DE102005043669A1

DE102005043669A1 - Verfahren zur enzymatischen Synthese von Ethern

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Publication number: DE102005043669A1
Application number: DE102005043669A
Authority: DE
Inventors: Uwe Prof. Dr. Bornscheuer; Burghard Dr. Grüning; Geoffrey Hills; Patrick Möbius; Oliver Dr. Thum; Christian Dr. Weitemeyer
Original assignee: Goldschmidt GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2005-09-14
Filing date: 2005-09-14
Publication date: 2007-03-22
Also published as: WO2007031184A2; WO2007031184A3; US20070059789A1

Abstract

Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Ethern, ausgehend von Estern.

Description

Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Ethern.
Ether stellen eine bedeutende Klasse chemischer Produkte dar, die in teilweise sehr großen Mengen hergestellt werden. Zur Herstellung von Ethern ist eine Reihe von chemischen Prozessen bekannt, im Falle der Produktion von Methyl-t-Butyl-Ether (MTBE) beispielsweise die Addition von Methanol an Isobuten unter Katalyse durch saure Ionenaustauscher. Weitere Verfahren verwenden Alkylhalogenide (Williamsonsche Ethersynthese) oder Lewis-Säuren wie ZnCl₂.
Gemeinsam ist diesen Verfahren allerdings, dass zur Durchführung der Synthesen relativ drastische Bedingungen angewendet werden müssen, so dass insbesondere bei Verwendung von empfindlichen Rohstoffen (z. B. ungesättigten Alkoholen) Nebenreaktionen nicht zu vermeiden sind. Um eine Verwendung dieser Produkte in Bereichen zu ermöglichen, in denen eine hohe Reinheit nötig ist, z. B. in kosmetischen Formulierungen, sind daher üblicherweise aufwändige zusätzliche Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte erforderlich.

Die enzymatische Synthese von Ethern wurde bislang sehr wenig untersucht. Die Forschung konzentrierte sich stattdessen auf Untersuchungen des mikrobiellen Abbaus von Ethern, vor allem in Hinblick auf den Abbau von MTBE-Verunreinigungen in Wasser und Böden.

Die für diese Etherspaltung verantwortlichen Enzyme können nicht in der Synthese von Ethern eingesetzt werden. Der Grund hierfür liegt in den Abbaumechanismen, bei denen die Etherbindung durch Oxygenierung, Oxidation durch P450-Enzyme, Dealkylierung, Reduktion oder Lyasen gespalten wird (G. White, N. J. Russell, E. C. Tidswell, Microbiol. Rev. 1996, 60, 216–232). Alle diese Mechanismen zum Abbau von Ethern sind irreversibel und können nicht zur Synthese genutzt werden. Auch das als β-Etherase bezeichnete Enzym ist aus mechanistischen Gründen nicht zur Ethersynthese geeignet (E. Masai, Y. Katayama, S. Kubota, S. Kawai, M. Yamasaki, N. Morohoshi, FEBS Letters 1993, 323, 135–140).

Ein einziges Verfahren zur enzymatischen Synthese eines Ethers ist bis dato bekannt geworden. Dabei wird ein 1-Acyldihydroxyaceton-Phosphat (z. B. 1-Palmitoyl-DHAP) in ein 1-Alkyldihydroxyaceton-Phosphat (z. B. 1-Palmityl-DHAP) unter Verwendung der Alkyldihydroxyaceton-Phosphat-Synthase (ADAPS, EC 2.5.1.26) umgewandelt (vgl. Schema 1) (A. J. Brown, F. Snyder, J. Biol. Chem. 1981, 257, 8835–8839; A. J. Brown, F. Snyder, Methods Enzymol. 1992, 209, 377–384; A. Zomer, P. Michels, F. Opperdoes, Mol. Biochem. Parasitol. 1999, 104, 55–66).

