DE102005023748A1 - Verwendung der Peptide HNP 1-3 als Marker für den Nachweis von malignen Lymphomen, insbesondere von kutanen T-Zell Lymphomen aus Blut - Google Patents

Abstract

Aufgabe der Erfindung war es, Lymphome, insbesondere kutane T-Zell-Lymphome, mit hoher Sensitivität und Spezifität frühzeitig, aufwandgering und schnell nachzuweisen. DOLLAR A Überraschend wurde gefunden, dass sich für einen solchen Nachweis die an sich als Marker für aktivierte entzündliche Prozesse sowie für kolorektale Karzinome bekannten Peptide HNP1-3 eignen, indem diese über ein Antikörper-basierendes Nachweisverfahren aus Blut erkannt werden. DOLLAR A Die Erfindung erscheint insbesondere in der klinischen Routineuntersuchung von Patienten zur Früherkennung und Prognosedifferenzierung maligner Lymphome als prädestiniert.

Description

• Die Erfindung betrifft die Verwendung der Peptide HNP1-3, die an sich der Fachwelt als Marker für mikrobiell verursachte entzündliche Prozesse und als Marker für kolorektale Karzinome bekannt sind, zum Nachweis von Lymphomen, insbesondere kutaner T-Zell Lymphome (cutaneous T-cell lymphoma; CTCL) im Blut. Ein solcher nichtinvasiver Nachweis wäre vorteilhaft in der klinischen Routineuntersuchung von Patienten zur Früherkennung und Prognosedifferenzierung von Lymphomen anwendbar.
• Die malignen Lymphome sind Neoplasien (Gewebsneubildungen) des lymphatischen Systems. Sie werden in zwei Gruppen eingeteilt:
• a) Hodgkin-Lymphom und
• b) Non-Hodgkin-Lymphome (NHL).
• Dabei sind die lymphatischen Organe (Lymphknoten, Milz) betroffen. Alle malignen Lymphome können sich über das lymphatische System ausbreiten. Extralymphatische Organe (meist Leber und Knochenmark) werden durch unmittelbare Tumorinfiltration des benachbarten Gewebes von einem erkrankten Lymphknoten aus oder in fortgeschrittenen Stadien über die Blutbahn (hämatogen) befallen. Non-Hodgkin-Lymphome können daneben auch in der Haut (z. B. kutane T-Zell-Lymphome) entstehen.
• Die Mehrzahl der kutanen Lymphome sind T-Zell Lymphome. Mehr als 90 % der T-Zell Lymphome werden durch die Mycosis fungoides (MF) und das Sézary Syndrome (SS) repräsentiert. Kutane T-Zell Lymphome (CTCL) des MF-Typs entwickeln sich im mittleren Alter mit einer z. Z. ansteigenden Inzidenz von 0,4/100.000 Patienten/Jahr in den USA (Weinstock M. A.: Epidemiology of Mycosis-Fungoides, Seminars in Dermatology 1994, 13, 154-159). Die Prognose hängt hauptsächlich vom Stadium und der Schwere der Involvierung der Haut und von dem Lympknotenstatus ab. Zu Beginn der Erkrankung ist eine histologische Diagnose schwierig. Das 10-Jahre-Überleben bei Patienten im sog. Tumorstadium T3 und T4 liegt statistisch bei 40 %. Zu diesem Zeitpunkt ist eine klare Prognose für einen individuellen Fall nicht möglich (Foss F.: Overview of cutaneous T-cell lymphoma: Prognostic factors and novel therapeutic approaches, Leukemia & Lymphoma 2003, 44, 55-61).
• Trotz großer Anstrengungen gibt es bisher nur sehr wenige relevante Tumormarker für die Früherkennung von Neoplasien allgemein (van't Veer L. J., Dai H. Y., van de Vijver M. J., He Y. D. D., Hart A. A. M., Mao M., Peterse H. L., van der Kooy K., Marton M. J., Witteveen A. T., Schreiber G. J., Kerkhoven R. M., Roberts C., Linsley P. S., Bernards R., Friend S. H.: Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer, Nature 2002, 415, 530-536; Pritzker K. P. H.: Cancer biomarkers: Easier said than done, Clinical Chemistry 2002, 48, 1147-1150).
