-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer entkalkten
Hartgewebeprobe, insbesondere ein Verfahren, nach dem einfach und
kostengünstig
eine entkalkte, zur Zellanhaftung bestimmte Probe eines lebenden
Hartgewebeersatzmaterials, eines lebenden Hartgewebes oder eines
aus diesen Komponenten bestehenden Verbund- oder Mischstoffs hergestellt
werden kann.
-
Zur
mikroskopischen Betrachtung von Hartgeweben, z.B. von Verbundstoffen,
die Gerüste
aus lebenden Hartgewebeersatzmaterialien enthalten, an denen Zellen
haften, oder von lebenden Hartgeweben, etc. werden Proben mit einer
Dicke von 10 μm oder
weniger hergestellt. Solche Proben werden herkömmlicherweise gefertigt, indem
Hartgewebe entkalkt, in Paraffin eingebettet, in Scheiben geschnitten,
und dann gefärbt
werden. Insbesondere wenn lebende Körperbestandteile nur in geringen
Mengen enthalten sind, ist es jedoch bei diesem Verfahren schwierig,
die wahren Zustand von Zellen und der gesamten Hartgewebestrukturen
zu beobachten, da die Hartgewebe zu schwach sind oder gänzlich verloren gehen,
nachdem die Calciumbestandteile herausgelöst sind. So ist beispielsweise
in einem künstlichen Knochen,
an dem Zellen anhaften und wachsen, nach dem Entkalken z.B. infolge
einer zu geringen Menge an Kollagen, kein ausreichendes Gerüst vorhanden,
um den Zustand der anhaftenden Zellen in ausreichendem Maße aufrecht
zu erhalten.
-
Deshalb
wurden Untersuchungen angestellt, um ein Verfahren anzugeben, bei
dem Hartgewebe ohne Entkalkung in einem Harz eingebettet und anschließend in
Scheiben geschnitten und gefärbt
wird. Jedoch können
mit diesem Verfahren nur Abschnitte mit einer Dicke von etwa 100 μm hergestellt
werden, die anschließend
noch zerkleinert werden müssen. Dies
erhöht
die Kosten zur Herstellung einer solchen Probe. Außerdem besteht
das Problem, dass man mit diesem Verfahren aus einem Probenkörper ein und
derselben Größe nur eine
Zahl an Proben erhält, die
1/100 oder weniger der Zahl an entkalkten Proben beträgt.
-
Ein
Verfahren zum Herstellen einer zu einer Scheibe geschnittenen Probe
aus nicht-entkalktem Hartgewebe ist in der Druckschrift JP 2000-346770
A beschrieben. Dort wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem ein
nicht-entkalktes Hartgewebe in ein Ethylen-ungesättigtes Monomer (z.B. MMA)
und einen Polymerisationsinitiator vom Azo-Typ, der im Stande ist,
das Monomer bei tiefen Temperaturen zu polymerisieren, eingebettet,
das Ethylen-ungesättigte
Monomer polymerisiert und dann das Hartgewebe in Scheiben geschnitten
wird. Da das Ethylenungesättigte
Monomer eine ausgezeichnete Permeabilität gegenüber dem Hartgewebe aufweist,
sind in einem solchen Monomer eingebettete Probenkörper besonders
gut in Scheiben zu schneiden. Da jedoch bei dem Verfahren nach der
Druckschrift JP 2000-346770 A ein eingebettetes Hartgewebe in Scheiben
geschnitten wird, besteht die Gefahr, dass die Feinstruktur des
Hartgewebes, falls dieses eine hohe Härte aufweist, beim Schneiden
leicht bricht. Außerdem
nimmt das Einbetten bei diesem Verfahren etwa drei bis vier Wochen
in Anspruch.
-
In
der Druckschrift JP 2002-31586 A ist ein Verfahren zum Herstellen
einer in Scheiben geschnittenen Probe beschrieben, das zum Ziel
hat, das Gewebe in gutem Zustand zu halten. In dieser Druckschrift
ist hierzu ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem das Hartgewebe in
eine wässrige
Carboxymethylcellulose-Lösung eingetaucht,
der resultierende gefrorene und eingebettete Probenkörper über Glycerin
auf einem Lagerblock angeordnet, ein dünner Kunststofffilm, der mit
einem Klebstoff beschichtet ist, auf die Oberfläche des Probenkörpers aufgebracht und
schließlich
der gefrorene, eingebettete Probenkörper horizontal in Scheiben
geschnitten wird. Das Verfahren nach der Druckschrift JP 2002-31586
A arbeitet zwar gut bei einer Weichgewebeprobe, zerstört jedoch
die Feinstruktur von Hartgewebe, wenn dieses in Scheiben geschnitten
wird. Außerdem
erfordert es eine Gefrierschneideinrichtung, was zu höheren Kosten
führt.
-
Aufgabe
der Erfindung ist es, ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Herstellen
einer entkalkten Hartgewebeprobe anzugeben, bei dem die Feinstruktur
des Hartgewebes erhalten bleibt.