Schema 1: Natürliche Reaktion der ADAPS

Die ADAPS wurde aus verschiedenen Organismen isoliert, z. B. Trypanosoma sp. und Leishmania sp. und biochemisch charakterisiert. Dabei wurde allerdings ausschließlich über die katalytische Wirkung der ADAPS in ihrer natürlichen Funktion und unter Reaktionsbedingungen, die denen der physiologischen Funktion ähneln, berichtet, d. h. das bekannte Verfahren ist auf Reaktionen unter Verwendung von 1-Acyldihydroxyaceton-Phosphaten als Edukte beschränkt. Über die Eignung dieses oder anderer Enzyme für die industrielle Biokatalyse mit anderen, leichter zugänglichen Substraten als den 1-Acyl-dihydroxyaceton-Phosphaten ist bis heute nichts bekannt. Ferner weisen die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren den Nachteil auf, dass es sich jeweils um wässrige Systeme handelt, in denen eine Vielzahl von organischen Verbindungen nicht oder nur eingeschränkt löslich sind. Dadurch werden die Anwendungsmöglichkeiten in der industriellen organischen Synthese stark beschränkt.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, ein Verfahren zu entwickeln, welches die enzymkatalysierte Herstellung von Ethern unter Bedingungen ermöglicht, wie sie üblicherweise für die industrielle Produktion organisch-chemischer Verbindungen verwendet werden.

Weitere nicht explizit genannte Aufgaben ergeben sich aus dem Kontext der nachfolgenden Beschreibung, der Beispiele sowie der Ansprüche.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass Enzyme, bevorzugt aus der Gruppe der Alkylgruppen übertragenden Transferasen (EC 2.5.x.y), insbesondere die Alkyldihydroxyaceton-Phosphat-Synthase (ADAPS, EC 2.5.1.26), auch unter Verwendung von nicht-natürlichen Substraten und unter nicht-wässrigen Systemen die Synthese von Ethern katalysieren können.

Diese Erfindung ermöglicht es somit, eine Vielzahl von Substraten zu verwenden, was ein breites Anwendungsspektrum des erfindungsgemäßen Verfahrens eröffnet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Ethern, dadurch gekennzeichnet, das zumindest ein Enzym beteiligt ist und nicht-natürliche Substrate verwendet werden.

Gegenstand ist insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I), R-O-R¹ (I)worin
R der Kohlenwasserstoffrest eines substituierten oder unsubstituierten, gegebenenfalls verzweigten und/oder eine oder mehrere Mehrfachbindung(en) enthaltenden Alkohols mit 1 bis 30 C-Atomen, bevorzugt mit 2 bis 30 C-Atomen, besonders bevorzugt mit 3 bis 22 C-Atomen, insbesondere mit 8 bis 18 C-Atomen, ist, welcher gegebenenfalls zusätzliche Hydroxygruppen und/oder mit organischen Resten veretherte Hydroxygruppen enthalten kann,
dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Alkohole der allgemeinen Formel (II) R-OH (II)worin R wie oben definiert ist, in Gegenwart von zumindest einem Enzym als Katalysator, mit einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (III), R¹-O-R² (III)worin
R¹ eine lineare oder verzweigte, substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist, gegebenenfalls zusätzliche Carbonylgruppen und/oder Hydroxygruppen und/oder mit organischen Resten veretherte Hydroxygruppen und/oder mit organischen oder anorganischen Säuren veresterte Hydroxygruppen, enthaltend, und
R² der Acylrest einer substituierten oder unsubstituierten, gegebenenfalls verzweigten und/oder eine oder mehrere Mehrfachbindung(en) und/oder Hydroxygruppen enthaltenden Säure mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist,
wobei R² im Falle, dass R¹ ein 1-Dihydroxyacetonphosphat ist, kein Acylrest einer natürlich vorkommenden Fettsäure mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen sein kann, umgesetzt wird.

Erfindungsgemäß wird bevorzugt ein nicht-wässriges Reaktionssystem verwendet, welches im Sinne dieser Erfindung aus einer für die gewünschte Synthese geeigneten Reaktionsmischung besteht, die weniger als 30 Gewichts-%, bevorzugt weniger als 10 Gewichts-%, besonders bevorzugt weniger als 5 Gewichts-% Wasser enthält.

