DE102005032038A1

DE102005032038A1 - Entwicklung einer ortsspezifischen, chemoselektiven und gerichteten photochemischen Mikrostrukturierungstechnik für bio- und materialwissenschaftliche Anwendungen (z.B. zur Herstellung von Mikroarrays)

Info

Publication number: DE102005032038A1
Application number: DE200510032038
Authority: DE
Inventors: Herbert Prof. Dr. Waldmann; Maja Dipl.-Chem. Köhn; Rolf-Peter Prof. Dr. Breinbauer; Dirk Dipl.-Ing. Nüsse; Edgar Prof. Dr.-Ing. Voges
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Chimera Biotec GmbH
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Chimera Biotec GmbH
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2007-01-11
Also published as: WO2007006488A2; WO2007006488A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen. Die Beschichtung erfolgt durch eine chemoselektive Reaktion zwischen ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppen und Mercaptanen. Durch entsprechende Wahl der Reaktanten können die Oberflächen beliebig funktionalisiert und z. B. unter Verwendung von Masken und/oder Lasern strukturiert werden. Das Verfahren zeichnet sich durch kurze Reaktionszeiten sowie einfache Substanzauftragungs- und Waschprozesse aus. Die Selektivität und Milde des Verfahrens ermöglichen vielfältige Nutzungen der erfindungsgemäßen Strukturierungstechnik.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen. Die Beschichtung erfolgt durch eine chemoselektive Reaktion zwischen ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppen und Mercaptanen. Durch entsprechende Wahl der Reaktanten können die Oberflächen beliebig funktionalisiert und z.B. unter Verwendung von Masken und/oder Lasern strukturiert werden. Das Verfahren zeichnet sich durch kurze Reaktionszeiten sowie einfache Substanzauftragungs- und Waschprozesse aus. Die Selektivität und Milde des Verfahrens ermöglicht vielfältige Nutzungen der erfindungsgemäßen Strukturierungstechnik.

Strukturierte bzw. mikrostrukturierte Oberflächen sind Oberflächen, die mit Reaktanten unterschiedlich belegte oder funktionalisierte Bereiche aufweisen. Insbesondere mikrostrukturierte Oberflächen finden breite Anwendung wie beispielsweise beim Hochdurchsatz-Screening. Ursprünglich wurden mit Proteinen strukturierte Oberflächen entwickelt, um biologische Moleküle in miniaturisierte biologisch-elektronische Geräte zu integrieren. Sie finden auch Anwendung in der Entwicklung von Biosensoren, welche beispielsweise zur Ermittlung von Selektivität und Sensitivität von Antikörpern herangezogen werden können. Weiterhin werden sie zur Vermittlung von strukturiertem Zellwachstum genutzt, womit beispielsweise Zell-Mikroarrays hergestellt werden können. Mit ihrer Hilfe sollen künstliche Gewebe sowie Organ-Transplantate erzeugt werden.

Weitere Anwendungsgebiete für mikrostrukturierte Oberflächen finden sich in der Computer-Chip-Industrie, der Elektro- und Halbleitertechnik, der Displaytechnologie und der Herstellung mikrofluidischer Systeme. Insbesondere bei der Herstellung von LEDs (light emitting diodes), LCDs (liquid crystal displays) und OLEDs (organic light-emitting diodes) spielen strukturierte Oberflächen eine wichtige Rolle. In OLEDs, die durch Photolitographie mittels Photosäure hergestellt werden, finden beispielsweise Spirobifluoren-co-fluoren Polymere Verwendung (Müller et al., 2003).

Strukturierte Oberflächen können durch Photolackverfahren, Photochemische Techniken und mit Hilfe von SAMs hergestellt werden. Die Muster können durch UV-Lampen in Kombination mit Masken oder Fokussierung erstellt werden. Weiterhin können Oberflächen durch lithografische Techniken strukturiert werden, welche ohne Belichtung auskommen. Man unterscheidet zwischen Lithografie, bei der starre anorganische Materialien beispielsweise durch Laser-Abtragung oder -induzierte Abscheidung behandelt werden, und Softlithografie, bei welcher die Strukturen in selbstorganisierten Schichten durch Stempel oder Gussformen aus Elastomer auf Substrate übertragen und flexible organische Moleküle und Materialien verwendet werden. Im Allgemeinen, von der Halbleiterindustrie bis zur biologischen Oberflächenstrukturierung, wird Photolithographie aber weitaus häufiger standardmäßig angewendet.

Konventionelle Photolackverfahren, die in der Elektronikindustrie zur Herstellung von Mikroschaltkreisen verwendet werden, wurden zur Erzeugung von Protein-Strukturen adaptiert.

Photochemische Substanz-Mikrostrukturierungstechniken nutzen chemisch labile funktionelle Gruppen, welche durch UV-Belichtung aktiviert werden können, um Zielmoleküle zu binden. Umgekehrt kann kurzwellige UV-Strahlung zum Deaktivieren von chemischen Spezies verwendet werden, wie z.B. bei der Umsetzung von Thiolen zu Sulfonaten.

Die am meisten verwendeten Methoden für die photochemische Immobilisierung nutzen Arylazid-, Nitrobenzyl-(Schutzgruppen) und Diazirin-Gruppen (1). Auch Benzophenone werden verwendet, und kürzlich wurde über die Adaption vom Photobleichen von Fluorophoren berichtet.

Alle diese Techniken haben die Gemeinsamkeit, dass es sich um eine C-H-Insertion einer hochreaktiven Spezies in die zu immobilisierende Substanz handelt. Aufgrund der hohen Reaktivität können unerwünschte Nebenreaktionen nicht vermieden werden. So kann beispielsweise der Funktionserhalt bei der Immobilisierung, insbesondere die Aktivität von Proteinen, durch diese Techniken nicht gewährleistet werden. Weitere Probleme der photolithographischen Mikrostrukturierung liegen in der Immobilisierung von vielen verschiedenen Substanzen und dem unspezifischen Binden, insbesondere von Proteinen, auf nicht-aktivierten Regionen der Oberfläche.

Selbstassemblierte Monoschichten (self-assembled monolayers (SAMs)) werden häufig in Kombination mit photochemischen Methoden verwendet. Die Herstellung ausgerichteter SAMs mit verschiedenen Fuktionalitäten auf Goldoberflächen ist bekannt. Dazu wurden Regionen unbelichtet belassen und eine photolabile Schutzgruppe sowie ein photolabiler Linker verwendet. Mrksich et al. nutzten SAMs zusammen mit photolabilen Schutzgruppen, um chemoselektiv durch eine Diels-Alder-Reaktion Liganden zu immobilisieren. Dies ist neben der Verwendung von Ligandenpaaren mit hoher Affinität wie Biotin-Streptavidin das einzige Beispiel für eine chemoselektive Mikrostrukturierung, die aber viele chemische Schritte benötigt.

Für die Herstellung von Mikroarrays stehen nur wenige Alternativen an chemoselektiven Reaktionen zur Auswahl, bei denen die eingesetzten funktionellen Gruppen nicht möglicherweise auch für die biologische Aktivität wichtig sind. Eine hohe Chemoselektivität wird beispielsweise bei der Cu^l+ vermittelten Cycloaddition eines Acetylens mit einem Azid erreicht. Da aber Kupfer insbesondere mit Sulfiden Komplexe bildet, kann ein Verlust der Aktivität bzw. Funktion von Proteinen durch diese Komplexbildung nicht ausgeschlossen werden.

Zur Mikrostrukturierung von Oberflächen ist derzeit im Stand der Technik keine milde, direkte kovalente Kupplungsmethode beschrieben, bei der nicht unselektiv in eine C-H-Bindung des Substrats insertiert wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb ein Verfahren bereitzustellen, welches eine Möglichkeit zur chemoselektiven Beschichtung von Oberflächen unter milden Bedingungen bereitstellt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch eine Reaktion zwischen einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe und einem Mercaptan gelöst, wobei einer der beiden Reaktanten auf der Oberfläche immobilisiert ist.

Zur Durchführung der Reaktion wird

(a) einer der beiden Reaktanten, ausgewählt aus einem Mercaptan und einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe, auf der Oberfläche immobilisiert,
(b) der zweite, an den ersten Reaktanten zu bindende, Reaktant zugegeben und
(c) die Reaktion induziert.

Grundsätzlich können erfindungsgemäß beliebige Mercaptane oder ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppen eingesetzt werden. Diese können mit allen dem Fachmann bekannten Verfahren zur Einführung einer Mercaptangruppe oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe, bevorzugt einer Doppelbindung, in Moleküle hergestellt werden. Das Einführen der gewünschten Gruppe kann vor der Immobilisierung des ersten Reaktanten auf der Oberfläche aber auch nach dessen Immobilisierung auf der Oberfläche erfolgen.

Vorteilhafterweise können erfindungsgemäß als ein Reaktant beliebige Moleküle eingesetzt werden, solange sie eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, insbesondere eine -C=C- Doppelbindung und besonders bevorzugt eine nicht konjugierte -C=C- Doppelbindung aufweisen.

Die Formulierung „ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe" umfasst bevorzugt C2 bis C100, insbesondere C3 bis C20-Kohlenwasserstoffe, die wenigstens einfach ungesättigt sind. Die Kohlenwasserstoffegruppe kann geradkettig oder verzweigt, substituiert oder unsubstituiert sein. Bevorzugt handelt es sich um eine terminate ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe.

Bei dem Molekül, welches eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe aufweist, kann es sich grundsätzlich um einen ungesättigten Kohlenwasserstoff oder einen substituierten ungesättigten Kohlenwasserstoff handeln, aber auch um ein Molekül, bei welchem die ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe selbst einen Substituenten darstellt.

Die ungesättigten Kohlenwasserstoffe können mit funktionellen Gruppen wie beispielsweise OH, COOH, COOR, NO₂, RSO₂, wobei R ein geradkettiger oder verzweigter, substituierter oder unsubstituierter Kohlenwasserstoff mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen ist, oder mit funktionellen Molekülen substituiert sein.

Die erfindungsgemäße Formulierung „Mercaptan" umfasst alle dem Fachmann bekannten Verbindungen bzw. Moleküle, die wenigstens eine -SH-Gruppe aufweisen.

Beispiele für bevorzugte Moleküle, die mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe substituiert sein können oder eine Mercaptangruppe enthalten können, umfassen Naturstoffe wie beispielsweise Zucker und Kohlenhydrate, Aminosäuren, Peptide, Phosphopeptide, Proteine, Enzyme, Antikörper, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Nukleinsäuren. Weitere bevorzugte Beispiele umfassen Farbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle, Isotopen markierte Moleküle, Monomere für Polymerisationsreaktionen oder Polymere, lumineszierende Moleküle, insbesondere fluoreszierende Moleküle, elektrolumineszierende Moleküle bzw. Polymere, Nanopartikel, Vesikel und anorganische Katalysatoren.

Diese Moleküle werden, um als Reaktant im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden zu können, mit einer oder mehreren ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppen oder Mercaptangruppen versehen. Falls diese Gruppierungen bereits im Molekül enthalten sind, können diese vorhanden Gruppierung zur Durchführung der Reaktion genutzt werden. Es ist auch möglich, noch weitere zusätzliche Kohlenwasserstoff- oder mercaptangruppen in die Moleküle einzubringen.

Die eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe oder eine Mercaptangruppe aufweisenden Moleküle umfassen besonders bevorzugt elektrolumineszierende, z.B. rot, grün und/oder blau elektrolumineszierende Moleküle bzw. Polymere. Besonders bevorzugte Beispiele für elektrolumineszierende Moleküle umfassen Poly(1,4-phenylenvinylene) (PPV) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere PPV-Copolymere und CN-PPVs, Poly(3-alkylthiophene) und davon abgeleitete Derivate, Poly(para-phenylene) (PPP) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere Leiter-Poly(para-phenylene) (LPPP), und Gemische solcher Verbindungen, welche für die Erfindung mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe oder einer Mercaptangruppe derivatisiert werden.

Besonders bevorzugte Beispiele für Nanopartikel umfassen Quantum Dots, insbesondere Halbleitermaterialien wie beispielsweise CdS, CdSe, CdTe, ZnS, TiO₂ oder ähnliche Übergangsmetallchalkogenide, und Metallpartikel, insbesondere aus Au, Ag, Pt, Pd und Cu. Die Nanopartikel können z.B. oberflächenfunktionalisiert vorliegen und/oder sie können in organisch ummantelter Form vorliegen. Eine organische Ummantelung wird bevorzugt aus verzweigten Kohlenwasserstoffen gebildet, die substituiert oder unsubstituiert sein können

Die Immobilisierung des ersten Reaktanten an eine Oberfläche kann über beliebige Wechselwirkungen erfolgen, die zu einer Bindung zwischen der Oberfläche und dem zu immobilisierenden Reaktanten führen. Diese Wechselwirkungen können z.B. kovalent, ionisch, Wasserstoffbrücken oder van-der Waals-Kräfte sein. Die Bindung an die Oberfläche erfolgt in einer Ausführungsform nicht über die Mercaptangruppe bzw. über die ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, so dass diese für die Reaktion mit dem zweiten Reaktanten zur Verfügung steht. Bevorzugt weist der an die Oberfläche zu bindende erste Reaktant eine funktionelle Gruppe auf, welche die Bindung an die Oberfläche ermöglicht. Besonders bevorzugt sind Hydroxyl-, Thiol- oder Amino-Gruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Immobilisierung des ersten Reaktanten durch Selbstassemblierung unter Ausbildung einer selbstassemblierten Monoschicht.

