DE102004026330A1

DE102004026330A1 - Verwendung einer Genveränderung im Humanen GNAQ-Gen zur Vorhersage von Erkrankungsrisiken, Krankheitsverläufen und zur Vorhersage des Ansprechens auf Krankheitstherapien

Info

Publication number: DE102004026330A1
Application number: DE102004026330A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dr. med. Frey; Winfried Prof. Dr. med. Siffert
Original assignee: Universitaet Duisburg Essen
Current assignee: Universitaet Duisburg Essen
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2005-12-15
Also published as: EP1751308A2; WO2005118845A3; US20080020385A1; WO2005118845A2

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer genomischen Genveränderung im Gen für die Galphaq-Untereinheit menschlicher Proteine, die durch das Gen GNAQ kodiert wird, zur Vorhersage von Krankheitsrisiken, Krankheitsverläufen und von Ansprechen auf Krankheitstherapien mittels pharmakologischer und nicht-pharmakologischer Maßnahmen und zur Vorhersage unerwünschter Arzneimittelwirkungen. Ferner betrifft die Erfindung die Bereitstellung von einzelnen Genveränderungen und Haplotypen, mit deren Hilfe weitere für die oben genannten Zwecke verwendbaren Genveränderungen detektiert und validiert werden können. Solche Genveränderungen können darin bestehen, dass im Promoter des Gens ein GC(-909/-908)TT-Polymorphismus nachgewiesen wird. Die Genveränderungen können einzeln oder in beliebiger Kombination mittels dem Fachmann geläufigen Verfahren detektiert werden.

Description

Funktion und Bedeutung heterotrimerer G-Proteine

Alle Zellen des menschlichen Körpers verfügen über Membranrezeptoren an ihrer Oberfläche, über die alle Zellfunktionen gesteuert werden. Zu solchen Rezeptoren gehören die so genannten heptahelikalen Rezeptoren für Hormone, Neurotransmitter und Chemokine. Daneben gibt es eine Vielzahl von Rezeptoren für Wachstumsfaktoren und Rezeptoren mit intrinsischer Tyrosinkinaseaktivität, beispielsweise Rezeptoren für Insulin, Insulin-like Growth Factor, Epidermal Growth Factor, Platelet-derived Growth Factor und viele mehr. Weiterhin existieren viele Rezeptoren, die für die Regulation der Blutbildung verantwortlich sind, wie z.B. der Rezeptor für Erythropoietin. Über solche Rezeptoren werden unter anderem Zellwachstum, Motilität, Genexpression, Apoptose und Chemotaxis gesteuert. Die genannten Rezeptoren übermitteln ihre Signale ins Zellinnere über die Aktivierung sog. heterotrimerer G-Proteine. Diese G-Proteine bestehen aus einer großen Familie unterschiedlicher Isoformen und sind jeweils aus unterschiedlichen α-, β- und γ-Untereinheiten zusammengesetzt. Derzeit sind 5 β-Untereinheiten, 13 γ-Untereinheiten und mehr als 20 α-Untereinheiten bekannt, die durch unterschiedliche Gene kodiert werden (Farfel Z et al.

The expanding spectrum of G protein diseases. N Engl J Med. 1999 Apr 1;340(13):1012-20). Durch die Kombination aus diesen verschiedenen α-, β- und γ-Untereinheiten entsteht eine Vielzahl unterschiedlicher heterotrimerer G-Proteine.