Neben den Reaktionspartnern, dem Biokatalysator sowie weiteren, zur Aufrechterhaltung der Enzymaktivität notwendigen Substanzen wie beispielsweise Cofaktoren, wie zum Beispiel FADH₂/FAD, NAD(P)H/NAD(P)⁺, Metallionen, Stabilisatoren oder Detergentien, wie zum Beispiel Triton X-100, können erfindungsgemäß organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Pentan, Hexan, Heptan, Oktan, Diethylether, MTBE, Dioxane, Furane, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, 2-Butanol, t-Butanol, Methylcyclohexan, Toluol, Aceton, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dichlormethan, Chloroform, verwendet werden. Erfindungsgemäß können auch andere Substanzen als Lösungsmittel verwendet werden, beispielsweise Verbindungen unter überkritischen Bedingungen (z. B. überkritisches Kohlendioxid, überkritisches Propan oder andere Kohlenwasserstoffe) oder ionische Flüssigkeiten (z. B. EMIM-PF₆, BMIM-PF₆, BMIM-BF₄). Die Verwendung geeigneter Puffersysteme kann notwendig sein, beispielsweise ein Puffer bestehend aus 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,5, 50 mM NaF, 0,1% Triton-X 100.

Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Alkoholen nach der allgemeinen Formel II kann es sich um gegebenenfalls verzweigte und/oder eine oder mehrere Mehrfachbindungen enthaltende, substituierte und/oder unsubstituierte Alkohole mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, bevorzugt mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt mit 3 bis 22 Kohlenstoffatomen, insbesondere 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentanol, Hexanol, Octanol sowie deren Isomeren wie i-Propanol, i-Butanol, 2-Ethylhexanol, Isononylalkohol, Isotridecylalkohol, sowie mehwertige Alkohole, wie 1,6-Hexandiol, 1,2-Pentandiol, Glycerin, Diglycerin, Triglycerin, Polyglycerin, Ethylenglykol, Diethylenglycol, Triethylenglycol, Polyethylenglycol, handeln.

Weiterhin können Alkohole, die nach bekannten Verfahren aus einbasischen Fettsäuren auf Basis natürlicher pflanzlicher oder tierischer Öle mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, bevorzugt mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, insbesondere 8 bis 18 Kohlenstoffatomen hergestellt werden, wie Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Isostearinsäure, Stearinsäure, 12-Hydroxystearinsäure, Dihydroxystearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Petroselinsäure, Elaidinsäure, Arachinsäure, Behensäure, Erucasäure, Gadoleinsäure, Rapsölfettsäure, Sojaölfettsäure, Sonnenblumenölfettsäure, Talgölfettsäure, Palmölfettsäure, Palmkernölfettsäure, Kokosfettsäure, allein oder in Mischung eingesetzt werden.

Beispiele für den Rest R¹ in der allgemeinen Formel III sind die Alkylreste von Dihydroxyaceton, 1,2-Propylenglycol, 1,3-Propylenglykol, Neopentylglycol, 1,6-Hexandiol, 1,2-Pentandiol, Glycerin, Trimethylolpropan, Pentaerithrol oder Sorbitol abgeleiteten Reste. Erfindungsgemäß können eventuell vorhandene weitere Hydroxygruppen mit einer anorganischen Säure, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder einem Acylrest verestert sein. Dies ist beispielsweise bei der Verwendung der Alkylreste von 1(2)-Monoacylglyceriden, 1,2-Diacylglyceriden oder 1-Acylethylenglykol der Fall. Erfindungsgemäß können eventuell vorhandene weitere Hydroxygruppen auch mit einem weiteren Alkohol verethert sein, wie beispielsweise bei der Verwendung der Alkylreste von Diglycerin, Triglycerin, Polyglycerin, Dieethylenglycol, Triethylenglycol oder Polyethylenglycol.

