DE102004060899A1

DE102004060899A1 - Verfahren zur Bestimmung von Nitrit in Proben mit biologischem Material

Info

Publication number: DE102004060899A1
Application number: DE200410060899
Authority: DE
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2004-12-14
Publication date: 2006-07-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Nitrit in Proben mit vorzugsweise biologischem Material, dadurch gekennzeichnet, dass DOLLAR A - die nitrithaltige Probe mit einer chemilumineszenten Reagenzlösung Safranin/O3-Chemilumineszenz inkubiert wird, DOLLAR A - die Reagenzlösung einer luninometrischen Messung zur Ermittlung des CL-Signals unterzogen wird, wobei das in der Probe vorhandene Nitrit eine Erniedrigung des CL-Signals bewirkt, und DOLLAR A - das Maß der Erniedrigung des CL-Signals als Maß der Nitritkonzentration in der Probe ausgewertet wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Nitrit in Proben mit vorzugsweise biologischem Material. Das Anwendungsgebiet der Erfindung bezieht sich größtenteils auf die Untersuchung von biologischen Proben im Sinne von Gewebsproben oder Körperflüssigkeiten.
Derartige Untersuchungen sind insbesondere im Rahmen der humanen Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie zur Aufklärung von akut und chronisch entzündlichen Prozessen von außerordentlicher Bedeutung.
Nitrit stellt ebenfalls einen wesentlichen Mediator im Zusammenhang mit malignen Erkrankungen einerseits und mit Erkrankungen des Gefäßsystems andererseits dar.
Daneben hat die Bestimmung von Nitrit große Bedeutung im Rahmen der Umweltanalytik.

Die bisher in der Literatur beschriebenen Methoden zur Bestimmung von Nitrit lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. Kapillarelektrophorese (T. Miyado et al., J. Chromatogr. A. 1051 (2004)185–191; E. Morcos et al., Methods Mol. Biol. 279(2004)21–34)
2. Spektrophotometrische Bestimmung (Vanadium-Methode) (K. Rejdak et al., Neurology 63(2004)1439–1445)
3. Griess-Reaktion (S. Arias-Negrete et al., Anal. Biochem. 328(2004)14–21)
4. GC-MS-Methoden (D. Tsikas, Methods Mol. Biol. 279(2004)81–103)
5. Elektron-Spin-Resonanz (K. Minakata et al., Anal. Biochem. 325(2003)168–170)
6. Kapillar-Zonen-Elektrophorese ((T. Miyado et al., J. Chromatogr. A. 1014(2003)197–202)
7. lonenchromatographie(HPLC) (C. Mitaka et al., Shock 19(2003)305–309)

Nachteilig bei allen aufgeführten Methoden ist, dass gerade für die Untersuchung von biologischen Proben eine z. T. aufwendige Probenvorbereitung erfolgen muss. Daneben erfordern die angewandten Methoden einen z. T. extrem komplizierten und teuren apparativen Aufwand, wobei nicht gewährleistet ist, dass Konzentrationen von Nitrit auch im Bereich von wenigen μmol/L reproduzierbar erfasst werden können.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, welches mit geringem gerätetechnischen Aufwand eine hochspezifische und selektive Bestimmung von Nitrit in sehr niedrigen Konzentrationsbereichen gewährleistet.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein verfahren mit den im Anspruch 1 genannten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Varianten des Verfahrens sind Gegenstand von Unteransprüchen.

Erfindungsgemäß wird die nitrithaltige Probelösung mit dem System Safranin-Ozon, welches hochchemilumineszent ist, inkubiert. Aufgrund von mindestens 2 nicht chemilumineszenten schnellen Konkurrenzreaktionen des Nitrits wird die Safranin-Ozon-Chemilumineszenz spezifisch und stark inhibiert. Die Erniedrigung des CL-Messsignals ist ein Maß für die in der Probe enthaltene Nitritkonzentration:
Das als Reagenzlösung verwendete Gemisch einer verdünnten Lösung von Safranin und Ozon wird dabei vorzugsweise in einem wässrigen oder organischen Lösungsmittel, namentlich Acetonitril unmittelbar vor der Verwendung hergestellt.