Die Immobilisierung des ersten Reaktanten auf der Oberfläche kann gleichmäßig über die gesamte Oberfläche erfolgen, die Immobilisierung kann aber auch nur an festgelegten Abschnitten auf der Oberfläche erfolgen, so dass die Oberfläche bereits durch die Immobilisierung des ersten Reaktanten eine Strukturierung erfahren kann. Überschüssiger und/oder loser erster Reaktant wird nach seiner Immobilisierung von der Oberfläche entfernt.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden mit einer Mercaptangruppe oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe derivatisierte Dendrimere und/oder Silane als erster Reaktant verwendet und auf der Oberfläche immobilisiert. Die Dendrimere, beispielsweise PAMAM-Dendrimere, bzw. die Silane verfügen über wenigstens eine funktionelle Gruppe, die zu einem Mercaptan oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe umgesetzt werden kann.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein eine Mercaptangruppe (Thiol) enthaltendes Molekül als erster Reaktant auf der Oberfläche immobilisiert. Insbesondere die Thiol-Gruppe des Mercaptans kann sowohl vor dessen Immobilisierung auf der Oberfläche bereits im Molekül vorhanden sein, vorzugsweise in geschützter Form, oder sie kann erst nach der Immobilisierung auf der Oberfläche durch chemische Umsetzung einer anderen funktionellen Gruppe erzeugt werden.

Eine beispielhafte Funktionalisierung von Glasträgern mit Mercaptanen ist in Schema 2 gezeigt. Die Funktionalisierung immobilisierter Dendrimere oder Silane erfolgt analog, wobei die Dendrimere bzw. Silane nach ihrer Immobilisierung auf der Trägeroberfläche vorzugsweise als selbstassemblierte Monoschichten vorliegen.

Die Formulierung „Oberfläche" umfasst alle Flächen auf welchen einer der beiden Reaktanten, vorzugsweise das Mercaptan immobilisiert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform verhindern die verwendeten Oberflächen zumindest teilweise die Reflexion oder Weiterleitung von Licht im Oberflächenträger. Auf diese Weise kann eine hohe Randschärfe bei der Erzeugung von Strukturen erreicht werden.

Die Oberfläche besteht bevorzugt aus Si, SiOx mit 0< x < 5, wobei SiO₂ besonders bevorzugt ist, Polysiloxanen, Ge, Ge-Oxiden, wobei GeO₂ besonders bevorzugt ist, Metallen, wie beispielsweise Au, Ag, Cu, Pd, Pt und besonders bevorzugt Al, Metalloxiden, wobei Al-Oxide, wie beispielsweise Al₂O₃, ZrO₂, und In-Sn-Oxide (ITO), wie beispielsweise In₂O₃/SnO₂, besonders bevorzugt sind, GaAs, InP, beliebigen Gemischen von Metallen und Oxiden und/oder Halbleitermaterialien, insbesondere Gemischen von Ge, Al und/oder deren Oxiden, Legierungen von Ge und/oder Al und andere Halbleitermaterialien.

Die Oberfläche ist vorzugsweise 0,1–10 mm stark. Besonders bevorzugt ist eine Stärke von 5 ± 1 mm, stärker bevorzugt von 2 ± 1 mm und nochmals stärker bevorzugt von 0,5 ± 0,4 mm.

Die Oberfläche verfügt bevorzugt über funktionelle Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Hydroxyl- oder Thiolgruppen, durch welche die Immobilisierung des ersten Reaktanten auf der Trägeroberfläche möglich ist. Liegt eine SiOx-Oberfläche vor, sind Hydroxylgruppen bevorzugt.

Die Oberfläche ist bevorzugt eine Trägeroberfläche, wobei bevorzugt Polymere, Glas, Quartz- und Siliciumwafer, sowie kombinierte Si/SiO_X Elemente mit 0 < x < 5 als Träger auf welchem die Oberfläche aufgebracht ist, Verwendung finden. Des Weiteren können alle Materialien, welche wie oben beschrieben die Oberfläche bilden, auch den Träger selbst bilden. Die Träger und damit auch die Oberflächen können planar oder nicht-planar, z.B. konkav oder konvex, sein. Die Verwendung von Silicium-, Siliciumoxid- und kombinierten Silicium/Siliciumoxidträgern ist besonders bevorzugt.

Die Reaktion zwischen Mercaptan und ungesättigtem Kohlenwasserstoff ist bevorzugt photoinduziert oder Radikal-induziert.

Durch die Induktion zerfällt das eingesetzte Mercaptan vor der Additionsreaktion mit der ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe in ein Wasserstoff- und ein Schwefel-lokalisiertes Radikal. Das Schwefelradikal addiert dann selektiv an eine Doppelbindung, bevorzugt an eine terminate Doppelbindung. Die Additionsreaktion läuft bevorzugt unter Bildung eines anti-Markownikow-Produkts ab.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist chemoselektiv, d.h. die an der Reaktion beteiligten funktionellen Gruppen gehen weitgehend keine anderen Reaktionen mit anderen funktionellen Gruppen ein. Solche „anderen funktionellen Gruppen" können in den Reaktanten selbst und in weiteren in der Reaktionslösung vorhandenen, aber nicht direkt an der Reaktion teilnehmenden, Substanzen, vorliegen. Die Reaktion ist insbesondere kompatibel zu funktionellen Gruppen wie Carbonsäuren, Estern, Amiden, Nitrilen, Hydroxy, O- und N-Carbonyl, Alkyl, Aryl (Thio)Ethern, Aminen, deren Gegenwart die Reaktion nicht stört. Auch Halogene können als funktionelle Gruppen im Reaktionsgemisch vorliegen. Durch die chemoselektive Reaktion kann das Reaktionsprodukt unter weitgehendem Ausschluss von Nebenprodukten exakt vorhergesagt und erhalten werden.

Die chemoselektive Reaktion ermöglicht somit die zielgerichtete Planung und Herstellung von beschichteten Oberflächen. Die Vielzahl zum erfindungsgemäßen Verfahren kompatibler funktioneller Gruppen ermöglicht den weitgehenden Verzicht auf den Einsatz von Schutzgruppenchemie während der Reaktion. Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäß funktionalisierten Reaktanten keine unspezifische Komplexbildung und/oder unspezifische Bindung an die Oberfläche.

Neben der Chemoselektivität zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch Regioselektivität aus, d.h. die Reaktanten reagieren an einer definierten, durch die Funktionalisierung mit -SH oder einer Doppelbindung festgelegten Stelle im Molekül. Die Immobilisierung an die Oberfläche erfolgt dann ausschließlich über die so funktionalisierte Reaktionsstelle. Die Funktionalisierung mit -SH oder einer Doppelbindung kann in jedem beliebigen Abschnitt auf der Oberfläche eines Moleküls erfolgen, der einer solchen Funktionalisierung zugänglich ist. Beispielsweise können so, falls die Proteinstruktur bekannt ist, gezielt die Domänen eines Proteins ausgesucht und anschließend funktionalisiert werden, über die eine Bindung an die Oberfläche erfolgen soll.

Chemoselektivität und Regioselektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen eine gerichtete Immobilisierung einer Vielzahl komplexer Substrate an Oberflächen, wobei deren Funktionalität und/oder Aktivität erhalten bleibt. Im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, ist es möglich, die Reaktionsstellen in den zu addierenden Molekül so zu wählen, dass sich die zwischen den Reaktanten bildende kovalente Bindung die native Funktionalität oder Aktivität der Reaktanten nicht oder nur unwesentlich beeinflusst. Bei der Immobilisierung von Proteinen ist es beispielsweise vorteilhaft, die Reaktions- bzw. Additionsstellen so zu wählen, dass sie aktive Zentren der Proteine nicht beeinflussen. In einer anderen Ausführungsform ist es möglich, die Reaktionstelle so zu wählen, dass sie gerade im aktiven Zentrum eines Proteins liegt, um so die katalytische Aktivität des Proteins zu hemmen oder vollständig auszuschalten. Auf diese Weise können Aktivitätsstudien durchgeführt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das gleiche Protein in unterschiedlichen experimentellen Ansätzen über verschiedene Domänen bzw. Abschnitte auf einer Oberfläche immobilisiert werden. Durch Vergleich der unterschiedlichen Immobilisierungsansätze können Hinweise auf die katalytische Struktur oder das Substratbindungsverhalten des Proteins gewonnen werden. Selbstverständlich können beispielsweise aber auch Chromophore oder lumineszierende Moleküle selektiv so immobilisiert werden, dass das Chromophor- bzw. Lumineszenzsystem nicht beeinträchtigt wird.

Aufgrund der hohen Chemoselektivität und Regioselektivität zeichnet sich das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren ferner durch seine hohe Reproduzierbarkeit aus. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zudem zu einer gleichmäßigen und dichten Belegung der Oberflächen mit aktiven bzw. funktionalen Molekülen.

Die Reaktion kann unter Verwendung von Radikalstartern wie beispielsweise N,N-Azobisisobutyronitril (AIBN) oder Ammoniumpersulfat (APS) Radikal-induziert werden. Bei Radikal-Induktion kann die Strukturierung der zu beschichtenden Oberfläche z.B. durch Verwendung von Masken, die abstandslos auf die Oberfläche aufgebracht werden, erhalten werden. Abstandslos bedeutet dabei, dass zwischen Oberfläche und Maske, kein Raum zur Verfügung steht, in den Radikalstarter eindringen bzw. eindiffundieren können, um dort die Additionsreaktion zwischen den beiden Reaktanten zu induzieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Reaktion zwischen Mercaptan und ungesättigtem Kohlenwasserstoff eine photochemische Reaktion, die vorzugsweise photoinduziert ist. Die Photoinduktion wird durch Bestrahlung der Reaktanten erreicht. Zur Bestrahlung kann Licht mit Wellenlängen aus dem sichtbaren Bereich und/oder dem infrarot Bereich verwendet werden, jedoch wird die photochemische Reaktion vorzugsweise durch UV-Licht induziert. Dabei wird bevorzugt Licht des UV-Wellenlängenbereichs von 200–400 nm verwendet. Besonders bevorzugt wird die Photoinduktion in einem Wellenlängenbereich von 350 bis 400 nm und noch stärker bevorzugt bei 365 ± 5 nm durchgeführt. Als Lichtquelle kann dabei jede geeignete Lampe, die über ein geeignetes Spektrum verfügt, verwendet werden. Die Verwendung von Quecksilberdampflampen stellt für die Induktion durch UV-Licht eine bevorzugte Ausführungsform dar.

Die Dauer der Photoinduktion bzw. Belichtung liegt in einem Bereich von 1 Sekunde bis 30 Minuten, bevorzugt in einem Bereich von 1 Sekunde bis 20 Minuten und ganz besonders bevorzugt in einem Bereich von 1 Sekunde bis 10 Minuten.

In einer weiteren Ausführungsform wird die photochemische Reaktion durch Verwendung eines Lasers induziert, wobei die Verwendung eines Lasermikroskops besonders bevorzugt ist. Durch die Verwendung von Laserlicht ist es erfindungsgemäß auch möglich die einer bestimmten Energie entsprechende Wellenlänge durch Einfach- oder Mehrfach-Photonen-Anregung zu erzeugen. Einfach-Photonen-Anregung ist besonders bevorzugt. Zwei-Photonen- und Drei-Photonen-Anregung stellen bevorzugte Ausführungsformen der Mehrfach-Photonen-Anregung dar. Zwei-Photonen-Anregung kann durch die hohe, lokalisiert gebündelte Energie Laser-Pulse erfolgen. Das bedeutet, dass während der Dauer eines Pulses Moleküle gleichzeitig zwei oder drei (bei Drei-Photonen-Anregung) Photonen einer längeren Wellenlänge aufnehmen, wodurch ein Elektron in den ersten Singulett-Anregungszustand angehoben wird. Diese hohe Energie ist lokalisiert, d.h. nicht nur in der X- und Y- Ebene sondern auch in der Z-Ebene definiert. Dadurch kann die zwei-Photonen-Anregung zur Erstellung dreidimensionaler Abbildungen verwendet werden. Die Fokussierung des hochenergetischen Peaks erreicht man durch die Verwendung von optischen Mikroskop-Objektiven bzw. Objektiven mit hoher numerischer Apertur.

Die Anwendung von Lasermikroskopen, welche über einen computergesteuerten, in der X-Y-Ebene beweglichen Objektträgertisch verfügen, kann eine Auflösung der funktionalisierten Oberflächen im nm-Bereich ermöglichen und stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Die Auflösung konventioneller optischer Mikroskope ist durch Beugungseffekte auf rund die Hälfte ihrer Strahlungswellenlänge begrenzt. Durch die Fokussierung des Laserstrahls mit Hilfe von Objektiven zur Erzeugung eines beugungsbegrenzten Punktes ist die Breite der Strukturen nicht mehr durch den Durchmesser des Laserstrahls begrenzt. Die optische Auflösung eines solchen Mikroskops kann 100 nm betragen, so dass man die Strukturen scannen kann und nicht mehr auf die Auflösung des in der Photolithographie verwendeten Fluoreszenz-Scanners angewiesen ist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die photochemische Reaktion unter Verwendung von optischer Raster-Nahfeldmikroskopie (SNOM; scanning near-field optical microscope) induziert bzw. SNOM zur Strukturierung verwendet. SNOM ermöglicht die Auflösung von Strukturen von bis zu 10 nm. SNOM basiert auf der Ausnutzung extrem kurzreichweitiger Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einer Oberfläche, wobei das mit dem Abstand exponentiell abklingende optische Nahfeld herangezogen wird. Das Prinzip der SNOM besteht darin, eine submikroskopische Strahlenquelle in Form einer Nahfeldsonde im Abstand von nur wenigen Nanometern, und somit innerhalb der Reichweite des Nahfelds, rasterförmig über eine Oberfläche zu bewegen. Dabei ist die Auflösung im Wesentlichen nur durch die Geometrie der Sonde (d.h. in der Regel durch den Aperturdurchmesser) und nicht durch die Strahlungswellenlänge bestimmt. Die Verwendung von Sonden mit definierter Sondengeometrie bei hoher Strahlungsemission ist bevorzugt.

