen können besonders geeignet als Tierfutter verwendet werden und sind dort vorteilhaft, weil weniger Abbauprodukte der Glucosinolate den Nährwert des Tierfutters verringern. Die Verringerung der Glucosinolate erfolgt durch gezielten Eingriff in deren Biosyntheseweg.

Die WO 2004/089065 A1 beschreibt eine Brassica Pflanze mit erhöhtem Glucosinolat Gehalt, der aufgrund der antikanzerogenen Eigenschaften der Glucosinolate angestrebt wird. Offenbart ist ein Verfahren zur Herstellung von Brassica Pflanzen mit erhöhtem Glucosinolat Gehalt in essbaren Pflanzenteilen, wie beispielsweise Brokkoli, Blumenkohl und Kohl. Zur Gewinnung der Glucosinolate werden alle oberirdischen Pflanzenteile geerntet, zerstört und mechanisch sowie enzymatisch aufgeschlossen. Nachteilig ist der geringe Glucosinolat Gehalt in oberirdischen Pflanzenteile der Brassica Pflanzen.

Die FR 2 819 376 A1 beschreibt Brassica Pflanzen mit einem erhöhten Gehalt an Glucosinolaten. Die Pflanzen entstehen durch gezielte Kreuzung und Züchtung. Für die Isolierung der Glucosinolate werden die Pflanzen geerntet, zerstört und aufgeschlossen. Nachteilig an diesem Verfahren ist die Zerstörung der Ausgangspflanze, so dass stets neues Pflanzenmaterial bereitgestellt werden muss.

Die WO 99/52345 A1 beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Brassica Pflanze mit erhöhtem Gehalt an antikanzerogenen Glucosinolat Derivaten. Die Glucosinolate werden aus gefriergetrocknetem Material gewonnen. Nachteilig ist insbesondere, dass der Glucosinolat Gehalt in oberirdischen Pflanzenteilen von Brassica Pflanzen relativ gering ist.

Somit besteht ein Bedarf an einem wirksamen Verfahren zur Gewinnung von Glucosinolaten aus Pflanzen der Ordnung Capparales, bei dem die Ausgangspflanze bei der Gewinnung der Glucosinolate nicht zerstört werden muss. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch das Bereitstellen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexudaten mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales gelöst, das in den Patentansprüchen angegeben ist und das im Folgenden detaillierter beschrieben wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales, umfassend die Schritte:

(a) Anzucht der Pflanze in einem erdlosen System;
(b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt;
(c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitors;
(d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze.

Daneben betrifft die Erfindung die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Glucosinolate sowie deren Verwendung zur Nahrungsergänzung, als Ausgangs- bzw. Rohstoff für Nahrungsergänzungsmittel (functional food) oder als Pharmazeutikum.

Kurzbeschreibung der Figuren

1 zeigt eine Graphik der Glucosinolate, die aus Wurzelexsudaten aus Rübenpflanzen (Brassica rapa) nach 30 Tagen Wachstum im hydroponischen System gewonnen wurden. 1H – Hoagland Lösung, 2H – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung, 2H2S – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel, 2H2S-SA₀ – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen (appliziert) am Anfang, 2H2S-MJ₀ – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Methyljasmonat, aufgetragen am Anfang, 2H2S-SA₂₅ – zweifach konzetrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen (appliziert) am 25. Tag des Experiments.

2 zeigt die aliphatischen, aromatischen und Indolglucosinolate, die in 30 Tagen von den Rübenpflanzen (Brassica rapa), die im hydroponischen System angezogen wurden, exsudiert wurden. Dunkle Balken: aliphatische Glucosinolate, hellgraue Balken: aromatische Glucosinolate; mittelgraue Balken: Indolglucosinolate; Bedeutungen der Abkürzungen wie in 1.

3 zeigt die Kinetik der Glucosinolat Exsudation an Rübenpflanzen (Brassica rapa, var. rapifera, subvar. pigmeae teltowiensis), die im hydropoischen System angezogen wurden. Linke Seite, 3a: ohne Elicitoren, rechte Seite, 3b: mit Elicitoren; C = Kontrolle (= 2H2S – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel, ohne Elicitoren Behandlung); Bedeutung der Abkürzungen wie in 1.

4 zeigt die Dynamik des Gesamt Glucosinolat Gehalts in Exsudaten der Rübenpflanze (Brassica rapa, var. rapifera, subvar. pigmeae teltowiensis). SA: Salicylsäure, MJ: Methyljasmonat.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

(a) Anzucht der Pflanze in einem erdlosen System;
(b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt;
(c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitons;
(d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze.

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem wissenschaftlichen Befund, dass bei Anzucht (= Kultuvierung) einer Pflanze der Ordnung Capparales in einem erdlosen (= erdfreien) System, der eine spezielle Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt verabreicht wird, durch Stimulation der Glucosinolat Bildung bzw. Ausbildung über Elicitoren Glucosinolate aus Wurzelexsudaten auf einfache Weise und in hoher Konzentration gewonnen werden können. Außerdem muss die Pflanze zur Ge winnung der Glucosinolate nicht zerstört werden, so dass es sich um ein nicht destruktives Verfahren handelt.

Ohne durch irgendeine Theorie gebunden oder eingeschränkt zu sein, nehmen die Erfinder der vorliegenden Erfindung an, dass der erhöhte Schwefelgehalt der Nährlösung zusammen mit den verabreichten Elicitoren kombinatorisch die Pflanze zu einer erhöhten Glucosinolat Bildung stimuliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den besonderen Vorteil, dass die Pflanze zur Gewinnung der Glucosinolate nicht geerntet und zerstört werden muss. Vielmehr können die Glucosinolate kontinuierlich aus ein und derselben Pflanze aus den Wurzelexsudaten gewonnen werden. Damit ist dieses Verfahren kostengünstig, weil kein neues pflanzliches Ausgangsmaterial – wie in den Verfahren des Standes der Technik – zur Gewinnung der Glucosinolate bereitgestellt werden muss. Daneben ist die Glucosinolat Expression durch Verwendung der erfindungsgemäßen Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt zusammen mit den Elicitoren gerade in den Wurzeln der Pflanzen erhöht. Dadurch wird die Gewinnung der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten besonders interessant, so dass auf aufwändigen Aufschluss und die Isolierung der Glucosinolate – wie im Stand der Technik beschrieben – aus den oberirdischen Pflanzenteilen verzichtet werden kann.

So wie hier verwendet bedeutet der Begriff „erhöhter Schwefelgehalt" einen Schwefelgehalt, der höher liegt als in einfacher Hoagland Lösung. Insbesondere ist ein Schwefelgehalt von zwischen ca. 300 mg/l bis ca. 1.000 mg/l ein „erhöhter Schwefelgehalt".

So wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Exsudat aus Wurzeln" bzw. "Wurzelexsudat" die vorwiegend flüssigen Ausscheidungsprodukte der lebenden Pflanzenwurzel. Die Exsudate werden von der Pflanzenwurzel vorwiegend kontinuier lich abgegeben, so dass sie aufgefangen und ihre Inhaltsstoffe konzentriert und analysiert werden können.

Der Begriff "Elicitor" bzw. "Elicitoren" bezeichnet auslösende, spezifische Substanzen. "Elicitoren" leitet sich von Lat.: Elegere = Auslesen, Auswählen ab. Elicitoren sind Substanzen pflanzlichen Ursprungs, die ein Abwehrsystem bzw. eine Abwehrantwort induzieren. Sie induzieren hypersensitive Antworten, Ligninbildung sowie schützende Proteine können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Elicitoren insbesondere Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) verstanden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Glucosinolate aliphatische Glucosinolate, aromatische Glucosinolate und/oder Indolglucosinolate. Alle Glucosinolate weisen eine β-D-Thioglucose reduzierte Gruppe, eine sulfonierte Oximeinheit und eine variable Seitenkette, die von Aminosäuren abgeleitet ist, auf. Die aliphatischen Glucosinolate sind insbesondere von den Aminosäuren Methionin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin abgeleitet. Die aromatischen Glucosinolate stammen insbesondere von Tyrosin und Phenylalanin als der grundliegenden Aminosäure ab. Die Indolglucosinolate können insbesondere von Tryptophan abgleitet sein.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die aliphatischen Glucosinolate ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Progoitrin, Gluconapin, Gluconapoleiferin, Glucobrassicanapin; Sinigrin; Glucoalyssin und Glucoraphanin; die Indolglucosinolate sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 4-Hydroxy-Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin, Neoglucobrassicin und Glucobrassicin; und das aromatische Glucosinolat ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gluconasturtiin und Glucotropaeolin.

Indolglucosinolate, insbesondere Glucobrassicin und seine Derivate sind bevorzugt, weil sie besonders gut als Antikrebsmittel eingesetzt werden können. Auch von den aromatischen Glucosinolaten Gluconasturtiin und Glucotropaeolin wird angenommen, dass sie starke antikanzerogene Stoffe sind, weshalb sie ebenfalls bevorzugt sind. Das aliphatische Glucosinolat 4-Methylsulfinylbutylisothiocyanat (als Derivat von Glucoalyssin) induziert die Entgiftung von Enzymen, wie Chinonreduktase und Glutathiontransferase, die beide in der Unterdrückung von Krebszellen wirken.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Wurzeln primäre und/oder sekundäre Wurzeln der Pflanze. Die primäre Wurzel weist eine Rhizodermis, eine primäre Rinde, eine Endodermis, einen Perizykel mit Seitenwurzeln für ein sekundäres Dickenwachstum sowie ein Periderm, radiale Leitbündel sowie eine Rinde um den Zentralzylinder auf. Sekundäre Wurzeln sind Wurzeln, die dem Spross und nicht der Primärwurzel entspringen. Beide Arten von Wurzeln sind für die Erfindung in besonderer Weise geeignet, weil sie einen erhöhten Gehalt an vorteilhaften Glucosinolaten aufweisen.

