DE102005030986A1

DE102005030986A1 - Rotierende magnetische Nanopartikel

Info

Publication number: DE102005030986A1
Application number: DE200510030986
Authority: DE
Inventors: Ernst Stetter; Martin Friedrich; Martin Dr. Koch
Original assignee: Individual
Current assignee: KOCH, MARTIN, DR., DK
Priority date: 2005-07-02
Filing date: 2005-07-02
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2025-07-03
Also published as: DE102005030986B4

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Erzeugung von überlagerten magnetischen Wechselfeldern in Verbindung mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischen Beads, um diese mit einem entsprechenden Apparat (Steuergerät mit Feldgenerator) gezielt und reversibel in Rotation oder Rotation mit überlagerten Longitudinalbewegungen zu bringen.
Diese Methode läßt sich anwenden bei der Herstellung von Vorrichtungen zur:
Transfektion von Zellen in Kulturen,
gezielten Wirkstofffreisetzung,
Identifizierung von markierten Zellen,
Zerstörung von Thrombosen,
Entfernung arteriosklerotischer Beläge,
Herstellung von speziellen Oberflächenstrukturen,
Herstellung von speziellen Sensoren mit Nanopartikeln,
Herstellung von nanoskalaren Pumpen und Ventilen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung überlagerter magnetischer Wechselstromfelder in Verbindung mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetische Beads, für Vorrichtungen zur Transfektion von Zellen in Kulturen, gezielte Wirkstoffabgabe, Identifizierung von Zellen, Zerstörung von Thrombosen, Entfernung arteriosklerotischer Beläge vom Inneren der Arterie, Herstellung spezieller Oberflächen und Sensoren aus Nanopartikeln sowie auf implantierte Pumpen und Ventile im Nanometerbereich, die von extrakorporalen Energiequellen versorgt werden.

Bekannte Methoden

Systeme zur Isolation von mit magnetischen Beads markierten Zellen sind bereits bekannt. Diese benutzen entweder Zellsortierer (siehe z.B. US 5,837,200 ), die einen relativ geringen Durchsatz aufweisen, oder basieren auf dem Anlegen eines statischen Magnetfeldes, um magnetisch markierte Zellen mittels eines Magneten zurückzuhalten, der ein statisches Magnetfeld erzeugt und der einen Bereich umschließt, in dem es nur nach dem Auswaschen der nicht markierten Zellen und durch Entfernen des Magneten möglich ist, auch die markierten Zellen auszuwaschen (MACS = Magnetically Activated Cell Sorter, kommerziell erhältlich von Miltenyi Biotec).

Systeme, die auch auf DC-Gradienten-Feldern für magnetische Wirkstofffreisetzung am Zielort basieren, werden in folgenden Artikeln erwähnt: Preclinical Experiences with magnetic drug targeting: Tolerance and Efficacy, A.S.Lübbe et al. (Cancer Research 56, 4694–4701, October 15, 1996), Clinical Experiences with Magnetic Drug Targeting: A PHASE 1 Study with 4'-Epidoxorubicin in 14 Patients with Advanced Solid Tumors, A.S.Lübbe et al. (Cancer Research 56, 4686–4693, October 15, 1996) and Drug targeting in Chemotherapy: A clinical perspective, P.K.Gupta (J.Pharm. Sci., 79:949–962.1990), Analytical Magnetapheresis of Ferritin-Labeled Lymphocytes, M.Zborowski et al., Anal.Chem. 67,3702–3712, 1995, Locoregional Cancer Treatment with Magnetic Drug Targeting, C.Alexiou et. Al, (Cancer Research 60, 6641–6648, December 1, 2000)

Interessante neue Systeme für gezielte Gen-Abgabe mittels sehr starker Permanentmagneten sind kürzlich entwickelt worden (The Magnetofection Method: Using Magnetic Force to Enhance Gene Delivery, C.Plank et al. (Biol.Chem., vol.384, pp.737–747, May 2003).