Das Verfahren ist rasternd, d.h. Strukturen werden durch punkt- und zeilenweises Zusammensetzen vieler Einzelbestrahlungsvorgänge gewonnen. Anstelle von SNOM können auch Rastertunnel (STM)- und Rasterkraftfeldmikroskopie (AFM) eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet die photochemische Reaktion zur Addition des zweiten Reaktanten nur in solchen Bereichen der Oberfläche statt, die bestrahlt werden. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Beschichtung strukturiert, bevorzugt mikro- oder nanostrukturiert, erfolgt. Strukturierung im erfindungsgemäßen Sinn umfasst dabei jegliche äußere Form der Oberflächenbeschichtung, die nicht auf einem zufälligen Beschichtungsergebnis basiert. Nano- bzw. Mikostrukturierung beschreibt Strukturen im Nanometer- bzw. Mikrometerbereich, bevorzugt zwischen 10 nm und 1000 μm, stärker bevorzugt zwischen 10 nm und 100 μm und am stärksten bevorzugt zwischen 10 nm und 1 μm.

Sowohl die Strukturierung durch Verwendung von Masken, als auch die Strukturierung durch Verwendung von Laser kann Strukturen im Nanometerbereich erzeugen. Die oben beschriebene Nanostrukturierung durch Laser, insbesondere durch SNOM, ist besonders bevorzugt. Durch Nanostrukturierung mittels Laser werden bevorzugt Strukturen Im Bereich von 10–500 nm, stärker bevorzugt von 10–100 nm und am stärksten bevorzugt von 10–100 nm erhalten.

In einer Ausführungsform ermöglicht die Verwendung eines Lasers die selektive Bestrahlung der Oberfläche. Selektive Bestrahlung beschreibt die Bestrahlung vorbestimmer, eng definierter Bereiche auf der Oberfläche. Nur in den vom Laser bestrahlten Bereichen findet dabei die erfindungsgemäße Reaktion statt bzw. erfolgt eine Strukturierung der Oberfläche. Der selektive Bereich kann für jeden Bestrahlunsvorgang beliebig gewählt werden. Durch Entfernen von überschüssigem zweiten Reaktanten nach einer ersten Bestrahlung in einem ersten selektiven Bereich und Aufbringen eines weiteren unterschiedlichen Reaktanten und einer zweiten Bestrahlung in einem anderen, zweiten selektiven Bereich, ist es möglich eine Oberfläche gezielt in definierten Bereichen unterschiedlich zu beschichten bzw. zu strukturieren. Der Vorgang kann beliebig häufig wiederholt werden (multiple Strukturierung).

In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die multiple Strukturierung den Aufbau bzw. die Gestaltung dreidimensionaler Strukturen, wie zum Beispiel Kammern, Röhren oder Kanäle auf der Oberfläche. Aber auch verschiedene Targets oder Testsubstanzen für Screening-Verfahren oder elektrolumineszierende Polymere, die unterschiedliche Farben emittieren, können beispielsweise auf diese Weise auf einer Oberfläche immobilisiert werden.

Die Randunschärfe bei der selektiven Bestrahlung mit Laser, insbesondere bei Verwendung des SNOM-Verfahrens, beträgt höchstens ± 1 μm, stärker bevorzugt höchstens ± 500 nm, noch stärker bevorzugt höchstens ± 100 nm und am stärksten bevorzugt ± 10 nm.

In einer weiteren Ausführungsform wird zur Festlegung der Bereiche, die einer Bestrahlung zugänglich sind, wird eine Maske verwendet. Die Erfindung umfasst weiterhin alle Techniken, die in entsprechenden photolitographischen Verfahren eingesetzt werden.

Die Form der Maske entspricht dem Bereich an welchem keine photochemische Reaktion stattfindet, d.h. kein Reaktant addiert wird. An Stellen, welche in der Maske ausgespart sind, d.h. die einer Bestrahlung oder Radikalinitiatoren zugänglich sind, findet eine Reaktion statt. An solchen Stellen wird erfindungsgemäß Reaktant addiert. Die Masken können aus Formelementen wie Linien, Kreisen, Punkten, Feldern und dergleichen bestehen. Die Abmessungen der Formelemente liegen bevorzugt im Nano- bis Mikrometerbereich, bevorzugt zwischen 350 nm bis 100 μm, stärker bevorzugt zwischen 350 nm bis 10 μm und am stärksten bevorzugt zwischen 350 nm bis 1 μm. Die Abmessungen der Formelemente werden durch die Wellenlänge des zur Bestrahlung eingesetzten Lichtes in ihrer Minimalgröße begrenzt. Bei der erfindungsgemäß bevorzugten Verwendung von Licht einer Wellenlänge λ = 365 ± 5 nm betragen die minimalen Abmessungen der verwendeten Formelemente somit 365 ± 5 nm.

Die Masken werden bevorzugt so auf der Trägeroberfläche fixiert, dass kein Abstand zwischen Maske und Trägeroberfläche vorhanden ist. Die Abweichung bei der Addition des zweiten Reaktanten bezüglich der Maskenstruktur beträgt bevorzugt höchstens ± 2 μm und stärker bevorzugt höchstens ± 0,5 μm. Bevorzugt wird ein Maskenmaterial verwendet, welches eingestrahltes Licht nicht reflektiert und/oder weiterleitet. Auf diese Weise wird zu einer höheren Randschärfe bei der Erzeugung von Strukturen beigetragen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden nacheinander unterschiedlich strukturierte Masken verwendet. Dies ermöglicht entsprechend eine multiple Strukturierung, wie sie weiter oben für die Verwendung von Lasern ausführlich beschrieben ist.

Die Oberfläche der Bereiche, die durch das erfindungsgemäße Verfahren beschichtet werden, können durch durch das erfindungsgemäße Verfahren auch funktionalisiert werden. Im Gegensatz hierzu ist jedoch eine inerte Beschichtung ebenfalls möglich.

Eine inerte Beschichtung kann weiteren Reaktionen oder Umsetzungen unabhängig von den Reaktionsbedingungen in keiner Weise zugänglich sein oder eine inerte Beschichtung kannnur unter den in der Reaktionslösung vorliegenden Bedingungen einer weiteren Reaktion bzw. Beschichtung nicht zugänglich sein.

Eine funktionalisierte Beschichtung weist beliebig zu wählende, von der Art der Funktionalisierung abhängige Charakteristika auf. Die Funktionalisierung kann beispielsweise verwendet werden, um chemische Reaktionen Abschnitts-lokalisiert auf der beschichteten Oberfläche auszuführen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Reaktanten, die zu einer inerten Beschichten führen, mit Reaktanten, die zu einer Funktionalisierung führen, vor der Induktion der Reaktion vermischt. Durch Einstellung unterschiedlicher Mischungsverhältnisse ist es dadurch möglich, die Funktionalisierung in verschiedenen Bereichen der Oberfläche graduell, d.h. je nach Anteil des zu einer inerten Beschichtung führenden Reaktanten, abzustufen.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Funktionalisierung der Oberflächen durch Mikrofluidik. Mikrofluidsysteme weisen eine Vielzahl von Mikrofluidstrukturen auf. In diese Mikrofluidstrukturen (z.B. Kammern, Kanäle etc.) werden Reaktanten bzw. die auf eine Oberfläche aufzubringenden funktionellen Moleküle in Nanolitervolumina eingebracht. Da Mikrofluidik und Photolitographie zueinander kompatibel sind, ist es möglich, anschließend das erfindungsgemäße Verfahren im Mikrofluidsystem durchzuführen, so das erfindungsgemäß strukturierte bzw. funktionalisierte Mikrofluidoberflächen erhalten werden können. Die Ausführungsform zeichnet sich durch den Einsatz geringer Reaktantenvolumina aus. Durch Verwendung eines solchen Mikrofluidsystems ist es darüber hinaus möglich, einen Reaktanten nach erfolgter Immobiliserung leicht zu entfernen und im Rahmen einer multiplen Immobilisierung nacheinander weitere unterschiedliche Reaktanten in das System einzubringen. So ist es möglich auf einfache Weise unterschiedlich funktionalisierte Oberflächen bzw. Mikrofluidstrukturen auf engstem Raum bereitzustellen.

Eine Funktionalisierung erfolgt bevorzugt durch Verwendung von mit einer Mercaptangruppe oder einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe derivatisierten funktionellen Molekülen als zweiten Reaktanten. Funktionelle Moleküle umfassen bevorzugt biologische Moleküle wie Proteine, Peptidfragmente, Antikörper Enzyme, Nukleinsäuren, Zucker und Lipide, Farbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle, Isotopen markierte Moleküle, Monomere für Polymerisationsreaktionen, Polymere, lumineszierende Moleküle, insbesondere fluoreszierende Moleküle, elektrolumineszierende Moleküle bzw. Polymere, Nanopartikel, Vesikel und anorganische Katalysatoren.

Funktionalisierung umfasst ferner, dass die Oberfläche nach dem erfindungsgemäßen Strukturierungsverfahren einer weiteren beliebigen chemischen Umsetzung unterzogen werden kann. Dabei können sowohl weitere Moleküle addiert als auch Gruppen, z.B. Schutzgruppen, von der Oberfläche abgespalten werden. Ebenso ist die Umwandlung einer immobilisierten funktionellen Gruppe in eine andere funktionelle Gruppe, beispielsweise durch Oxidation oder Reduktion möglich, wobei gegebenenfalls vor der Umsetzung eine Schutzgruppe abgespalten werden kann.

Funktionalisierung im erfindungsgemäßen Sinn umfasst des weiteren das Verändern und/oder Hinzufügen von Eigenschaften der Oberfläche wie elektrische Leitfähigkeit, dielektrische Anisotropie, Doppelbrechung, Rotationsviskosität, Elastizitätskonstanten, Lichtempfindlichkeit, Temperatursensivität, Oxidations- bzw. Reduktionseigenschaften, saure und basische Eigenschaften, hydophobe und hydrophile Eigenschaften etc.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die oben beschriebenen funktionellen Moleküle erst nach dem erfindungsgemäßen Strukturierungsverfahren zugegeben und über Wechselwirkungen mit dem immobilisierten zweiten Reaktanten an die Oberfläche gebunden.

In einer hierzu besonders bevorzugten weiteren Ausführungsform wird als zweiter Reaktant eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe oder ein Mercaptan eingesetzt wird, welche bzw. welches mit einem ersten Bindepartner eines hochaffinen Bindepaares funktionalisiert ist. Der erste Bindepartner des hochaffinen Bindepaares wird so erfindungsgemäß auf einer strukturierten Oberfläche immobilisiert. Anschließend wird ein weiterer Reaktant oder eine Reaktionslösung umfassend den zweiten Bindepartner des hochaffinen Bindepaares zugegeben, der dann mit dem ersten immobilisierten Bindepartner in Wechselwirkung tritt. Die Wechselwirkungen zwischen den Bindepartnern können kovalent, hydophob, ionisch, Wasserstoffbrücken oder Van der Waals-Kräfte sein. Beispiele für bevorzugte hochaffine Bindepaare umfassen Biotin bzw. biothinylierte Substrate/(Strept-)Avidin, Ni(Nitrilessigsäure)_n/His-Tags, Antikörper/Epitop, Rezeptor/Ligand, Dien/Dienophil und komplementäre Nukleinsäuren. Erfindungsgemäß ist die Verwendung von Biotin bzw. biothinylierten Substraten/(Strept-)Avidin besonders bevorzugt, wobei bevorzugt Biotin oder ein biothinyliertes Substrat durch das erfindungsgemäße Verfahren direkt auf einer Oberfläche immobilisiert ist.

Die Ausbildung von Komplexen zwischen hochaffinen Bindepartnern, wobei ein Partner erfindungsgemäß an einer Oberfläche immobilisiert ist, kann ebenfalls zu einer Funktionalisierung einer strukturierten Oberfläche verwendet werden. Der zweite nicht direkt an die Oberfläche immobilisierte Bindepartner kann in jeder beliebigen Weise funktionalisiert sein. Bevorzugte Funktionalisierungen umfassen alle Funktionen wie sie weiter oben für eine direkte Funktionalisierung der Oberfläche bereits diskutiert wurden. Bevorzugt werden Komplexe zur Herstellung Bindepartner vermittelter Nanostrukturierungen, wie z.B. leitender Mikrostrukturen, verwendet. Beispiele für derartige Nanostrukturierungen umfassen Metallpartikel, bevorzugt Au, Ag, Pt, Pd und Cu, wobei die Metalle auf ihrer Oberfläche derivatisiert sein können, insbesondere mit einer ungesättigten Kohlenwasserstoffgruppe oder einem Thiol und Quantum-Dots, insbesondere Halbleitermaterialien wie beispielsweise CdS, CdSe, CdTe, ZnS, TiO₂ oder ähnliche Übergangsmetallchalkogenide. Die Ausbildung Biotin-Streptavidin vermittelter Goldstrukturierungen ist besonders bevorzugt. Ferner eignet sich diese Ausführungsform bevorzugt zur Immobilisierung von Rezeptoren oder Antikörpern insbesondere zum Screening nach biologischen Interaktionspartnern.

Insbesondere die eben beschriebene Ausführungsform, welche ein hochaffines Bindepaar verwendet, eignet sich zur Herstellung einer universellen strukturierten Bindeoberfläche oder eines molekularen Clips, die nach ihrer Herstellung nicht auf eine bestimmte Funktionalisierung festgelegt sind, sondern erst später durch entsprechende Wahl eines funktionalisierten zweiten Bindepartners des hochaffinen Bindepaares funktionalisiert werden können.

Zur bevorzugten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird wie bereits erläutert ein Thiol-funktionalisierter, Trägeroberflächen-gebundener erster Reaktant verwendet. Der zu addierende zweite Reaktant wird gleichmäßig auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Bevorzugt wird der zu addierende zweite Reaktant durch Zentrifugation gleichmäßig auf die Trägeroberfläche aufgebracht. Nach Belichtung und Entfernen Reaktanten durch Waschen kann ein weiterer Reaktant auf die Oberfläche aufgebracht und immobilisiert werden. Das Verfahren kann beliebig oft wiederholt werden.