-
Nach
intensiven Untersuchungen zur Lösung
der vorstehend angegebenen Aufgabe haben die Erfinder herausgefunden,
dass es möglich
ist, eine entkalkte Hartgewebeprobe einfach und kostengünstig herzustellen
und dabei die Feinstruktur des Hartgewebes aufrecht zu erhalten,
wenn das Hartgewebe entkalkt wird, nachdem es in ein Harz eingebettet
worden ist, welches das Eintreten von Flüssigkeit in das Hartgewebe
ermöglicht.
Die Erfindung basiert auf dieser Erkenntnis.
-
Die
Erfindung wird im Folgenden an Hand der Figuren näher erläutert. Darin
zeigen:
-
1 eine
Querschnittsansicht, die ein dehydratisiertes Hartgewebestück zeigt,
das in eine primäre
Eintauchflüssigkeit
eingetaucht wird,
-
2 eine
Querschnittsansicht, die das primär eingetauchte Hartgewebestück zeigt,
das in eine zweite Eintauchflüssigkeit
eingetaucht wird,
-
3 eine
Querschnittsansicht, die das sekundär eingetauchte Hartgewebestück zeigt,
das in ein den Flüssigkeitseintritt
ermöglichendes
Harz eingebettet wird,
-
4 eine
Querschnittsansicht, die einen Probenkörper zeigt, in den das Hartgewebestück eingebettet
ist,
-
5 eine
Querschnittsansicht, die den Probenkörper zeigt, der in eine entkalkende
Flüssigkeit eingetaucht
wird,
-
6 eine
Querschnittsansicht des entkalkten Probenkörpers,
-
7 eine
Querschnittsansicht des entkalkten Probenkörpers, der erneut in ein Harz
eingebettet wird,
-
8 eine
Querschnittsansicht des durch das erneute Einbetten hergestellten
Probenkörpers,
-
9 eine
Querschnittsansicht des durch das erneute Einbetten hergestellten
Probenkörpers, der
in einer Form angeordnet und auf einen Lagerblock geklebt wird,
-
10 eine
Querschnittsansicht, die den an dem Lagerblock befestigten Probenkörper zeigt,
-
11 eine
mikrofotografische Aufnahme (vierfache Vergrößerung), die die zellenthaltende, entkalkte
Hydroxylapatit-Probe nach Beispiel 1 zeigt,
-
12 eine
mikrofotografische Aufnahme (20-fache Vergrößerung), die einen Teil der
Probe nach Beispiel 1 zeigt,
-
13 eine
mikrofotografische Aufnahme (20-fache Vergrößerung), die einen anderen
Teil der Probe nach Beispiel 1 zeigt,
-
14 eine
mikrofotografische Aufnahme (20-fache Vergrößerung), die einen weiteren
Teil der Probe nach Beispiel 1 zeigt,
-
15 eine
mikrofotografische Aufnahme (20-fache Vergrößerung), die die Probe nach
Beispiel 2 zeigt,
-
16 eine
mikrofotografische Aufnahme (20-fache Vergrößerung), die einen anderen
Teil der Probe nach Beispiel 2 zeigt,
-
17 eine
mikrofotografische Aufnahme (20-fache Vergrößerung), die einen weiteren
Teil der Probe nach Beispiel 2 zeigt,
-
18 eine
mikrofotografische Aufnahme (10-fache Vergrößerung), die die Probe nach
Beispiel 3 zeigt, und
-
19 eine
mikrofotografische Aufnahme (20-fache Vergrößerung), die einen Teil der
Probe nach Beispiel 3 zeigt.
-
Beschreibung bevorzugter
Ausführungsbeispiele
-
[1] Hartgewebe
-
Hinsichtlich
der für
die Proben vorgesehenen Hartgewebe bestehen keine besonderen Beschränkungen.
Beispiele hierfür
sind ein lebendes Hartgewebe, ein erster Verbund- oder Mischstoff,
der aus einem durch ein lebende Hartgewebeersatzmaterial gebildeten
Gerüst
und Zellen besteht, ein zweiter Verbund- oder Mischstoff, der aus
einem durch einen lebenden Hartgewebeersatzmaterial gebildeten Gerüst und einem
lebenden Hartgewebe besteht, und ein dritter Verbund- oder Mischstoff,
der aus einem durch einen lebenden Hartgewebeersatzmaterial gebildeten
Gerüst,
Zellen und einem lebenden Hartgewebe besteht. Das Hartgewebe kann
einer der vorstehend genannten Stoffe sein.
-
(1) Lebendes Hartgewebe
-
Das
lebende Hartgewebe kann in Form von Knochen, Zähnen, Gelenken, Steinchen (Calculus) etc.
vorliegen. Das lebende Hartgewebe kann zudem Weichgewebe, z.B. Fasergewebe,
Knorpelgewebe, etc. enthalten.