Elektromagnetische Mikromotoren sind bekannt für Motor- und Mikroventil-Anwendungen: Electromagnetic micromotor for microfluidics applications, M.Barbic et al. (Applied Physics Letters, Vol.79, No. 9,2001)

Hintergrund der Erfindung

Starre Nanokristall-Strukturen wie 'Beads' (z.B. magnetische Nanopartikel aus Eisenoxyd -) können in hochdynamische Einheiten transformiert werden, wenn die Drehimpulse der Kristalle permanent geändert werden. Das Phänomen der dauerhaften, reversiblen und kontrollierbaren Bewegung der Kristalle, basiert auf der permanenten Änderung des Drehimpulses (Gerthsen, Physik. S.47).

Besonders effektiv ist es nun, mit von magnetischen Materialkonstanten freien Feldern in die Kristallen zu intervenieren und den Drehimpuls zu ändern. Beispielsweise können Zellen in Suspension oder biologisch wichtige Makromoleküle in Lösung, mit Beads (magnetische Nanopartikel) markiert werden. Dies ermöglicht ihre Verarbeitung, Manipulation und Detektion durch Anlegen eines magnetischen Feldes. Dieses Magnetfeld sollte jedoch dynamisch sein und kein traditionelles DC (statisches) Feld. DC-Felder bilden Feldgradienten nahe der Pole der felderzeugenden Spule oder des felderzeugenden Magneten. Dort werden sich die magnetischen Partikel ansammeln. Sie können aber nicht dreidimensional bewegt werden, was die Voraussetzung für die Verarbeitung markierter Objekte wäre. Die dynamischen magnetischen Felder funktionieren nach der ersten Maxwellgleichung:

wobei der zweite Teil der Summe auf der rechten Seite wegen sehr kleiner Verschiebeströme vernachlässigt werden kann. Dies macht das H-Feld unabhängig von Materialkonstanten, das dem System ermöglicht, in Medien wie Blut, Salzwasser etc. mit nur geringen Verlusten angewendet zu werden.

Diese Anwendung betrifft hauptsächlich Materialien, die magnetisch, vorzugsweise ferromagnetisch sind. Der neue wissenschaftliche Aspekt ist, mit speziellen überlagerten magnetischen Wechselfeldern eine Änderung der Einzel-Drehimpulse auf permanente spezifische Weise durch ein interferierendes Magnetfeld zu erreichen. Dies ergibt eine mikroskopische Aktion die in abgeschlossenen Systemen (Kristallstrukturen wie z.B. magnetische Beads) eine makroskopische Reaktion verursacht (Drehmoment der Beads), die technisch genutzt werden kann.

Die Technik der rotierenden magnetischen Nanopartikel kann für medizinische und biomedizinische Anwendungen eingesetzt werden, wie z.B. bei

1. der Transfektion von Zellen in Kulturen
2. Vorrichtungen zur gezielten Wirkstofffreisetzung
3. der Detektion und Erfassung von markierten Zellen und Zell-Subpopulationen Es ist naheliegend, daß die Technik der rotierenden magnetischen Nanopartikel auch in einem weiten Bereich anderer Anwendungen eingesetzt werden kann, z.B.
4. bei Vorrichtungen zur Zerstörung von Thrombosen
5. bei Vorrichtungen zur Entfernung arteriosklerotischer Beläge vom Inneren der Arterie
6. Herstellung spezieller Oberflächen aus Nanopartikeln
7. Herstellung spezieller Sensoren aus Nanopartikeln
8. bei implantierten nanoskalaren Pumpen und Ventilen, die von extrakorporalen Energiequellen versorgt werden

Bedarf und Relevanz

1. Transfektion

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung überlagerter magnetischer Wechselfelder in Verbindung mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischer Beads, zur Transfektion von Zellen in Kulturen, in welchen DNA-beschichtete Nanobeads als Transfektionshilfsmittel benutzt werden.

