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Die
vorliegende Erfindung beschreibt maßgeblich vier Verfahrensschritte
(Klonierung, Generierung heterologer DNA-Einzelstränge, Hybridisierung und Ligation),
die in ihrer Kombination zu klonierungsfähigen, spontan selbstorganisierenden
Halte-Strukturen ("Stem-Loops") an Standardplasmiden führen. Diese
Strukturen sind in der Lage das funktionalisierte Plasmid, über eine
einzelsträngige Loop-Sequenz, ortsaufgelöst an Oberflächen zu
immobilisieren.
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In
der Nanobiotechnologie oder Molekularbiotechnologie werden unter
anderem Biomoleküle, wie
Nukleinsäuren
oder Proteine oder Teile dieser Moleküle, in vielfältiger Weise
genutzt. So können
in inzwischen etablierten Analyseverfahren Analyte in Form von Peptiden
oder kurzen Nukleinsäuremolekülen an Glasoberflächen (Biochips)
ortsaufgelöst immobilisiert
werden, um an ihnen intermolekulare Kinetiken mit entsprechenden
Liganden in Form von Antikörpern
oder DNA-Sonden zu beobachten bzw. auszuwerten (Peptid- oder DNA-Microarrays,
Expressionsanalysen).
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Längere DNA-Moleküle, deren
Nukleotidsequenz bekannt ist, können
als Struktur dienen, wenn man sie beispielsweise gerichtet auf einer
Glasoberfläche
immobilisiert. Einzelne kleinere Sequenzbereiche können so
ortsaufgelöst
adressiert werden.
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Die
Bindung all dieser Nukleinsäuren,
wie auch der o. g. Proteine bzw. Peptide auf diesen Biochip-Glasoberflächen, erfolgt
in der Regel über
endständige
Modifikationen, die während
der Synthese an diese Moleküle
angefügt
wurden. Hierbei werden über
eine Wechselwirkung mit einem auf der Chipoberfläche befindlichen Reaktionspartner
affine oder kovalente Kopplungen erzeugt.
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Bei
komplexeren DNA-Molekülen,
wie Plasmiden, lässt
sich eine, wie zuvor beschriebene Modifikation, die sich für eine Immobilisierung
dieses Moleküls
eignet, nur mit sehr großem
Aufwand bewerkstelligen und stellt ein einmaliges Ereignis für jedes einzelne
Plasmid dar, d. h. diese Modifikation geht nach einer Transfektion
des entsprechenden Plasmids mit einer anschließender Klonierung verloren. Um
die einzelnen Funktionen bzw. die Komplexität als Solches von Plasmiden
in-vitro auf Biochip-Oberflächen zu
erhalten, können
diese nicht unspezifisch an Oberflächen gekoppelt werden, sondern
müssen gezielt
und an bestimmten Stellen immobilisiert sein. Nur so ist gewährleistet,
dass beispielsweise Enzymwechselwirkungen ungehindert ablaufen können. Auch
das Quasi-Fixieren in Gelen oder Polymermatrizes ist den einzelnen
Funktionen von Plasmiden abträglich,
da Reaktionen durch eine erhöhte
Viskosität bzw.
eine verlangsamte Diffusion erheblich eingeschränkt sind.
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Im
Folgenden wird eine Verfahren beschrieben, wie Plasmide, durch Einfügen neuer
bestimmter Sequenzabschnitte, auf diese Weise als Matritze für eine Polymerase
dienen können,
die in einer isothermalen, linearen und stetigen Vervielfältigung
einen Einzelstrang in Form eines Konkatamers (aneinandergekettete
Einzelmoleküle)
generiert, das dann in den entsprechenden Sequenzabschnitten (s.
o.) klonierbare, selbstorganisierende Halte-Strukturen ("Stem-Loop"-Strukturen) ausbildet.
In einer analogen Polymerasereaktion an einem homologen aber unmodifizierten
Plasmid als Matritze wird der komplementäre Gegenstrang erzeugt, der
nach Hybridisierung mit dem erstgenannten Molekül die neuen Plasmide, zunächst noch
als Konkatamere, zum linearen Doppelstrang, vervollständigt und
gleichzeitig die "Stem-Loop"-Struktur stabilisiert.