-
(2) Erster Verbundstoff
-
Der
erste Verbundstoff enthält
ein Gerüst, das
aus einem lebenden Hartgewebeersatzmaterial sowie Zellen besteht
und nicht nur als Material zum Füllen
und/oder Flicken von Defekten, sondern auch als Material zur Zelldifferenzierung
und Zellvermehrung eingesetzt werden kann. Das lebende Hartgewebeersatzmaterial
liegt beispielsweise in Form von harten Materialien vor, die für künstliche
Knochen, künstliche
Zahnwurzeln, Knochenfüllstoffe,
etc. verwendet werden, typischerweise Calciumverbindungen. Die Calciumverbindungen
sind beispielsweise Hydroxylapatit, Fluorapatit und Apatitcarbonat,
Dicalciumphosphat, Tricalciumphosphat, Tetracalciumphosphat, Octacalciumphosphat,
etc.
-
Das
lebende Hartgewebeersatzmaterial kann auch weiche Materialien enthalten.
Solche weichen Materialien sind beispielsweise bekannte hochmolekulare
Materialien wie Proteine (Kollagen, Albumin, Fibrin etc.); synthetisierte
Polymere (polylaktische Säure,
Polyglykolsäure,
Poly-ε-Caprolacton, etc.);
Polysaccharide (Stärke,
Alginsäure,
etc.) etc. Beispiele für
das lebende Hartgewebeersatzmaterial, der aus einem Verbundstoff
aus harten Materialien und weichen Materialien besteht, sind Verbundstoffe aus
Calciumverbindungen und Kollagen. In diesen Verbundstoffen kann
das Kollagen vernetzt sein.
-
Hinsichtlich
der Zellen, die an dem durch das lebende Hartgewebeersatzmaterial
gebildeten Gerüst
haften, bestehen keine besonderen Beschränkungen, sofern sie an dem
Gerüst
kultiviert werden können.
Solche Zellen sind beispielsweise motorische Zellen, Leberzellen,
Fibroblaste, Harnzellen (z.B. Nierenzellen, Blasenzellen, etc.),
respiratorische Zellen (z.B. Lungenzellen, Lungenbläschenzellen,
etc.), Nervenzellen, digestive Zellen (z.B. Magenzellen, Dünndarmzellen,
Dickdarmzellen, etc.), Kreislaufzellen (z.B. Herzzellen, Blutgefäßzellen, etc.),
reproduktive Zellen, etc. Auch können
Stammzellen, Vorläuferzellen
und Tumorzellen dieser Zellen eingesetzt werden.
-
Von
diesen Zellen sind die motorischen Zellen (oder deren Stammzellen,
Vorläuferzellen
und Tumorzellen) die bevorzugten Zellen. Die motorischen Zellen
können
beispielsweise Osteoblaste, osteoblastähnliche Zellen, Knochenzellen,
Knorpelzellen, Muskelzellen, etc. sein. Die an dem Gerüst haftenden
Zellen werden beispielsweise eine gewünschte Zeit lang kultiviert.
Dadurch wird eine Bewertung dahingehend möglich, wie schnell sich die Zellen
in dem Hartgewebeersatzmaterial vermehren, das in einen lebenden
Körper
eingebracht wird.
-
(3) Zweiter Verbundstoff
-
Der
zweite Verbundstoff enthält
ein Gerüst, das
aus dem oben angegebenen harten und/oder weichen, lebenden Hartgewebeersatzmaterial
und dem oben beschriebenen lebenden Hartgewebe besteht.
-
(4) Dritter Verbundstoff
-
Der
dritte Verbundstoff enthält
ein Gerüst, das
aus dem oben beschriebenen harten und/oder weichen, lebenden Hartgewebeersatzmaterial,
den oben angegebenen Zellen sowie dem oben angegebenen lebenden
Hartgewebe besteht. Die an dem Gerüst anhaftenden Zellen können eine
gewünschte Zeit
lang kultiviert werden.
-
[2] Herstellung der Probe
-
Das
Verfahren nach der Erfindung zum Herstellen von Proben wird im Folgenden
unter Bezugnahme auf die Figuren im Detail beschrieben, ohne dass
die Erfindung auf die beispielhaft angeführten Verfahren beschränkt ist.
-
(1) Verfestigungsschritt
-
Um
das Hartgewebe vor der Entkalkung zu stabilisieren, werden vorzugsweise
die äußere Form, die
innere Struktur etc. des Gewebes im vorliegenden Zustand fixiert.
Das Fixieren der äußeren Form, etc.
des Gewebes wird in der Weise durchgeführt, dass das Hartgewebe vor
der Entkalkung in ein Fixiermittel eingetaucht wird.