Eine Lösung, welche 1 μg/l Safranin und 1 g/l Ozon in Acetonitril enthält, erzeugt eine Chemilumineszenz von ca. 4.500.000 RLU/s bei Einsatz von 1 ml Reagenzlösung.

Je zu erwartender Nitritkonzentration in der Probe kann mit einer wässrigen Alkalinitritlösung im Konzentrationsbereich von 1 μg bis 1 g/l eine geeignete Eichkurve erstellt werden.

Die Quenchingrate des CL-Signals ist direkt proportional zur Nitritkonzentration und kann mit einem Luminometer, dessen höchste Empfindlichkeit zwischen 400 und 600 nm liegt, als integrales Messsignal über die ersten 1 bis 10 s – im Bedarfsfall auch länger oder kürzer – registriert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für alle Arten von biologischen Untersuchungsmaterialien namentlich Gewebe- und Körperflüssigkeiten. Die hier beschriebene Nitritbestimmung wird durch keinerlei andere anorganische oder organische Ionen bzw. Verbindungen gestört.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von Ausführungsbeispielen noch näher erläutert.

Bestimmung der Nitritkonzentration im humanen Harn:
Als Untersuchungsmaterial dient ein humaner Spontan- oder 24-Stunden-Sammelurin ohne besondere Probenvorbereitung. Das Probenmaterial kann entweder steril filtriert oder sofort zur Messung genutzt werden.
a) Herstellung der Reagenzlösung:
In geeignete Luminometerröhrchen (12 × 75 mm Polypropylen) wird jeweils 1 ml einer Safraninlösung in Acetonitril (1 μg/l) vorpipettiert.
Des Weiteren stellt man eine Lösung von Ozon in Acetonitril (Ozonisator) mit einem Gehalt von 1 g/l O₃ her. Diese Lösung wird in eine geeignete Injektionseinrichtung des Luminometers (z. B. LB 9501, 9502, 9503 der Fa. Berthold, Bad Wildbad) gebracht und das Injektionsvolumen auf 100 μl eingestellt.
b) Bestimmungsansatz:
Zu der Safraninlösung (1 ml) wird 100 μl des zu untersuchenden Harns bzw. des Standards (wässrige Natriumnitritlösung) pipettiert.
Dann erfolgt die Injektion von 100 μl Ozonreagenz und die Detektion des integralen Messsignals über die ersten 7 Sekunden. In dieser Art und Weise werden alle Proben nacheinander vermessen. Messbeispiel: Standards (wässrige Natriumnitritlösung):

0 μgl/l 4.100.000 RLU/s

1 μg/l 3.800.000 RLU/s

10 μg/l 1.200.000 RLU/s

100 μg/l 250.000 RLU/s

1 mg/l 45.000 RLU/s

10 mg/l 4.800 RLU/s
Aus der angepassten Standardkurve lässt sich die Konzentration der Probe im Bereich von 1 mg bis 10 mg/l ermitteln.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Nitrit in Proben mit vorzugsweise biologischem Material, dadurch gekennzeichnet, dass – die nitrithaltige Probe mit einer chemilumineszenten Reagenzlösung Safranin/O3-Chemilumineszenz inkubiert wird, – die Reagenzlösung einer luminometrische Messung zur Ermittlung des CL-Signals unterzogen wird, wobei das in der Probe vorhandene Nitrit eine Erniedrigung des CL-Signals bewirkt, und – das Maß der Erniedrigung des CL-Signals als Maß der Nitritkonzentration in der Probe ausgewertet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Reagenzlösung ein Safranin/O3-Gemisch im Konzentrationsbereich 1 bis 10 μg Safranin und 0,5 bis 1,5g Ozon/l Lösungsmittel verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Quantifizierung der Nitritkonzentration das integrale Messsignal eines Luminometers über die ersten 1 bis 10 s ausgewertet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Luminometer ein Gerät mit einer maximalen Empfindlichkeit zwischen 400 und 600 nm verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung bei einem neutralen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 durchgeführt wird.