Technisches
Problem der Erfindung
Es
ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Gewinnung menschlicher Stammzellen zu schaffen, bei dem einerseits
auf sichere Art und Weise die Stammzellen gewonnen, konserviert
und gelagert werden können
und andererseits das Problem der Infektion und/oder Kontamination
verringert oder ausgeschlossen wird. Dies wird unter anderem dadurch
sichergestellt, dass von der Entnahme des Blutes bis zur Einlagerung
ein Qualitätssicherungsstandard
befolgt und durchgeführt
wird. Ferner wird für
die erforderliche Separation der Stammzellen aus dem Vollblut ein
geschlossenes System beschrieben, welches sicherstellt, dass ein Kontaminationsrisiko
ausgeschlossen werden kann. Die Separation in einem geschlossenen
System ist ein wesentlicher Schritt bei der Herstellung für eine aseptische
Bearbeitung.
Dadurch,
dass einzelne Verfahrensschritte des Bereitstellens von Spendermaterial,
der Entnahme von Stammzellen, der Separation der Stammzellen, der
Konservierung der Stammzellen und deren Lagerung oder die Gesamtheit
des Verfahrens erfindungsgemäss
entweder in einer sterilen Raumeinheit und nach einer standardisierten
Methode, mit genauer Dokumentation und Kontrolle der einzelnen Verfahrensschritte
sowie mit vorgegebenen Materialen durchgeführt werden, ergibt sich der
Vorteil, dass in all den Fällen,
in denen in Kliniken, Labors, sonstigen Anlagen oder Orten, in denen
Sauberkeit und/oder Keimfreiheit nicht gewährleistet ist, dieses Problem einfach
dadurch gelöst
wird, dass die Gewinnung, Konservierung und Lagerung durch die Durchführung dieser
Verfahrensschritte in einer sterilen Raumeinheit und nach einer
standardisierten Methode, mit genauer Dokumentation und Kontrolle
der einzelnen Verfahrensschritte sowie mit vorgegebenen Materialen
durchgeführt
werden, sodass sich der Vorteil ergibt, dass beispielsweise für eine Entnahme und
Gewinnung der Stammzellen unter wenig hygienischen Bedingungen,
die Keimfreiheit oder Sterilität und
die Wiederverwendung der Stammzellen gewährleistet ist. Ein weiterer
Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sich der zeitliche
und damit auch der finanzielle Aufwand bei der Gewinnung der Stammzellen
signifikant reduziert.
Hintergrund
der Erfindung und Stand der Technik
Morphologisch
und funktionell unterscheidbare Zellen zirkulieren im Blut wie z.B.
Erythrozyten, neutrophile, eosinophile, basophile Granulozyten,
B-, T-, nicht B-, nicht T-Lymphozyten,
und Blutplättchen oder
Thrombozyten. Diese differenzierten Zellen stammen von und werden
ersetzt von zur Zellteilung fähigen
Vorläufer-
oder Stammzellen einer bestimmten Zellinie wie Erythroblasten für die Erythrozyten-Linie,
Myeloblasten, Promyelocyten und Myelocyten für die Granulocyten-Linie und
Megakaryocyten für
die Blutplättchen.
Diese Vorläufer-
oder Stamm- oder Precursorzellen stammen von undifferenzierten,
omni- oder pluripotenten Zellen ab, die vereinfachend in zwei Hauptgruppen
unterteilt werden können:
Stammzellen und Vorläuferzellen
(Übersicht
bei Broxmeyer, H. E., 1983, "Colony
Assays of Hematopoietic Progenitor Cells and Correlations to Clinical
Situations," CRC
Critical Reviews in Oncology/Hematology 1(3):227–257). Die Definition von Stamm-
und Vorläuferzellen
sind operational und hängen
eher von funktionellen Parametern ab, als von morphologischen Kriterien.