Dabei determiniert die Isoform- Kombination, welches Heterotrimer durch einen bestimmten Rezeptor aktiviert werden kann. Die βγ-Untereinheiten sind funktionell als Monomer zu betrachten. Im Ruhezustand hat die α-Untereinheit GDP gebunden (1). Nach Aktivierung eines koppelnden Rezeptors setzt die α-Untereinheit GDP im Austausch gegen GTP frei und es kommt zur Dissoziation der βγ-Untereinheiten von den α- Untereinheiten. Sowohl die freien α- als auch die βγ-Untereinheiten können die Aktivität einer Vielzahl unterschiedlicher Effektoren steuern. Hierzu gehören beispielsweise Ionenkanäle, die Adenylylzyklase, die PI3-Kinase, unterschiedliche MAP-Kinasen usw. Die α-Untereinheiten verfügen über eine intrinsische GTPase-Aktivität die das nach Aktivierung gebundene GTP zu GDP hydrolysiert. Nachfolgend reassoziieren die freigesetzten βγ-Untereinheiten wieder mit der α-Untereinheit, wodurch der Aktivierungszyklus beendet wird. Damit steht das Heterotrimer für einen erneuten Aktivierungszyklus zur Verfügung (Bourne HR. How receptors talk to trimeric G proteins. Curr Opin Cell Biol. 1997;9(2):134-42). Ein Schema des G-Proteinzyklus ist in 1 dargestellt. Die Aktivierung solcher G-Proteine ist der entscheidende Schritt für die Zellaktivierung. Aufgrund der überragenden Bedeutung von G-Proteinen ist es unmittelbar einleuchtend, dass Mutationen oder genetische Polymorphismen in Genen, die für G-Proteine kodieren, einen nachhaltigen Einfluss auf die Aktivierbarkeit von Zellen haben müssen, falls diese Mutationen die Funktion oder Expression von G-Protein-Untereinheiten beeinflussen. Damit werden auch Erkrankungsrisiken oder Krankheitsverläufe in entscheidender Weise beeinflusst. Zudem ist das Ansprechen auf die Therapie von Erkrankungen, sei es durch Pharmaka oder durch andere Maßnahmen wie Bestrahlung, Diäten, Operationen, invasive Eingriffe etc. von der Aktivierbarkeit von G-Proteinen abhängig.

Bedeutung der Gαq-Untereinheit

Die Gαq-Untereinheit wird in allen Körperzellen des Menschen exprimiert. Ihre Stimulation führt u.a. zur Aktivierung der Phospholipase C und damit zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration (1). Damit können z. B. Ca2+-abhängige Prozesse aktiviert werden. Ferner kann Gαq die Aktivität von Ionenkanälen, z.B. von Kalium- oder Kalzium-Kanälen, regulieren. Nahezu alle bekannten Rezeptoren koppeln an Gαq, z.B. die Rezeptoren für Azetylcholin, Adenosin, Adrenalin, Angiotensin, Bradykinin, Endothelin, Histamin, Noradrenalin, P2-purinerge Rezeptoren, Opioide, Dopamin, Epidermal Growth Factor, FSH, VIP, Thyroliberin, Glucagon, Vasopressin, Histamin und viele mehr. Nach Stimulation Gαq- gekoppelter Rezeptoren wird in vielen Zelltypen Apoptose induziert, so dass sich ein Zusammenhang zu Tumorerkrankungen und deren Verlauf und Therapieansprechen, aber auch ein Zusammenhang zu entzündlichen und immunologischen Erkrankungen und deren Verlauf und Therapieansprechen ergibt. Daneben werden vielfältige Stoffwechselwege durch Gαq reguliert. Änderungen der Expression von Gαq (Überexpression oder fehlende Expression) führen im Tierexperiment oder auf zellulärer Ebene zu einer Reihe von Krankheitszuständen bzw. Phänotypen:

1. Die Überexpression von Gαq im Herzen führt zu Hypertrophie, Herzinsuffizienz und Apotpose
2. Konstitutiv aktives Gαq induziert Apoptose über den Proteinkinase C- Weg
3. Knockout von Gαq hemmt die Thrombozytenaggregation, führt zu Ataxie und stört die motorische Koordination
4. Knockout von Gαq führt zu Adipositas und Gαq ist an der Signaltransduktion von Insulin beteiligt.
5. Konstitutiv aktive Gαq-Untereinheiten sind onkogen(De Vivo M et al. Enhanced phospholipase C stimulation and transformation in NIH-3T3 cells expressing Q209LGq-alpha-subunits. J Biol Chem. 1992 Sep 15;267(26):18263-6) und an der Regulation des Glukosestoffwechsels beteiligt.

Bereits diese wenigen Beispiele belegen, dass funktionsverändernde Mutationen in Gαq oder die Unter- oder Überexpression des Proteins auch beim Menschen zu unterschiedlichen Krankheiten und/oder Funktionsstörungen führen können.