Neben der Funktion als Organ für die Nährstoffaufnahme ist die Pflanzenwurzel auch in der Lage eine Vielzahl von Verbindungen in die Wurzelumgebung auszuscheiden. In einjährigen Pflanzenspezies wird 30 bis 60 % des photosynthetisch fixierten Kohlenstoffs in die Wurzeln gebracht, und der beachtliche Anteil von bis zu 70 % dieses Kohlenstoffs kann über die Wurzel in die Rhizosphäre abgegeben werden. Neben der Extraktion von Pflanzenorganen können Stoffe auch aus Exsudaten von Pflanzen erhalten werden. Besonders vorteilhaft sind hier Wurzelexsudate. Für die kommerzielle Verwendung können manche sekundäre Metabolite durch kontinuierliche Rhizosekretion aus den Wurzeln von hydroponisch (siehe unten) angezogenen Pflanzen gewonnen werden.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Glucosinolate aus den Wurzeln lebender Pflanzen, vorzugsweise durch Rhizosekretion gewonnen. Die Verwendung von Wurzeln von lebenden Pflanzen besitzt den besonderen Vorteil, dass das Ausgangsmaterial kontinuierlich verwendet werden kann. Im Gegensatz zu vielen Verfahren des Standes der Technik, in denen grünes Pflanzenmaterial verwendet wird, das mechanisch und/oder enzymatisch aufgeschlossen und durch die Glucosinolat Gewinnung verbraucht wird, können die Pflanzen in der vorliegenden Erfindung ständig weiter verwendet werden. Wenn ein und dieselbe Pflanze über mehrere Wochen bzw. Monate für die Gewinnung von Glucosinolaten verwendet wird, ist dies besonders umweltfreundlich und wirtschaftlich. Vorzugsweise wird das Verfahren der Rhizosekretion verwendet, bei dem gewünschte sekundäre Pflanzenstoffe (= Metabolite) in das umgebende Medium abgegeben wird, was insbesondere Vorteile bei der anschließenden Reinigung und Gewinnung des segregierten Stoffes besitzt.

In einer weiteren Ausführungsform ist die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Pflanze eine Pflanze der Ordnung Capparales. Die Pflanze kann ferner ausgewählt sein, aus der Gruppe bestehend aus Capparaceae, Brassicaceae, Resedaceae und Tropaeolaceae.

Beispiele der Mitglieder der Familie Brassicaceae (= Kreuzblütler) sind Brassica (Kohl), Sinapis (Senf), Raphanus (Rettich), Lepidium (Kresse), Cardaria (Pfeilkresse), Capsella (Hirtentäschel), Camelina (Leindotter), Arabis (Gänsekresse), Cardaminopsis (Schaumkresse), Nasturdium (Brunnenkresse), Rorippa (Sumpfkresse), Erysimum (Schöterich), Arabidopsis (Schmalwand) und Sisymbrium (Rauke).

Als besonders vorteilhaft hat sich die Rübe, Brassica rapa erwiesen. Besonders gut kann die Varietät Brassica rapa L. var. Teltow verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem erdlosen (= erdfreien) System durchgeführt. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, das erdfreie System als aeroponisches oder hydroponisches System auszugestalten.

Als erdfreie Systeme eignen sich insbesondere wasserbasierte Systeme, so dass die Glucosinolate aus den Wurzelexsudaten gewonnen werden können. Im aeroponischen System werden die Wurzeln ständig über angefeuchtete Luft mit Nährstoffen versorgt. Die Nährstofflösung wird als feuchter Staub in kurzen Intervallen, für gewöhnlich Intervalle von wenigen Minuten, aufgesprüht. Die Lösung wird von einem Vorratstank entnommen und durch eine Pumpe über einen extrem genauen Timer in sehr kurzen Zyklen, die von wenigen Sekunden bis einigen Minuten reichen, an die Pflanzen verabreicht.

In einer vorteilhaften Ausführungsform ist das aeroponische System mit mindestens einer Sprühvorrichtung versehen. In diesem System werden die Wurzeln in einem Film bzw. Nebel aus Nährlösung gehalten, der nahezu 100 % relative Luftfeuchtigkeit sicherstellt, um das Austrocknen der Pflanzenwurzeln zu verhindern. Besonders vorteilhaft kann eine Sprühvorrichtung des Typs Dan Fogger 7800, Dan Sprinklers, Kibbutz Dan, Israel verwendet werden. Insbesondere kann die Nährstofflösung mit einer zweistufigen Zentrifugalpumpe gepumpt werden. Zunächst wird die Flüssigkeit von dem Vorratstank über einen Filter auf das Pflanzenbett gepumpt, von wo aus sie in den Tank zurückfließt.

Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, die Nährlösung konstant über die Sprüher aufzusprühen. Dieses Vorgehen ist nicht typisch für ein aeroponisches System, das mit einer Sprühvorrichtung ausgestattet ist, die für gewöhnlich mit Intervallen in Minutenabständen arbeiten. Es hat sich jedoch aufgrund der Wurzelstrukturen als vorteilhaft erwiesen, den Wassergehalt nicht durch ein Intervall abzusenken. Der Druck der Pumpe beträgt vorteilhafterweise 2 bar, was um ca. die Hälfte gegenüber Werten aus dem Stand der Technik erniedrigt ist. Dieser niedrige Pumpendruck hat sich als vorteilhaft für die Wurzeln erwiesen, die durch höheren Pumpendruck mechanisch beschädigt werden können.

In einer alternativen Ausführungsform ist das aeroponische System mit mindestens einem Defensor ausgestattet. Vorteilhafterweise bildet der rotierende Defen sor einen sehr feinen Feuchtigkeitsnebel. Die Wasserpartikel liegen in der Größenordnung von ca. 5–10 μm. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Pumpe alle 15 Minuten angeschaltet wird und sich danach 30 Minuten Ruhephase anschließen.

Die Pflanzen werden vorteilhafterweise im hydroponischen oder aeroponischen System kultiviert. Borisjuk (1999) schlägt vor, Pflanzen für Exsudate in hydroponischen Systemen anzuziehen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch die Beobachtung gemacht, dass sich ein aeroponisches System hervorragend eignet, weil die Menge an Wasser im System minimiert werden kann. Auf diese Weise ist es möglich, eine von Beginn an vergleichsweise hohe Exsudatkonzentration zu erhalten, so dass die Gewinnung der Glucosinolate aus den Exsudaten über weniger aufwändige Reinigungs- und Konzentrationsstufen erfolgen kann. Somit ist das aeroponische System besonders wirtschaftlich, weil die Betriebskosten geringer sind.

In einer alternativen Ausführungsform wird ein hydroponisches System mit einer schwimmenden Plattform, vorzugsweise in Form einer Styroporplatte verwendet, wobei die Pflanzen direkt in der schwimmenden Plattform verankert sind, die auf der Oberfläche der Nährstofflösung schwimmt. Das hydroponische System kann mit Hilfe eines Kompressors belüftet werden, der Luftblasen durch die Nährstofflösung in einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr 100 ml/min. an jeder der ca. zehn Belüftungsröhren realisiert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nährlösung eine ca. 1,5-fach bis ca. 3-fach konzentrierte Hoagland Lösung, wobei eine ca. 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung besonders bevorzugt ist.

Es hat sich insbesondere herausgestellt, dass der Schwefelgehalt der Hoagland Lösung deutlich erhöht werden muss, um optimale Ausbeuten an Glucosinolaten zu erhalten. Insbesondere wird der Schwefel (S) als Sulfat (SO₄) direkt zu der Nährstofflösung hinzugegeben. Insbesondere eignen sich die Salze MgSO₄, ZnSO₄ und/oder CuSO₄. Möglich ist auch die Verwendung von K₂SO₄, Na₂SO₄ und/oder FeSO₄.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Nährlösung folgende Bestandteile, bezogen auf 1 l auf:

– ca. 610 mg bis ca. 1.230 mg Ca(NO₃)₂;
– ca. 456,7 mg bis ca. 909,3 mg KNO₃;
– ca. 23,1 mg bis ca. 46,2 mg Eisenchelat (FeChe);
– ca. 204 mg bis ca. 408 mg KH₂PO₄;
– ca. 339,3 mg bis ca. 1.000 mg MgSO₄ × 7 H₂O;
– ca. 2,1 mg bis ca. 4,3 mg H₃BO₃;
– ca. 0,7 mg bis ca. 1,3 mg MnCl₂;
– ca. 0,09 mg bis ca. 0,2 mg ZnSO₄;
– ca. 0,04 mg bis ca. 0,08 mg CuSO₄; sowie
– ca. 0,12 mg bis ca. 0,24 mg H₂MoO₄.

In dieser Ausführungsform kann die MgSO₄ × 7 H₂O Menge in der großen Bandbreite von ca. 339,3 mg bis ca. 1.000 mg variiert werden.

– ca. 820 mg Ca(NO₃)₂;
– ca. 606,2 mg KNO₃;
– ca. 30,8 mg FeChe;
– ca. 272 mg KH₂PO₄;
– ca. 492,4 mg MgSO₄ × 7 H₂O;
– ca. 2,9 mg H₃BO₃;
– ca. 0,8 mg MnCl₂;
– ca. 0,1 mg ZnSO₄;
– ca. 0,05 mg CuSO₄; sowie
– ca. 0,16 mg H₂MoO₄.