Beispiele für den Rest R² in der allgemeinen Formel III sind substituierte oder unsubstituierte und/oder verzweigte oder unverzweigte und/oder Mehrfachbindungen enthaltende und/oder Hydroxygruppen enthaltende Acylreste handelsüblicher Säuren mit 1 bis 15, bevorzugt 1 bis 10, besonders bevorzugt 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Essigsäure, Propansäure, Butansäure, Pentansäure, Chloressigsäure, Trifluoressigsäure. Weiterhin sind substituierte oder unsubstituierte Acylreste einbasischer Fettsäuren auf Basis natürlicher pflanzlicher oder tierischer Öle mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Isostearinsäure, Stearinsäure, 12-Hydroxystearinsäure, Dihydroxystearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Petroselinsäure, Elaidinsäure, Arachinsäure, Behensäure, Erucasäure, Gadoleinsäure, Linolensäure, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Arachidonsäure, welche allein oder in Mischung eingesetzt werden können. Dabei ist zu beachten, dass im Falle, dass R¹ ein 1-Dihydroxyacetonphosphat ist, R² kein Acylrest einer natürlich vorkommenden Fettsäure oder in speziellen Fällen generell einer natürlich vorkommenden Säure, jeweils mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen, sein kann.

Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Enzymen handelt es sich bevorzugt um solche aus der Gruppe der Alkylgruppen übertragenden Transferasen (EC 2.5.X.X), bevorzugt um eine Alkyldihydroxyaceton-Phosphat-Synthase (EC 2.5.1.26). Ganz besonders bevorzugt können die aus dem Stand der Technik bekannten Alkyldihydroxyaceton-Phosphat-Synthasen, wie sie in Tabelle 1 und 2 aufgeführt sind und zumindest zum Teil in A. Zomer, P. Michels, F. Opperdoes, Mol. Biochem. Parasitol. 1999, 104, 55–66 offenbart wurden, oder ein Analoges, Allel, Derivat, eine funktionelle Variante oder eine funktionelle Teilsequenz davon, verwendet werden. Der Inhalt dieser Druckschrift sowie der in Tabellen 1 und 2 zitierten Aminosäuresequenzen wird hiermit ausdrücklich in die Beschreibung der vorliegenden Anmeldung mit einbezogen. Tabelle 1: Organismen mit ADAPS-Accession code von BRENDA

Tabelle 2: Organismen mit ADAPS-Accession code von NCBI

Die in Tabelle 1 und 2 angegebenen Aminosäure- sowie Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) sowie des Enzym Informations Systems BRENDA des Biochemischen Instituts der Universität Köln entnommen werden.

Ganz besonders bevorzugt Verwendung findet Alkyldihydroxyaceton-Phosphat-Synthase aus Trypanosoma sp., Leishmania sp., Aeropyrum pernix, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius oder Archaeoglobus fulgidus. Die entsprechenden Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen dieser Enzymkatalysatoren werden in den SEQ. ID's Nr. 1–12 beigefügt. Die einzelnen SEQ. ID's sind wie folgt zugeordnet:
SEQ: ID. Nr. 1: Aminosäuresequenz der ADAPS aus Trypanosoma brucei
SEQ: ID. Nr. 2: Nukleinsäuresequenz der ADAPS aus Trypanosoma brucei
SEQ: ID. Nr. 3 Aminosäuresequenz der ADAPS aus Leishmania major
SEQ: ID. Nr. 4 Nukleinsäuresequenz der ADAPS aus Leishmania major
SEQ: ID. Nr. 5: Aminosäuresequenz der ADAPS aus Aeropyrum pernix
SEQ: ID. Nr. 6: Nukleinsäuresequenz der ADAPS aus Aeropyrum pernix
SEQ: ID. Nr. 7: Aminosäuresequenz der ADAPS aus Sulfolobus solfataricus
SEQ: ID. Nr. 8: Nukleinsäuresequenz der ADAPS aus Sulfolobus solfataricus
SEQ: ID. Nr. 9: Aminosäuresequenz der ADAPS aus Sulfolobus acidocaldarius
SEQ: ID. Nr. 10: Nukleinsäuresequenz der ADAPS aus Sulfolobus acidocaldarius
SEQ: ID. Nr. 11: Aminosäuresequenz der ADAPS aus Archaeoglobus fulgidus
SEQ: ID. Nr. 12: Nukleinsäuresequenz der ADAPS aus Archaeoglobus fulgidus

In den in den Tabellen 1 und 2 sowie den Sequenz ID Nummern 1, 3, 5, 7, 9 und 11 angegebenen Aminosäuresequenzen bzw. Teilsequenzen davon können eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sein, ohne dass die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich reduziert wird.