In einer weiteren Ausführungsform wird dem zu verteilenden zweiten Reaktanten vor der Zentrifugation ein Detergenz zugegeben. Die Oberflächenspannung der Lösung wird so herabgesetzt und die gleichmäßige Verteilung auf der Trägeroberfläche erleichtert.

Die Belichtung zur Induktion der photochemischen Reaktion wird wie beschrieben bevorzugt durchgeführt nachdem der zweite Reaktant auf der Trägeroberfläche angetrocknet ist.

Nicht umgesetzter zweiter Reaktant wird nach der Reaktion von der Oberfläche entfernt. Alle Arbeitsschritte werden bevorzugt unter Schutzgasatmosphäre (z.B. Stickstoff, Argon, etc.) und in einer Lichtumgebung, welche nicht zur Induktion der photochemischen Reaktion beitragen kann (z.B. Gelblicht, Rotlicht etc.) durchgeführt. Nach der Belichtung wird der zweite Reaktant vorzugsweise durch einfaches Spülen entfernt. Das zu verwendete Lösungsmittel unterliegt keinen Beschränkungen solange es nicht mit den immobilisierten Reaktanten reagiert. Bevorzugt ist die Verwendung von DMF und Wasser.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der zu addierende zweite Reaktant nach der Reaktion durch einen zum Waschschritt zusätzlichen Zentrifugationsschritt von der Oberfläche entfernt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl in polaren als auch in unpolaren Lösungsmitteln, in protischen als auch in aprotischen Lösungsmitteln sowie in Lösungsmittelgemischen durchgeführt werden. Beispielhafte Lösungsmittel, die nicht beschränkend auf die Erfindung wirken, sind Wasser, Alkohle, Dimethylformamid (DMF), Hexan, Chloroform sowie Toluol. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in der Gasphase durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt in hochsiedenden Lösungsmitteln, bevorzugt DMF, oder in Gemischen hochsiedender Lösungsmittel durchgeführt. Der Siedepunkt eines Lösungsmittels ist dabei bevorzugt ≥ 100°C, stärker bevorzugt ≥ 120°C und am stärksten bevorzugt ≥ 150°C. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein DMF/Toluol-Gemisch im Verhältnis DMF:Toluol von 10:1 bis 2:1 und bevorzugt im Verhältnis 3:1 eingesetzt..

In einer weiteren Ausführungsform wird dem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch ein Mittel zugegeben, welches die photochemische Energieübertragung unterstützt bzw. katalytisch wirkt oder/und während der Reaktion stabilisierend auf radikalische Zwischenstufen wirkt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einem Temperaturbereich von –20° bis 150°C ausgeführt werden, vorzugsweise jedoch bei Raumtemperatur (20°C +/– 5°C).

Zusammenfassend zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren in der praktischen Durchführung somit durch kurze Reaktionszeiten sowie einfache Substanzauftragungs- und Waschprozesse aus. Die Selektivität und Milde des Verfahrens ermöglicht die vielfältigen Nutzungen der erfindungsgemäßen Strukturierungstechnik.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren automatisiert durchgeführt. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem automatisierbaren Mikrofluidsystem in Kombination mit Laser- oder Laser-Spiegel-Technologie eingesetzt.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine beschichtete Oberfläche bzw. ein Träger der über eine solche Oberfläche verfügt, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Oberflächen bzw. Microarrays zeichnen sich durch eine hohe Dichte der immobilisierten Moleküle, eine hohe native Aktivität bzw. Funktionalität der immobilisierten Moleküle und die Stabilität der Beschichtung aus. Die strukturierten bzw. funktionalisierten Oberflächen zeigen während der Reaktionen in welchen sie verwendet werden keine Desorption immobilisierter Moleküle. Die strukturierten Oberflächen oder Träger können planar oder nicht-planar sein.

Die Beschichtung einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Oberfläche kann Naturstoffe wie beispielsweise Zucker und Kohlenhydrate, Aminosäure, Peptide, Phosphopeptide, Proteine, Enzyme, Antikörper, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Nukleinsäuren, darüber hinaus Farbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle, Isotopen markierte Moleküle, Polymere, Monomere für Polymerisationsreaktionen,, lumineszierende Moleküle, insbesondere fluoreszierende Moleküle, Flüssigkristalle, elektrolumineszierende Moleküle und/oder Polymere, Nanopartikel, Vesikel und/oder anorganische Katalysatoren umfassen.

Derart beschichtete Oberflächen können für eine Vielzahl von Anwendungen, beispielsweise in der Biosensorik und im Wirkstroffscreening, z.B. zur Identifizierung oder/und Charakterisierung pharmakologischer Wirkstoffe, eingesetzt werden. Weiterhin können beschichteten Oberflächen zu Analyse von Biomolekülen, ausgewählt aus Proteinen, Antikörpern, Antibiotika, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, Hormonen, Steroiden etc., dienen. Die beschichteten Oberflächen können ferner zur Nachahmen der äußeren Hülle einer Zelle verwendet werden, um beispielsweise biologische Vorgänge an Zellen zu untersuchen. Eine Verwendung in der Chirurgie oder Transplantationsmedizin beispielsweise zum Ersatz bzw. zur Überbrückung defekter Nerven ist denkbar.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung Herstellung von Biochips insbesondere für das Hochdurchsatz-Screening nach neuen pharmazeutischen Wirkstoffen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung mikrofluidischer Systeme, z.B. durch strukturierte Immobilisierung von Polymeren. Das Verfahren kann verwendet werden, um dreidimensionale Strukturen aufzubauen, wie sie in Mikrofluidensystemen z.B. in Form von Kanälen bzw. Reaktionskammern benötigt werden. Neben dem Aufbau solcher Strukturen können diese erfindungsgemäß zusätzlich beschichtet bzw. funktionalisiert werden. Solche Systeme eignen sich insbesondere zur Analyse und Synthese mehrstufiger katalytischer Reaktionen. Ein weiterer Aspekt ist die Herstellung von Mikroperlen, die immobilisierte Enzyme oder heterogene Katalysatoren tragen. Solche Mikroperlen sind im Rahmen der Mikrofluidik besonders bevorzugt, da sie ein hohes Oberflächen-Volumenverhältnis aufweisen, welches für eine effiziente heterogene Reaktion erforderlich ist.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächen, welche mit lumineszierenden Molekülen, insbesondere fluoreszierenden Molekülen, elektrolumineszierenden Polymeren und/oder elektrolumineszierenden anorganischen Molekülen beschichtet sind. Insbesondere die Beschichtung mit elektrolumineszierenden konjugierten Molekülen bzw. Polymeren ist besonders vorteilhaft, da eine Feinabstimmung ihrer Eigenschaften (Farbe, Quantenausbeute) durch Änderung der Struktur leicht möglich ist. Die vorliegende Erfindung umfasst eine erfindungsgemäß strukturierte Oberfläche, die mit rot, grün und/oder blau elektrolumineszierenden Molekülen und/oder Polymeren beschichtet ist. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Beispiele für elektrolumineszierende Moleküle umfassen Poly(1,4-phenylenvinylene) (PPV) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere PPV-Copolymere und CN-PPVs, Poly(3-alkylthiophene) und davon abgeleitete Derivate, Poly(para-phenylene) (PPP) und davon abgeleitete Derivate, insbesondere Leiter-Poly (para-phenylene) (LPPP), und Gemische solcher Verbindungen. So beschichtete Oberflächen eignen sich insbesondere zum Aufbau von LEDs.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächenstrukturen, welche Flüssigkristalle enthalten. Besonders bevorzugt ist dabei die Herstellung von TN-Zellen (twisted nematic, TN), in welchen sich Flüssigkristalle orientieren. Ein weiterer besonders bevorzugter Aspekt ist dabei eine Ausführungsform, bei der jedes Bildelement (Pixel) einzeln über einen Transistor angesteuert wird. Als Flüssigkristalle werden bevorzugt mehrfach fluorierte Kohlenwasserstoffe eingesetzt. Erfindungsgemäß so erhältliche Oberflächenstrukturen eignen sich insbesondere zum Aufbau von LCDs und AM-LCDs (active matrix LCDs).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von LEDs, LCDs, AM-LCDs und OLEDs. Die so hergestellten LEDs, LCDs, AM-LCDs und OLEDs zeichnen sich gegenüber Displays wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind insbesondere durch eine hohe Auflösung aus.

Des erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung großflächiger LED-Anzeigen, da nach dem Stand der Technik zu deren Herstellung sowohl anorganische Halbleitermaterialien als auch organische Fluoreszenzfarbstoffe durch teure Verfahren wie Sublimation oder Aufdampfen aufwendig aufgebracht werden müssen.

Des Weiteren weisen insbesondere OLEDs, welche durch Photolitographie mit Photosäure hergestellt wurden, aufgrund nicht vollständig entfernter Photosäure nur eine beschränkte Haltbarkeit auf. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird dieser Nachteil des Stands der Technik ausgeräumt, so dass sich erfindungsgemäß erhältliche OLEDs durch eine hohe Haltbarkeit bzw. thermische Stabilität auszeichnen. Erfindungsgemäß erhältliche OLEDs eignen sich deshalb besonders zur Herstellung von True-Colour-Matrix-Displays.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächen, welche mit Nanopartikeln, insbesondere Ag, Au, Pd, Pt, Cu, Quantum Dots, Vesikeln und/oder anorganische Katalysatoren beschichtet sind. Solche Nanopartikel können ausschließlich aus einem Element oder einer einzelnen Verbindung bestehen, oder sie können durch organische Moleküle, vorzugsweise Kohlenwasserstoffe, ummantelt sein.

Mit stromleitenden Nanopartikeln strukturierte Oberflächen können zur Bildung von leitenden Mikrostrukturen verwendet werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von leitenden Mikrostrukturen. Erfindungsgemäß hergestellte leitende Mikrostrukturen können in der Halbleiter- und Chiptechnologie eingesetzt werden.

Mit anorganischen Katalysatoren beschichtete Oberflächen können ebenso wie Vesikel beschichtete Oberflächen, die beispielsweise eine Substanz in einer kontrollierten Weise freisetzen können, insbesondere im Rahmen von miniaturisierten Systemen, wie Mikrofluidsystemen, verwendet werden. Solche miniaturisierten Systeme sind beispielsweise in der Lage alle für einen bestimmten Syntheseweg notwendigen Reaktionen in kleinem Massstab auf engen Raum, beispielsweise ein Chip, durchzuführen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Oberflächen welche mit Polymeren und/oder Monomeren für eine anschließende Polymerisationsreaktion beschichtet sind. Erfindungsgemäß können so Oberflächen-immobilisierte dreidimensionale Strukturen (Kammern, Röhren, Kanäle etc.) aufgebaut werden, wie sie beispielsweise in der Mikrofluidik und der Displaytechnologie Anwendung finden. Solche dreidimensionale Strukturen können sowohl Fluide aufnehmen, als auch bei entsprechender Funktionalisierung ihrer Oberflächen Reaktionen in aufgenommenen Fluiden katalysieren.

Chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben und beziehen sich auf Tetramethylsilan, CHCl₃, H₂O oder MeOH als internen Standard. Die Kopplungskonstanten J sind in Hertz (Hz) angegeben und die Signalmultiplizitäten werden wie folgt abgekürzt: s = Singulett, d = Dublett, dd = Dublett von Dubletts, t = Triplett, m = Multiplett, br = breites Signal, Z = Zucker, AS = Aminosäure. Die Zucker-Protonen bzw. Kohlenstoffe wurden mit 1–6 bezeichnet, beginnend am anomeren Zentrum.
Die FAB-Massenspektren wurden auf einem Finnigan MAT MS 70 Spektrometer gemessen. Als Matrix diente bei den FAB-Messungen standardmäßig 3-Nitrobenzylalkohol (3-NBA).
Als Trägergas für GC-MS-Untersuchungen wurde Helium und als Standardgradient folgender benutzt: 1 min 100°C, dann innerhalb von 5 min auf 280°C, die 5 min gehalten wurden.
Die spezifischen Drehwerte [α]_D ²⁰ beziehen sich auf die Na-D-Linie.
Zur analytischen Dünnschichtchromatographie wurden Kieselgelplatten verwendet (Kieselgel 60 F254). Zur Detektion wurde UV-Licht der Wellenlängen 254 nm bzw. 366 nm und zur Anfärbung folgende Reagenzien verwendet:
Reagenz A: 5 g Kaliumpermanganat auf 100 g Wasser;
Reagenz B: 2.5 g Molybdatophosphorsäure, 1 g Cer(IV)-sulfat, 6 ml konz. Schwefelsäure und 94 ml Wasser;
Reagenz C: 10% konz. Schwefelsäure in Ethanol.
Die entsprechenden Laufmittel und R_f-Werte sind bei den jeweiligen Verbindungen angegeben. Die säulenchromatographischen Trennungen erfolgten an Flash-Kieselgel mit einem Überdruck von 0.3–0.8 bar.
Die präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) wurde mit einem System der Firma Agilent (1100 Series) durchgeführt. Als Säulen fanden eine CC125/21 Nucleosil 120-5 C4 Säule bzw. CC125/21 Nucleodur 120-5 C18 Gravity der Firma Macherey&Nagel bei Flussraten von 25 ml/min Verwendung. Die analytische HPLC wurde mit einem HP 1100-Modell der Firma Hewlett-Packard mit CC125/4 Nucleosil 120-5 C4 Säule bzw. CC125/4 Nucleodur 120-5 C18 Gravity der Firma Macherey & Nagel mit Flussraten von 1 ml/min durchgeführt. Die Detektion erfolgte jeweils bei den Wellenlängen 210 nm und 280 nm. Als Laufmittel wurden Wasser + 0.1 Vol.-% TFA (A) und Acetonitril + 0.1 Vol.-% TFA (B) verwendet.
Als Standardgradienten wurden folgende benutzt:
Analytische HPLC: 1 min 10% B, dann innerhalb von 10 min auf 90 % B;
Präparative HPLC: 3 min 10% B, dann innerhalb von 15 min auf 100 % B.
Alle weiteren genutzten Gradienten sind individuell angegeben.
Die Silicium-Wafer (SSP, Dicke: 125 mm, Größe: 2.5 × 7.5 cm²) wurden mit einer beschichteten Oberseite (1μm PECVD-SiO₂) hergestellt. Die verschieden funktionalisierten Dendrimer-modifizierten Glas- und Siliciumträger wurden von der Firma Chimera Biotec GmbH, Dortmund, bezogen.
Für die Photolithografie wurde zum Auftragen der Substanzen ein Spin-Coater der Firma Laurell zusammen mit einem Chuck-Adapter aus Mylar-Folie (zur Sicherstellung des benötigten Vakuums) benutzt und die Belichtung wurde mit der Anlage MA6 (Firma Süss, Wellenlänge: 365 nm, Leistung: 20 mW/cm², Programm: Softkontakt) mit der Maske PKI im Institut für Hochfrequenztechnik durchgeführt. Die Belichtung ohne photolithografische Anlage wurde mit Hilfe einer Quecksilberdampflampe („Pen Ray"-Lampe von der Firma UVP, Kalifornien, USA, Wellenlängenmaximum 365 nm, Leistung 5.5 W, Länge 2 1/8 inches) ausgeführt. Die photochemische Immobilisierung am Laser-Rastermikroskop der Firma Biorad, Typ MRC-1024, wurde mit einem Kr-Ar-Laser durchgeführt.
Die Fluoreszenzsignale wurden mit dem Microarray-Fluorescence-Reader 4000B der Firma Axon ausgelesen und mit dem Programm Axon Gene Pix Pro 4.0 ausgewertet. Streptavidin-Cy5 wurde von der Firma Chimera Biotec zur Verfügung gestellt und stammt von der Firma Zyomed. Alexa-Fluor-647-markiertes Concanavalin A wurde von der Firma Molecular Probes, anti-Phosphotyrosin-Biotin von der Firma BIOTREND Chemikalien bezogen.
Für biologische Tests und Nachweise verwendete Puffer:
TETBS: 20 mM TRIS-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 7.5, bei Bedarf + DTT;
MESTBS: 20 mM TRIS-Cl, 150 mM NaCl, 4.5% Milchpulver (Oxoid), 5 mM EDTA, 0.2% NaN₃, 1 mg/ml DNA MB Grade (Roche);
Der Nachweis der immobilisierten Substanzen wurde von der Firma Chimera Biotec GmbH, Dortmund, durchgeführt.
Soweit nicht anders beschrieben wurden die Reaktionen bei RT durchgeführt.
Die prozentualen und die anteiligen Lösungsmittelzusammensetzungen sind soweit nicht anders angegeben in v/v angegeben.
Beispiel 1: Immobilisierung von Haptenen mittels Licht-induzierter Addition von Mercaptanen an terminale Doppelbindungen
Die Immobilisierungsreaktion wurde mit Hilfe des Biotinallylamids 143 mit Streptavidin-Cy5 als Nachweis evaluiert. Die benötigten Thiol-funktionalisierten Glasträger wurden wie in Schema 2 gezeigt synthetisiert. Dendrimer-überzogene Carbonsäure-funktionlisierte Objektträger der Firma Chimera Biotec wurden mit DCC und Cystamindihydrochlorid umgesetzt und anschließend wurde Disulfid 150 mit DTT zum Thiol reduziert.
Die Anwesenheit der Thiole auf der Oberfläche wurde mit dem Thiol Quantification Kit (Molecular Probes) überprüft.
Im ersten Immobilisierungsexperiment wurden Biotinallylamid 143 (Schema 1) und Biotinpropylamid 38 in den Lösungsmitteln abs. DMF, abs. DMF/Toluol (3:1) in einer Konzentration von 0.1 mM auf die Oberfläche 151 mit einer Eppendorfpipette gespottet. Nach dem Spotten wurden die Glasträger 3 h belichtet und mit DMF und Wasser intensiv gewaschen. Der Nachweis wurde durch Inkubation mit einer 100 nM Lösung von Streptavidin-Cy5 von ausgeführt (2).
2 zeigt das Ergebnis der Dendrimer-überzogenen Thiol-funktionalisierten Glasträger. Das Experiment zeigt eindeutig, dass die Anbindung über die Doppelbindung verläuft, da die Negativkontrolle 38 nicht detektiert werden konnte. Bezüglich der Lösungsmittel lief die Reaktion in DMF/Toluol (3:1) am besten ab.
Die Stabilität der Bindung zur Oberfläche wurde in einem Regenerierungsexperiment nachgewiesen. Biotinallylamid 143 wurde in den Konzentrationen von 0.1 mM und 0.01 mM auf einem Thiol-funktionalisierten Glasträger immobilisiert. Nach dem Nachweis mit einer 100 nM Lösung von Streptavidin-Cy5 (3A) wurde der Glasträger mehrmals stringent mit 0.1%iger Natriumdodecylsulfat-Lösung bei 80°C gewaschen (3B und 3C). Anschließend wurde wieder mit Streptavidin-Cy5 inkubiert (3D).
Die erneute Inkubation mit Streptavidin-Cy5 lieferte den Nachweis, dass das Biotin fortwährend auf der Oberfläche anwesend war. Die Fluoreszenzsignale zeigten eine Intensität, die in dem Bereich der ursprünglichen lag. Die Anbindung des Biotins an die Oberfläche beruht somit auf einer stabilen, kovalenten Bindung.
Zum Nachweis der Abhängigkeit der Reaktion von der Belichtung wurden Biotinallylamid 143 und Biotinpropylamid 38 in einem Konzentrationsgradienten mit einem Handspotter auf zwei Thiol-funktionalisierte Glasträger gespottet. Einer der Glasträger wurde 3 h bei 365 nm belichtet, der andere wurde nach dem Spotten unter Laborlicht 3 h im Dunkeln verwahrt. Nach intensivem Waschen mit DMF und Wasser wurde die Anbindung wiederum mit einer 100 nM Lösung von Streptavidin-Cy5 nachgewiesen (4).
In 4A ist der Glasträger dargestellt, der 3 h belichtet worden ist. Die Signalintensitäten entsprechen dem Konzentrationsgradienten und die Nachweisgrenze für das Biotinallylamid 143 liegt bei 1 μM. Es ist ein klarer Intensitätsunterschied beim Nachweis des Biotinallylamids zur Negativkontrolle 38 zu sehen. Die Spuren der Negativkontrolle, die nachgewiesen wurden, sind in der Eintrocknung der Substanz und ungenügendem Waschen begründet. Der in 4B dargestellte Glasträger war unter Laborlicht gespottet und dann im Dunkeln verwahrt worden. Im Vergleich zu dem belichteten Träger wurden wesentlich geringere Signale detektiert. Dies wird in dem in 4C dargestellten Histogramm verdeutlicht.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde Mannosallylamid 155 synthetisiert (Schema 3). Immobilisierung zusammen mit Mannose 44, intensives Waschen mit DMF und Wasser und Nachweis mit Concanavalin A ergaben Fluoreszenzsignale entsprechend dem gespotteten Konzentrationsgradienten (5).
Als weiteres Beispiel für die Selektivität und Effizienz dieser Immobilisierungsreaktion wurde das Phosphopeptid 158 immobilisiert und mit anti-pTyr-Antikörper nachgewiesen. Es wurde in Lösung hergestellt (Schema 4).
Spotten im Konzentrationsgradienten, dreistündige Belichtung, Waschen mit DMF und Wasser und Nachweis mit dem Konjugat aus biotinyliertem anti-pTyr-Antikörper-und Streptavidin-Cy5 (50 nM, 6) ergaben hohe Fluoreszenzsignalintensitäten. Dies zeigt, dass das Phosphotyrosin weder durch die Schwefelradikale noch durch die Einstrahlung des UV-Lichts beschädigt worden war.
Wie die Resultate der Immobilisierung des Mannoseallylamids 155 zeigen auch die Ergebnisse für das Phosphopeptid 158 eine gute Bindungseffektivität und Selektivität.
Anschließend wurde gezeigt, dass die Licht-induzierte Reaktion nach einem bestimmten Zeitraum eine Sättigung erreicht. Phosphopeptid 158 wurde hierzu in einer Konzentration von 1 mM auf Thiol-funktionalisierte Glasstücke gespottet, welche dann belichtet wurden. Nach jeweils 45 Minuten wurde ein Glasstück unter der UV-Lampe hervorgenommen und mit DMF und Wasser gewaschen. Als Negativkontrolle (nk) diente ein bespottetes Glasstück, welches 315 Minuten im Dunkeln aufbewahrt worden war. Im Anschluß erfolgte der Nachweis wiederum mit dem anti-pTyr-Antikörper Konjugat (50 nM) (7). Dabei wurde festgestellt, dass sich die Signalintensität bereits nach 135 Minuten nicht weiter erhöhte, d.h. eine Sättigung eingetreten war. Dies zeigte ebenso, dass die Anbindung des Phosphopeptids von der Lichteinstrahlung abhängig war. Die Signalintensität der Negativkontrolle lag im Bereich derjenigen nach 45 Minuten Belichtungszeit, was bedeutet, dass 45 Minuten für eine sichtbare Immobilisierung mittels der verwendeten UV-Lampe nicht ausreichen.
Beispiel 2: Anwendung der Licht-induzierten Addition von Mercaptanen an Biotinallylamid 143 zur Strukturierung von Oberflächen durch Photolithographie
Zur Photolithographie wurden Siliciumträger verwendet, die eine Reflexion oder Weiterleitung des Lichts im Träger verhindern. Dazu wurden Siliciumplatten mit einer ca. 1 μm dicken SiO₂-Schicht hergestellt und in die Form von Objektträgern geschnitten. Anschließend wurden diese Siliciumträger mit Dendrimeren beschichtet. Die Thiol-Funktionalisierung erfolgte wie bereits für die Glasträger beschrieben (Schema 2).
Die Träger wurden durch Spin-Coating mit der Biotinallylamid 143-Lösung benetzt. Dies wurde mit einer 1 mM und 10 mM Biotinallylamid-Lösung und Belichtungszeiten von 10 und 30 min realisiert. Anschließend wurde mittels Zentrifugation gewaschen und mit Streptavidin-Cy5 (100 nM) inkubiert (8).
Der Nachweis der Immobilisierung von Biotinallylamid 143 (10 mM) durch zehnminütige Belichtungszeit ergab eine Signalintensität der belichteten Stellen (8A), die derjenigen beim Nachweis der Immobilisierung von Biotinallylamid (1 mM) durch dreißigminütige Belichtungszeit entsprach (8D). Die geringste Intensität der belichteten Stellen wurde bei der Reaktion der 1 mM Lösung von Verbindung 143 nach 10 min erhalten ( 8C), die höchste bei derjenigen der 10 mM Lösung nach 30 min (8B, unterschiedliche Kontrasteinstellungen bei der Darstellung). Das Signal/Hintergrund-Verhältnis konnte bei der dreißigminütigen Belichtung der 10 mM Biotinallylamid-Lösung auf 9:1 verbessert werden.
Vergrößert man den oberen Abschnitt des in 8A gezeigten Experimentes wird deutlich, dass die Auflösung der Licht-induzierten Oberflächenstrukturierung der Auflösung von 5 μm entspricht, was der höchsten Auflösung des Fluoreszenz-Scanners entspricht (9). Dies ist daran zu erkennen, dass die 3 μm breite Linie in der Mitte einmal etwas nach unten verschoben wird, was durch den Wechsel zwischen Pixel-Reihen des Scanners bei einer Abweichung der Linie von der horizontalen Ebene bedingt ist. Moleküle werden daher nur an den Stellen immobilisiert, an denen sie belichtet werden, mit einer möglichen Abweichung von ± 2 μm.
Da die Auflösung der Licht-induzierten Oberflächenstrukturierung in diesen Experimenten lediglich die Auflösung des Fluoreszenz-Scanners beschränkt war, ist es ferner möglich, Strukturen im sub-Mikrometer-Bereich herzustellen und mittels hochauflösenden Techniken wie beispielsweise der Mikroskopie nachzuweisen.
Beispiel 3: Anwendung der Licht-induzierten Addition von Mercaptanen an Phosphopeptid 158 und Pentensäure-funktionalisiertes Streptavidin 161 zur Strukturierung von Oberflächen durch Photolithographie
Zum einen wurde das Phosphopeptid 158 und zum anderen Pentensäure-funktionalisiertes Streptavidin 161 zur Strukturierung von Oberflächen verwendet (10D). Es wurde für dieses Experiment eine 0.5 mM Lösung des Peptids in absolutem DMF/Toluol (3:1) benutzt und nach dem dreißigminütigen Belichten mit DMF, Methanol und TETBS-Puffer abzentrifugiert. Das Pentensäure-funktionalisierte Streptavidin 161 wurde in einer 200 μM Lösung in Wasser eingesetzt. Da Wasser eine hohe Oberflächenspannung hat, war das gleichmäßige Verteilen durch Zentrifugation problematisch. Das Wasser bildete einen großen Tropfen in der Mitte, der während der Zentrifugation trocknete. In zukünftigen Experimenten sollte deshalb etwas Detergenz hinzugegeben werden. Nach dreißigminütigen Belichten wurde mit TETBS-Puffer und Wasser abzentrifugiert. Das Auslesen wurde bei der Immobilisierung des Phosphopeptids mit dem Konjugat aus biotinyliertem anti-pTyr-Antikörper- und Streptavidin-Cy5 (50 nM) und bei der des Streptavidins mit Biotin-Cy5 (10 nM) vollzogen. Die Ergebnisse sind in 10A und C dargestellt.
Beide Haptene konnten an den belichteten Stellen nachgewiesen werden. Streptavidin wird somit nicht durch die UV-Strahlung zerstört und die Immobilisierung ist Licht-abhängig. Die Tatsache, dass für ein gutes Immobilisierungsergebnis nur eine 200 μM Lösung des Streptavidins notwendig war, ist durch die vier Bindungsstellen des Streptavidins für das Biotin zu erklären, weil die mögliche vierfache Bindung des Biotin-Cy5 einen Signalintensitäts-verstärkenden Effekt hat.
Dass das Streptavidin tatsächlich über die Doppelbindung an die Oberfläche bindet wurde mittels unfunktionalisiertem Streptavidin 162 gezeigt, welches der gleichen Immobilisierungsprozedur wie das Streptavidin 161 unterzogen wurde. In 10B ist das Resultat gezeigt. Zwar ist eine Strukturierung mittels Streptavidin zu erkennen, aber das Signal/Hintergrund-Verhältnis ist mit ~6:1 wesentlich geringer als das durch die Immobilisierung von Streptavidin 161 erzielte (~50:1). Somit findet zwar eine geringe Nebenreaktion statt, aber die Anbindung verläuft hauptsächlich durch die Addition der Thiole auf der Oberfläche an die terminalen Doppelbindungen, welche am Streptavidin lokalisiert sind.
Es konnte anhand verschiedener Verbindungen, die durch unterschiedliche biologische Wechselwirkungen nachgewiesen wurden, die Oberflächenstrukturierung mittels Photolithographie realisiert werden.
Beispiel 4: Anwendung der Laser-induzierten Addition von Mercaptanen an Biotinallylamid 143 und Strukturierung von Oberflächen durch Photolithographie
Dazu wurde ein konfokales Lasermikroskop verwendet. Energie Wellenlänge 365 nm wurde durch Zwei-Photonen-Anregung erzeugt. Die Multi-Photonen-Anregung ist kein linearer Prozess und daher erreicht man bei einer eingestrahlten Wellenlänge von 728 nm nur theoretisch den halbierten Wert von 364 nm. Unter Berücksichtigung dieses Hintergrunds wurde in eine Hybridisierungskammer auf einem Thiol-funktionalisierten Glasträger eine Lösung von Biotinallylamid 143 in DMF/Toluol (3:1) (1 mM) gegeben. Innerhalb dieser Hybridisierungskammer wurde jeweils eine Fläche von 338.4 μm² (512 × 512 Pixel) gescannt, wobei der Scan pro Fläche 10, 30 und 100mal wiederholt wurde. Zwischen diesen drei Scans wurde der Objektträger geringfügig mit der Hand verschoben, so dass die gescannten Felder in einer Reihe lagen (11A und B). 30 Scanwiederholungen entsprechen einer Belichtungszeit von 1 × 10^–4 Sekunden pro Pixel. Die Laserintensität wurde bei 100% gewählt. Nach dem Scannen wurde der Glasträger sofort stringent mit DMF und Wasser gespült. Anschließende Inkubation mit Streptavidin-Cy5 (100 nM) ergab die in 11A und vergrößert in 11B gezeigten quadratischen Signale. Die Fluoreszenzsignalintensitäten entsprechen der jeweiligen Scanwiederholung, also der Belichtungszeit. Das bedeutet, dass eine geringere Scanwiederholung und dementsprechend eine niedrigere Belichtungszeit ein Signal mit geringerer Intensität lieferten.
Durch die Immobilisierung von Biotinallylamid 143 (100 nM) in DMF/Toluol (3:1) mit einer Laserintensität von 100% und 100facher Scanwiederholung wurde ein Muster auf der Oberfläche immobilisiert. Dazu wurden drei Felder im rechten Winkel gescannt. Anschließendes Waschen wie zuvor und Inkubation mit Streptavidin-Cy5 (100 nM) ergab das in 11C dargestellte Muster. Das hergestellte Muster ist deutlich zu erkennen.
Somit konnte durch Zwei-Photonen-Anregung die Oberflächenstrukturierung mittels Laser erfolgreich durchgeführt werden.
Beispiel 5: Biotin-6-amidocapronsäureallylamid (143)
Eine Lösung von 50 mg (0.14 mmol) Biotin-6-amidocapronsäure in 3 ml abs. DMF wurde hergestellt, indem die durch Zugabe erhaltene Suspension mit einem Heißluftfön erhitzt wurde und, nachdem sich alles gelöst hatte, wieder auf rt abgekühlt wurde. Dann wurden 30 mg (0.15 mmol) EDC und 24 mg (0.15 mmol) HOBt zugegeben und 1 h gerührt. Danach wurden 23 μl (0.3 mmol) Allylamin hinzugefügt und 18 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde i. Vak. entfernt, der Rest wurde in wenig MeOH aufgenommen und mit viel Et₂O das Produkt ausgefällt. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt.
Gräulicher Feststoff.
Ausbeute: 49 mg (0.12 mmol), 86%.
Schmp.: 134°C.
[α]_D ²⁰ = +31.0° (c = 0.6, DMSO).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-D₆): δ = 7.92–7.81 (br, 1H, Amid-NH), 7.74–7.67 (br, 1H, Amid-NH), 6.38 (s, 1H, Biotin-NH), 6.32 (s, 1H, Biotin-NH), 5.82–5.68 (m, 1H, CH=CH₂), 5.16–4.96 (m, 2H, CH=CH ₂), 4.28–4.23 (m, 1H, CH-CH₂-S), 4.10–4.05 (m, 1H, CH-CH-S), 3.81–3.75 (m, 1H, CHa-CH=CH₂), 3.65–3.60 (m, 1H, CHb-CH=CH₂), 3.08–3.01 (m, 1H, S-CH), 3.01–2.92 (m, 2H, Amid-NH-CH ₂), 2.77 (dd, ²J = 5.1 Hz, ³J = 12.6 Hz, 1H, S-CHa), 2.53 (d, ³J = 12.6 Hz, 1H, S-CHb), 2.14 (t, ³J = 7.3 Hz, 1H, HCH), 2.06–1.96 (m, 3H, HCH, CH₂), 1.49–1.15 (m, 12H, 6 CH₂).
C₁₉H₃₂N₄O₃S (396.22).