Hierbei handelt es sich um eine 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die 1,5-fach bis ca. 3-fach konzentrierte Hoagland Lösung mit zusätzlichem Schwefel, vorteilhafterweise in Form von MgSO₄ × 7 H₂O ergänzt werden. Besonders bevorzugt enthält die Nährlösung ca. 984,6 mg MgSO₄ × 7 H₂O, bezogen auf 1 l Flüssigkeit.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden bestimmte vorteilhafte Elicitoren verwendet. Vorteilhafte Elicitoren sind glucosinolatbeeinflussende Elicitoren. Die Glucosinolat Profile können durch die physiologische Behandlung (= Applikation) mit/von Elicitoren beeinflusst werden. Elicitoren ahmen die Wirkungen von Stressfaktoren, wie den Befall von Pathogenen und Schädlingen nach und aktivieren dadurch das biochemische Verteidigungssystem der Pflanze, was zu quantitativen und qualitativen Veränderungen im Profil der sekundären Metabolite der Pflanze führt. Elicitoren beeinflussen auch die Genexpression und können deshalb als molekulare Werkzeuge verwendet werden, um die Glucosinolat Profile der Pflanze zu modifizieren.

Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) dienen als Signalmoleküle, die bei Pathogenbefall oder mechanischer Verletzung der Pflanze induziert werden. Die Anwendung von entweder Salicylsäure und/oder Methyljasmonat kann den Glucosinolat Gehalt in den Pflanzen stark verändern, insbesondere stark anreichern. Diese Elicitoren lösen Signalkaskaden aus, die verschiedene Verteidigungsantworten wie Zellwandverstärkung, Induktion von PR-Proteinen oder die Synthese von sekundären Metaboliten, wie Glucosinolaten durch Einflussnahme auf die Expression von Genen, in die Glucosinalat Synthese involviert sind, induzieren. Unter PR-Proteinen werden Pathogenese bezogene Proteine (= pathogenesis related proteins) verstanden, die in gesunden Pflanzen nicht nachweisbar sind und erst nach bestimmten Stressbedingungen akkumulieren. Darüber hinaus können Salicylsäure und Methyljasmonat wirksam den Gehalt an Indol, aliphatischen und aromatischen Glucosinolaten in Spezies der Ordnung Capparales erhöhen. Die Verwendung der Elicitoren Salicylsäure und Methyljasmonat ist insbesondere für Pflanzen der Spezies Brassica rapa vorteilhaft, wobei sich die kombinierte Anwendung besonders bewährt hat.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Elicitor/werden die E1icitoren zusammen mit der Nährlösung verabreicht. Auf diese Weise enthält die Nährlösung sowohl eine gewünschte Konzentration an Schwefel als auch die Elicitoren bzw. den Elicitor, so dass nur eine einzige Nährlösung verwendet werden muss, die daneben auch nur in einem einzigen Schritt angewendet wird. Ein kompliziertes An- und Abschalten verschiedener Nährlösungen bzw. Intervallschalten kann auf diese Weise vermieden werden.

In einer vorteilhaften Weiterbildung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Glucosinolaten aus Wurzelexsudaten den zusätzlichen Schritt des Reinigens und Konzentrierens der Glucosinolate. Weil die Glucosinolate von der Pflanze kontinuierlich über die Wurzelexsudate in das umgebende Nährlösungsmedium abgegeben werden, ist die Reinigung und Gewinnung der Glucosinolate sehr einfach. Beispielsweise kann eine HPLC verwendet werden.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Glucosinolate, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden. Die Glucosinolate sind insbesondere als Nahrungsergänzungsmittel, als Ausgangs- bzw. Rohstoffe für Functional Food oder als Pharmazeutika geeignet.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
A. Detaillierte Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Gesamtausbeute von Glucosinolaten in Exsudaten von Rübenpflanzen (Brassica rapa). Die Ausbeute stieg von 2,3 mg/Pflanze auf 7,8 mg/Pflanze. Die verwendeten Abkürzungen sind wie folgt: 1H – Hoagland Lösung, 2H – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung, 2H2S – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel, 2H2S-SA₀ – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen am Anfang, 2H2S-MJ₀ – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Methyljasmonat, aufgetragen am Anfang, 2H2S-SA₂₅ – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel plus Salicylsäure, aufgetragen am 25. Tag des Experiments.
Die Zunahme der Konzentration der Nährlösung bewirkte eine Steigerung des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten auf 3,8 mg/Pflanze, was einen 1,8-fachen Anstieg bedeutet. Die Verwendung von zusätzlichem Schwefel führte zu einer Zunahme des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten auf 4,6 mg/Pflanze. Wurden die Elicitoren Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) zusammen mit erhöhten Mengen an Schwefel verabreicht, stiegen die maximalen Glucosinolat Mengen auf 7,8 mg/Pflanze bzw. 7,3 mg/Pflanze. Eine Verabreichung der Elicitoren zu einem späteren Zeitpunkt des Pflanzenwachstums bewirkte keine derart starken Veränderungen im Vergleich zu der Verabreichung zu Beginn des Experiments: es wurden 6,6 mg/Pflanze Glucosinolate in Exsudaten ermittelt, bei denen Salicylsäure am 25. Tag des Experiments hinzugefügt wurde (2H2S-SA₂₅).
2 zeigt die Verteilung der aliphatischen, aromatischen und Indolglucosinolate bei Pflanzen, die für 30 Tage im hydroponischen System angezogen wurden. Die Zunahme der Nährstoffmenge steigerte die Menge der aliphatischen und aromatischen Glucosinolate, während die Menge an Indolglucosinolaten ungefähr gleich blieb. Zusätzlicher Schwefel steigerte vor allem die Ausbeute an aliphatischen Glucosinolaten. Die Zugabe der Elicitoren Salicylsäure und Methyljasmonat, die zu Beginn des Pflanzenwachstums hinzugefügt wurden, reduzierten den Gehalt an aliphatischen Glucosinolaten in Exsudaten. Die Verabreichung von Salicylsäu re am 25. Tag des Pflanzenwachstums änderte den Gehalt an aliphatischen Glucosinolaten nicht wesentlich.
Gluconasturtiin war das einzige aromatische Glucosinolat, das in Rübenpflanzen (Brassia rapa) identifiziert wurde. Sein Gehalt in den Exsudaten war 2-fach erhöht in einer doppelt konzentrierten Hoagland Lösung im Vergleich zu einer einfach konzentrierten Hoagland Lösung, und die Konzentration der aromatischen Glucosinolate wurde bei zusätzlicher Gabe von Schwefel reduziert. Die Zugabe von Salicylsäure und Methyljasmonat zu Beginn der Kultur (SA₀ und MJ₀) steigert den Gehalt von Gluconasturtiin um 50 bis 70 % im Vergleich zu 2H2S. Dies war auch bei Verabreichung von Salicylsäure am 25. Tag des Experiments der Fall.
Der Gehalt der Indolglucosinolate in Exsudaten änderte sich bei Anstieg der Konzentration der Hoagland Lösung praktisch nicht, aber er stieg um ca. 1,5-fach nach der Verabreichung von zusätzlichem Schwefel. Beide Elicitoren, Salicylsäure und Methyljasmonat, verabreicht zu Beginn der Kultur, bewirkten einen überraschend starken Anstieg der Indolglucosinolate in Exsudaten (3,3-fach mehr als von 2H2S für SA₀ und 2,8-fach mehr für MJ₀). Selbst bei Gabe von Salicylsäure am 25. Kulturtag stieg der Gehalt der Indolglucosinolate immer noch auf den 1,8-fachen Wert im Vergleich zu 2H2S. Der deutlich überproportionale Anstieg der Indolglucosinolate bei Verabreichung von Salicylsäure oder Methyljasmonat ist überraschend und wurde von den Erfindern nicht erwartet. Somit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Gewinnung von hohen Indolglucosinolaten, die besonders vorteilhaft in der Krebstherapie, als Nahrungsergänzungsmittel oder als Ausgangs- bzw. Rohstoff für Funcitonal Food verwendet werden können.