Gegenstand der Erfindung

Die hier beschriebene Erfindung zielt darauf ab

a. funktionsverändernde genomische Polymorphismen und Haplotypen im Gen GNAQ bereitzustellen, die entweder zu einem Aminosäurenaustausch führen, oder
b. die das Spleißverhalten beeinflussen, oder
c. die zur Änderung der Proteinexpression oder zur Änderung der Expression von Spleißvarianten führen, oder
d. die zum Auffinden und/oder Validieren weiterer Polymorphismen bzw. Haplotypen im Gen GNAQ geeignet sind.
e. Nukleotidaustausche und Haplotypen bereitzustellen, die geeignet sind, generell Krankheitsrisiken- und Verläufe vorherzusagen
f. Nukleotidaustausche und Haplotypen bereitzustellen, die geeignet sind, generell Ansprechen auf Pharmaka und Nebenwirkungen vorherzusagen
g. Nukleotidaustausche und Haplotypen bereitzustellen, die geeignet sind, generell die Wirkung anderer Therapieformen vorherzusagen (Bestrahlung; Wärme, Hitze, Kälte, Bewegung etc.)

Wegen der grundlegenden Bedeutung von Gαq für die Signaltransduktion sind solche Polymorphismen bzw. Haplotypen geeignet, generell Erkrankungsrisiken bzw.

Krankheitsverläufe bei allen Erkrankungen vorherzusagen bzw. Therapieansprechen/Therapieversagen oder unerwünschte Nebenwirkungen für alle Pharmaka oder nichtpharmakologische Therapien vorherzusagen.

Nachweis neuer Polymorphismen im Promoter des Gens GNAQ

Das humane Gαq Gen (GNAQ) ist auf Chromosom 9q21 lokalisiert (2).

Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Auffinden des vor Exon 1 im Promotor des Gen liegenden Gen-Polymorphismus GC(-909/-908)TT, der durch systematische Sequenzierung von DNA-Proben von Menschen gefunden wurde. Hierzu wurden Gensequenzen, die vor Exon1 von GNAQ liegen, mittels PCR-Reaktion amplifiziert und gemäß der Methode nach Sanger sequenziert. Die dazu erforderlichen Verfahren, z.B. das Ableiten von für die PCR-Reaktion erforderlichen Primerpaaren und die Auswahl von Sequenzier-Primern sind dem Fachmann geläufig. Hierbei wurden neue Polymorphismen gefunden, wobei in der Promotorregion an Position -909 eine Substitution von Guanin durch Thymin vorliegt (G-909T) und wobei gleichzeitig an Position -908 eine Substitution von Cytosin durch Thymin vorliegt (C-908T). Die Austausche G(-909)T und C(-908)T kommen immer gleichzeitig vor, so dass die Genotypen TT/TT, GC/GC und TT/GC resultieren. Die entsprechenden Teilsequenzen lauten demnach:

Die Nummerierung dieser SNPs erfolgt in der Weise, dass dem Nukleotid A des Startcodon ATG die Nummer +1 zugeordnet wird. Da es der Konvention entsprechend die Nummer 0 nicht gibt, ist dem vor dem A des Startcodon ATG liegenden Nukleotid die Nummer -1 zugeordnet.

Der Nachweis dieser SNPs im Sinne ihrer erfindungsgemäßen Verwendung kann mit beliebigen, dem Fachmann geläufigen Verfahren nachgewiesen werden, z.B. direkte Sequenzierung, PCR mit nachfolgender Restriktionsanalyse, reverse Hybridisierung, Dot-blot- oder slot-blot-Verfahren, Massenspektrometrie, Tagman^®- oder Light-Cycler^®-Technologie, Pyrosequencing^®. Invader^®-Technologie, Luminex-Verfahren etc. Ferner können diese Genpolymorphismen gleichzeitig nach Mulitplex-PCR und Hybridisierung an ein DNA-Chip detektiert werden.

Verteilung der GC(-909/-908)TT -Polymorphismus bei unterschiedlichen Ethnien und Verwendung dieser Genotypen zum Auffinden weiterer relevanter Polymorphismen und Haplotypen.