FAB-HR: ber.: 397.2273 [M + H]⁺

gef.: 397.2261 [M + H]⁺
Beispiel 6: Ethoxy-[(N-allyloxycarbonyl)-aminoethyl]-ether (156)
Es wurden 1.94 ml (19.4 mmol) 2.2-Aminoethoxyethanol und 1.08 g (27.0 mmol) NaOH in 20 ml Dioxan und 10 ml Wasser gelöst. Unter Eiskühlung und Rühren wurde innerhalb von 40 min 2.48 ml (23.3 mmol) Allylchloroformat in 20 ml Dioxan hinzugetropft, wobei eine weiße Suspension entstand. Die Mischung wurde anschließend 21 h bei rt gerührt und dann wurde das Lösungsmittelgemisch i. Vak. entfernt. Der Rückstand wurde mit 100 ml Chloroform und 100 ml Wasser überschichtet und mit 1 M HCl-Lösung auf pH 5 gebracht und die Phasen nach Extraktion getrennt. Die wässrige Phase wurde drei weitere Male mit Chloroform extrahiert. Danach wurde per DC (DCM/MeOH/NH₃ = 10:8:0.5) die wässrige Phase auf Produkt kontrolliert und weitere zwei Male extrahiert, bis kein Produkt mehr in der wässrigen Phase enthalten war. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel i. Vak. entfernt.
Farblose Flüssigkeit.
Ausbeute: 4.05 g, (ca. 19.4 mmol), quantitativ.
R_f = 0.52 (DCM/MeOH/NH₃ = 10:8:0.5).
¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃): δ = 5.95–5.84 (m, 1H, CH=CH₂), 5.28 (dd, ²J = 1.6 Hz, ³J = 17.2 Hz, 1H, CH=CHa), 5.18 (dd, ²J = 1.4 Hz, ³J = 10.4 Hz, 1H, CH=CHa), 4.54 (d, ³J = 5.7, 2H, CH ₂-CH=CH₂), 3.71 (t, ³J = 4.5 Hz, 2H, CH ₂-OH), 3.57–3.53 (m, 4H, CH ₂-O-CH ₂), 3.36 (t, ³J = 5.2 Hz, 2H, CH ₂-NH).
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 156.7, (C=O), 133.1 (CH=CH₂), 117.9 (CH=CH₂), 72.5, 70.3 (CH₂-O-CH₂), 65.8, 61.9, 41.1 (3 CH₂).
C₈H₁₅NO₄ (189.10).
Beispiel 7:[O'-(2,3,4,6-Tetra-O''-acetyl-α-D-mannopyranosyl)ethoxy]-[2-( N-allyloxycarbonyl)-aminoethyl]ether (157)
Es wurden 500 mg (1.21 mmol) Acetobromomannose unter Argon in einem ausgeheizten Schlenkkolben zusammen mit 117 mg Drierite und 213 mg (1.13 mmol) N-Alloc-aminoethyl-2-ethoxyethanol 156 in abs. Toluol/Nitromethan = 1:1 gelöst. Dann wurden 260 mg (1.03 mmol) Hg(CN)₂ hinzu gegeben und die Mischung für 16.5 h gerührt. Die Mischung wurde durch Celite filtriert und i. Vak. eingeengt. Die säulenchromatographische Aufreinigung mit dem Laufmittel Cy/EA = 1:1 lieferte einen leicht gelblichen Sirup.
Ausbeute: 242 mg (0.47 mmol), 39%.
R_f = 0.23 (Cy/EA = 1:1).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 5.98–5.86 (m, 1H, CH=CH₂), 5.32–5.15 (m, 5H, CH=CH ₂, Z-H2, Z-H3, Z-H4), 4.89 (d, ³J = 1.6 Hz, 1H, Z-H1), 4.52 (d, ³J = 5.3 Hz, 2H, CH ₂-CH=CH₂), 4.26–4.21 (dd, ²J = 5.5 Hz, ³J = 12.5 Hz, 1H, Z-O-CHa), 4.13–4.07 (m, 2H, Z-O-CHb, Z-H5), 3.78 (m, 1H, Z-H6a), 3.72–3.65 (m, 3H, Z-H6b, CH₂), 3.55 (t, ³J = 5.6 Hz, 2H, CH₂), 3.37 (m, 2H, CH₂), 2.15, 2.09, 2.03, 1.99 (4s, je 3H, 4 (C=O)CH ₃).
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 170.9, 170.3, 170.1, 170.0 (4 C=O), 133.2 (CH=CH₂), 117.7 (CH=CH₂), 97.8 (Z-C1), 70.5, 70.2, 69.9, 69.2, 68.7, 67.3, 66.5, 65.7, 62.8 (5 Z-C, 4 CH₂), 41.1 (N-CH₂), 21.2, 21.1, 21.0, 20.9 (4 (C=O)-CH₃).
C₂₂H₃₃NO₁₃ (519.20).

ESI-MS: ber.: 542.2 [M + Na]⁺

gef.: 542.4 [M + Na]⁺
Beispiel 8:[(O'-α-D-mannopyranosyl)ethoxy]-[2-(N-allyloxycarbonyl)-aminoethyl]ether (155)
Zu einer Lösung von 226 mg (0.44 mmol) 157 in 2 ml abs. MeOH wurde unter Argon 1 M NaOMe in MeOH solange hinzugetropft, bis pH 10 erreicht war (insgesamt 0.7 ml). Der Umsatz der Reaktion wurde mittels DC (Laufmittel MeOH/EA = 1:9) kontrolliert. Nach 1.5 h wurde Na⁺-Amberlite Ionenaustauscher hinzugefügt, bis pH 8 erreicht war. Die Mischung wurde filtriert und das Lösungsmittel anschließend i. Vak. entfernt. Zur Entfernung restlicher Salze wurde in Ethanol suspendiert, filtriert und wieder eingeengt. Ausbeute: 142 mg (0.41 mmol), 93%.
Leicht gelblicher Sirup.
R_f = 0.34 (MeOH/EA = 1:9), lang gezogener Fleck.
[[α]_D ²⁰ = +46.9° (c = 1, MeOH).
¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ = 5.98–5.86 (m, 1H, CH=CH₂), 5.32–5.26 (dd, ²J = 1.4 Hz, ³J = 17.2 Hz, 1H, CH=CHa), 5.17 (d, ³J = 10.6 Hz, 1H, CH=CHb), 4.78 (s, 1H, Z-H1), 4.52 (d, ³J = 5.3 Hz, 2H, CH ₂-CH=CH₂), 3.85–3.80 (m, 3H, Z-H, Z-O-CH₂), 3.73–3.68 (m, 2H, 2 Z-H), 3.65–3.52 (m, 7H, 3 Z-H, 2 CH₂), 3.28 (m, 2H, CH₂).
¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): δ = 163.0 (C=O), 133.3 (CH=CH₂), 116.3 (CH=CH₂), 100.5 (Z-C1), 73.4, 71.4, 70.9, 70.0, 69.8, 67.5, 66.6, 65.2, 61.8 (5 Z-C, 4 CH₂) 40.5 (N-CH₂).
C₁₄H₂₅NO₉ (351.15).