Stammzellen haben eine hohe Selbsterneuerungs- oder Selbsterhaltungskapazität (Lajtha,
L. G., 1979, Differentialion 14:23). Dies ist eine biologische Notwendigkeit,
da Abwesenheit oder Verringerung dieser Zellen in einem teilweisen
oder vollständigen
Verlust einer oder mehrerer der Zellinien resultieren würde. Dieser
wiederum führt
innerhalb kurzer Zeit zu Krankheit oder Tod. Einige dieser Stammzellen
differenzieren sich nur unter bestimmten Verhältnissen, wenn der Organismus
sie braucht, andere Stammzellen oder deren Tochterzellen produzieren
andere Stammzellen, um den Pool dieser wertvollen Zellen aufrecht
zu erhalten. Pluripotente Stammzellen sind nicht nur in der Lage
ihre eigene Art zu erhalten, sondern zusätzlich noch fähig, sich
in verschiedene Sublinien der Vorläuferzellen zu differenzieren,
die eine begrenzte Selbsterneuerungs- oder Selbsterhaltungskapazität besitzen.
Verfahren
zur Züchtung
von Vorläuferzellen sind
bekannt aus der Offenlegungsschrift
DE 44 22 667 A1 . Methoden zur Gewinnung und
Herstellung von Stammzellen werden in den Offenlegungsschriften
DE 101 62 080 A1 und
DE 101 46 371 A1 beschrieben.
Die WO 00 38762 offenbart ein Verfahren zur Isolierung von hämatopoetischen
Stammzellen.
Bedarf
an humanen hämatopoetischen
Vorläuferzellen,
besteht vor allem im Hinblick auf die Transplantation solcher Zellen
bei der Behandlung von Krebs- und AIDS-Patienten. Eine weitere Anwendung
einer solchen Transplantation ist die Behandlung von chronischen
Anämien,
bei denen die Reifung der Erythrozyten gestört ist, z. B. Thalassämien und
andere genetisch bedingte Anämien.
Die
Stammzellen, die nach dem hier geschilderten Verfahren gewonnen
werden eignen sich besonders zur späteren Transplantation auf den
Spender, auch autologe Transplantation genannt.
Grundzüge der Erfindung
und bevorzugte Ausführungsformen
Stammzellen
können
aus dem Blut, bevorzugterweise aus dem Nabelschnurblut, sie werden dann
auch CB-Stammzellen genannt, oder dem Plazentarestblut gewonnen
werden. Hierzu wird nach der Entbindung des Kindes eine ausreichende
Menge Blutes z. B. aus der Nabelschnurvene entnommen.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemässen
Verfahrens sieht vor, dass die Entnahme mit einem Entnahmeset durchgeführt wird
wie sie z.B. die Firma Biosafe S.A: bereitstellt wird. Das Entnahmeset
beinhaltet unter anderem einen Blutbeutel mit einer Kanüle, mit
der das Blut aus der Nabelschnurvene nach der Entbindung des Kindes
entnommen wird.
Eine
Blutprobe der Mutter und/oder das entnommene Blut werden zur Untersuchung
ins Labor weitergeleitet. Die Untersuchungen können z.B. eine CD34-Zählung, einen
Vitalitätstest,
oder eine Untersuchung auf Infektionen umfassen.
Bevorzugterweise
finden die Schritte zur Vorbereitung auf die Gefrierkonservierung
auch Kryokonservierung genannt, unter sterilen oder keimfreien Bedingungen
statt. Dies können
sterile Räume oder
entsprechende Laborbänke
sein.
Insbesondere
die Schritte vor und nach der Separation der Stammzellen aus dem
Blut werden bevorzugterweise unter sterilen oder keimfreien Bedingungen
durchgeführt.
Das
entnommene Blut wird zur Vorbereitung auf die Separation der Zellen
vorbereitet indem die Nabelschnurblutmenge ermittelt und die HES-Lösung (Hydro
Ethyl Sarch) hinzudosiert wird.