Mit den überlagerten Wechselfeldern kann man wie prinzipiell in 2 dargestellt, Abrollbewegungen mit Kleinstpartikeln erreichen. Beispielsweise wird durch die Abrollbewegung von DNA-beschichteten Nano-Beads an Zelloberflächen die Transfektionsrate gesteigert, weil (im Gegensatz zur geradlinigen Bewegung durch starke Dauermagnete) eine Abrollbewegung der Beads die Kontaktwahrscheinlichkeit mit den entsprechenden Rezeptoren der Zelloberfläche wesentlich erhöht.

Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, daß die Transfektion mit DNA-beschichtete Nanobeads effektiver ist als die herkömmliche Transfektionstechnik. Der Bedarf an effizienten Transfektionstechniken steigt wegen der Nachfrage nach effektiven Gentherapie-Techniken. Die Methode der rotierenden magnetischen Nanopartikel bei der Transfektion, ermöglicht die natürliche Einführung (Endozytose) speziell beschichteter Nanopartikel in die Zellen.

2. Vorrichtungen zur gezielten Wirkstofffreisetzung

Die größte Hürde in der Chemotherapie bei Krebsbehandlungen ist es, den Tumor (eine Zellpopulation, die die Fähigkeit verloren hat, ihr Wachstum und ihre Vermehrung zu kontrollieren) gezielt zu zerstören, dabei aber andere Zellpopulationen sich teilender gesunder Zellen des Organsimuses zu erhalten, wie z.B. Knochenmarkzellen.

Die Lenkung des Wirkstoffes direkt in den Tumorbereich, wird es erlauben, nur Zellen mit Fehlfunktion zu zerstören und dabei gesunde Zellen zu erhalten. Obwohl es viele verschiedene Ansätze der gezielten Wirkstofffreisetzung gibt, ist doch keiner so vielversprechend wie die Technik der rotierenden magnetischen Nanopartikel, die es nicht nur erlaubt, den Wirkstoff in den Tumor zu lenken, sondern ihn auch durch die gezielte Feldwirkung in einem begrenzten Bereich wirken zu lassen. Statische Magnetfelder werden bereits zu solchen Zwecken eingesetzt. Der Nachteil dieser statischen Felder ist die hohe und nicht gleichmäßig verteilte Wirkstoffkonzentration die bedingt ist durch konzentrierte Kraftwirkung an den Magnetpolen. Bei der Anwendung dynamischer Felder ist die Verteilung der magnetischen Partikel im Einflussbereich des magnetischen Feldes wesentlich besser.

Die Wirkstoffe können in Paßformen, wie beispielsweise Nanoröhrchen oder porösen Strukturen (Zeolithe) eingebracht werden, um über den Feldgenerator und die Drehbewegung und der damit verbundenen Wirkung der Zentrifugalkraft eine gezielte Wirkstofffreisetzung zu erreichen.

3. Detektion und Erfassung von markierten Zellen und Zell-Subpopulationen

Der wichtige Schritt in der Diagnose verschiedener Krankheiten und pathologischen Stadien ist die Detektion und Abschätzung einer Anzahl verschiedener Zellen und Zell-Subpopulationen (Identifikation von magnetisch markierten Zellen unter der großen Zahl von Zellen in einer Blutprobe – z.B. zur Diagnose von Leukämie). Die Auswahl von Zellen in einer Population von normalen Zellen und die Methode zu ihrer Detektion (kontrollierte Bewegung) ist eine verhältnismäßig preiswerte und schnelle Alternative zu hochentwickelten und teuren Diagnosegeräten, wie sie in Kliniken angewendet werden.

Durch die Verwendung magnetischer Partikel, die mit Antikörpern verbunden sind, die wiederum an den Rezeptoren der Zellen (z.B. Krebszellen) andocken und die Anwendung eines Gerätes, welches dynamisch veränderliche Magnetfelder erzeugen kann, kann der Benutzer leicht die interessanten Zellen detektieren und manipulieren. Damit könnte die Diagnose (im Gegensatz zu bekannten Methoden, wie z.B. Einfärben und/oder Benutzung von Flourochromen) schneller und kostengünstiger werden.