FAB-HR: ber.: 374.1422 [M + Na]⁺

gef.: 374.1429 [M + Na]⁺

ber.: 352.1602 [M + H]⁺

gef.: 352.1608 [M + H]⁺
Beispiel 9: N-Fluorenmethyloxycarbonyl-asparaginsäure(O-tert-butyl) allylamid (160)
Unter Argon wurden 100 mg (0.24 mmol, 1 Äq) Fmoc-Asp(OtBu)-OH in einem Schlenkkolben in 2 ml abs. DCM/DMF = 1:1 gelöst, 37 mg (0.24 mmol, 1 Äq) HOBt, 45.2 μl DIC (0.29 mmol, 1.2 Äq) sowie 84.9 μl (0.49 mmol, 2 Äq) DIPEA wurden hinzu gegeben und alles 10 min gerührt. Dann wurden 18.3 μl (0.24 mmol, 1 Äq) Allylamin hinzugefügt und 24 h gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittelgemisch i. Vak. Entfernt und das Produkt säulenchromatographisch (Laufmittel 2% MeOH in DCM) aufgereinigt.
Farbloser Feststoff.
Ausbeute: 109 mg (0.24 mmol), 100%.
R_f = 0.39 (2% MeOH in DCM).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 8.00 (s, 1H, NH), 7.75 (d, ³J = 7.4 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.57 (d, ³J = 7.6 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.39 (t, ³J = 7.4 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.33–7.27 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 5.85–5.74 (m, 1H, CH=CH₂), 5.16 (d, ³J = 17.2 Hz, 1H, CH=CHa), 5.11 (dd, ²J = 1.4 Hz, ³J = 10.4 Hz, 1H, CH=CHb), 4.72 (m, 1H, Asp-α-H), 4.43 (d, ³J = 6.6, 2H, Fmoc-CH₂), 4.21 (t, ³J = 6.9 Hz, 1H, Fmoc-CH), 3.88–3.81 (m, 2H, CH ₂-CH=CH₂), 2.59 (dd, ²J = 6.6 Hz, ³J = 17.4 Hz, 2H, Asp-CH₂), 1.44 (s, 9H, tBu).
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 171.5, 170.5 (2 C=O), 162.8 (Fmoc-C=O), 143.9, 141.6 (4 Fmoc-ar-C), 133.9 (CH=CH₂), 128.0, 127.3, 125.2, 120.3 (8 Fmoc-ar-C), 116.6 (CH=CH₂), 82.1 (C-(CH₃)₃), 67.4 (Fmoc-CH₂), 47.4, 42.2 (Asp-α-C, CH₂-CH=CH₂), 36.7, 31.7 (Asp-CH₂, Fmoc-CH), 28.3 (C-(CH₃)₃).
C₂₆H₃₀N₂O₅ (450.22).
Zur Fmoc-Entschützung wurde die Substanz zu 5 ml DCM/Diethylamin = 4:1 gegeben und 4 h gerührt. Danach wurden 10 ml Toluol zugegeben, die Mischung i. Vak. eingeengt und im HV getrocknet.
Beispiel 10: N-Fluorenmethyloxycarbonyl-glycyl-[asparaginsäure(O-tert-butyl)]allylamid (zu 158)
Zu einer Lösung von 107 mg (0.36 mmol, 1.1 Äq) Fmoc-Gly-OH in 2 ml DMF/DCM = 1:1 wurden nacheinander 55 mg (0.36 mmol, 1.1 Äq) HOBt, 127 μl (0.73 mmol, 2.2 Äq) DIPEA und 277 mg (0.36 mmol, 1.1 Äq) HBTU hinzu gegeben. Nach 10 min Rühren wurde die Mischung zu 0.33 mmol (1 Äq) Asp(OtBu)-allylamid gelöst in 1 ml DMF/DCM = 1:1 gegeben. Nach 20 h Rühren wurde die Mischung i. Vak. konzentriert und das Produkt säulenchromatographisch (Laufmittel 2% MeOH in DCM) aufgereinigt.
Farbloser Feststoff.
Ausbeute: 145 mg (0.29 mmol), 87%.
R_f = 0.31 (2% MeOH in DCM).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 8.01 (s, 1H, NH), 7.75 (d, ³J = 7.3 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.58 (d, ³J = 7.4 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.40 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.31 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 5.82–5.71 (m, 1H, CH=CH₂), 5.14 (dd, ²J = 1.4 Hz, ³J = 17.2 Hz, 1H, CH=CHa), 5.05 (dd, ²J = 1.4 Hz, ³J = 10.4 Hz, 1H, CH=CHb), 4.77 (m, 1H, Asp-α-H), 4.44 (m, 2H, Fmoc-CH₂), 4.22 (t, ³J = 7.2 Hz, 1H, Fmoc-CH), 3.88 (d, ³J = 4.7 Hz, 2H, Gly-CH₂), 3.83 (t, ³J = 5.5 Hz, 2H, CH ₂-CH=CH₂), 2.57 (dd, ²J = 6.7 Hz, ³J = 17.2 Hz, 2H, Asp-CH₂), 1.40 (s, 9H, tBu).
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 171.6, 170.1, 169.1 (3 CH₂-C=O), 162.8 (NH-C=O), 143.9, 141.5 (4 Fmoc-ar-C), 133.9 (CH=CH₂), 127.9, 127.3, 125.2, 120.2 (8 Fmoc-ar-C), 116.4 (CH=CH₂), 82.2 (C-(CH₃)₃), 67.7 (Fmoc-CH₂), 49.5 (Gly-α-C), 47.3, 42.2 (Asp-α-C, CH₂-CH=CH₂), 36.8, 31.7 (Asp-CH₂, Fmoc-CH), 28.2 (C-(CH₃)₃).
C₂₈H₃₃N₃O₆ (507.24).
Die Fmoc-Gruppe wurde wie unter Beispiel 9 beschrieben abgespalten.
Beispiel 11:N-Fluorenmethyloxycarbonyl-[tyrosyl-O-(N',N''-Phosporsäurebisdimethylamido)]-glycyl-[asparaginsäure(O-tert-butyl)]allylamid (zu 158)
Zu einer Lösung von 0.29 mmol (1 Äq) Gly-Asp(OtBu)-allylamid in 3 ml abs. DMF wurden nacheinander 169 mg (0.32 mmol, 1.1 Äq) Fmoc-pTyr[(NMe₂)₂]-OH, 48 mg (0.32 mmol, 1.1 Äq) HOBt, 110 μl (0.63 mmol, 2.2 Äq) DIPEA und 164 mg (0.32 mmol, 1.1 Äq) PyBOP hinzugefügt. Nach 12 h Rühren wurde die Mischung i. Vak. konzentriert und das Produkt säulenchromatographisch (Laufmittelgradient 3% MeOH in DCM, dann 6% MeOH in DCM) aufgereinigt.
Farbloser Feststoff.
Ausbeute: 205 mg (0.25 mmol), 86%.
R_f = 0.45 (4% MeOH in DCM).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 7.73 (d, ³J = 7.2 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.53 (d, ³J = 7.4 Hz, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.36 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.28 (m, 2H, 2 Fmoc-ar-H), 7.15–7.01 (m, 4H, 4 Tyr-ar-H), 5.83–5.73 (m, 1H, CH=CH₂), 5.14 (m, 1H, CH=CHa), 5.04 (m, 1H, CH=CHb); 4.75 (m, 1H, Asp-α-H), 4.44–4.38 (m, 3H, Fmoc-CH₂, pTyr-α-H), 4.17 (t,³J = 7.1 Hz, 1H, Fmoc-CH), 3.94–3.72 (m, 4H, Gly-CH₂, CH ₂-CH=CH₂), 3.10–2.94 (m, 2H, pTyr-CH₂), 2.71–2.62 (m, 14H, P[N(CH₃)₂]₂, Asp-CH₂), 1.40 (s, 9H, tBu).
³¹P-NMR (162 MHz, CDCl₃): δ = 17.2 (P[N(CH₃)₂]₂).
C₄₁H₅₃N₆O₉P (804.36).
Die Fmoc-Gruppe wurde wie unter Beispiel 9 beschrieben abgespalten.
Beispiel 12: N-tert-Butyloxycarbonyl-leucyl-[tyrosyl-O-(N',N''-Phosporsäurebisdimethylamido)]-glycyl-[asparaginsäure(O-tert-butyl)]allylamid (zu 158)
Zu einer Lösung von 79 mg (0.32 mmol, 1.3 Äq) Boc-Leu-OH in 2 ml DMF/DCM = 1:1 wurden nacheinander 48 mg (0.32 mmol, 1.3 Äq) HOBt, 110 μl (0.63 mmol, 2.6 Äq) DIPEA und 120 mg (0.32 mmol, 1.3 Äq) HBTU hinzu gegeben. Nach 10 min Rühren wurde die Mischung zu 0.25 mmol (1 Äq) pTyr[(NMe₂)₂]-Gly-Asp(OtBu)-allylamid gelöst in 1 ml DMF/DCM = 1:1 gegeben. Nach 12.5 h Rühren wurde die Mischung i. Vak. konzentriert und der Rest danach wieder in 20 ml DCM aufgenommen. Die Lösung wurde mit 20 ml ges. NaHCO₃-Lösung und anschließend mit 20 ml 1 M HCl-Lösung extrahiert, die Phasen getrennt, die organische Phase über MgSO₄ getrocknet und i. Vak. eingeengt.
C₃₇H₆₂N₇O₁₀P (795.43).

ESI-MS: ber.: 818.4 [M + Na]⁺

gef.: 818.5 [M + Na]⁺, 662.7 [M – 2 tBu + Na]⁺
Beispiel 13: Leucyl-phosphotyrosyl-glycyl-asparaginsäureallylamid (158)
Das Rohprodukt wurde 3 h in 2 ml TFA/DCM/TES = 95:2.5:2.5 gerührt und dann wurden 2 ml Wasser hinzugefügt. Nach 13 h wurde dreimal mit je 20 ml Toluol koevaporiert, der Rest in 20 ml Wasser aufgenommen und mit 20 ml DCM extrahiert. Die wässrige Phase wurde i. Vak. konzentriert, das Rohprodukt in wenig MeOH gelöst und durch Zugabe von viel Et₂O wieder ausgefällt. Abfiltrieren und im HV trocknen lieferte einen weißen Feststoff.
Rohausbeute: 90 mg.
Die Substanz wurde durch präparative HPLC (C18, Gradient: 3 min 5% B, dann innerhalb von 12 min auf 60 % B und nach weiteren 3 min auf 100%, die 2 min gehalten werden) aufgereinigt.

Ausbeute: Fraktion 1: 30 mg (0.05 mmol), 20% (sauberes Produkt);

Fraktion 2: 29 mg (gering verunreinigtes Produkt).

HPLC (C18): t_r = 4.94 min (Standardgradient).

[α]_D ²⁰ = +8.65° (c = 1, H₂O).
Schmp.: 171 °C.
¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ = 7.20 (d, ³J = 8.4 Hz, 2H, Tyr-ar-H meta zum O), 7.13 (d, ³J = 8.6 Hz, 2H, Tyr-ar-H ortho zum O), 5.86–5.76 (m, 1H, CH-CH₂), 5.18 (m, 1H, CH=CHa), 5.07 (m, 1H, CH=CHb), 4.76 (t, ³J = 6.8 Hz, 1H, Asp-α-H), 4.47 (dd, ²J = 6.5 Hz, ³J = 9.0 Hz, 1H, pTyr-α-H), 3.99 (d, ³J = 16.8 Hz, 1H, Gly-CHa), 3.86 (t, ³J = 6.8 Hz, 1H, Leu-α-CH), 3.79 (d, ³J = 5.3 Hz, 2H, CH ₂-CH=CH₂), 3.66 (d, ³J = 16.8 Hz, 1H, Gly-CHb), 3.15 (dd, ²J = 6.3 Hz, ³J = 14.1 Hz, 1H, pTyr-CHa), 3.01 (dd, ²J = 9.0 Hz, ³J = 13.9 Hz, 1H, pTyr-CHb), 2.88 (dd, ^zJ = 6.3 Hz, ³J = 16.8 Hz, 1H, Asp-CHa), 2.77 (dd, ²J = 7.2 Hz, ³J = 16.8 Hz, 1H, Asp-CHb), 1.66 (m, 3H, CH ₂-CH-(CH₃)₂), 0.97 (t, ³J = 5.6 Hz, 6H, CH-(CH ₃)₂).
¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD): δ = 172.9, 172.5, 171.5, 170.2, 170.1 (5 C=O), 151.9 (pTyr-ar-C am O), 133.9 (CH=CH₂), 132.8 (pTyr-ar-C an CH₂), 130.1 (2 pTyr-ar-C meta zum O), 120.3 (2 pTyr-ar-C ortho zum O), 115.1 (CH=CH₂), 56.0, 51.7 (pTyr-α-C, Leu-α-C), 50.1 (Gly-α-C), 42.5, 41.7 (Asp-α-C, CH₂-CH=CH₂), 40.4 (Leu-CH₂), 36.0, 35.8 (Asp-CH₂, pTyr-CH₂), 24.1 (C-(CH₃)₂), 22.1, 20.6 (C-(CH₃)₂).
³¹P-NMR (162 MHz, CD₃OD): δ = –3.9.
C₂₄H₃₆N₅O₁₀P (585.22).