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemässen
Verfahrens wird nach dem Zentrifugen-Prinzip der Buffy-Coat von
dem Blutplasma und dem Erythrozytenkonzentrat getrennt. In dem Separator
wird das Separations-Kit mit den entsprechenden Schläuchen, Ventilen
und Beuteln installiert. Das Separations-Kit ist in sich geschlossen
und steril. Nach dem Zentrifugieren des Nabelschnurblutes sind die
entsprechenden Bestandteile des Blutes getrennt. Mittels Druck werden
die einzelnen Separationsbestandteile in die vorgesehenen Beutel
geleitet. Die Steuerung des Programms ist innerhalb der Programmsteuerung
des Separators fest hinterlegt. Der Bediener wählt das entsprechende Programm
aus und der Prozess der Separation läuft vollautomatisch ab. Die
Steuerung der einzelnen Ventilhähne
vom Separations-Kit übernimmt
ebenfalls die vollautomatische Steuerung. Nachdem das Separationsprogramm
beendet ist wird die Dokumentation des Separationsablaufes auf dem
am Separator angeschlossenen Drucker ausgedruckt.
Das
aus dem Separationsvorgang resultierende Endprodukt (Buffy-Coat)
wird manuell oder bevorzugt automatisch in den Kryobeutel geleitet.
Das Blutplasma und das Erythrozytenkonzentrat werden zur Sterilitätskontrolle
weitergeleitet. Von dem Buffy-Coat Produkt wird eine Probe zur CD34-Zählung und
zum Vitalitätstest
genommen. Der Kryobeutel oder auch Buffy-Coat Beutel für die Lagerung
von Blutstammzellen ist aus Material gefertigt, welches es erlaubt
den Beutel bei den entsprechenden Temperaturen (bis zu –196°Celsius)
zu lagern.
Die
benötigte
Gefrierlösung
(Dimethylsulfoxyd (DMSO) – Lösung) wird
hinzudosiert, wobei der zu befüllende
Buffy-Coat Beutel mit seinem Inhalt während der Zugabezeit auf einem
Mischer verweilt. Nach Beendigung der Zugabe wird eine Probe vom Endprodukt
zur Sterilitätsprüfung genommen.
Der
im Cryobeutel befindliche Buffy-Coat wird eingefroren, dies geschieht
vorzugsweise mittels eines Einfrierautomaten. Mit dem Einfrierautomaten
werden die im BC-Beutel befindlichen Blutstammzellen mit der Gefrierlösung zur
Langzeitlagerung eingefroren. Hierzu werden die BC-Beutel in die Kammer
des Einfrierautomaten nach einem Beladungsschema positioniert. An
der Steuerung des Einfrierautomaten wird das benötigte Einfrierprogramm angewählt und
gestartet. Das Einfrierprogramm läuft vollautomatisch ab und
der Temperaturverlauf des Einfriervorgangs wird dokumentiert (Chargendokumentation).
Als Einfriermedium wird Stickstoff verwendet, welches über ein
Ventil in die Einfrierkammer einströmt.
Die
eingefrorenen Blutstammzellen werden vor der Langzeitlagerung auf
Quarantäne
gelagert, bis alle Untersuchungen des Blutes der Mutter als auch
der Probe des Kindesblutes abgeschlossen sind.
Anschliessend
werden sie der Langzeitlagerung überführt. In
einem Kryo-Lagerbehälter
werden die eingefrorenen BC-Beutel zur Langzeitlagerung aufbewahrt.
Hierzu lagern die BC-Beutel
in der Gasphase vom flüssigen
Stickstoff. Der flüssige
Stickstoff wird in Stickstoff-Flaschen
angeliefert und über
das Dosierventil mit dem Kryo-Lagerbehälter angeschlossen. Eine Füllstandsregelung übernimmt
die Nachdosierung vom flüssigen
Stickstoff in den Kryo-Lagerbehälter. Im
Kryo-Lagerbehälter
befinden sich Racks mit gekennzeichneten Fächern, in dem die BC-Beutel
gelagert werden.
Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemässen
Verfahrens wird ab der Blutentnahme jeder weitere Verfahrensschritt
in einem Protokoll dokumentiert. Dieses kann personenbezogene Daten über die
Eltern, die Mutter oder Daten über
die Geburt selber oder medizinische Parameter zum Gesundheits- und
Allgemeinzustand der Mutter oder des Kindes enthalten. Insbesondere
können
die Parameter der Aufbereitung des Blutes, der Trennung (Separation)
der Zellen, des Einfrierprozesses, der Lagerung oder des Transportes
des Blutes oder einzelner Komponenten dokumentiert werden sowie
andere Untersuchungsergebnisse.
Bevorzugterweise
wird bei jeder Charge, unter einer Charge wird eine individuelle
Blutentnahme oder eine individuelle Gewinnung oder Trennung von Stammzellen
verstanden, ein Herstellungsprotokoll angelegt, welches die Charge
bis zu ihrer Wiederverwendung begleitet.
Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemässen
Verfahrens wird im folgenden beschrieben.
Es
wird aus der Nabelschnur des Kindes oder der Plazenta das Blut entnommen.
Vorzugsweise geschieht dies mit einem Entnahmeset. Dieses beinhaltet
unter anderem einen Blutbeutel mit einer Kanüle, mit der das Blut aus der
Nabelschnurvene nach der Entbindung des Kindes entnommen wird.
In
einem weiteren Schritt wird der Blutbeutel einer visuellen Kontrolle
auf seinen Zustand unterworfen. Insbesondere wird der Blutbeutel
auf Koagulate untersucht und die Temperatur kontrolliert.
Die
Blutprobe der Mutter wird gemäss
eines Untersuchungsprofils untersucht, insbesondere auf Infektionsmarker
gemäss
den Richtlinien zur Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut, CB=Cord
Blood, Dt. Ärzteblatt
96 Heft 19, 14. Mai 1999, Untersuchung auf:
HBs-Ag, Anti-HBc-IgG,
Anti-HCV, Anti-HIV 1/2, Anti-HTLV I/II, Anti-Treponema, GPT, Anti-CMV-IgG
und Anti-CMV-IgM. Bei positivem Ergebnis ist beim CB-Präparat mittels
einer PCR zu überprüfen, ob eine
CMV-Virämie
vorliegt.
In
einem nächsten
Schritt wird das mit Nabelschnurblut gefüllte Schlauchstück wie folgt
behandelt:
Das in dem Blutbeutel befindliche Nabelschnurblut wird
durch die Betätigung
der Hand so bearbeitet, dass sich das Blut indem an dem Blutbeutel
befindlichen Schlauch sammelt. Mit der Schweißzange wird das 1. Stück vom Beutelschlauch
(ca.2cm) abgeschweißt.
Mit der Schweißzange
wird das 2. Stück vom
Beutelschlauch (ca.2cm) abgeschweißt. Die Schlauchstücke werden
gekennzeichnet. Das ca. 10 cm lange, mit Nabelschnurblut gefüllte Schlauchstück ist so
zur Cd 34 Bestimmung und Vitalitätstest, ggf.
zur PCR – Analyse
vorbereitet.
Durch
die geforderten Entnahmen von Proben, muss am Blutbeutel ein Zugang
an einer Stelle in Abstimmung zum jeweiligen Herstellungsschritt gelegt
werden. Unter Berücksichtigung
der geforderten Laboruntersuchungen während der Herstellung muss
ein äußerer Zugang
zum Produkt (Nabelschnurblut und Stammzellen) mindestens 6 mal bei den
jeweils unterschiedlichen Herstellungsschritten erfolgen.
Unter
diesen Voraussetzungen ist es nicht gewährleistet, wie bisher im Stand
der Technik beschrieben, eine geforderte Sterilität zu wahren
oder das Risiko einer Kontamination auszuschließen. Das erfindungsgemässe Verfahren
stellt sicher, dass die erforderlichen Proben zu unterschiedlichen
Herstellungsschritten steril entnommen werden können. Es besteht darin, dass
vor den eigentlichen Herstellungsschritten das Nabelschnurblut im
Blutbeutel unter sterilen Bedingungen in einem Reinraum zum Beispiel
der Klasse A mit einem einzigen Zugang zum Produkt so zu versehen
ist, dass alle erforderlichen Labor-Proben und Zugaben von sterilen
Lösungen (wie
z.B. HES/DMSO) zu unterschiedlichen Herstellungsschritten erfolgen
können.