Nach einer Verdauung der Konkatamere (vor oder nach der Hybridisierung
der Einzelstränge)
mit spezifischen Restriktionsendonukleasen in Einzelmoleküle, können diese zu
zirkulären, "Stem-Loop"-tragenden Ankerplasmiden
ligiert werden.
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Standardplasmide
werden in der Art modifiziert, dass sie in der Lage sind, spontan
zwei sich gegenüberliegende
Stem-Loop-Strukturen
auszubilden (Doppel-Ankerplasmide). Diese Stem-Loop-Strukturen ermöglichen zum Einen die Immobilisierung
der Plasmide an einer mit zur Loop-Sequenz komplementären Oligonukleotid-modifizierten
Chipoberfläche,
als auch die spezifische Detektion dieser Plasmide als Kontrollfunktion
der diskreten örtlichen
Fixierung auf der Chipoberfläche
mittels zur zweiten Loop-Sequenz komplementärer Sonden. Die modifizierten
Plasmide werden, nachdem sie mit einem beliebigen zu untersuchenden
Gen ligiert wurden, dem unten beschriebenen Verfahren aus heterolog
linearer "Rolling-Circle-Amplifikation" und Hybridisierung der
heterologen Einzelstränge,
mit anschließender Ligation
unterzogen. Die im Plasmidgenom intergrierte Stem-Loop-Funktionalität ermöglicht die
ortsgebundene Immobilisierung der Plasmide ohne weitere aufwendige
Verfahren, wie etwa einer Biotinylierung. Diese Plasmide sind in
ihrer Funktion uneingeschränkt.
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Funktionalisierte Plasmide
(Ankerplasmide)
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Konstruktion
von immobilisierbaren Plasmiden (Ankerplasmide) mit Hilfe eines
klonierten, teilweise palindromischen Inserts zur Ausprägung von sogenannten
Stem-Loop-Strukturen.
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a) Konstruktion der Oligonukleotide
als Bausteine für ein
doppelsträngiges
DNA-Insert mit dem Potential, eine Stem-Loop-Struktur auszubilden.
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Um
zu vermeiden, dass die palindromischen Oligonukleotid-Moleküle für den Bau
des doppelsträngigen
DNA-Inserts bereits vor der Klonierung mit sich selbst hybridisieren
können,
werden zunächst
4 Teil-Oligonukleotide hergestellt:
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Oligonukleotid
1 besteht, abgelesen in 5'-3'-Richtung, aus einem
Teilbereich (geschnitten) einer Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonukleasen
(I), gefolgt von einer variierten repetitiven Sequenz, die als Komplement
einen Teilbereich der Stem-Loop-Struktur darstellt (II), gefolgt
von einer Erkennungsstelle für
eine Restriktionsendonuklease (III), gefolgt von einer repetitiven
Sequenz, die die einzelsträngige
Schleife der Stem-Loop-Struktur darstellt (IV) und einem Teilbereich
einer Erkennungsstelle für
eine Restriktionsendonuklease (V)(s. Beispiel 1). Die Triphosphate,
insbesondere der repetitiven Bereiche werden so gewählt, dass
keine interne Hybridisierung des Moleküls auf Grund komplementärer Abschnitte
erfolgen kann. Zudem stehen die Basen G und C der repetitiven palindromischen
Sequenz in einem speziell ausgewogenen Verhältnis, das eine Kontrollsequenzierung
des Klonierungserfolges zulässt
(keine langen "Stretches").
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Oligonukleotid
2 ist komplementär
zu Oligonukleotid 1 und besteht, abgelesen in 5'-3'-Richtung des
Molekülsinns,
aus einer repetitiven Sequenz, die die Hälfte der Schleifensequenz von
Oligonukleotid 1 umfasst (i), gefolgt von einer Erkennungsstelle
für eine
Restriktionsendonuklease (ii), gefolgt von einer variierten repetitiven
Sequenz, die als Komplement einen Teilbereich der Stem-Loop-Struktur
darstellt (iv), gefolgt von einem Teilbereich einer Restriktions-Endonukleasen-Erkennungsstelle
(v)- s. Beispiel 2.