Unter einer funktionellen Variante im Sinne der Erfindung wird eine ADAPS enthaltend eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzhomologie von mindestens 30%, bevorzugt von über 60% zu einer der in Tabelle 1 und 2 oder den Sequenz ID Nummern 1, 3, 5, 7, 9 und 11 referierten Sequenzen verstanden. Unter einer funktionellen Teilsequenz werden darüber hinaus ADAPS verstanden, die Aminosäurefragmente aus mindestens 50 Aminosäuren, bevorzugt aus mindestens 100 Aminosäuren, besonders bevorzugt aus mindestens 200 Aminosäuren enthalten, aber auch funktionelle Varianten mit Deletionen von bis zu 300 Aminosäuren, bevorzugt mit bis zu 150 Aminosäuren, besonders bevorzugt mit bis zu 50 Aminosäuren fallen unter den Begriff der funktionellen Teilsequenz.

Die erfindungsgemäßen ADAPS können darüber hinaus posttranslationale Modifikationen, wie z.B. Glycosylierungen oder Phosphorylierungen, aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Translationsprodukte von Nukleinsäuren mit einer der in Tabelle 1 und 2 oder den Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 referierten Sequenzen zur Herstellung von Ethern. Zudem ist die Verwendung von Translationsprodukten von Teilsequenzen oder Nukleinsäuresequenzen, welche in Folge der Degeneration des genetischen Codes eine andere Nukleinsäuresequenz besitzen, jedoch für das gleiche Polypeptid gemäß einer der in Tabelle 1 oder 2 oder den Sequenz ID Nummern 1, 3, 5, 7, 9 und 11 referierten Aminosäuresequenzen oder für ein Analoges, Allel, Derivat oder eine Teilsequenz davon, worin eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich zu reduzieren, codieren, zur Herstellung von Ethern Gegenstand der Erfindung.

Erfindungsgemäß werden außerdem Translationsprodukte von allelen oder funktionellen Varianten einer der in Tabelle 1 und 2 oder den Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 referierten Nukleinsäuresequenzen mit einer Homologie von über 50%, bevorzugt von über 75%, besonders bevorzugt von über 90% oder deren Teilsequenzen aus mindestens 150 Nukleotiden, bevorzugt aus mindestens 300 Nukleotiden, besonders bevorzugt aus mind. 600 Nukleotiden, oder Fragmente, die zu solchen, mit einer codierenden, in Tabelle 1 oder 2 oder den Sequenz ID Nummern 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 referierten Sequenz oder einer allelen oder funktionellen Variante oder deren Teilsequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisierenden, Nukleinsäuresequenzen, komplementär sind, gehören.

Erfindungsgemäß können ganze Zellen, ruhende Zellen, immobilisierte Zellen, gereinigte Enzyme oder Zellextrakte, die die entsprechenden Enzyme enthalten oder Mischungen davon eingesetzt werden. Die Enzyme können erfindungsgemäß in Ganzzellsystemen, in freier Form oder auf geeignete Träger immobilisiert verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Reaktanden gemischt und eventuell ein nicht-wässriges Lösungsmittel zugegeben. Das entsprechende Enzym, ein Zellextrakt oder ganze Zellen, die das gewünschte Enzym enthalten, werden zugegeben und die Reaktionsmischung auf die für das verwendete Enzym optimale Temperatur, üblicherweise 15°C bis 100°C, bevorzugt 20°C bis 70°C temperiert. Die Reaktionskontrolle erfolgt durch analytische Standardmethoden, beispielsweise durch Gaschromatographie.