Dieser
alleinige Zugang zum Nabelschnurblut, ist mit verschiedenen sterilen
Spritzen mit eigenen Filtern über
einzeln geregelte Zugänge
zum Produkt sowie sterilen Zugängen
für die
Applikation der vorgeschriebenen Lösungen (HES/DMSO) versehen.
In Abhängigkeit
von der Grösse
des Blutbeutels, der Anzahl Proben, die entnommen werden muss und
der Grösse
der Spritzen kann die Anzahl der Zugänge beliebig gewählt werden.
Bevorzugt sind 10 Zugänge,
besonders bevorzugt sind 6 Zugänge.
In
einem nächsten
Schritt wird das Gewicht des Nabelschnurblutes ermittelt. Der mit
Nabelschnurblut gefüllte
Beutel wird gewogen. Zur Ermittlung des Nettoblutgewichtes wird
das Gewicht des Beutels mathematisch abgezogen.
In
einem nächsten
Schritt wird das HES-Volumen bestimmt. Zum ermittelten Nettoblutgewicht werden
20% HES (Hydro Ethyl Sarch) über
einen sterilen Zugang dazugegeben.
In
einem sechsten Schritt wird zu dem Nabelschnurblut im Blutbeutel
das errechnete Volumen der HES-Lösung
hinzudosiert. Eine Spritze mit einem angeschlossenen sterilen Schlauch
ist mit ca. 20ml HES-Lösung
gefüllt.
Mittels eines Schlauch-Schweißgeräts wird
der Schlauch von der mit der HES-Lösung gefüllten Spritze und der Schlauch
vom Blutbeutel steril miteinander verschweißt. Dieses Schlauch-Schweißgerät dient
zum Verschweißen
von PVC-Schläuchen mittels
eines Hochfrequenz-Schweißsystems.
Aufgrund der Schweißtechnik
ist sichergestellt, das bei der Verschweißung zweier Schläuche keine
Kontamination von außen
ins innere der Schläuche
gelangen kann. Somit kann zwischen zwei sterilen Schläuchen eine sterile
Schlauchverbindung hergestellt werden. Das errechnete HES-Volumen
wird mittels der Spritze hinzudosiert. Danach wird mit einer Schweißzange die
sterile Schlauchverbindung wieder getrennt. Die Schweißzange dient
zum sterilen Verschließen
eines Schlauches. Die zuführenden
Schläuche,
wie z.B. der DMSO-Schlauch, können
vor der Kryokonservierung von dem BC-Beutel abgetrennt werden. Um
die sterilen Bedingungen zu bewahren, wird der PVC-Schlauch in sich
verschweißt,
so das nach der Schweißstelle
vom Beutel entfernte Schlauchstück
z. B. mit einer unsterilen Schere abgetrennt werden kann.
Zum
Mischen der im Blutbeutel befindlichen HES-Lösung und dem Nabelschnurblut
wird der Beutel wird für
ca. 10 Minuten auf einen Blutmischer gelegt und durchgemischt.
Zum
Andocken des Blutbeutels an das Separations-Kit wird der mit dem
Nabelschnurblut und HES-Lösung
durchmischte Blutbeutel mittels dem am Blutbeutel befindlichem Schlauch
mit dem Anschlussschlauch des Separations-Kits verbunden. Dieser
Vorgang erfolgt mit dem Schlauch-Schweißgerät. Das Separations-Kit wird
an den Separator installiert und der BC-Beutel (Buffy-Coat Beutel) gekennzeichnet.