• Auch ein spezifischer Tumormarker für CTCL fehlt, obgleich die Zunahme der Laktatdehydrogenase (LDH) mit einer schlechteren Prognose einhergeht (Diamandidou E., Colome M., Fayad L., Duvic M., Kurzrock R.: Prognostic factor analysis in mycosis fungoides/Sezary syndrome, Journal of the American Academy of Dermatology 1999, 40, 914-924).
• Ein Markerkandidat ist Neopterin, das die Aktivierung der zellulären Immunantwort anzeigt (Hamerlinck F. F. V, Toonstra J., van Vloten W. A.: Increased serum neopterin levels in mycosis fungoides and Sezary syndrome, British Journal of Dermatology 1999, 141, 1136-1137). Neopterine sind bei Patienten mit höhren CTCL-Satdien erhöht. Ein anderer Kandidat ist die alpha-Kette vom IL-2R (sIL-2R). Seine Konzentration ist bei fortgeschrittenen Tumorstadien des CTCL erhöht (Hassel J. C., Meier R., Joller-Jemelka H., Burg G., Dummer R.: Serological immunomarkers in cutaneous T cell lymphoma, Dermatology 2004, 209, 296-300).
• Die durch Lymphome verursachte Mortalität ist wesentlich auf die zu späte Diagnosestellung der Tumorerkrankung zurückzuführen. Bislang verfügbare Tumormarker weisen für eine Früherkennung eine nicht ausreichende Sensitivität auf.
• Trotz der bisher bekannten molekularen Veränderungen gilt es als sicher, dass an der Entstehung von Lymphomen weitere molekulare Mechanismen beteiligt sein müssen, welche die Existenz verschiedenster biologischer Merkmale der Tumorzellen und das unterschiedliche klinische Verhalten individueller Lymphome Tumoren erklären können (Knudson A. G.: Hereditary cancer: two hits revisited, J Cancer Res Clin Oncol 1996, 122, 135-140).
• Für die Erkennung von Lymphomen, insbesondere von CTCL eignen sich insbesondere Blutproben (Serum und andere Blutbestandteile).
• Alpha-Defensine sind Peptide mit der Größe von ca. 3,5 kDa, die über sechs Cysteinreste drei Disulfidbrücken ausbilden. Die humanen Neutrophilen-Defensine (HNP-1, -2, -3) werden in neutrophilen Granulozyten und möglicherweise auch in intestinalen Epithelzellen sowie auch anderen Blutbestandteilen exprimiert (Ogawa H., Fukushima K., Sasaki I., Matsuno S.: Identification of genes involved in mucosal defense and inflammation associated with normal enteric bacteria, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2000, 279, G492-G499; Cunliffe R. N., Kamal M., Rose F. R, James P. D., Mahida Y. R:. Expression of antimicrobial neutrophil defensins in epithelial cells of active inflammatory bowel disease mucosa, J Clin Pathol 2002, 55, 298-304).
• HNP 1-3 wurden auch als Serummarker für kolorektale Karzinome vorgestellt (Albrethsen J., Bogebo R., Gammeltoft S., Olsen J., Winther B., Raskov H.: Upregulated expression of human neutrophil peptides 1, 2 and 3 (HNP 1-3) in colon cancer serum and tumours: a biomarker study, BMC Cancer 2005 Jan 19, 5(1), 8 oder WO 2004/090550 A2. Darüber hinaus sind Anwendungen dieser Peptide als Marker, insbesondere zur Erkennung von Lymphomen, in der Literatur nicht beschrieben oder anderweitig in der Fachwelt bekannt geworden.
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Lymphome, insbesondere kutane T-Zell Lymphome, frühzeitig sowie mit hoher Sensitivität und Spezifität im Serum und anderer Blutbestandteile von Betroffenen nachzuweisen und damit ein möglichst aufwandgeringes Screeningverfahren mit kurzer Auswertezeit zur Früherkennung von Lymphomen zu etablieren.