FAB-HR: ber.: 586.2273 [M + H]⁺

gef.: 586.2253 [M + H]⁺
Beispiel 14: Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Thiol-Funktionalisierung von Oberflächen
Fünf Carbonsäure-funktionalisierte Glas- oder Siliciumträger wurden auf einem Teflonhalter in ein hohes, schlankes Schlenk-Gefäß mit Rührmagneten gegeben, wobei auf Sauberkeit des Gefäßes sowie der Oberflächen geachtet wurde. Wegen ihrer geringen Dicke mussten die Siliciumwafer zusätzlich mit Deckgläsern an ihrer unfunktionalisierbaren Seite im Teflonhalter festgesteckt werden. Das Schlenk-Gefäß wurde 10 min am HV angeschlossen und anschließend mit Argon gespült. Dann wurden 58 ml abs. DMF hinzugegeben, die Mischung in einem Eisbad auf 0°C gekühlt und danach mit 40 mg (2.5 mM, 0.5 mM pro Träger) DCC versetzt und bei mittlerer Geschwindigkeit gerührt. Nach 15 min wurden 41 mg (3.0 mM Lösung, 0.6 mM pro Träger) Cystamindihydrochlorid, die in 1 ml abs. DMF und einem Tropfen H₂O zusammen mit 59.5 μl (6.0 mM Lösung, 1.2 mM pro Träger) DIPEA gelöst worden waren, hinzu gegeben. Das Gefäß, in dem diese Lösung angesetzt worden war, wurde mit 1 ml abs. DMF gespült und dieses dann zu den Trägern gegeben. Die Träger wurden mindestens 14 h in der Reaktionslösung gerührt, wobei die Mischung sich auf rt erwärmte. Die Reaktionslösung wurde mittels einer Spritze mit dicker, langer Kanüle entfernt, die Träger mit DMF im Gefäß gespült, das DMF wieder entfernt und anschließend wurden die Träger 30 min in 80 ml DMF/H₂O = 3:1 (v/v) wie beschrieben gerührt. Sowohl bei der Reaktion als auch bei dem Waschvorgang müssen alle Träger mit Flüssigkeit bedeckt sein. Die Flüssigkeit wurde wieder entfernt, die Träger nacheinander mit DMF und H₂O gespült und im Schlenk-Gefäß am HV getrocknet.
Nach mindestens 5 h Trocknung wurden unter Argon 60 ml abs. DMF, 230 mg (25 mM Lösung, 5 mM pro Träger) DTT und 104 μl (12.5 mM Lösung, 2.5 mM pro Träger) TEA zu den Trägern gegeben. Die Lösung wurde durch drei Zyklen Vakuum/Argon nochmals entgast und mindestens 16 h unter Argon gerührt. Die Reaktionslösung wurde entfernt, die Träger mit abs. DMF im Gefäß gespült, das DMF wieder entfernt und anschließend wurden die Träger 15 min in 60 ml abs. DMF gerührt. Das DMF wurde entfernt, die Träger mit abs. DCM gespült und 60 ml abs. DCM hinzugefügt. Alle Waschvorgänge wurden unter Argon durchgeführt. Nach 15 min Rühren wurde das DCM entfernt, die Träger mit abs. DCM nochmals gespült, im HV getrocknet und unter Argon aufbewahrt.
Beispiel 15: Allgemeine Arbeitsvorschrift zum Hand-Bespotten Thiol-funktionalisierter Glasträger
In ein weites Becherglas mit Teflonhaltern (zwei pro Glasträger) wurde DMF gegeben, bis die Teflonhalter bis zur Hälfte in DMF standen. Dann wurde das Becherglas mit einem größeren abgedeckt und durch eine kleine Öffnung Argon durch das DMF geblubbert. Für die Bespottung mit dem Handspotter wurden in eine 384 well Mikrotiterplatte pro Spot 40 μl der entsprechenden Lösung vorgelegt, die Nadeln des Handspotters dort eingetaucht und dann die Tröpfchen auf dem Glasträger abgesetzt. Bei der Bespottung durch Eppendorfpipetten wurden in einem gewünschten Muster 0.5 μl Tröpfchen abgesetzt. Das Durchblubbern mit Argon wurde beendet und das zweite, größere Becherglas entfernt. Direkt nach der Bespottung wurden die Glasträger auf jeweils zwei Teflonhalter in das Becherglas gelegt. Die UV-Lampe wurde ca. 10 cm über dem Becherglas mit den Glasträgern angebracht. Nach dem Belichten wurden die Glasträger mit DMF gespült, dann 30 min in DMF/H₂O = 2:1 in einer slide-Box geschüttelt, wieder mit DMF und H₂O gespült und im HV getrocknet.
Beispiel 16:Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Photoimmobilisierung durch eine Maske oder ein Lasermikroskop auf Glasträgern
Auf einen Thiol-modifizierten Glasträger wurden drei 25 μl (1.0 × 1.0 cm, AB-0576) Rahmen der Firma ABGene, Surrey, UK, aufgebracht. Es wurde die entsprechenden Lösung im Dunkeln in die Rahmen gefüllt und anschließend wurde der Glasträger entweder in die Maske hineingelegt und von oben durch die geschlossene Maske mit der ca. 10 cm entfernten UV-Lampe oder auf einem Lasermikroskop durch ein Objektiv von unten belichtet. Danach wurde der Glasträger sofort intensiv mit DMF und H₂O gespült und am HV getrocknet.
Einstellungen der Laser-Belichtung:
Slow scan,
40er Objektiv extra long working distance,
Scanwiederholung: 100,
Größe der belichteten Quadrate: 512 × 512 pixel = 338.4 μm² (0.661 μm = 1 Pixel),
Laserpower: 100% bei 728 nm ca. 150–200 mW (zwei Photonen-Anregung ergab theor. 364 nm).
Beispiel 17: Allgemeine Arbeitsvorschrift zu Photolithografie-Experimenten auf Siliciumwafern
Auf Thiol-funktionalisierte Siliciumwafer wurden 400 μl der entsprechenden Lösung aufgegeben. Die Lösung wurde durch Zentifugation gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt. Das Programm zur Zentrifugation lautete:
Nach der Auftragung wurde der Siliciumwafer 10 min unter Stickstoffstrom im Spin-Coater zum Trocknen gelassen. Dann wurde mit variabler Dauer belichtet. Nach der Belichtung wurde mit dem gleichen Zentrifugationsprogramm gewaschen:

Für jeden Waschschritt wurde das Zentrifugationsprogramm einmal durchlaufen. Anschließend wurden die Wafer weiter gewaschen:

Biotin:	– je einmal mit DMF, H₂O und MeOH gespült,
	– in der slide-Box jeweils einmal 30 sec mit
	DMF/H₂O = 1:1 und MeOH geschüttelt,
	– mit MeOH abgespült;
Phosphopeptid:	– je einmal mit DMF, TETBS und MeOH gespült,
	– in der slide-Box jeweils einmal 30 sec mit DMF,
	TETBS sowie MeOH
	geschüttelt,
	– mit MeOH abgespült;
Streptavidin:	– je einmal mit TETBS und H₂O gespült,
	– in der slide-Box jeweils einmal 30 sec mit TETBS
	und H₂O geschüttelt,
	– wieder je einmal mit TETBS und H₂O abgespült.

Nach dem Waschprozess wurden die Wafer an der Luft zum Trocknen stehengelassen.
Kurze Beschreibung der Schemata und Figuren:
Schema 1: Synthese der zur Testreaktion benötigten Verbindung 143.
Schema 2: Funktionalisierung von Glasträgern mit Thiolen.
Schema 3: Synthese des Mannoseallylamids 155.
Schema 4: Synthese des Phosphopeptids 158 in Lösung. a: DCM/Diethylamin (4:1); b: Fmoc-Gly-OH, HOBt, DIPEA, HBTU, DMF/DCM (1:1), RT, 20 h; c: Fmoc-pTyr[(NMe₂)₂]-OH, HOBt, DIPEA, PyBOP, DMF, RT, 12 h; d: Boc-Leu-OH, HOBt, DIPEA, HBTU, DMF/DCM (1:1), RT, 12.5 h; e: 1. TFA/DCM/TES (95:2.5:2.5), RT, 3 h, 2. H₂O, RT, 13 h.
1: Reaktionen zur photochemischen Immobilisierung nach Blawas et al.1998.
2: Nachweis der Immobilisierung von Biotinallylamid 143 und Biotinpropylamid 38 auf Thiol-funktionalisierten Oberflächen mit STV-Cy5; Effekte verschiedener Lösungsmittel auf einem Dendrimer- Glasträger;
3: Experiment zur Regenerierung der Oberfläche; A: Nachweis von Biotin 143 durch Bindung von Streptavidin-Cy5; B und C: Stringentes Waschen mit 0.1% SDS-Lösung; D: Erneutes Binden von Streptavidin-Cy5.
4: Nachweis der Anbindung von in einem Konzentrationsgradienten immobilisierten Biotin 143 mit STV-Cy5; A: 3 h bei 365 nm belichteter Glasträger; B: 3 h im Dunkeln verwahrter Glasträger;
C: Histogramm der Signalintensitäten mit /_rel = Fluoreszenzsignalintensität (relative Einheiten),
b. = belichtet und n.b. = nicht belichtet.
5: Nachweis der immobilisierten Mannose 155 mit Concanavalin A (2 μM).
6: Nachweis des Phosphopeptids 158 mit dem biotinylierten anti-pTyr-Antikörper-Streptavidin-Cy5 Konjugat und Histogrammdarstellung der Signalintensitäten.
7: Histogramm der Signalintensitäten der zeitabhängigen Immobilisierung von Phosphopeptid 158.
8: Nachweis von immobilisiertem Biotinallylamid 143 mit Streptavidin-Cy5; Biotin 143 wurde in Konzentrationen von 1 und 10 mM eingesetzt und die Belichtungszeit wurde mit 10 und 30 min variiert. A: 10 mM Biotin 143, 10 min Belichtungszeit; B: 10 mM Biotin 143, 30 min Belichtungszeit; C: 1 mM Biotin 143, 10 min Belichtungszeit; D: 1 mM Biotin 143, 30 min Belichtungszeit.
9: Vergrößerung des oberen Abschnitts von 8A.
10: A: Nachweis von immobilisiertem Streptavidin 161 mit Biotin-Cy5; B: Nachweis von immobilisiertem Streptavidin 162 mit Biotin-Cy5 als Negativkontrolle zu A; C: Nachweis von immobilisiertem Phosphopeptid 158 mit dem Fluoreszenzmarkierten Antikörper-Konjugat; D: Pentensäure funktionalisiertes Streptavidin 161 (schematisch).
11: A: Nachweis von mittels Laserstrahl immobilisiertem Biotinallylamid 143 mit Streptavidin-Cy5; B: Vergrößerung von A; C: Scan dreier Felder im rechten Winkel, nachgewiesen mit Streptavidin-Cy5.
Literatur:

B.T. Houseman, M. Mrksich, Chem. Biol. 2002, 9, 443–454.
A.S. Blawas, W.M. Reichert, Biomaterials 1998, 19, 595–609.
R. Benters, C.M. Niemeyer, D. Wöhrle, ChemBioChem 2001, 2, 686–694.
C.D. Müller et al., Nature 2003, 421,829–833.
R.F. Ismagilov, Angew. Chem. 2003, 115, 4262–4264.
S.P.A. Fodor, R.J. Leighton, M.C. Pirrung, L. Stryer, A.T. Lu, D. Solas, Science 1991, 251, 767–776.
W.S. Dillmore, M.N. Yousaf, M. Mrksich, Langmuir 2004, 20, 7223–7231.

Schema 1:
Schema 2:
Schema 3:
Schema 4:

Claims

Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reaktion zwischen einem Molekül, welches eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe aufweist, und einem Mercaptan ausgeführt wird, wobei einer der beiden Reaktanten auf der Oberfläche immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion eine photochemische Reaktion oder eine Radikal-induzierte Reaktion ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion chemoselektiv abläuft.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mercaptan auf der Oberfläche immobilisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Mercaptan als selbstassemblierte Monoschicht auf der Oberfläche immobilisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Mercaptan ein thiol-funktionalisiertes Dendrimer oder Silan ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit ungesättigter Kohlenwasserstoffgruppe eine terminate Doppelbindung aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche eine Oberfläche ist, die die Reflexion oder Weiterleitung von Licht im Träger minimiert oder verhindert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche aus SiO₂ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche auf einem Träger, insbesondere einem Glasträger oder einem Siliziumwaver, aufgebracht ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion Licht-induziert, insbesondere UV-Licht induziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion unter Verwendung eines Lasers, insbesondere eines Lasermikroskops, induziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion unter Verwendung von optischer Raster-Nahfeldmikroskopie (SNOM) induziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtexposition bzw. Belichtungszeit zur Induktion der photochemischen Reaktion 1 Sekunde bis 30 Minuten beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung strukturiert, bevorzugt mikro- oder nanostrukturiert, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die photochemische Reaktion zur Addition des zweiten Reaktanten nur in solchen Bereichen der Oberfläche stattfindet, die mit Licht bestrahlt werden, oder die Radikal-induzierte Reaktion zur Addition des zweiten Reaktanten nur in solchen Bereichen der Oberfläche stattfindet, die mit Radikalen behandelt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass zur Festlegung von Bereichen in denen eine Reaktion zwischen ungesättigter Kohlenwasserstoffgruppe und Mercaptan erfolgt eine Maske verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass kein Abstand zwischen Maske und Oberfläche vorhanden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Abweichung bei der Addition des zweiten Reaktanten höchstens ± 2 μm bezüglich der Maskenstruktur beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine strukturierte Beschichtung durch selektives Bestrahlen der Oberfläche, insbesondere mittels Laser, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Randunschärfe höchstens ± 1 μm beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass nicht umgesetzter zweiter Reaktant nach der Reaktion von der Oberfläche entfernt wird und das Verfahren wiederholt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche durch die Beschichtung funktionalisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass als zweiter Reaktant eine ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe oder ein Mercaptan eingesetzt wird, welche bzw. welches mit einem ersten Bindepartner eines hochaffinen Bindepaares funktionalisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 24 dadurch gekennzeichnet, dass ein weiterer Reaktant umfassend den zweiten Bindepartner des hochaffinen Bindepaares zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Nanopartikel-Strukturierung verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren automatisiert durchgeführt wird.
Beschichtete Oberfläche erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 27.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung einer Oberfläche, die mit Naturstoffen wie beispielsweise Zucker und Kohlenhydraten, Aminosäuren, Peptiden, Phosphopeptiden, Proteinen, Enzymen, Antikörpern, Lipiden, Nukleotiden, Nukleosiden und Nukleinsäuren, Farbstoffen, radioaktiv markierten Molekülen, Isotopen markierten Molekülen, Monomeren für Polymerisationsreaktionen oder Polymeren, lumineszierenden Molekülen, insbesondere fluoreszierenden Molekülen, Flüssigkristallen elektrolumineszierenden Molekülen und/oder Polymeren, Nanopartikeln, Vesikeln und/oder anorganischen Katalysatoren zumindest teilweise beschichtet ist.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 27 oder 29 zur Herstellung von mikrofluidischen Systemen, LCDs, AM-LCDs, LEDs, OLEDs, dreidimensionalen Strukturen, leitenden Mikrostrukturen, insbesondere für die Halbleiter- und Chiptechnologie, Mikroarrays, und/oder Biochips, insbesondere für das Hochdurchsatz-Screening nach neuen pharmazeutischen Wirkstoffen oder leitenden Mikrostrukturen.