Zum
Starten des Separationsprogramm wird das benötigte Separationsprogramm „UCB-HES-Protokoll" am Display des Separators ausgewählt und
gestartet. Das Separationsprogramm läuft automatisch ab (Dauer ca.
25–35
min.). Nach Ablauf der Separation wird das Protokoll des Separationsvorganges
an dem am Separator angeschlossenen Drucker ausgedruckt.
Nach
Beendigung der Separation werden die mit dem Blutplasma und dem
mit dem Erythrocytenkonzentrat gefüllten Beutel mittels der Schweißzange von
der Schlauchverbindung zum Separations-Kit getrennt. Die Trennung
soll in der Hälfte
der Schlauchverbindung erfolgen. Der vom Separations-Kit zum Plasmabeutel
führende
Schlauch wird mittels der Schweißzange abgetrennt: Der Plasmabeutel
wird gekennzeichnet. Der vom Separations-Kit zum Erythrocytenbeutel
führende
Schlauch wird mittels der Schweißzange abgetrennt. Der Erythrocytenbeutel
wird gekennzeichnet.
Der
abgetrennte und gekennzeichnete Plasmabeutel und der abgetrennte
und gekennzeichnete Erythrozytenbeutel werden zur Untersuchung auf
aerobe und anaerobe Bakterien sowie Pilze zur mikrobiologischen
Untersuchung weitergegeben.
Zur
Abtrennung der Probe nach der Separation für die CD34 Bestimmung und Vitalitätstest ohne DMSO-Lösung wird
wie folgt vorgegangen. Nach der Beendigung der Separation werden
die Dreiwegehähne
am Separations-Kit per Hand so gestellt, dass die Flussrichtung
vom BC-Beutel zur Zentrifugenkammer eingestellt ist. Per Hand werden
ca. 0,3ml Buffy-Coat ins Schlauchsystem in Richtung Zentrifugenkammer
zurückgedrückt. Der
Dreiwegehahn zwischen Zentrifugenkammer und Zentrifugeneingang wird
geschlossen. Der Teil des Schlauches vom Dreiwegehahn zum Zylinder
(Zentrifugation) wird beidseits mit der Schweißzange abgeschweißt. Der
abgeschweißte
Schlauch wird gekennzeichnet und zur CD 34 Zählung und zum Vitalitätstest ins
Labor gegeben.
Zu
dem im Cryobeutel befindlichen Buffy-Coat wird die DMSO-Lösung über einen
der sterilen Zugänge
hinzudosiert. Eine Spritze mit einem angeschlossenen sterilen Schlauch
ist mit 5ml einer 50% DMSO-Lösung
gefüllt.
Mit dem Schlauch-Schweißgerät wird das
Schlauchende vom Separations-Kit (ehemals Anschluss Plasmabeutel) mit
dem Schlauch der mit DMSO-Lösung
gefüllten Spritze
steril miteinander verschweißt.
Die Dreiwegehähne
am Separations-Kit werden per Hand so gestellt, dass die Flussrichtung
von dem am Separator-Kit angeschlossenen DMSO-Behältnis zum BC-Beutel
eingestellt ist. Das in der Spritze befindliche DMSO-Volumen wird
mit dem Perfusor in den BC-Beutel dosiert. Der Perfusor dosiert
eine gleiche Menge über
eine vorgegebene Zeit, so dass im Gesamtvolumen der Mischung im
BC eine DMSO-Konzentration von ca. 10% vorhanden ist.
Zum
Abtrennen des Cryobeutels und des Rückstellmusters sowie eine Probe
des Endproduktes für
die Sterilitätskontrolle
vor dem Einfrierprozess wird wie folgt vorgegangen. Nach dem Mischen
wird per Hand ein Teil vom Buffy-Coat in den Schlauch, zum Dreiwegehahn
hin, zurückgedrückt. Der Schlauch
wird unterhalb des Dreiwegegehahns (vom Separator-Kit) abgeschweißt. Das
erste Schlauchstück
enthält
die Endproduktprobe für
die Sterilitätskontrolle.