Ferner kann die Subpopulation der markierten Zellen einfach isoliert und auch für andere z. B. biochemische Forschung benutzt werden.

Als Erzeuger der magnetischen Feldstruktur dient ein spezieller Feldgenerator (1). Durch Laborversuche wurde gezeigt, daß es möglich ist, die markierten Zellen mit dem dynamischen magnetischen Feldes zu bewegen. Dies zeigt, daß das Prinzip der Erfindung wirklich anwendbar ist.

Innerhalb der Probe unter dem Mikroskop existiert eine große Zahl unmarkierter Zellen und eine kleinere (abhängig von der Probe auch sehr kleine) Zahl markierter Zellen, markiert mit dem entsprechenden Antikörper und zugehörigen magnetischen Partikeln. Durch die Erzeugung konstanter oder inkonstanter Rotationen der magnetischen Partikeln (Beads) im mathematisch positiven oder negativen Sinn kann eine konstante/inkonstante Rotation der markierten Zellen erreicht werden. Damit können wenige und sogar einzelne markierte Zellen inmitten einer Vielzahl anderer identifiziert werden.

4. Zerstörung von Thrombosen

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung überlagerter magnetischer Wechselfelder in Verbindung mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischer Beads, zur Zerstörung von Thrombosen, wobei mit thrombolytischen Enzymen beschichtete Nanobeads verwendet werden, um die thrombolytischen Enzyme in Kontakt mit dem Thrombus zu bringen und die Beads dann in eine rotierende Bewegung zu versetzen und somit den Thrombus zu zerstören. Eine der Haupttodesursachen in Europa und den USA sind Kreislauferkrankungen und Fehlfunktionen durch Blutgerinnung. Die Formierung von Blutgerinnseln führt zu lokaler Ischämie und als Konsequenz zu Gewebezerstörung. Die gezielte Einwirkung auf die Thrombose ist durch die Anwendung der Technik der rotierenden magnetischen Nanopartikel möglich. Die Nanobeads können mit thrombolytischen Enzymen wie Streptokinase beschichtet und im Bereich des Thrombus konzentriert und rotiert werden. Dies erlaubt dann den Enzymen, besser mit dem Fibrin zu interagieren und das Gerinnsel aufzulösen.

5. Entfernung arteriosklerotischer Beläge vom Inneren der Arterie

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung überlagerter magnetischer Wechselfelder in Verbindung mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischer Beads, zur Entfernung arteriosklerotischer Beläge von den Innenwänden der Arterie, indem Nanobeads in Kontakt mit arteriosklerotischen Belägen gebracht werden und kontrollierte Rotations- und Longitudinalbewegungen der Nanobeads, im Bereich der Beläge generiert werden, als Methode zur Entfernung arteriosklerotischer Beläge vom Inneren der Arterie. Ein weiteres pathologisches Stadium, das zu Kreislaufproblemen führt, ist die Arteriosklerose – das Stadium wenn oxidierte Lipide und Lipoproteine an den Arteriewänden angelagert werden und so die Kavität der Blutgefäße reduzieren, bis hin zum Verschluß. Die Technik der rotierenden magnetischen Nanopartikel kann für die mechanische Entfernung arteriosklerotischer Beläge durch Generierung kontrollierter Bewegungen von Nanobeads oder magnetischer Scheiben im Bereich der Beläge eingesetzt werden.

6. Herstellung spezieller Oberflächen aus Nanopartikeln

Mit der Methode der drehenden magnetischen Nanopartikeln oder speziell beschichteter magnetischer Nanopartikel in Verbindung mit überlagerten magnetischen Wechselfelder, kann man durch die Drehung oder Drehung mit überlagerter Longitudinalbewegung (Abrolleffekt) das Wachstum und den Aufbau spezieller Obertächenstrukturen erreichen.