Beispiel 1: Herstellung rekombinanter ADAPS aus Trypanosoma brucei:
500 mL Ampicillinhaltiges (100 mg/L) Luria Bertani Medium wird mit einer Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3)pLysS angeimpft, welches das Plasmid pETl5b trägt, in dem das Gen der ADAPS (SEQ II) codiert ist. Die Kultivierung erfolgt bei 37°C und bei Erreichen einer OD₆₀₀ von 0,5 wird durch Zugabe von IPTG (0,4 mM) die ADAPS Produktion induziert. 4,5 Stunden nach der Induktion werden die Zellen durch Zentrifugation (4000 g, 4°C, 15 min) abgetrennt. Das erhaltene Pellet wird zweimal in je 20 ml eiskaltem Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) resuspendiert und anschließend erneut zentrifugiert. Schließlich werden die Zellen durch 10-minütiges Beschallen mit Ultraschall (50% power, 50% pulse) auf Eis aufgeschlossen. Die Zellhüllen werden durch Zentrifugation abgetrennt und der Überstand zur Anwendung in der organischen Synthese lyophilisiert. Der Proteingehalt wird durch die Bradford-Methode bestimmt unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Referenz. Proteingehalt des Zellrohextraktes: ca. 5 mg/mL (Gesamtproteingehalt: 100 mg).
Beispiel 2: Via His-tag aufgereinigte ADAPS
Eine weitere Reinigung der ADAPS erfolgte durch Metallionenchromatographie unter Verwendung der Talon^TM Methode gemäß dem Protokoll des Herstellers. Dies ergab 3,5 mg aufgereinigte ADAPS aus obigem Kulturansatz.
Beispiel 3: Analytik der ADAPS-Reaktion
Proben des Reaktionsgemisches werden durch gaschromatographische Analyse (Hewlett Packard GC HP 5890 Serial II plus), mit Flammenionisationsdetektor und Optima-17-TG-Säule (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren) analysiert. Folgendes Temperaturprogramm wurde verwendet:
Injektortemperatur: 245°C
Detektortemperatur: 245°C
Bei ADAPS-katalysierten Umsetzungen mit phosphorylierten Verbindungen werden nur Alkohol und Fettsäure nachgewiesen, bei allen nicht phosphorylierten Verbindungen sind alle Substrate und Produkte mit dieser Methode quantifizierbar.
Proben des Reaktionsansatzes (100 μL) werden gegebenenfalls gefriergetrocknet (wässriges System) oder mit Stickstoff eingeengt (evaporiert, Lösungsmittelsystem). Anschließend wird Chloroform (20 μL) und 2 μL eines inneren Standards (10–20 mmol) zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Das Gemisch wird am Gaschromatographen analysiert.
Beispiel 4: Enzymatische Umsetzung von Palmitoyldihydroxyaceton (PDHA)
90 μM Palmitoyldihydroxyaceton (PDHA) und 90 μM n-Octadekanol werden in 800 μL Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5, 50 mM NaF, 0,1% [w/v] Triton X-100, 100 mL) gelöst. 200 μL einer Proteinlösung aus Beispiel 1 wird zugegeben und die Reaktion schüttelnd (1000 rpm) bei 37°C in einem 1 mL-Reaktionsgefäß durchgeführt. Proben mit einem Volumen von 100 μL werden in Abständen entnommen und nach Beispiel 3 analysiert. Nach etwa 4 Stunden stellt sich ein Gleichgewicht bei ca. 45% Umsatz ein.
Beispiel 5: Enzymatische Herstellung von 1-Octyldecyl Dihydroxyaceton in Kaliumphosphatpuffer
50 mg (0,15 mmol) Palmitoyldihydroxyaceton (PDHA) und 50 mg (0,19 mmol) n-Octadekanol werden in Kaliumphosphatpuffer, 50 mM NaF, 0,1% [w/v] Triton X-100, 100 mL) gelöst. 20 mL einer Proteinlösung aus Beispiel 1 wird zugegeben und die Reaktion bei 37°C in einem 1000 mL-Kolben durchgeführt, gerührt mit einem Magnetrührer. Die Reaktion wird durch Zentrifugation (4000 g, 15 min, 4°C) beendet, um das Enzym abzutrennen. Die wässrige Phase wird durch Gefriertrocknung entfernt und das Rohprodukt säulenchomatographisch an Kieselgel (Chloroform:Methanol, 2:1) gereinigt. Ausbeute: 8 mg 1-Octadecyldihydroxyaceton. Analytische Daten: ¹H-NMR (Chloroform-d, D = 99,8) δ in ppm: CH₃ 0,89 3H; CH₂ 1,27 28H; CH₂ 1, 31 2H; CH₂ 1,59 2H; OH 2,36 2H; CH₂ 3,56 2H; CH₂ 4,25 2H, ¹³C-NMR (Chloroform-d, D = 99,8): CH₃ 14,43; CH₂ 23,35; CH₂ 30,07; CH₂ 30,28; CH₂ 30,42; CH₂ 32,65; CH₂ 67,62; CH₂ 70,01; C = O 173,11.
Beispiel 6: Enzymatische Herstellung von 1-Tetradecyl Dihydroxyaceton in Kaliumphosphatpuffer
Bei der Umsetzung von 100 mg Palmitoyldihydroxyaceton (PDHA) mit Myristylalkohol analog zu Beispiel 5 konnten 12 mg des gewünschten Produktes 1-Tetradecyl Dihydroxyaceton isoliert werden.