Hierbei wird ein Schlauchstück
mit ca. 1 ml. Füllung
abgeschweißt.
Die Schweißung
erfolgt in ca. 15 cm Distanz vom Anschluss am BC-Beutel. Das zweite
Schlauchstück
enthält
das Rückstellmuster. Hierbei
wird das am BC-Beutel verbleibende mit einzufrierende Stück Schlauch
in ca. 5cm Distanz vom Anschluss am BC-Beutel abgeschweißt. Das
abgeschweißte
Ende (Probe) verbleibt an dem Schlauch vom BC-Beutel und wird mit
dem BC-Beutel eingefroren.
Bis
zum Beginn des Einfriervorgangs erfolgt eine Einlagerung der in
den BC-Beutel befindlichen Stammzellen aus dem Nabelschnurblut in
einem Kühlschrank
bei einer Temperatur von ca. +4° Celsius.
Die
in den BC-Beutel befindlichen Blutstammzellen werden mit einem Einfrierautomaten zur
Langzeitlagerung eingefroren. Der Einfrierautomat wird in den Betriebszustand
versetzt und die BC-Beutel mit den Blutstammzellen nach dem Beladungsschema
positioniert. Die Tür
des Einfrierautomaten wird verschlossen. Dann erfolgt die Eingabe der
Daten in die Steuerung, die Auswahl des Einfrierprogramms und der
Start des Einfrierprogramms. Die Eingabe der Chargen-Daten erfolgt
in die Eingabemaske der PC-Steuerung. Das zur Einfrierung der Blutstammzellen
benötigte
Programm wird geladen. Der Einfrierverlauf (Einfrierkurve der Referenzfühler) soll
einen nahezu linearen Temperaturverlauf innerhalb eines Einfrierfensters
von –0,1°C/Min. bis –5°C/Min. aufweisen.
Nach Beendigung des Einfrierprozesses werden die Beutel mit den
eingefrorenen Blutstammzellen entnommen und in die Kryo-Lagerbehälter auf
Quarantäne
eingelagert. Der Vorteil der Quarantänelagerung liegt darin, dass
zum Beispiel bei Kontamination des Blutes oder der Stammzellen oder
einer Infektion oder Krankheit der Mutter oder des Kindes oder sonstiger
Abweichungen von vorgegebenen Soll-Parametern keine weiteren Kosten
entstehen, oder Lagerraum unnützerweise
verschwendet wird wie dies bei sofortiger Überführung in die Langzeitlagerung
der Fall wäre.
Bis
zur Freigabe der eingefrorenen Stammzellen aus dem Nabelschnurblut
werden diese auf Quarantäne
in einem Kryo-Lagerbehälter
gelagert. Die Freigabe zur Umlagerung erfolgt erst nach der Prüfung aller
für die
Herstellung benötigten
Schritte und Ergebnisse. Die Freigabe zur Umlagerung wird im Herstellungsprotokoll
dokumentiert. Diese Zwischen- oder Quarantänelagerung verhindert wirksam,
dass Stammzellen, die nicht den Soll-Parametern entsprechen oder
gerecht werden, langfristig gelagert werden, wodurch erhebliche
Kosten entstehen können.
Ferner wird verhindert, dass Stammzellen, die nicht den Soll-Parametern
entsprechen oder gerecht werden, später wiederverwendet werden
und so dem oder den Patienten weiteren oder noch grösseren Schaden
zufügen.
Zur
Quarantäne-
oder zur Langzeitlagerung werden die eingefrorenen Stammzellen aus
dem Nabelschnurblut in einem Kryo-Lagerbehälter eingelagert. In diesem
Lagertank befindet sich im unteren Teil des Behälters flüssiger Stickstoff. Die Lagerung der
Blutstammzellen erfolgt zwischen –140 und –200 Grad Celsius vorzugsweise
zwischen –140
und –160 Grad
Celsius. Vorzugsweise lagern die Stammzellen in der Gasphase des
flüssigen
Stickstoffs bei ca. –150
Grad Celsius. Die Einlagerung der Stammzellen aus dem Nabelschnurblut
erfolgt in einem in dem Kryo-Lagerbehälter befindlichen Rack mit
entsprechenden Fächern.