7. Herstellung spezieller Sensoren aus Nanopartikeln

Spezielle Sensoren (z.B. Biosensoren), vorzugweise in Halbleitertechnik in Kombination mit magnetischen Beads (Hybride Sensoren) können unter Anwendung der Bewegung von magnetischen Beads oder speziell beschichten magnetischen Beads in Verbindung mit speziellen Halbleiterstrukturen (z.B. Feldeffekt-Transistoren), auswertbare messtechnische Signale und Informationen erzeugen.

8. Implantierte nanoskalare Pumpen und Ventile, die von extrakorporalen Energiequellen versorgt werden

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Methode zum Pumpen, Öffnen oder Schließen von winzigen Ventilen, in welchen magnetische Beads in eine Passform wie z.B. Nanoröhrchen eingesetzt und in den Körper implantiert werden, wonach die Nanobeads durch rotierende magnetische Wechselfelder zu Rotations- oder Rotations- und Longitudinalbewegungen angeregt werden, um einen Pumpeffekt oder das Öffnen und Schließen der Nanoröhrchen zu erreichen.

Die Methode verwendet daher implantierte Nanopumpen und -ventile, die von extrakorporalen Energiequellen versorgt werden.

Ein weiterer interessanter therapeutischer Ansatz, der von der Technologie der rotierenden magnetischen Nanopartikel profitieren kann, ist die Technik der Nanomaschinen (mit Größen im Nanometerbereich). Der heutige Stand der Technik sind elektromagnetische Mikromotoren (mit Größen im Mikrometerbereich), die Mikrospulen und Mikrospitzen als Statorelemente sowie einzelne permanentmagnetische Einzeldomänenpartikel als Rotor kombinieren.

In Nanomaschinen können Nanostrukturen (Beads oder Scheiben) in Passformen (z.B. Nanoröhrchen) eingebracht, implantiert und als extrakorporal mit Ernergie versorgte Nanopumpen eingesetzt werden. Die Nanomaschine aus rotierenden magnetischen Nanopartikeln oder -scheiben wird sich auch von molekularen Motoren unterscheiden, da der Nanomotor einfacher zu kontrollieren ist und sich genau in der gewünschten Richtung starten und präzise und gleichmäßig zur benötigten Geschwindigkeit beschleunigen läßt, – das zeichnet ihn als einzigartig aus.

Die Erfindung ermöglicht auch eine Pumpe im Nanobereich zur Implantation in den menschlichen Körper, deren Pumpmechanismus von magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischen Beads und Scheiben, in eine Paßform wie z.B. Nanoröhrchen eingebracht, Gebrauch macht, in Kombination mit Quellen überlagerter magnetischer Wechselfelder und magnetischer Beads mit Beschichtung von DNA oder mit Beschichtung von thrombolytischen Enzymen.

Solche Nanopumpen und magnetische Beads sind geeignet zur Anwendung der Erfindung und um die Methoden der Erfindung zu realisieren.

Erzeugung einer Rotationsbewegung von magnetischen Beads durch überlagerte magnetische Wechselfelder.
Auf einem Objektträger wurden 300 nm große Beads (gemischt mit destilliertem Wasser) unter einem hochauflösenden Lichtmikroskop beobachtet (siehe 3). Der in 1 und 2 dargestellte Feldgenerator wurde senkrecht (parallel zum Objektträger) auf dem Mikroskoptisch plaziert.
Unter dem Einfluß der magnetischen überlagerten Wechselfelder, konnte man eindeutig das Rotieren der magnetischen Beads beobachten.
Bei höheren Feldstärken ist auch eine zusätzliche Longitudinalbewegung der rotierenden Beads zu registrieren. Die Drehgeschwindigkeit ist durch die Frequenz und die Drehrichtung durch die Überlagerungsfolge der Wechselfelder am Steuergerät (Frequenzumrichter) einstellbar.
Aufbau der Vorrichtung zur Generierung der überlagerten magnetischen Wechselfelder ist bereits in dem Patent PCT/DK95/00025 WO 95/19217 beschrieben.