3 zeigt die Kinetik der Rhizosekretion, insbesondere die Kinetik von Glucosinolaten in Exsudaten von Pflanzen, die im hydroponischen System angezogen wurden. Die Untersuchungen der Exsudationskinetiken zeigte, dass der Gehalt an exsudierten Glucosinolaten in den ersten 10 Tagen des Experiments nicht we sentlich durch die Nährstoffkonzentration beeinflusst wurde (3 – linke Seite). Während der nächsten 10 Tage stieg der Gehalt der exsudierten Glucosinolate in jenen Pflanzen, die mit anfänglicher Hoagland Lösung (1H) behandelt wurden enbenso wie für jene, die mit der modifizierten, zweifach konzentrierten Hoagland Lösung behandelt wurden (2H). Zwischen dem 20. und dem 30. Tag des Versuchs stieg der Gehalt der Glucosinolate für 1H und 2H2S, aber er fiel für 2H leicht ab. Der Anstieg des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten nach der Verabreichung beider Elicitoren wurde bereits zu Beginn des Experiments beobachtet (3 – rechte Seite). In dem System, in dem MJ verwendet wurde, wurde der höchste Gehalt an exsudierten Glucosinolaten unmittelbar nach dem Behandlungsbeginn (3,1-fach gesteigert gegenüber der unbehandelten Variante) gemessen, während der Gehalt gegen Ende des Experiments schnell abfiel. Während der ersten 10 Tage nach der Salicylsäure Behandlung exsudierten die Pflanzen 2,4-fach mehr Glucosinolate als die Kontrollpflanzen ("C" = 2H2S – zweifach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerter Schwefel) ohne Elicitor Behandlung. Der Gehalt der Glucosinolate, die in dem Zeitraum zwischen dem 10. und dem 15. sowie zwischen dem 15. und dem 20. Tag des Experiments exsudiert wurde, betrug 2,1- bzw. 1,9-fach mehr als die Kontrolle im selben Zeitraum. Die Intensität der Exsudation verringerte sich für Salicylsäure behandelte Pflanzen ebenso wie für Methyljasmonat behandelte Pflanzen gegen Ende des Wachstums. Somit ist die pflanzliche Reaktion bzw. Antwort auf die Elicitoren Verabreichung eine einmalige Antwort bzw. ein einmaliges Ereignis, die/das während der ersten Tage nach der Behandlung stattfindet und anschließend schrittweise abfällt. Deshalb ist es insbesondere bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Elicitoren Behandlung mit Salicylsäure und/oder Methyljasmonat unmittelbar zu Beginn des Experiments durchzuführen, am besten den bzw. die Elicitoren zusammen mit der Nährlösung zu Beginn am Tag Null des Experiments zu verabreichen.
4 zeigt die Ergebnisse eines zu 3b parallel durchgeführten Versuchs, mit dem Unterschied, dass die Pflanzen im aeroponischen System angezogen wurden. Insbesondere ist die Behandlung mit Elicitoren gezeigt, die zu einer Verstär kung der Glucosinolat Rhizosekretion im Vergleich zur Kontrolle führte. Die Untersuchung der Exsudationskinetiken von sekundären Wurzeln zeigte, dass der Anstieg des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten nach der Verabreichung beider Elicitoren bereits unmittelbar nach dem Beginn des Experiments beobachtet wurde. Bei der Behandlung mit Methyljasmonat, wurde der höchste Gehalt an exsudierten Glucosinolaten unmittelbar nach der Behandlung gemessen, während der Glucosinolat Gehalt zum Ende des Experiments (Tag 30) abfiel. Der Glucosinolat Gehalt, der aus den Pflanzen während der ersten zehn Tage nach der Behandlung exsudiert wurde, betrug 2,1 mg/Pflanze und lag somit 3,1-fach über den Werten der Kontrolle. Zwischen dem 10. und dem 15. Tag ebenso wie zwischen dem 15. und 20. Tag fiel der Glucosinolat Gehalt auf 1,5 mg/Pflanze und betrug somit nur noch 2,0- bzw. 1,8-fach des Werts der Kontrolle. In den nächsten fünf Tagen lag er nahezu bei dem Wert der Kontrolle. Während der letzten fünf Tage des Pflanzenwachstums bei dieser Behandlung erreichte der Glucosinolat Gehalt einen Wert von 1,0 mg/Pflanze, der 0,2 mg/Pflanze unter dem Wert der Kontrolle lag. Während der ersten zehn Tage nach der Salicylsäure Verabreichung exsudierten die Pflanzen 1,6 mg/Pflanze Glucosinolate, was 2,4-fach über den Werten der Kontrolle lag. Der Gehalt der Glucosinolate, die während dem Zeitraum zwischen dem 10. und dem 15. sowie dem 15. und dem 20. Tag des Experiments exsudiert wurden, betrug 1,6 mg/Pflanze. Diese Werte liegen 2,2- bzw. 1,9-fach über dem Wert der Kontrolle im selben Zeitraum. Zwischen dem 20. und dem 25. Tag sowie zwischen dem 25. und dem 30. Tag des Experiments exsudierten die Pflanzen nach der Salicylsäure Behandlung 1,4 mg Glucosinolate/Pflanze, so dass der Wert 1,2-fach bzw. 1,3-fach über der Kontrolle lag. Zu Beginn des Experiments bewirkte die Verabreichung von Methyljasmonat eine stärkere Zunahme des Glucosinolat Gehalts in Exsudaten im Vergleich zu Salicylsäure, was nach Ansicht der Erfinder möglicherweise dadurch erklärt wird, dass Salicylsäure nicht nur die Glucosinolat Synthese sondern auch ihren Abbau durch Beeinflussung der Aktivität des Enzyms Myosinase verstärkt.
B. Detaillierte Beschreibung der verwendeten Materialien und der Ergebnisse
1. Anzucht der Pflanzen
Die Rübensamen wurden in Grodan Steinwolle Pflanzwürfeln (5 cm Breite × 5 cm Tiefe × 5 cm Höhe), die in Standard Gewächshaus Plastikschalen (52 cm breit × 35 cm tief × 7 cm hoch) gesetzt wurden, angezogen. Die Samen wurden mit halbkonzentrierter Hoagland Lösung über oberhalb der Pflanzenkultur angebrachten Feuchtigkeitssystemen bewässert. Sie wurden vorgekeimt, bis die Wurzeln der Setzlinge ca. 2 bis 4 cm aus dem Boden der Würfel hervorgetreten waren. Dies war nach ca. 15 bis 20 Tagen bei 2 Blättern und einem Wurzelgewicht von ca. 3 g der Fall. Die Würfel wurden anschließend in 10 × 11 cm Abständen in die Löcher von Polystyrol Platten (1 m × 1 m groß, 4,5 cm dick) eingesetzt, die anschließend in die aeroponischen bzw. hydroponischen Systeme eingesetzt wurden.
2. Technische Charakteristika der aeroponischen und hydroponischen Systeme
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden sowohl aeroponische als auch hydroponische Systeme verwendet. Diese erdlosen (= erdfreien) wasserbasierten Systeme besitzen den Vorteil, dass die Nährstoffe direkt in Wasser gelöst sind und die Pflanzen die Nährstoffe zu jedem Zeitpunkt aufnehmen können. Aufgrund der ubiquitären Verfügbarkeit der gewünschten Nährstoffmenge kann die Pflanze die von ihr individuell benötigte Menge jederzeit direkt über die Wurzel aufnehmen. Außerdem sind die erdfreien Systeme vorteilhaft, weil der pH-Wert und der Nährwert des Wassers auf einfache Weise gemessen und die gewünschten Werte aufrechterhalten werden können. Die wasserbasierten Systeme steigern das Pflanzenwachstum und die Ausbeute pro Fläche gegenüber den erdhaltigen Syste men (= Erdsystemen) deutlich. Darüber hinaus ist die Gefahr des Schädlingsbefalls sowie das Auftreten von Erkrankungen an den Pflanzen deutlich reduziert. Außerdem entfällt das Gießen der Pflanzen nach einem Gießplan. In den vorliegenden Experimenten wurden neben den hydroponischen Systemen auch aeroponische Systeme mit dem Ziel verwendet, die Menge des verwendeten Wassers im System maximal zu minimieren, was die Exsudat Extraktion einfacher macht. Auf diese Weise kann das aeroponische System sehr wirtschaftlich betrieben werden. Im Rahmen der Erfindung wurden drei verschiedene Systeme installiert, nämlich ein aeroponisches System mit einer Sprühvorrichtung, ein aeroponisches System mit einem Nebelzerstäuber oder einem Defensor und ein hydroponisches System. Die Sprühvorrichtung des aeroponischen Systems war in dem konkreten Beispiel als Sprühdüsen ausgebildet.
Die durchgeführten Experimente im aeroponischen bzw. hydroponischen System sind schematisch in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Schematische Darstellung der Experimente