-
Das
Fixiermittel ist beispielsweise Formaldehyd, Paraformaldehyd, Glutaraldehyd,
etc. Diese Fixiermittel werden beispielsweise mit Osmiumoxid, Essigsäure, Phosphorsäure, gesättigter
Picrinsäure, Alkohol,
etc. gemischt. Solche Mischungen sind beispielsweise ein Karnovsky-Fixiermittel,
das Glutaraldehyd und Osmiumtetraoxid enthält, ein Bouin-Fixiermittel,
das Formaldehyd, gesättigte
Picrinsäure und
Eisessig enthält,
eine Paraformaldehyd/Phosphorsäurepufferlösung (neutral),
etc.
-
Es
wird ein Hartgewebestück,
das in eine vorbestimmte Form geschnitten ist, in ein Fixiermittel eingetaucht.
Eintauchzeit und Temperatur werden in Abhängigkeit des Typs des Hartgewebestücks, des Fixiermittels,
etc. geeignet gewählt.
Damit das Fixiermittel, das in einen Probenkörper eindringt, keinen Konzentrationsgradienten
aufweist, wird es vorzugsweise gerührt. Nachdem die äußere Form,
die innere Struktur, etc. des Hartgewebes fixiert sind, wird der Probenkörper gewaschen,
um das Fixiermittel zu entfernen. Der Probenkörper wird vorzugsweise unter
fließendem
Wasser gewaschen.
-
(2) Dehydratisierungsschritt
-
Der
verfestigte Probenkörper
wird dehydratisiert. Durch diese Dehydratisierung wird die Permeabilität oder das
Eindringvermögen
eines Harzes, das den Flüssig keitseintritt
ermöglicht
und später
genauer beschrieben wird, in das Hartgewebestück verbessert. Die Dehydratisierung
erfolgt in der Weise, dass ein Probenkörper unter Rühren in
ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel
wie Ethanol oder Azeton eingetaucht wird. Eintauchzeit und Temperatur
werden dabei in Abhängigkeit
von Typ und Größe des Hartgewebestücks geeignet
gewählt.
Während
des Dehydratisierungsschritts wird das organische Lösungsmittel
vorzugsweise einige Male ausgetauscht. In diesem Fall ist es günstig, mehrere
wässrige
Lösungen,
die unterschiedliche Konzentrationen eines organischen Lösungsmittels
enthalten, in der Weise einzusetzen, dass die Lösungen beginnend mit einer Lösung geringster
Konzentration bis zu einer Lösung höchster Konzentration
(z.B. 100 %-organisches Lösungsmittel)
nacheinander ausgetauscht werden.
-
(3) Primärer Eintauchschritt
-
Um
das mit 1a bezeichnete Hartgewebestück in ein den Flüssigkeitseintritt
ermöglichendes Harz
einzubetten, wird das Hartgewebestück 1a vorzugsweise
zunächst
in eine Mischflüssigkeit
(primäre Eintauchflüssigkeit) 2a eingetaucht,
die ein Monomer eines den Flüssigkeitseintritt
befördernden
Harzes und ein organisches Lösungsmittel
enthält,
so dass die primäre
Eintauchflüssigkeit 2a in
das Hartgewebestück 1a eindringt
(vergl. 1). Ein "den Flüssigkeitseintritt ermöglichendes
Harz" bedeutet in
diesem Zusammenhang ein Harz, das es ermöglicht, dass Flüssigkeiten
(z.B. eine Entkalkungsflüssigkeit,
eine Dehydratisierungsflüssigkeit,
eine einbettende Monomerflüssigkeit,
etc.) in das mit 1b bezeichnete Hartgewebestück eindringt,
nachdem das Hartgewebestück 1b in
das Harz eingebettet worden ist (vergl. 4).
-
In
einem sekundären
Eintauchschritt und einem Einbettungsschritt können die gleichen Monomere
wie in dem primären
Eintauchschritt oder auch andere Monomere verwendet werden, sofern
diese die oben angegebenen Harze, die den Flüssigkeitseintritt ermöglichen,
bilden können.
Vorzugsweise werden die gleichen Monomere verwendet. Das Monomer
des den Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harzes wird unten im Detail beschrieben. Das organische Lösungsmittel ist
beispielsweise Ethanol, Azeton, etc. Hinsichtlich der Konzentration
des Monomers in der primären
Eintauchflüssigkeit 2a bestehen
keine besonderen Beschränkungen.
Vorzugsweise liegt diese Konzentration bei 30 bis 70 Massen-%. Die
primäre
Eintauchzeit wird in Abhängigkeit der
Größe des Hartgewebestücks 1a,
etc. geeignet gewählt.
Der primäre
Eintauchschritt kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Außerdem kann der
primäre
Eintauchschritt im Vakuum durchgeführt werden.
-
(4) Sekundärer Eintauchschritt
-
Nach
dem primären
Eintauchschritt wird das Hartgewebestück 1b vorzugsweise
in eine sekundäre
Eintauchflüssigkeit 2b eingetaucht,
die ein Monomer und einen Polymerisationsinitiator ohne organisches
Lösungsmittel
enthält.