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Oligonukleotid
3 besteht, abgelesen in 5'-3'-Richtung des Molekülsinns,
aus einem Teilbereich einer Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease
(A), gefolgt von einer variierten repetitiven Sequenz, die als Komplement
einen Teilbereich der Stem-Loop-Struktur darstellt (B), gefolgt
von einem Teilbereich einer Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease
(C)- s. Beispiel 3.
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Oligonukleotid
4 ist komplementär
zu Oligonukleotid 3 und besteht, abgelesen in 5'-3'-Richtung des
Molekülsinns,
aus einem Teilbereich einer Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuklease
(a), gefolgt von einer variierten repetitiven Sequenz, die als Komplement
einen Teilbereich der Stem-Loop-Struktur darstellt (b), gefolgt
von einer Erkennungsstelle für
eine Restriktionsendonuklease (c), gefolgt von einer repetitiven
Sequenz, die die einzelsträngige
Schleife der Stem-Loop-Struktur darstellt (d) – siehe Beispiel 4.
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b) Konstruktion eines
teilweise palindromischen Inserts mit Schleifensequenz aus oben
beschriebenen Oligonukleotiden
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Um
die Konstruktion des Stem-Loop-Inserts abzuschließen, werden
die Oligonukleotide 1 und 2 zu einem doppelsträngigen Molekül hybridisiert;
der gleichen Prozedur werden die beiden Oligonukleotide 3 und 4
unterzogen. Die beiden Oligonukleotide 2 und 3 sind an ihren 5'-Enden phosphoryliert,
um die nun folgende Ligation der beiden doppelsträngigen Teil-Moleküle aus 1
und 2 bzw. 3 und 4 zum kompletten Insert zu ermöglichen; die beiden Oligonukleotide 1
und 4 sind nicht am 5'-Ende
phosphoriliert, um zu verhindern, dass zwei Teilinserts des selben
Typs an den Klonierungsstellen, die für die spätere Klonierung in das Plasmid
benötigt
werden, ligieren. Bei der endgültigen
Klonierung des kompletten Inserts in das Plasmid genügen die
Phosphate an den offenen Schnittstellen des Vektors. Die langen
3'-Überhänge der
doppelsträngigen
Ligationspartner erlauben, neben den Standard-Protokollen, eine
stringente und zuverlässige
Ligation bei Temperaturen > 30 °C mit thermostabilen
Ligasen. Das fertig ligierte Insert weist nun 2 die Loop-Sequenz
flankierende Restriktionsschnittstellen auf, die es ermöglichen,
diese Loop-Sequenz, später,
im ligierten Plasmid auszutauschen.
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Insertkonstrukt mit o.
g. Beispiel-Oligonukleotiden
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Das
Insert kann hier über
die Restriktionsschnittstellen Kpn I und Sal I gerichtet in ein
Plasmid kloniert werden (s. Beispiel 5).
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Bei
der Konstruktion der zugrundeliegenden Oligonukleotide (siehe a))
werden die letztgenannten Erkennungssequenzen der Restriktions-Endonukleasen
entsprechend berücksichtigt,
d. h. diese werden zuvor bei der Linearisierung des Ursprungsplasmides
eliminiert, bzw. sind nicht vorhanden, um die Einmaligkeit der Schnittstellen
zu wahren. Die endgültige
gerichtete Ligation in ein entsprechend linearisiertes Plasmid erfolgt
nach Standard-Protokollen. Hierfür
werden konventionelle gentechnische Sicherheits-Plasmide aus bakteriellen,
Hefe- oder eukaryontischen Zellen in ihrer Multicloning-Site über einen Restriktionsverdau
mit zwei unterschiedlichen Restriktions-Endonukleasen linearisiert,
um das Insert gerichtet hinein zu ligieren. Der Doppelverdau des
Plasmids erleichtert zudem die Klonierung, da eine Religation der
linearisierten Plasmide verhindert wird.
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c) Konstruktion der Doppel-Stem-Loop-Plasmide
aus 2 aneinanderligierten, wie unter b) beschriebenen "Stem-Loop-Plasmiden"
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Analog
der unter b) beschriebenen Methode wird ein zweites Stem-Loop-Plasmid
(B) erzeugt, mit dem Unterschied, dass im mittleren Bereich des
Inserts (Loop-Sequenz) der GT-Repeat des ersten Stem-Loop-Plasmids
(A, siehe b)) im Sense-Strang durch ein gleich langen GA-Repeat
ersetzt wird sowie im komplementären
Bereich der CA-Repeat durch einen CT-Repeat.