1H – Hoagland Lösung;
1,5H – 1.5-fache Konzentration der Hoagland Lösung;
2H – doppelte Konzentration der Hoagland Lösung;
2S – doppelte Schwefel-Konzentration;
SA₀ – Salicylsäure, appliziert am 1. Tag;
MJ – Methyljasmonat, appliziert am 1. Tag;
SA₁₅ – Salicylsäure, appliziert am 15. Tag;
SA₂₀ – Salicylsäure, appliziert am 20. Tag;
SA₂₅ – Salicylsäure, appliziert am 25. Tag.

2.1 Aeroponisches System
In aeroponischen Systemen werden die Pflanzen mit Nährstoffen durch befeuchtete Luft versorgt. Die Wurzeln befinden sich in der Wachstumskammer, wo sie in kurzen Intervallen, für gewöhnlich Intervallen von wenigen Minuten mit dem Feuchtigkeitsnebel der Nährstofflösung besprüht wurden. Die Lösung wurde direkt aus ihrem Vorratstank über eine Pumpe entnommen und auf die Pflanzenwurzeln gesprüht. Die Pumpe wurde zeitlich präzise kontrolliert, so dass die Sprühzyklen exakt von wenigen Sekunden bis einige Minuten reichten.
2.2.1 Aeroponisches System mit Sprühdüsen
Im aeroponischen System, das mit Sprühdüsen ausgestattet ist, wurden die Wurzeln in einem Nebel aus der Nährstofflösung gehalten. Der Nebel der Nährstofflösung enthält eine relative Luftfeuchtigkeit von nahezu 100 % und verhindert wirksam das Austrocknen der Pflanzenwurzeln. Im Rahmen der Erfindung wurde das aeroponische System mit Sprühdüsen des Typs Dan Fogger 7800, Dan Sprinklers, Kibbutz Dan Israel, verwendet. Die Nährstofflösung wurde mit der zweistufigen Zentrifugalpumpe CH-60 (Modell A-A-CVBV, Grundfos, Erkrath, Israel) von einem Speichertank über einen Bitron 15 Filter (Typ G15T8, Oase, Berlin, Deutschland) zu dem Anzuchtbett gepumpt. Von dort konnte die überschüssige Nährstofflösung zu dem Speichertank zurückgeführt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde das aeroponische System mit Sprühdüsen kontinuierlich verwendet, d.h. die Nährstofflösung wurde konstant und kontinuierlich ohne Intervalle auf die Pflanzenwurzeln aufgesprüht. Diese Verwendung des aeroponischen Systems ist unüblich, aber die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass die Rübenwurzel sehr empfindlich gegenüber einem auftretenden Wassermangel reagiert. Der Druck der Pumpe betrug 2 bar, wobei im Stand der Technik für gewöhnlich 4 bar verwendet werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch herausgefunden, dass der im Stand der Technik verwendete Druck zu einer mechanischen Schädigung der Rübenwurzeln führt.
2.1.2 Aeroponisches System mit Defensor
Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete aeroponische System mit Defensor enthielt den Defensor des Typs 505, WMH Walter Meier Holding, Pfäffikon, Deutschland. Der rotierende bzw. drehende Zerstäuber bildete feinsten Nebel aus Nährstofflösung. Die Größe der Wasserpartikel im versprühten Nährstoffnebel beträgt ca. 5 bis 10 μm. Eine Zeitschaltuhr schaltete die Pumpe (Typ 505, Axair AG, Pfäffikon, Deutschland) für 15 Minuten bei einem 30-minütigen Intervall an. Der Defensor (Typ 505) selbst enthält einen rotierenden Kreisel (Zentrifuge), einen Raum in dem sich trockene Luft befindet, eine rotierende Platte sowie einen Feuchtigkeitsring, der die feuchte Luft als fein zerstäubten Feuchtigkeitsnebel (Aerosol) nach außen abgibt.
2.2 Hydroponisches System
Im hydroponischen System mit schwimmender Plattform und einem Belüftungssystem waren die Pflanzen direkt in der schwimmenden Plattform angeordnet, die auf der Oberfläche der Nährstofflösung schwamm. Das hydroponische System wurde durch einen Kompressor (Modell 40A-10011, Hiblo, Deutschland) belüftet. Der Kompressor blies Luft durch die Nährstofflösung in einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr 100 ml/min. Insgesamt waren 10 Belüftungsröhrchen vorgesehen, die alle gleichzeitig betrieben wurden.
3. Gewächshausbedingungen für das Pflanzenwachstum
3.1 Licht
Die Pflanzen wurden mit einer Belichtung von 12 Stunden, die der Tagzeit entspricht von 8 Uhr morgens bis 8 Uhr abends und hV 400 μmol/m²s angezogen. Es wurden Quantensensoren (Modell Li-190 SZ, LI-COR Lincoln, Nebraska, USA) zum Messen der photosynthetisch wirksamen bzw. aktiven Strahlung verwendet. Wenn die natürliche Strahlung außerhalb des Gewächshauses 450 μmol/m²s überstieg, wurden die Pflanzen durch über ihnen angebrachte Jalousien bzw. Lamellen beschattet. Als künstliche Lichtquelle wurden SRG 140 (Philips, Deutschland) Lampen verwendet, die das Pflanzenwachstum mit Licht, das ein natürliches Spektrum aufweist, fördern. Die Lampen waren 1,5 m über den Wachstums- bzw. Kultivierungssystemen angebracht, und sie deckten ungefähr 2 m² der Oberfläche pro Lampe ab.
3.2 Temperatur
Die Lufttemperatur im Gewächshaus betrug 16°C während des Tages und 12°C während der Nacht. In der Wurzelzone überschritt die Temperatur die Lufttemperatur um ungefähr 1 bis 2°C. Das Gewächshaus wurde belüftet, wenn die Temperaturen die oben genannten Werte überschritten.
3.3 Luftfeuchtigkeit
Die Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus erreichte 60 %. Sie wurde durch das Nebelsystem HNS (Typ 7, Osberma, Engelskirchen, Deutschland) mit HNS Düsen (Typ 07.1, Osberma, Engelskirchen, Deutschland) erreicht. Die Temperatur und die Luftfeuchtigkeit im Gewächshaus wurden mit Entlüftern, Typ 77001 (Henrich Zeiseniss Wasser Technik, Herrsching, Deutschland) bestimmt und aufgenommen. Die Temperatur in den Wurzelzonen innerhalb der aeroponischen Systeme wurde mit dem Psychrometer PT 100 (Typ WTE 10, Geraberg GmbH, Geraberg, Deutschland) bestimmt und aufgenommen. Die Temperatur, die Belichtung und die Feuchtigkeitsbedingungen in der Wachstumskammer wurden mit RAM CC 600 Ausstattung (Typ DT 500, Ltd Rowville, Victoria, Australien) kontrolliert. Die Messungen wurden einmal pro Minute durchgeführt, und der Durchschnittsmittelwert wurde einmal pro Stunde gespeichert. Die gesamten oben genannten Bedingungen wurden konstant während des vegetativen Zeitraums aufrechterhalten.
4. Herstellung der Exsudatproben
Es wurden jeweils vier Probenwiederholungen 1 l Probenlösung, welche die Pflanzenwurzelexsudate enthielt, von jedem System alle 10 Tage für das erste Experiment und alle 5 Tage beginnend am Tag 10 für das zweite und das dritte Experiment entnommen. Während der Probenentnahme wurden die Wurzeln zusätzlich mit der Lösung des Wachstums- bzw. Kultivierungssystems unter Verwendung des Kompressors (Typ 3590, Agrotop GmbH, Obertraubling, Deutschland) gewaschen. Zu der Probenlösung wurden 20 μM/l AgNO₃ zugegeben, um die Zerstörung der Glucosinolate durch das Enzym Myrosinase, die ebenfalls in das Wachstumsmedium abgegeben wird, zu verhindern. AgNO₃ stoppt nachweislich die Aktivität von Myrosinase. Nach der Probenentnahme wurde die Nährstofflösung in jedem System erneuert. Die Proben wurden zunächst unter Verwendung von Papierfiltern (N 604, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) gefiltert. Die Exsudatproben wurden durch Scaleup Ultrafiltration und reverse Osmose im Tangentialfluss Filtrationssystem (ProScale System mit Helicon-RO-4 Spi ralwickelmodule, die eine Nanomax-95 Membran, erhalten von Millipore GmbH, Eschborn, Deutschland) verarbeitet. Die Proben wurden anschließend in 600 ml Glasflaschen (Christ, Osterode am Harz, Deutschland) übertragen, bei –28°C gefroren und gefriergetrocknet.
Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 250 bis 2000 Da wurden ausgewählt und konzentriert, und monovalente Salze wurden aus der Lösung entfernt. Das im Rahmen der Erfindung durchgeführte Verfahren zur Herstellung der Exsudatproben benötigt weniger Schritte als das herkömmliche Verfahren zur Herstellung von oberirdischem Pflanzenmaterial. Die klassischen Herstellungsverfahren umfassen die Schritte des Reinigens, Einfrierens und Gefriertrocknens, des Mahlens und des Extrahierens der benötigten Verbindungen. Im Rahmen der Erfindung wurde ein zusätzlicher Verfahrensschritt in das Verfahren zur Herstellung der Exsudatproben für die HPLC eingeführt. Der Zusatzschritt umfasst die Präfiltration und die Konzentration der Flüssigkeit. Dennoch werden die herkömmlichen Schritte des Mahlens und des Extrahierens des Pflanzenmaterials vermieden, so dass das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber dem Stand der Technik Vorteile besitzt.
5. Glucosinolat Extraktion und Bestimmung durch HPLC
Für die Bestimmung der Glucosinolate durch HPLC wurde das HPLC Verfahren nach Krumbein et al. (2005) verwendet. Gefriergetrocknetes Probenmaterial, das aus getrockneten Substanzen von 1 l der Lösung mit Exsudaten bestand, wurde erhitzt und bei 75°C für 1 min. inkubiert, mit 4 ml eines Methanol/Wassergemisches (v/v = 7:3; T = 70°C) extrahiert und nach dem Hinzufügen von 1 ml 0,4 M Bariumacetat bei 400 rpm für 10 min. zentrifugiert. Der Rückstand wurde noch 2x mit 30 ml Methanol/Wassergemisch (v/v = 7:3; T = 70°C) extrahiert. Das extrahierte Material wurde vereinigt und auf 10 ml aufgefüllt. Davon wurden 5 ml des Extrak tes auf einen 250 μl DEA-Sephadex A-25 Ionenaustauscher (mit Essigsäure aktiviert, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) aufgetragen und mit 10 ml doppelt destilliertem Wasser gespült. Als nächstes wurden 250 μl einer gereinigten Lösung von Arylsulfatase (Boehringer-Mannheim GmbH, Mannheim, Deutschland) aufgebracht und für 12 h auf dem Austauscher belassen, bevor die Desulfoverbindungen mit 5 ml doppelt destilliertem Wasser eluiert wurden. Die Desulfoglucosinolat Analyse wurde durch HPLC (Merck HPLC Pumpe L-7100, DAD Detektor L-7455, automatische Probenverarbeitung AS-7200 und HPLC Manager Software D-7000) unter Verwendung einer Spherisorb ODS2 Säule (5 μm, 250 × 4 mm) durchgeführt. Es wurde ein Gradient von 0–20 % Acetonitril in Wasser für 2 bis 34 min., gefolgt von 20 % Acetonitril in Wasser bis zur 40sten Minute und anschließend 100 % Acetonitril für 10 min. bis zur 50sten Minute gewählt. Die Bestimmung wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,3 ml/min und einer Wellenlängen von 229 nm durchgeführt. Sinigrin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) und Glucotropaeolin (AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland) wurden als Standards verwendet.
Die einzelnen Glucosinolate wurden durch Vergleich ihrer Retentionszeiten (Rückhaltezeiten) mit einzelnen Glucosinolaten in den Rapsölsamen (BCR-190C und BCR-367 R), die als Standardreferenzmaterialien verwendet wurden, identifiziert. Der Glucosinolat Gehalt wurde unter Verwendung von Sinigrin als internem Standard und dem Response Faktor (Antwortfaktor) jeder Verbindung im Vergleich zu Sinigrin berechnet. Die Bestimmung der Glucosinolate wurde jeweils doppelt durchgeführt, und die Konzentrationen der Glucosinolate wurden als mg exsudierte Glucosinolate pro Pflanze ausgedrückt. Die Daten zeigen die Dynamik des Glucosinolat Gehalts sowohl in Pflanzen als auch in Exsudaten während des Versuchs ebenso wie in den Exsudaten, die während des 30 Tage andauernden Experiments gesammelt wurden.
Die in Rüben (Brassia rapa) vorkommenden Glucosinolate sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Glucosinolate in Rüben
Der jeweilige Glucosinolat Gehalt wurde über die jeweiligen Peakflächen unter Verwendung von Sinigrin als internem Standard und dem Response Faktor jeder Verbindung relativ zu Sinigrin berechnet. Der Gehalt der Glucosinolate in Exsudaten einer Pflanze wurde durch die folgende Formel berechnet:

Cex:: Gehalt an einzelnen Desulfoglucosinolaten in Exsudaten pro mg Pflanze
Vol:: Volumen der Lösung im System in l
Npl:: Menge der Pflanzen im System pro Pflanze
C:: Gehalt an einzelnen Deslufoglucosinolaten in der Lösung aus dem Gesamtsystem in mg, wobei

S:: Quadrat der Peakfläche von Desulfoglucosinolaten
Sis:: Quadrat der Peakfläche des internen Standards
RF:: Response Faktor von Desulfoglucosinolat
RFis:: Response Faktor des internen Standards
Nis:: Menge des internen Standards in mg/l
Vol':: Probenvolumen in l.