Die sekundäre
Eintauchzeit liegt üblicherweise
bei 24 Stunden, vorzugsweise bei 16 bis 22 Stunden. Der sekundäre Eintauchschritt
kann bei Raumtemperatur ausgeführt werden.
Dabei kann in dem sekundären
Eintauchschritt das gleiche Monomer wie in dem primären Eintauchschritt
verwendet werden.
-
Das
Monomer des den Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harzes ist vorzugsweise ein Monomer, das innerhalb kurzer Zeit vernetzbar
und in der Lage ist, ein den Flüssigkeitsdurchtritt
ermöglichendes
Harz hoher Lichtdurchlässigkeit
zu bilden, das über
lange Zeit keine Qualitätseinbußen erfährt. Solche
Monomere sind beispielsweise (Meth)acrylsäuren und deren Derivate, insbesondere
(Meth)acrylate oder Hydroxyalkyl(meth)acrylate, vorzugsweise Hydroxyalkyl(meth)acrylate.
Die bevorzugten Hydroxyalkyl(meth)acrylate umfassen beispielsweise
2-Hydroxymethyl(meth)acrylat, 2-Hydroxyethyl(meth)acrylat, 2-Hydroxypropyl(meth)acrylat, 2-Hydroxybutyl(meth)acrylat,
etc. Unter diesen Substanzen sind 2-Hydroxymethyl(meth)acrylat und 2-Hydroxyethyl(meth)acrylat
bevorzugt, insbesondere 2-Hydroxyethyl(meth)acrylat (HEMA). Die (Meth)acrylate
sind beispielsweise Methyl(meth)acrylat, Ethyl(meth)acrylat, Propyl(meth)acrylat,
etc. Diese Monomere können
allein oder in Kombination eingesetzt werden. Falls erforderlich,
kann das jeweilige Monomer auch einen Weichmacher enthalten.
-
Dieser
Weichmacher ist beispielsweise ein Hydroxyether. Handelsübliche Monomere
der den Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harze sind beispielsweise Technovit 7100 und 8100 von Heraeus Kulzer
aus Deutschland, Historesin Plus von Leica Microsysteme aus Deutschland,
JB-4 von Polyscience aus den Vereinigten Staaten von Amerika, etc.
-
Der
Polymerisationsinitiator ist vorzugsweise Benzoylperoxid (BPO, LUCIDOL®),
etc. Handelsübliche
Monomere wie Technovit werden mit bestmöglich angepassten Polymerisationsinitiatoren
geliefert. Die verwendete Menge an Polymerisationsinitiator wird
in Abhängigkeit
der kombinierten Monomere geeignet gewählt. Wird beispielsweise HEMA
mit BPO kombiniert, so liegt das Verhältnis HEMA/BPO vorzugsweise
bei 100/0,5–100/1,5,
z.B. bei 100/1, jeweils auf die Masse bezogen. Die sekundäre Eintauchflüssigkeit
kann einen Hilfskatalysator enthalten, der beispielsweise ein Katalysator
ist, der in der Lage ist, Chloridionen zu erzeugen. Handelsübliche Monomere
wie Technovit werden zusammen mit bestmöglich angepassten Katalysatoren
geliefert.
-
Ist
das sekundär
eingetauchte Hartgewebestück 1c in
einer Formmulde 4a einer Einbettform 4 (z.B. Histoform
von Heraeus Kulzer) angeordnet, so wird eine Einbettflüssigkeit 2c,
die die sekundäre
Eintauchflüssigkeit
(das Monomer des den Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harzes + der Polymerisationsinitiator) und einen Härtungsbeschleuniger enthält, in die
Formmulde 4a eingebracht, die dann mit einer Deckplatte 5 abgedichtet
wird. Um den Eintritt von Luft zu verhindern, die möglicherweise
die Verfestigung der Einbettflüssigkeit 2c behindert,
wird die Formmulde 4a mit der Einbettflüssigkeit 2c bis zu einer
Höhe eingefüllt, in
der sie bündig
mit der oberen Fläche 4b der
Formmulde 4a ist, so dass zwischen der Einbettflüssigkeit 2c und
der Deckplatte 5 kein Zwischenraum vorhanden ist. Der Härtungsbeschleuniger
ist beispielsweise eine Lösung
aus Barbitursäurederivaten,
aromatischen Aminen, N,N-Dimethylanilin in Styrol, etc. Handelsübliche Monomere wie
Technovit werden zusammen mit bestmöglich angepassten Härtungsbeschleunigern
geliefert. Mit einem solchen Härtungsbeschleuniger
kann das Monomer bei vergleichsweise tiefer Temperatur polymerisiert
werden. Insbe sondere in einem System, das mit BPO als Polymerisationsinitiator,
einem Barbitursäurederivat
als Härtungsbeschleuniger
und einem Hilfskatalysator, der Chloridionen erzeugen kann, arbeitet,
kann das Monomer vollständig
polymerisiert werden, indem es bei Raumtemperatur etwa eine Stunde
lang stehen gelassen wird und dann etwa eine Stunde lang auf 35
bis 45°C
warm gehalten wird. Wird das Monomer in dem in 3 gezeigten
Zustand erwärmt,
so wird es polymerisiert und bildet so einen Probenkörper (Einbettprobenkörper) 10a,
der das Hartgewebestück 1c enthält, das
in dem den Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harz 2d eingebettet ist (vergl. 4).