Analytische Daten: ¹H-NMR (Chloroform-d, D = 99,8) δ in ppm: CH₃ 1,0 3H; CH₂ 1,31 22H; CH₂ 1,5 2H; OH 2,1 1H; CH₂ 3,4 2H; CH₂ 4,5 4H, ¹³C-NMR (Chloroform-d, D = 99,8): CH₃ 14,1; CH₂ 22,7; CH₂ 28,1; CH₂ 30,4; CH₂ 70,1; CH₂ 78,1; C = O 202,1.

Beispiel 7: Enzymatische Herstellung von 1-Hexadecyldihydroxyaceton in Kaliumphosphatpuffer
Bei der Umsetzung von 100 mg Palmitoyldihydroxyaceton (PDHA) mit Hexadecanol analog zu Beispiel 5 konnten 16 mg des gewünschten Produktes 1-Hexadecyldihydroxyaceton isoliert werden.

Analytische Daten: ¹H-NMR (Chloroform-d, D = 99,8) δ in ppm: CH₃ 1,1 3H; CH₂ 1,3 24H; CH₂ 1,4 2H; CH₂ 1,5 2H; OH 2,3 1H; CH₂ 3,4 2H; CH₂ 4,6 4H, ¹³C-NMR (Chloroform-d, D = 99,8): CH₃ 13,9; CH₂ 23,0; CH₂ 27,1; CH₂ 30,0; CH₂ 70,3; CH₂ 77,1; C = O 207,0.

Beispiel 8: Enzymatische Herstellung von 1-Alkylglycerinethern in Kaliumphosphatpuffer
90 μmol/L 1-Palmitoylglycerin oder 1-Lauroylglycerin und 90 μmol/L n-Tetradekanol, n-Hexadekanol oder n-Octadekanol werden in 800 μL Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5, 50 mM NaF, 0,1% [w/v] Triton X-100, 100 mL) gelöst. 200 μL einer Proteinlösung aus Beispiel 1 wird zugegeben und die Reaktion schüttelnd (1000 rpm) bei 37°C in einem 1 mL-Reaktionsgefäß durchgeführt. Proben mit einem Volumen von 100 μL werden in Abständen entnommen und nach Beispiel 3 analysiert. Nach etwa 22 Stunden werden folgende Umsätze bestimmt.
Beispiel 9: Enzymatische Herstellung von 1-Octadecyldihydroxyaceton in n-Hexan
50 mg (0,12 mmol) PDHA und 50 mg (0,19 mmol) n-Oktadekanol werden in n-Hexan gelöst. 1 g lyophilisierter Zellextrakt aus Beispiel 1 wird zugegeben und die Reaktion bei 37°C in einem 250 mL-Kolben durchgeführt, gerührt mit einem Magnetrührer. Die Reaktion wird durch Zentrifugation (4000 g, 15 min, 4°C) beendet, um das Enzym abzutrennen. Die organische Phase wird vom Lösungsmittel befreit und das Rohprodukt säulenchomatographisch an Kieselgel (Chloroform:Methanol, 2:1) gereinigt. Ausbeute: 7,5 mg 1-Octyldecyldihydroxyaceton.