• Überraschend hat sich gezeigt, dass die Peptide HNP1-3, die an sich als Marker für aktivierte entzündliche Prozesse und Marker für kolorektale Karzinome identifiziert wurden und ausschließlich in diesem Zusammenhang der Fachwelt bekannt sind, in Lymphomen, insbesondere in CTCL exprimiert und ins Serum des Patienten abgegeben werden. Wie speziell gefunden wurde, ist der Marker beim Nachweis über etablierte immunologische Verfahren über einen Antikörper (z. B. ELISA) in Serum und andere Blutbestandteilen von gesunden Kontrollpersonen kaum detektierbar, wohingegen bei Lymphompatienten ein hoher Serumspiegel nachweisbar ist. (Sensitivität und Spezifität größer als 95 %). Der Nachweis mittels ELISA stellt ein robustes Verfahren dar, womit eine sichere Anwendung in der klinischen Routinediagnostik möglich wird. Weiterhin kann der Nachweis massenspektrometrisch geführt werden. Das Ergebnis dieses Nachweises liegt bereits innerhalb von 8 Stunden vor. Zur Untersuchung können Blutserum, Blutplasma oder auch andere Blutbestandteile, wie mononukleäre Zellen, herangezogen werden.
• Die Erfindung soll nachstehend anhand eines Antikörpers gegen die Peptide HNP1-3 als Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
• Die zu untersuchenden Seren oder andere Blutbestandteile werden wie folgt mit einem ELISA-Kit quantifiziert:
  Das Serum wird verdünnt und auf eine mit einem Antikörper gegen HNP1-3 beschichtete Mikrotiterplatte pipettiert. HNP1-3 im Serum bindet dabei an den Antikörper. Nach Waschen, um nicht gebundene Proteine zu entfernen, wird ein Tracer (biotinylierter Antikörper) dazugegeben. Wenn HNP1-3 an den ersten Antikörper gebunden hat, kann der Tracer binden (Sandwich aus Antikörper-Antigen-Tracer). Nach dem Waschen wird ein Streptavidin-Peroxidase-Konjugat zugegeben, das mit dem Biotin des Tracers reagiert. Nach nochmaligem Waschen wird Tetramethylbenzidin (TMB) zugegeben, welches mit der Peroxidase proportional zur Menge von HNP1-3 reagiert. Die Reaktion wird mit Zitronensäure gestoppt und die Intensität der Färbung wird bei 450 nm im Spektralphotometer gemessen. Über ein synthetisches Peptid, das parallel in verschiedenen definierten Konzentrationen gemessen wird, wird eine Standardkurve erstellt, über die eine Quantifizierung der HNP1-3 Konzentration der Proben möglich wird.

Claims (8)

1. Verwendung der Peptide HNP 1-3 als Marker für den Nachweis von malignen Lymphomen, insbesondere von kutanen T-Zell Lymphomen aus Blut.
2. Verfahren zur Verwendung der Peptide HNP1-3 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker mit einem immunologischen Verfahren nachgewiesen wird.
3. Verfahren zur Verwendung der Peptide HNP1-3 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker mit einem massenspektrometrischen Verfahren nachgewiesen wird.
4. Verfahren zur Verwendung des Peptide HNP1-3 gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis mit farbmarkierten Antikörpern und mittels enzymatischer Farbreaktion erfolgt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass für den Nachweis fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet werden.
6. Verfahren zur Verwendung der Peptide HNP1-3 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für den Nachweis Blutserum genutzt wird.
7. Verfahren zur Verwendung der Peptide HNP1-3 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für den Nachweis Blutplasma genutzt wird.
8. Verfahren zur Verwendung der Peptide HNP1-3 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für den Nachweis andere Blutbestandteile, wie mononukleäre Zellen herangezogen werden.