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Beide
Stem-Loop-Plasmide werden nach folgendem Schema ligiert (s. 1).
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Drei
benachbarte Restriktionsschnittstellen der Multicloning-Site der Plasmide
werden in der Form verwendet, dass Plasmid A über den Verdau der Schnittstellen
1 und 2 linearisiert wird, Plasmid B über die Schnittstellen 2 und
3, wobei bei einem der beiden Plasmide die Multicloning-Site dabei
bestmöglich
entfernt wird. Hierdurch wird die Einmaligkeit einer gewissen Anzahl
von Restriktionsschnittstellen in dem neuen "Doppelplasmid" gewährleistet
(beachte: spätere
Klonierung zu exprimierender Gene).
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Die
erste Ligation erfolgt jeweils an den beiden Schnittstellen 2 der
beiden Plasmide. Die zyklisierende Ligation erfolgt mit Hilfe eines
Linkers (2 hybridisierte komplementäre Oligonukleotide, die durch entsprechende
Konstruktion als kurzer Doppelstrang an seinen Enden eine Schnittstelle
1 und 3 anbietet). Nur die A-B-Ligationsprodukte lassen sich über den Linker
zyklisieren. Bei zwei ligierten Plasmiden des gleichen Typs fehlt
jeweils eine zum Linker passende Schnittstelle. Zusätzlich kann
die erfolgreiche Ligation des heterogenen Doppel-Stem-Loop-Plasmids (C) über die
Schnittstellen a und b bzw. alle nur noch einfach vorhandenen Schnittstellen
(s. o.) überprüft werden.
Das Doppel-Plasmid lässt
sich durch einen Restriktionsverdau an a oder b linearisieren. Diese Konstruktion
gewährleistet
die maximale Entfernung der beiden Stem-Loop-Sequenzen (X) an sich
gegenüberliegenden
Seiten.
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d) Gewinnung und Isolation
von Stem-Loop-tragenden Plasmiden
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- d.1) Die, wie beschrieben, durch Ligation veränderten
Plasmide können
für verschiedene
Transfektionsexperimente nach Standard-Protokollen in entsprechende
Wirtszellen transformiert und vermehrt werden (Klonierung).
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Nach
einer Ligation mit einem spezifischen Zielgen werden diese rekombinanten
Plasmide in entsprechend großen
und verwertbaren Molaritäten über NaOH-Denaturierung
in einzelsträngige DNA-Moleküle getrennt
und in diesem Zustand durch Vakuumtrocknung konserviert. Ein unverändertes
Ursprungs-Plasmid, in das das gleiche Zielgen kloniert wurde (ohne
o. g. Stem-Loop-Insert), wird auf die gleiche Art denaturiert und
parallel zu dem Stem-Loop-Plasmid weiterverarbeitet.
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Diese
trockene DNA beider Plasmide wird in einem im Folgenden beschriebenen
Reaktionsansatz resuspendiert und selektiv linear vermehrt:
Es
erfolgt ein Annealing mit nur einem Primer (Standard-Primer des
entsprechenden Plasmids) an den NaOH-denaturierten Einzelsträngen, mit
anschließender
Synthese des DNA-Gegenstranges.
Hierbei wird eine Polymerase eingesetzt, die über eine sogn. Strand-Displacement-Aktivität verfügt (Bsp.:
rBst-Polymerase, Vent-Polymerase, rTth-Polymerase, phi29- Polymerase). Dadurch
wird am zirkulären Plasmid
ein lineares einzelsträngiges
Konkatamer des Gegenstranges synthetisiert. Ein komplementäres Oligonukleotid "CC" (CC = complementary
cutter), das über
eine entsprechend gewählte
Restriktionsschnittstelle hybridisiert und so an der Stelle eine (s.
u.) doppelsträngige
Restriktionsschnittstelle erzeugt, ermöglicht die Generierung linearer
Einzelstränge
des ursprünglichen
Matrizenplasmids aus dem vorliegenden synthetisierten Konkatamer.