Analytische Daten: ¹H-NMR (Chloroform-d, D = 99,8), δ in ppm: CH₃ 1,0 3H; CH₂ 1,3 28H; CH₂ 1,4 2H; CH₂ 1,3 2H; OH 2,1 1H; CH₂ 4,4 4H; ¹³C-NMR (Chloroform-d, D = 99,8): CH₃ 14,0; CH₂ 23,0; CH₂ 30,0; CH₂ 30,7; CH₂ 33,0; CH₂ 68,2; CH₂ 80,1; CH₂ 70,9; C = O 198,1

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Ethern gemäß der allgemeinen Formel (I), R-O-R¹ (I)worin R der Kohlenwasserstoffrest eines, gegebenfalls verzweigten und/oder eine oder mehrere Mehrfachbindung(en) und/oder Hydroxygruppen und/oder mit organischen Resten veretherte Hydroxygruppen enthaltenden, Alkohols mit 1 bis 30 C-Atomen ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Alkohole der allgemeinen Formel (II) R-OH (II)worin R wie oben definiert ist, in Gegenwart von zumindest einem Enzym, mit einer Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (III), R¹-O-R² (III)worin R^leine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist, welche zusätzliche Carbonylgruppen und/oder Hydroxygruppen und/oder mit organischen Resten veretherte Hydroxygruppen und/oder mit organischen oder anorganischen Säuren veresterte Hydroxygruppen enthalten kann, und R² der Acylrest einer, gegebenenfalls verzweigten und/oder eine oder mehrere Mehrfachbindung(en) und/oder Hydroxygruppen enthaltenden, Säure mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist, wobei R² im Falle, dass R¹ ein 1-Dihydroxyacetonphosphat ist, kein Acylrest einer natürlich vorkommenden Fettsäure mit 8 bis 30 Kohlenstoffatomen sein kann, umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem nicht-wäßrigen Reaktionssystem mit einem Wassergehalt von weniger als 30%, bevorzugt weniger als 10%, besonders bevorzugt weniger als 5% durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkoholrest R 2 bis 30, bevorzugt 3 bis 22 Kohlenstoffatome aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus substituiertem oder unsubstituiertem Dihydroxyaceton, 1,2-Propylenglycol, 1,3-Propylenglykol, Neopentylglycol, Trimethylolpropan, Pentyerithrol, Sorbitol, 1,6-Hexandiol, 1,2-Pentandiol, Glycerin, Diglycerin, Triglycerin, Polyglycerin, Dieethylenglycol, Triethylenglycol oder Polyethylenglycol besteht.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass freie Hydroxylgruppen des Restes R¹ mit einer anorganischen Säure, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder einem Acylrest verestert oder mit einem weiteren Alkohol verethert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass R² ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus substituierter oder unsubstituierter Essigsäure, Propansäure, Butansäure, Pentansäure, Chloressigsäure, Trifluoressigsäure, und substituierten sowie unsubstituierten Acylresten einbasischer Fettsäuren auf Basis natürlicher pflanzlicher oder tierischer Öle mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Isostearinsäure, Stearinsäure, 12-Hydroxystearinsäure, Dihydroxystearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Petroselinsäure, Elaidinsäure, Arachinsäure, Behensäure, Eurucasäure, Gadoleinsäure, Linolensäure, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Arachidonsäure, sowie Mischungen davon, besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Enzyme oder Enzyme enthaltende Zellextrakte oder Mischungen davon eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Enzym aus der Klasse der Alkylgruppen übertragenden Transferasen (EC 2.5.x.y) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Alkyldihydroxyaceton-Phosphat-Synthase (ADAPS, EC 2.5.1.26) oder eine allele oder funktionelle Variante davon oder eine funktionelle Teilsequenz davon eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Alkyldihydroxyaceton-Phosphat-Synthase mit einer Aminosäuresequenzen, wie in Tabelle 1 oder 2 oder einer der SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 referiert, verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, hinzugefügt oder durch andere Aminosäuren substituiert worden sind, ohne dass die enzymatische Wirkung des Polypeptids wesentlich reduziert wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym ein Translationsprodukt einer Nukleinsäuresequenz, wie in Tabelle 1 oder 2 oder einer der SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 referiert, oder einer allelen oder funktionellen Variante davon oder deren Teilsequenzen oder Fragmente, die zu solchen, mit codierenden Nukleinsäuren unter stringenten Bedingungen hybridisierenden, Nukleinsäuresequenzen, komplementär sind, eingesetzt wird.