Das Frischgewicht, das getrocknete Material, das Gesamtgewicht sowie die einzelnen Glucosinolat Gehalte in Pflanzen und Exsudaten wurden unter Verwendung von beschreibender Statistik und Varianzanalyse verrechnet. Der Mittelwertvergleich erfolgte nach dem Tukey's Honest Significant Difference Test (HSD, Signifikanzlevel α = 0,05). Alle statistischen Analysen wurden mit Statistica^TM für Windows^TM (Version 6.1, Statstoft Inc.) durchgeführt.
7. Pflanzenwachstum bei unterschiedlicher Nährstoffversorgung
Die Erfinder haben zunächst eine Nährlösung ausgewählt, die ein ausreichendes Wachstum der Pflanzen von Brassica rapa sicherstellt. Diese Lösung wurde zur Steigerung des Glucosinolat Gehalts in Pflanzen ebenso wie in Exsudaten erfindungsgemäß modifiziert. Als Ausgangsnährlösung für das Wachstum von Rüben (Brassica rapa) wurde die Hoagland Lösung gewählt. Tabelle 3 zeigt die Bestandteile der Hoagland Lösung und ihre Modifikationen. Tabelle 3: Hoagland Lösung und ihre Modifikationen

1H: Ausgangs Hoagland Lösung (1-fach)
2H: 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung
2H2S:2-fach konzentrierte Hoagland Lösung plus zweifach gesteigerte Schwefelkonzentration

Die Salze können als zwei Einzellösungen (A und B) vorbereitet und gelagert werden. Unmittelbar vor dem Gebrauch werden die beiden Lösungen vereinigt.
Der Nährstoffgehalt der Ausgangs Hoagland Lösung wurde erhöht, weil die Erfinder an Rüben (Brassica rapa), die in Hoagland Lösung angezogen wurden, eine Gelbfärbung der Blätter (Chlorose) beobachtet haben. Aufgrund dieser Tatsache wurde die Nährstoffkonzentration in der Hoagland Lösung erhöht, wobei darauf geachtet wurde, dass eine Ausgewogenheit zwischen den einzelnen Bestandteilen bestehen blieb. Die Rübenpflanzen benötigten hohe Mengen an Schwefel in einem ausgewogenen Verhältnis zum Stickstoff. Dieser gesteigerte Schwefelbedarf von Pflanzen der Familie Brassicaceae war überraschend und wurde im Rahmen dieser Erfindung beobachtet und analysiert. Die Erfinder haben deshalb eine 2-fach konzent rierte Hoagland Lösung, die eine 2-fach gesteigerte Schwefelkonzentration enthält, hergestellt und verwendet.
8. Verwendung von Elicitoren
Als Elicitoren wurden Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ) verwendet. Salicylsäure wurde in einer Konzentration von 1,1 mg/l (= 110,0 mg/l) verwendet, während Methyljasmonat in einer Konzentration von 100 μg/l verwendet wurde. Beide Substanzen wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland bezogen. Die Elicitoren wurden zu der Nährstofflösung zu Beginn des Pflanzenwachstums in den aeroponischen Systemen gegeben, obwohl in vorhergehenden Studien (Van Dam et al., 2003) gezeigt wurde, dass eine Behandlung der Blätter mit Elicitoren den Glucosinolat Gehalt im Spross, aber nicht in den Wurzeln steigerte.
9. Ergebnisse
9.1 Gesamt Glucosinolate
Der Gesamt Glucosinolat Gehalt ebenso wie der Gehalt an individuellen aliphatischen, aromatischen und Indolglucosinolaten wurde quantitativ in den Blättern, primären Wurzeln, sekundären Wurzeln und Exsudaten von Pflanzen der Ordnung Capparales, insbesondere Rübenpflanzen (Brassica rapa) bestimmt. Als Vertreter der aliphatischen Glucosinolate wurden Progoitrin, Gluconapin, Gluconapoleiferin und Glucobrasscianapin bestimmt. Gluconasturtiin wurde als Vertreter der aromatischen Glucosinolate bestimmt. Als prominente Vertreter der Indolglucosinolate wurden 4-Hydroxy-Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin, Neoglucobrassicin und Glucobrassicin analysiert. Der Gesamtgehalt der Glucosinolate in Pflanzen und ihren Exsudaten nach 30 Tagen betrug 22,1 mg/Pflanze für die Kontrollbehandlung, und sie war um ca. ein Drittel für die Behandlung mit den Elicito ren Salicylsäure (Sa) und Methyljasmonat (MJ) erhöht, wobei die Werte jeweils 30,1 und 30,7 mg/Pflanze betrugen. Der Glucosinolat Gehalt, der in Exsudaten gefunden wurde, stieg von 4,6 mg/Pflanze (Kontrolle) auf 7,8 bzw. 7,3 mg/Pflanze für die Salicylsäure bzw. Methyljasmonat Behandlungen an. Die Erfinder nehmen an, das der Anstieg der Glucosinolate in den Exsudaten in der Freisetzung von Pflanzenabwehrstoffen, die durch das Zugeben des Elicitors ausgelöst werden, begründet ist.
Die Behandlung mit Salicylsäure und Methyljasmonat steigerte den Glucosinolat Gehalt in sekundären Wurzeln auf 10,2 bzw. 7,8 mg/Pflanze, was einer Steigerung von 2,1- bzw. 1,8-fach gegenüber der Kontrollbehandlung (4,8 mg/Pflanze) entsprach. Methyljasmonat konnte den Glucosinolat Gehalt in Blättern bis zu 6,1 mg/Pflanze (1,7-fach) steigern, wohingegen die Salicylsäure Behandlung zu einem niedrigeren Wert (3,6 mg/Pflanze) als in der Kontrolle führte. Die Erfinder nehmen an, dass diese Ergebnisse durch gesteigerte Expression von Genen, die in die Glucosinolat Synthese involviert sind ebenso erklärt werden können wie durch die Mobilisierung der Glucosinolate vom Spross durch Phloem Transport in die Wurzeln. Die Änderungen der metabolischen Profile der aliphatischen, aromatischen und Indolglucosinolate, die durch Salicylsäure und Methyljasmonat Behandlungen bewirkt wurden, waren signifikanter in den Exsudaten als in den Pflanzengeweben. Die Erfinder nehmen an, dass dies auf die Elicitor induzierte Rhizosekretion, die auf einer de novo Synthese der sekundären Metaboliten und nicht auf einem Elicitor induzierten Verlust aus den Wurzelgeweben beruht, zurückzuführen ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4 Glucosinolate in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)

Aliphatische Glucosinolate: Gluconapin, Progoitrin, Glucobrassicanapin, Gluconapoleiferin;
Aromatische Glucosinolate: Gluconasturtiin
Indolglucosinolate: Glucobrassicin, 4-Hydroxy-Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin, Neoglucobrassicin