In den meisten Fällen
erfolgt ein Restriktionsverdau an den entsprechenden Schnittstellen
auch ohne CC, da doppelsträngige
Schnittstellen auch dadurch erzeugt werden, dass sich homologe Schnittstellensequenzen
(Palindrome) aus benachbarten Molekülen des Konkatamereinzelstrangs
komplementär
anlagern (hybridisieren). Dabei entsteht eine kurze, doppelsträngige Erkennungssequenz
für eine
Restriktionsendonuklease und es kann dann dort mit dem passenden
Restriktionsenzym geschnitten werden.
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In
einem weiteren Reaktionsansatz werden die aus dem o. g. Konkatamer
durch Restriktion erzeugten, linearen Stem-Loop-Plasmid-Einzelstränge mit den auf gleiche Weise
aus unveränderten
Ursprungsplasmiden unter Verwendung des Gegenprimers generierten
linearen und zu den Stem-Loop-Molekülen komplementären Einzelsträngen in
gleichen Molaritäten
vereinigt (1:1) und nach einer 3-minütigen Erwärmung des Reaktionsansatzes
auf 98 °C
kontrolliert abgekühlt
und dabei hybridisiert. Während
des Abkühlvorganges
bildet sich die Stem-Loop-Struktur spontan aus, insbesondere auf Grund
der räumlichen
Nähe der
palindromischen Sequenzabschnitte. Das doppelsträngige Stem-Loop-Molekül wird schließlich auch
dadurch stabilisiert, dass das Molekül mit dem komplementären Einzelstrang,
dem der Sequenzabschnitt für
den Stem-Loop fehlt, hybridisiert. Mit der erzeugten Schnittstelle
aus dem CC-Oligobereich (s. o.), ist das doppelsträngige Molekül an beiden
Enden für
eine interne Ligation des Einzelmoleküls vorbereitet. Diese erfolgt über die
nun gleichartigen offenen Schnittstellen an den Molekülenden.
Um die möglicher
Weise die Ligation störenden
CC-Oligo-Fragmente, die sich noch aus der o. g. Restriktion an den
Enden der Einzelstränge
befinden können
(nach Verwendung), zu eliminieren, wird vorzugsweise mit einer thermostabilen
Ligase gearbeitet.
- d.2) Die unter d.1) beschriebenen Stem-Loop-Plasmide
können
auch in einem zweiten, alternativen Reaktionsansatz generiert werden.
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Die
rekombinant erzeugten Doppel-Stem-Loop-Plasmide (siehe c)) werden
in ausreichenden Mengen (ca. 1–5 μg) linearisiert.
Das homologe Doppel-Plasmid ohne die Stem-Loop-Sequenzen wird in
gleicher Menge mit der gleichen Restriktionsendonuklease linearisiert.
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Beide
Ansätze
werden in gleichen Molaritäten
vereinigt (1:1) und nach einer 3-minütigen Erwärmung des Reaktionsansatzes
auf 98 °C
kontrolliert abgekühlt
und dabei re-hybridisiert. Während
des Abkühlvorganges
bildet sich die Stem-Loop-Struktur spontan aus, insbesondere auf
Grund der räumlichen Nähe der palindromischen
Sequenzabschnitte. Das doppelsträngige
Stem-Loop-Molekül wird schließlich auch
dadurch stabilisiert, dass der eben genannte Einzelstrang mit dem
komplementären
Einzelstrang, dem der Sequenzabschnitt für den Stem-Loop fehlt, hybridisiert.
Insgesamt entstehen drei bzw. vier Zustände aus den zuvor Hitze-denaturierten
linearen Plasmidmolekülen:
Die
beiden ursprünglichen
Formen, d. h. die Doppelplasmide jeweils mit oder ohne die zusätzliche Stem-Loop-Sequenz
und Mischformen aus einem Stem-Loop-Einzelstrangmolekül und einem
komplementären
Einzelstrangmolekül
aus dem unveränderten
Ursprungsplasmid. Dies ist nur eine Alternative, da hier die Selektion
des gewünschten
Doppel-Stem-Loop-Plasmids aus dem eben beschriebenen Gemenge einen
zusätzlichen
Aufwand benötigt.