Claims

Die Verwendung überlagerter magnetischer Wechselfelder in Verbindung mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischen Beads, zur Transfektion von Zellen in Kulturen, wobei DNA-beschichtete Nanobeads mittels Abrollbewegung als Transfektionshilfsmittel eingesetzt werden.
Vorrichtungen für die Generierung überlagerter magnetischer Wechselfelder in Verbindung mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischen Beads, für die Zerstörung von Thrombosen, wobei mit thrombolytischen Enzymen beschichtete Nanobeads benutzt werden, um die thrombolytischen Enzyme in Kontakt mit dem Fibrin der Thrombosen bringen und die Beads dann in eine rotierende Bewegung zu versetzen.
Verfahren zur Identifizierung, Zählung und Selektierung von Zellen in Kulturen, wobei magnetische Beads, vorzugsweise ferromagnetische Beads, mit Antikörpern verbunden zur Zellkultur gegeben werden und nach Kontaktierung mit den Zellen mittels überlagerter magnetischer Wechselfelder angeregt werden wonach die Menge der mit Antikörpern gebundenen Zellen bestimmt wird.
Vorrichtungen zur Entfernung arteriosklerotischer Beläge von den Innenwänden der Arterie, wobei magnetische Beads, vorzugsweise ferromagnetische Beads oder Scheiben, mit den arteriosklerotischen Belägen in Kontakt gebracht werden, wonach die Nanobeads mittels überlagerter magnetischer Wechselfelder, die von der Vorrichtung erzeugt werden und die rotierende oder rotierende und longitudinale Bewegungen erzeugen, angeregt werden.
Vorrichtungen die überlagerte magnetische Wechselfelder erzeugen die mit magnetischen Beads, vorzugsweise ferromagnetischen Beads, wobei Nanobeads in Kombination mit Paßformen die den Wirkstoff enthalten, wie beispielsweise Nanoröhrchen oder porösen Strukturen (Zeolithe) eingesetzt werden, angeregt werden um über die Drehbewegung eine gezielte Wirkstofffreisetzung zu erreichen.
Eine Vorrichtung zum Pumpen oder Öffnen und Schließen von Ventilen, wobei magnetische Beads, vorzugsweise ferromagnetische Beads oder Scheiben, die in eine Paßform, wie beispielsweise Nanoröhrchen eingebracht und in den Körper implantiert werden, wonach die Nanobeads mittels überlagerter magnetischer Wechselfelder, die rotierende oder rotierende und longitudinale Bewegungen erzeugen, angeregt werden, um einen Pumpeffekt oder das Öffnen und Schließen der Nanoröhrchen zu erreichen.
Verfahren zum Pumpen oder Öffnen und Schließen mit nanoskalaren Pumpen oder Ventilen, wobei magnetische Beads, vorzugsweise ferromagnetische Beads oder Scheiben, die in eine Paßform, wie beispielsweise Nanoröhrchen eingebracht werden, wonach die Nanobeads mittels überlagerter magnetischer Wechselfelder, die rotierende, oder rotierende und longitudinale Bewegungen erzeugen, angeregt werden, um einen Pumpeffekt oder das Öffnen und Schließen der Nanoröhrchen zu erreichen.
Verfahren mit drehenden magnetischen Nanopartikel oder speziell beschichteter magnetischer Nanopartikel in Verbindung mit überlagerten magnetischen Wechselfelder zum Aufbau spezieller Oberfächenstrukturen.
Verfahren mit drehenden magnetischen Nanopartikel oder speziell beschichteter magnetischer Nanopartikel in Verbindung mit überlagerten magnetischen Wechselfelder zum Aufbau spezieller Sensoren.
Magnetische Beads, vorzugsweise ferromagnetische Beads, die mit einem Überzug aus DNA oder mit einem Überzug aus thrombolytischen Enzymen versehen sind.