-
(6) Entkalkungsschritt
-
Um
das Hartgewebestück 1d,
das in das Harz 2d eingebettet ist, zu entkalken, wird
der Probenkörper 10a,
der das Hartgewebestück 1d und
das Harz 2d umfasst, vorzugsweise in eine Entkalkungsflüssigkeit 6 eingetaucht,
das eine organische Säure, eine
anorganische Säure
und/oder ein chelatbildendes Mittel enthält, wie in 5 gezeigt
ist. Beispiele für
die Entkalkungsflüssigkeit 6 sind
eine wässrige Ameisensäurelösung mit
einer Konzentration von etwa 5 bis 10 Massen-%, eine wässrige Salpetersäurelösung mit
einer Konzentration von etwa 5 bis 8 Massen-%, eine wässrige Ethylendiamintetraessigsäurelösung (EDTA)
mit einer Konzentration von etwa 10 Massen-%, etc. Die eine organische
Säure enthaltende
Entkalkungsflüssigkeit 6 kann
auch Formalin oder Alkohol enthalten. Die Ameisensäure enthaltende
Entkalkungsflüssigkeit 6 kann
ferner Salzsäure
oder Zitronensäure
enthalten.
-
Der
Probenkörper 10a,
der das in das Harz 2d eingebettete Hartgewebestück 1d aufweist,
wird vorzugsweise drei bis 30 Tage lang in die Entkalkungsflüssigkeit 6 eingetaucht.
Die genannte Zeit kann beispielsweise in Abhängigkeit der Größe des Hartgewebestücks 1d auch
anders gewählt
werden. Die Entkalkungsflüssigkeit 6 dringt
in das eingebettete Hartgewebestück 1d ein,
um die Calciumbestandteile herauszulösen. Die verwendete Menge an
Entkalkungsflüssigkeit 6 beträgt volumenbezogen
vorzugsweise das 10-fache oder mehr des eingebetteten Hart gewebestücks 1d.
Nach Bedarf kann die Entkalkungsflüssigkeit 6 auch gerührt oder
geschüttelt werden,
oder es kann Spannung an sie angelegt werden, um die Entkalkungszeit
zu verkürzen.
Der mit 10b bezeichnete Probenkörper, der im Ergebnis das mit 1e bezeichnete
entkalkte Hartgewebestück
aufweist (vergl. 6), wird vorzugsweise mit Wasser, Alkohol,
einer Mischflüssigkeit
aus Wasser und Alkohol, etc. gewaschen.
-
(7) Erneuter Einbettschritt
-
In
dem entkalkten Hartgewebestück 1e (vergl. 6)
sind Poren zurückgeblieben,
nachdem die Calciumbestandteile herausgelöst worden sind. Demzufolge
werden diese Poren des entkalkten Hartgewebestücks 1e vorzugsweise
nochmals mit dem Harz 2d gefüllt. Dieser Schritt ist jedoch
nicht zwingend erforderlich. Hinsichtlich der zur erneuten Einbettung
bestimmten Harzmonomere bestehen keine besonderen Beschränkungen,
sofern diese in der Lage sind, in die Poren des entkalkten Hartgewebestücks 1e einzudringen.
Vorzugsweise sind diese Monomere gleich den oben angegebenen Monomeren
der den Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harze. Ähnlich
wie in dem oben beschriebenen Verfahren wird das erneute Einbetten
unter Verwendung des den Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harzes vorzugsweise in der Weise ausgeführt, dass der Probenkörper 10b,
der das entkalkte Hartgewebestück 1e enthält, zunächst gewaschen,
dann einer Dehydratisierung sowie dem primären und dem sekundären Eintauchschritt
unterzogen und anschließend
in der Formmulde 4a der Einbettform 4 angeordnet
wird (vergl. 7), worauf eine Einbettflüssigkeit
in die Formmulde 4a eingebracht und dann unter den gleichen
Bedingungen wie in Schritt (5) erwärmt wird, um das Monomer zu
polymerisieren.