Die Position der Einlagerung, sowie Datum und Uhrzeit der Einlagerung
und die Kennzeichnung des Beutels werden in einem Belegbuch mit
entsprechendem Belegungsschema eingetragen.
Während des
Herstellungsprozesses werden die einzelnen Schritte der Herstellungsanweisungen
dokumentiert und protokolliert. Das Herstellungsprotokoll wird beim
Abarbeiten der einzelnen Herstellungsschritte ausgefüllt und
mit Datum und Unterschrift des Ausführenden abgezeichnet. Berichte,
welche nach dem Herstellungsprotokoll zur Dokumentation benötigt werden,
sind als Anlage zum Herstellungsprotokoll zu kennzeichnen. Diese
sind dann im entsprechenden Herstellungsschritt im Herstellungsprotokoll
zu vermerken.
Die
in der Herstellungsanweisung beschriebenen Herstellungsschritte
werden in dem Herstellungsprotokoll, das der Qualitätssicherung
dient, dokumentiert. Hierzu ist im Herstellungsprotokoll in der Spalte „SCHRITT" ein Querverweis
zu dem Herstellungsschritt in der Herstellungsanweisung gegeben. In
der Spalte „PARAMETER" wird der zu bewertende Herstellungsparameter
des betroffenen Herstellungsschrittes genannt. Die Sollvorgaben
für den Herstellungsschritt
sind in der Spalte „SOLL" vorgegeben. In die
Spalte „IST" werden nun die Ist-Zustände/-Daten/-Ergebnisse
eingetragen. Nachdem die Daten auf dem Einzelblatt des Herstellungsprotokolls eingetragen
wurden, sind diese mit Datum und Unterschrift bei der Zeile „Ausführender" abzuzeichnen.
Bei
Abweichungen der Sollvorgaben gegenüber den Ist-Zuständen/-Daten/-Ergebnissen
ist dieses im Herstellungsprotokoll zu dokumentieren und entsprechend
in dem Feld „BEMERKUNG" zu kommentieren.
Die
Angaben im vorliegenden Herstellungsprotokoll werden geprüft. Hierzu
müssen
die benötigten
Unterlagen und Berichte vorliegen. Aufgrund der Prüfung des
Herstellungsprotokolls erfolgt eine zusammenfassende Bewertung des
Herstellungsablaufes. Es wird geprüft, ob die Herstellung der
Stammzellen aus dem Nabelschnurblut nach den Vorgaben hergestellt
wurden. Dann wird das Herstellungsprotokoll mit Unterschrift und
Datum abgezeichnet.
Zur
Freigabe der Stammzellen aus dem Nabelschnurblut werden die Angaben
im vorliegenden Herstellungsprotokoll geprüft. Hierzu müssen die
benötigten
Unterlagen und Berichte vorliegen. Es wird geprüft, ob die laut Herstellungsprotokoll
geforderten Qualitätsuntersuchungen
durchgeführt
wurden und die Stammzellen aus dem Nabelschnurblut zur Verwendung
freigegeben werden können.
Diese Freigabe wird im Herstellungsprotokoll vermerkt und dann mit
Unterschrift und Datum abgezeichnet.
Das
ausgefüllte
und unterschriebene Herstellungsprotokoll wird abgelegt und archiviert.
Die Archivierung der Papierform des Herstellungsprotokolls ist auf
mindestens 10 Jahre, ab dem Zeitpunkt der Anwendung, festgelegt.
Nach Ablauf der 10 Jahre Frist ist eine Vernichtung der Herstellungsprotokolle
in Papierformat dann möglich,
wenn die zu vernichtenden Dokumente elektronisch und manipuliersicher
gesichert werden können
und gewährleistet
ist, dass die elektronisch gesicherten Daten jederzeit in ein für den Menschen
lesbares Format hergestellt werden können.