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Die
bevorzugte Methode zur Erzeugung von Doppel-Stem-Loop-Plasmiden ist unter
d.1) beschrieben.
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Die
neue Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass durch die beschrieben
Arbeitsweise Sequenzabschnitte kloniert werden können, die ein Potential zur
Stem-Loop-Bildung besitzen. Desweiteren kennzeichnet diese Erfindung
die spontane Selbstorganisation eben dieser Stem-Loop-Strukturen
mit Hilfe des natürlicher
Weise vorkommenden Vorgangs der linearen "Rolling-Circle-Amplifikation, die mit
einer Polymerase durchgeführt
wird, die eine sogenannte Strand-Displacement-Aktivität besitzt. Dadurch kann nach
der ersten kompletten Synthese eines zirkulären Nukleinsäuremoleküls, das
5'-Ende des anfänglich eingesetzten
Primers abgelöst
werden und durch mehrfaches Umrunden der Matrizen-DNA ein vielfaches
des ursprünglichen
Plasmid-Moleküls
linear in einem einzelsträngigen
Konkatamer amplifiziert werden, das die Stem-Loop-Strukturen spontan ausbildet.
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Ein
weiteres Kennzeichen dieser Erfindung ist die homologe Synthese
des komplementären
Gegenstranges zu dem zuvor erzeugten einzelsträngigen Stem-Loop-Nukleinsäure-Konkatamers,
zum Zwecke der Stabilisierung des Moleküls in ein doppelsträngiges Stem-Loop-DNA-Molekül. Hierbei kann
sowohl das Urprungsplasmid (ohne Stem-Loop-Sequenz), als auch ein
geeignetes andersartiges Stem-Loop-Plasmid Verwendung finden, was
dazu führt
das nur einer der beiden Moleküle
des Doppelstranges oder beide eine Stem-Loop-Struktur tragen. Schließlich ist
die Erzeugung funktionsfähiger Stem-Loop-tragender, immobilisierbarer
und spezifisch detektierbarer Plasmide (Ankerplasmide) als Folge
der vorangegangenen Verfahrensschritte und nach einer Ligation von
doppelsträngigen
Einzelmolekülen,
die aus komplementären
einzelsträngigen Plasmidsequenz-Konkatameren
oder heterologen linearisierten rekombinanten Plasmiden erzeugt
wurden, das Hauptalleinstellungsmerkmal dieser Erfindung.
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Die
in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren erzeugen sowohl
einzelsträngige Konkatamere
von Plasmid-DNA mit spontan selbstorganisierenden Stem-Loop-Strukturen,
als auch nach Restriktion bzw. Hybridisierung Stem-Loop-tragende
einzelsträngige
Einzelmoleküle
bzw. entsprechende Doppelstränge.
Daraus können
nach einer Ligation bzw. Religation Stem-Loop-tragende Plasmide
erzeugt werden. Diese sind absolut neu und bisher in keiner Weise
beschrieben. Diese Plasmide können
ohne weitere aufwendige chemische Veränderungen an ihren "mitgebrachten" Haltestrukturen (Stem-Loops, s. o.) immobilisiert
werden. Die Plasmide besitzen ihre volle Funktionalität und sind
dadurch geeignet auf Biochips oder anderen Oberflächen in-vitro-Experimente
an ihnen druchzuführen.
Diese immobilisierten Plasmide eröffnen die Möglichkeit ortsaufgelöst auf einem
Biochip Transfektionen durchzuführen.
Der nach einer Internalisierung des Plasmids in eine Zelle herausragende
Stem-Loop ist in seinem Stem-Bereich hinreichen lang, um durch die
Zellmembran hindurch zu reichen. Zudem eröffnen die Vorstufen dieser
Plasmide, wie die einzelsträngigen
Stem-Loop-Konkatamere eine ganze Reihe von Möglichkeiten Nukleinsäurestrukturen
auf Oberflächen
zu realisieren. Über
die Loop-Sequenzen können
nach entsprechender Auswahl komplementärer Abschnitte unterschiedliche
Moleküle
auf vielfältige
Weise miteinander verknüpft
werden.