Die Unterschiede wurden für jede Behandlung ermittelt, insbesondere für die Kontrolle die SA- und MJ-Behandlung, ebenso wie für jedes Pflanzenorgan und für die Exsudate. Die Werte, die von demselben Buchstaben gefolgt werden (a, b, c) sind nicht signifikant unterschiedlich.
nnwb: nicht nachweisbar
9.2 Aliphatische Glucosinolate
Die aliphatischen Glucosinolate waren die Hauptklasse der Glucosinolate in Rübenpflanzen (Brassica rapa) und in Exsudaten der Kontrolle mit 12,2 mg/Pflanze, während der Gehalt der aromatischen und Indolglucosinolate 3,0 bzw. 6,6 mg/Pflanze betrug (Tabelle 4). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Brassica rapa ein Glucosinolat Profil aufweist, das Butenyl- und Pentenylglucosinolate und ihre hydroxylierten Homologe umfasst. Progoitrin ist das am häufigsten in der Rübe identifizierte aliphatische Glucosi nolat. Seine Konzentration erreichte 4,6 mg/Pflanze in Pflanzen und Exsudaten für die Kontrollbehandlung (Tabelle 5). Die Verabreichung von Salicylsäure und Methyljasmonat erniedrigte den Progoitrin Gehalt in Pflanzen und Exsudaten auf 2,5 bzw. 2,6 mg/Pflanze. Der Progoitrin Gehalt, der in Exsudaten nach einer Methyljasmonat Behandlung gefunden wurde, war gleich zu der Kontrollbehandlung, nämlich 0,6 mg/Pflanze, während er nach einer Salicylsäure Behandlung auf 0,4 mg/Pflanze abfiel. In den Pflanzen fiel der Progoitrin Gehalt hauptsächlich auf Kosten der primären Wurzeln, was bedeutete, dass sein Gehalt in der Kontrolle 2,5 mg/Pflanze betrug, im Vergleich zu 1,2 mg/Pflanze für die Salicylsäure Behandlung und 1,4 mg/Pflanze für die Methyljasmonat Behandlung.
Dieselben Veränderungen wurden auch für Gluconapin beobachtet, wo der Gesamtgehalt in Pflanzen und in Exsudaten 1,7 mg/Pflanze in der Kontrolle im Vergleich zu 1,1 mg/Pflanze für die Salicylsäure Behandlung und 1,3 mg/Pflanze für die Methyljasmonat Behandlung erreichte (Tabelle 5).
Der Gehalt an Gluconapoleiferin und Glucobrassicanapin in beiden Pflanzen und Exsudaten betrug 2,0 bzw. 1,2 mg/Pflanze für die Kontrolle. Diese Werte wurden durch eine Salicylsäure Behandlung nicht beeinflusst. Jedoch steigerte eine Methyljasmonat Behandlung den Gehalt an Gluconapoleiferin auf 1,3 mg/Pflanze, während die Methyljasmonat Behandlung den Glucobrassicanapin Gehalt auf 2,4 mg/Pflanze in den Pflanzen und den Exsudaten steigerte. Der größte Anstieg wurde in den Blättern beobachtet, wo Gluconapoleiferin einen Wert von 0,9 mg/Pflanze und Glucobrassicanapin einen Gehalt von 1,1 mg/Pflanze, jeweils nach der Methyljasmonat Verabreichung im Vergleich zu 0,6 bzw. 0,1 mg/Pflanze für die Kontrolle erreichten. Die Ergebnisse der Analysen der aliphatischen Glucosinolate sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Aliphatische Glucosinolate in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)
Die Unterschiede wurden für jede Behandlung ermittelt, insbesondere die Kontrolle, Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ), jeweils für jedes Pflanzenorgan ebenso wie die Exsudate. Die Werte, die jeweils von demselben Buchstaben (a, b, c) gefolgt werden, sind nicht signifikant verschieden.
Die Gls-elong Gene von Brassica rapa regulieren die Bildung von Elongase, was zur Kettenverlängerung von synthetisierten Glucosinolaten führt. Dies könnte das Verhältnis von Butenyl- zu Pentenylglucosinolaten in Pflanzen und Exsudaten von Brassica rapa von 2:1 in den Kontrollbehandlungen (6,2 : 3,1 mg/Pflanze) erklären (siehe Tabelle 6). Das Verhältnis von Butenyl- zu Pentenylglucosinolaten in Pflanzen und Exsudaten änderte sich jedoch dramatisch unter dem Einfluss von Salicylsäure und Methyljasmonat. Das Verhältnis betrug 1,1 : 1 (3,7 : 3,3 mg/Pflanze) bei Salicylsäure und 0,8 : 1 (3,9 : 4,7 mg/Pflanze) bei Methyljasmonat. Die Erfinder gehen davon aus, dass die Elicitoren die Expression der Gls-elong Gene nach der Verabreichung der Elicitoren beeinflussen. Die Alkenylglucosinolate Gluconapin und Glucobrassicanapin durchlaufen eine Hydroxylierung und damit eine Umwandlung in die Hydroxyalkenylglucosinolate Progoitrin und Gluconapoleiferin. Das Verhältnis von Hydroxyalkenylglucosinolaten zu Alkenylglucosinolaten betrug 2,3 : 1 für die Kontrollbehandlungen (6,6 : 2,9 mg/Pflanze). Jedoch änderte sich das Verhältnis auf 1,8 : 1 (4,5 : 2,5 mg/Pflanze) in Pflanzen und Exsudaten nach einer Salicylsäure Behandlung und auf 1,4 : 1 (4,9 : 3,6 mg/Pflanze) in Pflanzen und Exsudaten nach einer Methyljasmonat Behandlung. Die Erfinder nehmen an, dass die Elicitoren die Herunterregulation der Gls-oh Gene bewirken, die den Gehalt der Alkenylglucosinolate für die Salicylsäure- und Methyljasmonat Behandlungen reduzierten und die Hydroxyalkenylglucosinolate nach der Methyljasmonat Behandlung erhöhten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6: Zusammenhang zwischen den Subklassen von aliphatischen Glucosinolaten in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)

Butenylglucosinolate: Gluconapin und Progoitrin
Pentenylglucosinolate: Glucobrassicanapin und Gluconapoleiferin
Hydroxylalkenylglucosinolate: Progoitrin und Gluconapoleiferin
Alkenylglucosinolate: Glucobrassicanapin und Gluconapin