-
(8) Befestigen am Lagerblock
-
Der
mit 10c bezeichnete Probenkörper, der das erneut eingebettete,
entkalkte Hartgewebestück 1f (vergl. 8)
enthält,
wird vorzugsweise an einem Lagerblock 7 befestigt, so dass
er beispielsweise mittels eines Mikrotoms in Scheiben schneidbar
oder schälbar
ist. Zu diesem Zweck wird der erneut eingebettete Probenkörper 10c,
wie in 9 gezeigt, in die Formmulde 4a der schon
oben verwendeten Einbettform 4 eingebracht und der hohle
Lagerblock 7 (z.B. "Histoblock" von Heraeus Kulzer),
der ein mit einer Lagerfläche 7b in
Verbindung stehendes Loch 7a aufweist, über die obere Fläche 4b der
Formmulde 4a gehalten, in der der Probenkörper 10c angeordnet ist,
und dann ein Klebstoff 8 (z.B. "Technovit 3040" von Heraeus Kulzer, der hauptsächlich aus
Methylmethacrylat besteht) in den Lagerblock 7 eingebracht.
Der Klebstoff 8 füllt
den Zwischenraum zwischen der oberen Fläche 4b der Formmulde 4a und der
Lagerfläche 7b des
Lagerblocks 7 aus, wodurch eine Klebstoffschicht 8a ausgebildet
wird, die den Probenkörper 10c an
die Lagerfläche 7b bindet.
Wie in 10 gezeigt, ist der erneut eingebettete
Probenkörper 10c fest
an dem Lagerblock 7 befestigt.
-
Das
erneut eingebettete, entkalkte Hartgewebestück 1f des an dem Lagerblock 7 befestigten Probenkörpers 10c wird
beispielsweise mittels eines Mikrotoms in Scheiben geschnitten oder
geschält, um
eine Probe oder einen Dünnschnitt
zur mikroskopischen Betrachtung zu erzeugen. Dieser Dünnschnitt
ist vorzugsweise 0,5 bis 10 μm
dick. Der resultierende Dünnschnitt
wird dann zur weiteren Behandlung mit Wasser gespült, beispielsweise
auf einem Objektträger
angeordnet und getrocknet. Nachdem der Dünnschnitt gefärbt worden
ist, wird er beispielsweise in einem Deckglas abgedichtet, wodurch
man schließlich
eine entkalkte Gewebeprobe erhält.
-
Die
Erfindung wird im Folgenden an Hand von Beispielen noch genauer
erläutert.
-
Beispiel 1
-
Aus
dem Schädelknochen
einer neugeborenen Ratte gewonnene primäre Osteoblasten wurden an Hydroxylapatit
mit einem Durchmesser von 5 mm, einer Dicke von 2 mm und einer Porosität von 50
% angehaftet, bevor die Zellen aufgebracht und kultiviert wurden.
Das mit Zellen behaftete Hydroxylapatit wurde in eine 4 Massen-%-ige
Formaldehyd/Phosphorsäurepufferlösung, die
eine Woche lang auf Raumtemperatur gehalten wurde, getaucht, um
das Zellgewebe an dem Hydroxylapatit zu fixieren. Der so fixierte
Probenkörper
wurde mit fließendem
Wasser gewaschen, in eine 70 Volumen-%-ige und eine 96 Volumen-%-ige
wässrige
Ethanollösung
jeweils für zwei
Stunden bei Raumtemperatur eingetaucht und anschließend zur
Dehydratisierung bei Raumtemperatur eine Stunde lang in wasserfreies
Ethanol eingetaucht.
-
Der
dehydratisierte Probenkörper
wurde bei Raumtemperatur zwei Stunden lang in eine primäre Eintauchflüssigkeit 2a eingetaucht,
die einen Hauptbestandteil von Technovit 7100, der hauptsächlich aus
HEMA bestand und einen zum Erzeugen von Chloridionen geeigneten
Hilfskatalysator enthielt, sowie wasserfreies Ethanol im gleichen
Volumenverhältnis
enthielt. Das primär
eingetauchte Hartgewebestück 1b wurde
dann bei Raumtemperatur 20 Stunden lang in eine sekundäre Eintauchflüssigkeit 2b eingetaucht,
und wasserfreies Ethanol wurde entfernt. Die sekundäre Eintauchflüssigkeit 2b enthielt den
Hauptbestandteil von Technovit 7100 sowie einen Polymerisationsinitiator,
der ein Härtungsmittel
I (BPO mit einem Wassergehalt von 20 Massen-%) von Technovit 7100
war, in einem Massenverhältnis (Hauptbestandteil/Härtungsmittel
I) von 100/1.
-
Das
mit der sekundären
Eintauchflüssigkeit 2b getränkte Hartgewebestück 1c wurde
in die Formmulde 4a der Einbettform 4 (Histoform
von Heraeus Kulzer) eingebracht, wie in 3 gezeigt
ist. Dann wurden eine Einbettflüssigkeit 2c,
die den Hauptbestandteil von Technovit 7100, den oben angegebenen
Polymerisationsinitiator sowie einen Härtungsbeschleuniger, der ein
Barbitursäurederivate
enthaltendes Härtungsmittel
II von Technovit 7100 war, in einem Volumenverhältnis (sekundäre Eintauchflüssigkeit/Härtungsmittel
II) von 15/1 in die Formmulde 4a eingebracht, wodurch das
Hartgewebestück 1c in die
Einbettflüssigkeit 2c eingetaucht
wurde. Nachdem das Hartgewebestück 1c bei
Raumtemperatur eine Stunde lang stehen gelassen worden war, wurde es
in der Einbettflüssigkeit 2c eine
Stunde lang auf 37°C
warm gehalten, um den Hauptbestandteil von Technovit 7100 zu polymerisieren.
-
Ein
Probenkörper 10a,
der das in das aus Technovit 7100 gebildete Harz 2d eingebettete
Hartgewebestück 1d aufwies,
wurde aus der Einbettform 4 genommen und bei Raumtemperatur
fünf Tage
lang in eine 5 Massen-%-ige wässrige
Ameisensäurelösung getaucht,
um das Hartgewebestück 1d zu
entkalken (vergl. 5). Der das entkalkte Hartgewebestück 1e enthaltende
Probenkörper 10b wurde
mit fließendem
Wasser gewaschen und dann nacheinander unter Verwendung der primären Eintauchflüssigkeit,
der sekundären
Eintauchflüssigkeit
und der Einbettflüssigkeit
mit einer 70 Volumen-%-igen wässrigen
Ethanollösung,
einer 96 Volumen-%-igen wässrigen
Ethanollösung
sowie wasserfreiem Ethanol dehydratisiert und dann in das Harz aus
Technovit 7100 unter Verwendung der oben angegebenen primären Eintauchlösung, der
sekundären
Eintauchlösung
und der Einbettflüssigkeit
in gleicher Weise wie oben erneut eingebettet.
-
Der
erneut eingebettete Probenkörper 10c wurde
mittels eines Klebstoffs 8 (Technovit 3040 von Heraeus
Kulzer) an einem Lagerblock 7 (Histoblock von Heraeus Kulzer)
befestigt (vergl. 9). Der an dem Lagerblock 7 befestigte
Probenkörper 10c (vergl. 10)
wurde mittels eines Mikrotoms in Scheiben einer Dicke von 4 μm geschnitten,
und der resultierende Dünnschnitt
wurde auf destilliertem Wasser ausgebreitet, auf einem Objektträger angeordnet
und 15 Minuten bei 60°C
getrocknet. Dann wurde der Dünnschnitt
mit Hematoxilin-Eosin (HE) gefärbt
und mit einem Deckglas abgedichtet. Die resultierende Dünnschnittprobe
des zellenthaltenden, entkalkten Hydroxylapatits wurde mit einem
Lichtmikroskop betrachtet. Die 11 bis 14 zeigen
mikrofotografische Aufnahmen des Probengewebes. 11 zeigt das
gesamte Probengewebe mit 4-facher Vergrößerung. Die 12 bis 14 sind
20-fach vergrößerte Aufnahmen,
die jeweils einen Teil des in 11 dargestellten
Gewebes zeigen. In den 11 bis 14 ist
deutlich die feine Gewebestruktur der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Probe erkennbar. Daraus geht hervor, dass die Feinstruktur des
Hartgewebes in ihrer Gesamtheit ungebrochen blieb.
-
Beispiel 2
-
Es
wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 eine Dünnschnittprobe des zellenthaltenden,
entkalkten Hydroxylapatits hergestellt, abgesehen davon, dass ultraporöses Hydroxylapatit
(HAp-S) mit einem Durchmesser von 5 mm, einer Dicke von 2 mm und einer
Porosität
von 85 % vor Anbringung der Zellen verwendet wurde. An dem Hydroxylapatit
wurden im Handel erhältliche
klonale Osteoblaste (HOS-Zellen, menschliche Osteosarkomzellen)
aufgebracht und kultiviert. Die 15 bis 17 zeigen
mikrofotografische Aufnahmen der resultierenden Probe.
-
Beispiel 3
-
Es
wurde eine Dünnschnittprobe
eines zellenthaltenden, entkalkten Hydroxylapatits in gleicher Weise
wie in Beispiel 2 hergestellt, abgesehen davon, dass die Probe mit
Toluidinblau gefärbt
wurde. Die 18 und 19 sind
mikrofotografische Aufnahmen der resultierenden Probe.
-
Wie
in den 15 bis 19 gezeigt,
war selbst bei Verwendung ultraporösen Hydroxylapatits eine feine
Gewebestruktur wie bei Hydroxylapatit üblicher Porosität (Beispiel
1) deutlich erkennbar.
-
Die
Erfindung sieht vor, ein Hartgewebe nach Einbetten in einem den
Flüssigkeitseintritt
ermöglichenden
Harz zu entkalken. So kann eine entkalkte Hartgewebeprobe einfach
und kostengünstig
hergestellt und dabei die Feinstruktur des Hartgewebes aufrechterhalten
werden. Das Verfahren nach der Erfindung ist besonders geeignet
für die
Herstellung von entkalkten Hartgewebeproben künstlicher Knochen, etc., auf
denen beispielsweise Zellen angebracht und kultiviert werden.