9.3 Aromatische Glucosinolate
Gluconasturtiin war das einzige aromatische Glucosinolat, das in Brassica rapa nachweisbar ist. Sein Gehalt erreichte in Kontrolipflanzen und Exsudaten Werte von 3,0 mg/Pflanze und stieg auf 7,8 (2,6-fach) nach einer Salicylsäure Behandlung und sogar auf 9,1 mg/Pflanze (3,0-fach) nach einer Methyljasmonat Behandlung (Tabelle 4). Dieser Anstieg ist insbesondere in primären Wurzeln der Pflanzen beachtlich. Dort stieg der Gehalt des aromatischen Glucosinolats Gluconasturtiin von Werten von 0,6 mg/Pflanze auf 3,4 mg/Pflanze nach einer Salicylsäure Behandlung und auf 3,8 mg/Pflanze nach einer Methyljasmonat Behandlung. In den Exsudaten der Kontrollbehandlung betrug der Gluconasturtiin Gehalt 1,1 mg/Pflanze und stieg auf 1,8 bzw. 1,9 mg/Pflanze nach der Verabreichung von Salicylsäure bzw. Methyljasmonat. Dies bedeutet einen 60 bzw. 70 % Anstieg im Vergleich zu der Kontrolle.
Interessanterweise waren aromatische Glucosinolate in den Blättern nur nach Verabreichung der Elicitoren nachweisbar (SA: 0,4 mg/Pflanze und MJ: 0,6 mg/Pflanze). Diese Beobachtung lässt die Erfinder vermuten, dass die Elicitoren das Auftreten von Glucosinolaten in Organen bewirken, in denen sie zuvor nicht anwesend waren. Die Erfinder vermuten weiter, dass der Anstieg der aromatischen Glucosinolate in allen Pflanzenteilen nach der Verabreichung der Elicitoren über die Induktion von CYP79A2 erklärt werden kann, das Phenylalanin in aromatische Aldoxime umwandelt und gleichmäßig in Blättern und Wurzeln exprimiert wird.
9.4 Indolglucosinolate
In diesem Experiment betrug der Gesamtgehalt an Indolglucosinolat in den Pflanzen 5,1 mg/Pflanze und 1,5 mg/Pflanze in den Exsudaten für die Kontrollbehandlung (Tabelle 4). Beide Elicitoren bewirkten einen Anstieg des Indolglucosinolat Gehalts in Pflanzen (SA: 9,3 mg/Pflanze (2,2-facher Anstieg) und MJ: 7,7 mg/Pflanze (1,8-facher Anstieg)). Der Effekt war am deutlichsten in den sekundären Wurzeln (SA: 6,3 mg/Pflanze (2,7-facher Anstieg) und MJ: 3,9 mg/Pflanze (1,7-facher Anstieg)) und in den Exsudaten (SA: 4,9 mg/Pflanze (3,3-facher Anstieg) und MJ: 4,2 mg/Pflanze (2,8-facher Anstieg)) (Tabelle 4).
Die Indolglucosinolate, die in Brassica rapa vorkommen, sind 4-Hydroxy-Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin und Neoglucobrassicin. Dies sind Derivate von Glucobrassicin, nachdem es die Hydroxylierung und Methoxylierung durchlaufen hat. In den Experimenten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, induzierte die Salicylsäure- und Methyljasmonat Verabreichung auch einen spezifischen Anstieg des Indolglucosinolat Gehalts (Tabelle 7). Jedoch ist es wichtig anzumerken, dass die Elicitoren die einzelnen Indolglucosinolate in unterschiedlichen Ausmaßen beeinflussten. Salicylsäure steigerte den Gehalt von Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin und Neoglucobrassicin in Pflanzen sehr viel stärker als Methyljasmonat. In den Pflanzen und den Exsudaten für die Kontrolle wurden 1,3 mg/Pflanze Glucobrassicin und 3,3 mg/Pflanze Neoglucobrassicin beobachtet. Überraschenderweise wurden nach der Elicitoren Behandlungen sehr viel höhere Mengen beobachtet, nämlich 3,4 mg/Pflanze Glucobrassicin und 2,2 mg/Pflanze 4-Methoxy-Glucobrassicin nach Salicylsäure Behandlung und 2,6 mg/Pflanze Glucobrassicin und 1,3 mg/Pflanze 4-Methoxy-Glucobrassicin nach Methyljasmonat Behandlung. Der Anstieg des Glucobrassicin Gehalts fand hauptsächlich in den sekundären Wurzeln statt. Die Werte betrugen 0,3 mg/Pflanze für die Kontrolle, 2,2 mg/Pflanze für die Salicylsäure Behandlung und 0,9 mg/Pflanze für die Methyljasmonat Behandlung. In den Exsudaten war der Glucobrassicin Gehalt von 0,4 mg/Pflanze (Kontrolle) auf 0,7 mg/Pflanze (SA Behandlung) und 0,9 mg/Pflanze (MJ Behandlung) erhöht.
In Brassica rapa war Neoglucobrassicin das vorherrschendste Indolglucosinolat. Sein Gehalt erreichte in den Pflanzen 2,6 mg/Pflanze, während es in den Exsudaten in einer Menge von 0,7 mg/Pflanze vorkam. Es wurde auch am meisten durch die beiden verwendeten Elicitoren beeinflusst. In Pflanzen, die mit Salicylsäure behandelt wurden, stieg sein Gehalt auf 3,4 mg/Pflanze, während sein Gehalt unter Methyljasmonat Behandlung sogar auf 3,6 mg/Pflanze, jeweils im Vergleich zur Kontrolle anstieg. Dies bedeutete einen Anstieg von 31 bzw. 40 % im Vergleich zur Kontrolle. In den Exsudaten wurden nach Salicylsäure Behandlung ebenfalls große Anstiege beobachtet. Der absolute Wert lag bei 3,4 mg/Pflanze (4,9-facher Anstieg). Nach der Methyljasmonat Behandlung lag der Wert bei 2,4 mg/Pflanze, was einem 3,4-fachen Anstieg entsprach. Die höchste Zunahme an Neoglucobrassicin nach der Verabreichung von Elicitoren wurde in den sekundären Wurzeln beobachtet, wo der Gehalt 2,3 mg/Pflanze nach Salicylsäure Behandlung und 2,6 mg/Pflanze nach Methyljasmonat im Vergleich zu 1,7 mg/Pflanze für die Kontrolle erreichte. Es wurde kein Methoxy-Glucobrassicin in den Blättern und den primären Wurzeln der unbehandelten Pflanzen nachgewiesen, aber die Verabreichung von Elicitoren führte zu einer Anreicherung von 0,1 bzw. 0,3 mg/Pflanze jeweils in den Blättern und den primären Wurzeln nach einer Salicylsäure Behandlung und 0,1 bzw. 0,1 mg/Pflanze in den Blättern und den primären Wurzeln nach einer Methyljasmonat Behandlung. Die Erfinder nehmen an, dass dieser Befund durch die Induktion der Glucosinolat Synthese in den Blättern oder durch den Transport dieser Glucosinolate von den Wurzeln in das Phloem bewirkt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tabelle 7: Indolglucosinolate in Pflanzen und Exsudaten (mg/Pflanze)
Die Unterschiede wurden für jede Behandlung ermittelt, insbesondere die Kontrolle, Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ), jeweils für jedes Pflanzenorgan ebenso wie die Exsudate. Die Werte, die jeweils von demselben Buchstaben (a, b, c) gefolgt werden, sind nicht signifikant verschieden.
nnwb = nicht nachweisbar
9.5 Anwendung von Elicitoren
Die Anwendung beider Elicitoren steigerte stark den Gehalt an aromatischen und Indolglucosinolaten (Tabelle 8). Die Wurzeln von unbehandelten Pflanzen exsudierten 0,1 mg/Pflanze Gluconasturtiin während der ersten 10 Tage nach der Behandlung, während der Wert nach der Salicylsäure Behandlung 0,3 mg/Pflanze und nach der Methyljasmonat Behandlung 0,5 mg/Pflanze erreichte. Ganz besonders stark war der Anstieg des Indolglucosinolat Gehalts auf 1,2 mg/Pflanze nach einer Salicylsäure Behandlung und auf 1,3 mg/Pflanze nach einer Methyljasmonat Behandlung, während die Kontrolle bei 0,2 mg/Pflanze lag. Der Gehalt der exsudierten aliphatischen Glucosinolate fiel jedoch nach den Behandlungen mit den Elicitoren im Vergleich zu der Kontrolle. Für die Salicylsäure Behandlung erreichte er 0,1 mg/Pflanze, und für die Methyljasmonat Behandlung erreichte er 0,3 mg/Pflanze, während er für die Kontrolle bei 0,5 mg/Pflanze lag. Deshalb schlussfolgern die Erfinder, dass die Elicitoren Verabreichung die einzelnen Glucosinolate unterschiedlich (= differenziert) in Exsudaten ebenso wie in Pflanzengeweben beeinflusst. Dies liefert die Möglichkeit, die Profile der Glucosinolate durch Elicitoren Verabreichung gezielt zu steuern, um den Ertrag der Glucosinolate mit den gewünschten gesundheitsfördernden Eigenschaften zu steigern. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8: Glucosinolat Gehalt in Exsudaten am 10. Tag des Experiments (mg/Pflanze)
Die Unterschiede wurden für jedes Experiment ermittelt, insbesondere die Kontrolle, Salicylsäure (SA) und Methyljasmonat (MJ), jeweils für jedes Pflanzenorgan ebenso wie die Exsudate. Die Werte, die jeweils von demselben Buchstaben (a, b, c) gefolgt werden, sind nicht signifikant verschieden.
10. Zusammenfassung
Untersuchungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten, dass die Verwendung von Salicylsäure und Methyljasmonat einen starken Einfluss auf den Glucosinolat Gehalt in den Pflanzenorganen ebenso wie in den Wurzeln der Versuchspflanzen (Brassica rapa) aufwiesen. Insbesondere waren die Gehalte der aromatischen und der In dolglucosinolate, die beide antikanzerogene Eigenschaften besitzen, stark erhöht. Beide Elicitoren verringerten den Gehalt an aliphatischen Glucosinolaten, insbesondere in den primären Wurzeln und in den Exsudaten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erklären die verschiedenen Wirkungen der Elicitoren auf die einzelnen Glucosinolate durch ihre biologische Funktion innerhalb der Verteidigungsreaktion, die durch Interaktion zwischen der Pflanze und dem Herbivor bzw. der Pflanze und dem Mikroorganismus stattfindet. Eine Salicylsäure- und/oder Methyljasmonat Behandlung stimulierte die Rhizosekretion von Glucosinolaten. Die Antwort der Pflanze auf die Verabreichung der Elicitoren trat hauptsächlich während der ersten Tage nach der Behandlung auf, woran sich eine graduelle Abnahme anschloss. Damit ist die vorliegende Erfindung, insbesondere das erfindungsgemäße Verfahren geeignet, gewünschte Glucosinolate in hoher Konzentration gezielt zu erzeugen. Diese Glucosinolate können anschließend aufgrund ihrer vorteilhaften gesundheitsfördernden, antikanzerogenen und anderen Eigenschaften als sekundäre Pflanzenstoffe (= Metabolite), Pharmazeutika, Nahrungsergänzungsmittel oder Ausgangs- bzw. Rohstoffe für Functional Food verwendet werden.
Referenzliste

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Claims

Verfahren zur Gewinnung von mindestens einem Glucosinolat aus einem Wurzelexsudat mindestens einer Pflanze der Ordnung Capparales, umfassend die Schritte: (a) Anzucht der Pflanze in einem erdlosen System; (b) Verabreichen einer Nährlösung mit erhöhtem Schwefelgehalt; (c) Stimulieren der Glucosinolat Bildung durch Verabreichen mindestens eines Elicitors; (d) Gewinnen der Glucosinolate aus Wurzelexsudaten der Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glucosinolate aliphatische Glucosinolate, aromatische Glucosinolate und/oder Indolglucosinolate sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die aliphatischen Glucosinolate ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Progoitrin, Gluconapin, Gluconapoleiferin, Glucobrassicanapin, Sinigrin, Glucoalyssin und Glucoraphanin; die Indolglucosinolate ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 4-Hydroxy-Glucobrassicin, 4-Methoxy-Glucobrassicin, Neoglucobrassicin und Glucobrassicin; und die aromatischen Glucosinolate ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Gluconasturtiin und Glucotropaeolin ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wurzeln primäre und/oder sekundäre Wurzeln sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Glucosinolate aus den Wurzeln lebender Pflanzen, vorzugsweise durch Rhizosekretion gewonnen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Pflanze der Ordnung Capparales ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aus Capparaceae, Brassicaceae, Resedaceae und Tropaeolaceae.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erdfreie System ein aeroponisches oder hydroponisches System ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das aeroponische System mit mindestens einer Sprühvorrichtung und/oder einem Defensor ausgestattet ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das hydroponische System ein schwimmendes hydroponisches System ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nährlösung eine ca. 1,5-fach bis ca. 3-fach konzentrierte Hoagland Lösung, vorzugsweise eine ca. 2-fach konzentrierte Hoagland Lösung ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Schwefel (S) als Sulfat (SO₄), insbesondere als MgSO₄, ZnSO₄ und/oder CuSO₄.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nährlösung folgende Bestandteile, bezogen auf 1 l aufweist: – ca. 610 mg bis ca. 1.230 mg Ca(NO₃)₂; – ca. 456,7 mg bis ca. 909,3 mg KNO₃; – ca. 23,1 mg bis ca. 46,2 mg Eisenchelat (FeChe); – ca. 204 mg bis ca. 408 mg KH₂PO₄; – ca. 339,3 mg bis ca. 1.000 mg MgSO₄ × 7 H₂O; – ca. 2,1 mg bis ca. 4,3 mg H₃BO₃; – ca. 0,7 mg bis ca. 1,3 mg MnCl₂; – ca. 0,09 mg bis ca. 0,2 mg ZnSO₄; – ca. 0,04 mg bis ca. 0,08 mg CuSO₄; sowie – ca. 0,12 mg bis ca. 0,24 mg H₂MoO₄.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Nährlösung folgende Bestandteile, bezogen auf 1 l aufweist: – ca. 820 mg Ca(NO₃)₂; – ca. 606,2 mg KNO₃; – ca. 30,8 mg FeChe; – ca. 272 mg KH₂PO₄; – ca. 492,4 mg MgSO₄ × 7 H₂O; – ca. 2,9 mg H₃BO₃; – ca. 0,8 mg MnCl₂; – ca. 0,1 mg ZnSO₄; – ca. 0,05 mg CuSO₄; sowie – ca. 0,16 mg H₂MoO₄.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Nährlösung ca. 984,6 mg MgSO₄ × 7 H₂O aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Elicitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methyljasmonat, Salicylsäure, Jasmoninsäure, Chitosan und KCN.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elicitoren, insbesondere Methyljasmonat und Salicylsäure, zusammen verabreicht werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der/die Elicitor/en zusammen mit der Nährlösung verabreicht wird/werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zusätzlich den Schritt umfasst: (e) Reinigen und Konzentrieren der Glucosinolate.
Glucosinolate, erhalten durch ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verwendung der Glucosinolate nach Anspruch 19 zur Nahrungsergänzung oder als Pharmazeutikum.