Hierzu wurden unterschiedliche DNA-Proben von Kaukasiern, Schwarzafrikanern und Chinesen genotypisiert. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle dargestellt

Diese Genotypverteilung ist im Chi²-Test mit einem Chi 86,1 und einem P<0.0001 hochsignifikant verschieden. Der GC-Genotyp tritt bei Schwarzafrikanern am häufigsten auf. Aus dieser Verteilung kann man folgern, dass entwicklungsgeschichtlich (bezogen auf Kaukasier) der GC(-909/-908) den „Urzustand" darstellt. Solche Unterschiede der Genotypverteilung bei unterschiedlichen Ethnien weisen in der Regel darauf hin, dass assoziierte Phänotypen für die Evolution bedeutsam waren und den Trägern einen bestimmten Vorteil brachten. Es ist dem Fachmann bekannt, dass ethnisch unterschiedliche Genotypverteilung ein Hinweis darauf sind, dass auch heute noch bestimmte Genotypen- und Haplotypen mit bestimmten Erkrankungen oder physiologischen und pathopyhsiologischen Reaktionsweisen oder Ansprechen auf Therapie, z.B. mit Pharmaka, assoziiert sind.

Ein Gegenstand der Erfindung ist es, dass diese neuen Polymorphismen dazu benutzt werden können um weitere relevante genomische Genveränderungen in GNAQ oder benachbarten Genen zu detektieren und zu validieren, die z.B. mit Genotypen im Gen GNAQ im Kopplungsungleichgewicht stehen. Dies können auch Gene sein, die ebenfalls auf Chromosom 9 liegen, aber in großer Entfernung vom Gen GNAQ. Hierzu wird folgendermaßen vorgegangen:

1. Für bestimmte Phänotypen (zelluläre Eigenschaften, Krankheitszustände, Krankheitsverläufe, Arzneimittelansprechen usw.) wird zunächst eine Assoziation mit dem Polymorphismus GC(-909/-908)TT hergestellt.
2. Für neu detektierte Genveränderungen in GNAQ oder benachbarten Genen wird untersucht, ob bereits bestehende Assoziationen unter Verwendung oben beschriebener Genotypen oder Haplotypen verstärkt oder abgeschwächt werden.

Funktionelle Bedeutung des GC(-909/-908)TT Polymorphismus Es wurde untersucht, welche funktionellen Änderungen Genveränderungen im Gen GNAQ zuzuordnen sind. Denkbar sind hier beispielsweise eine Korrelation zu alternativem Spleißen, gewebespezifische Expression oder eine Überexpression des Gαq-Proteins in Abhängigkeit von Genotypen des GC(-909/-908)TT Polymorphismus. Hierzu wurde zunächst mittels eines Computer-Programms untersucht, ob die gefundenen Nukleotidaustausche die Bindung von Transkriptionsfaktoren beeinflussen können. Transkriptionsfaktoren binden an spezifische Konsensus-Sequenzen und können die Promoteraktivität steigern oder vermindern, so dass eine verstärkte oder verminderte Transkription des Gens resultiert und somit das Expressionsniveau des kodierten Proteins gesteigert oder vermindert wird. Wie in 3 dargestellt, befindet sich der GC(-909/-908)TT-Polymorphismus in einer Konsensus-Sequenz der Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor SP-1, dessen Bindungsfähigkeit durch den Polymorphismus beeinträchtigt werden kann. Diese Beeinträchtigung bezieht sich auf den Genotyp (-909/-908)TT. Das Auftreten dieses Genotyps führt zu einem Wegfall einer SP-1 Bindungsstelle an ihre Konsensus-Sequenz: GGGGCGGGGC. Zur experimentellen Untersuchung dieses Effekts wird ein sog. EMSA (electrophoretic mobility shift assay) durchgeführt. Bei diesem Versuch werden kurze Nukleinsäureabschnitte, die den Polymorphismus beinhalten, mit Zellkernextrakten inkubiert. Transkriptionsfaktor-Proteine, die sich in diesen Extrakten befinden, binden nun mit unterschiedlicher Intensität an die Nukleinsäureabschnitte. Die Bindung an die DNA wird schließlich im Röntgenfilm sichtbar gemacht. Dabei resultiert aus einer starken Bindung eine intensive Bande. 4 zeigt das Resultat dieses Versuches mit spezifischen Konstrukten, die entweder den TT- oder den GC-Genotyp enthalten. Die stärkere Intensität der GC-Konstrukt Bande beweist eine stärkere Bindung eines Transkriptionsfaktors an diese Region. Das Verschwinden der Bande duch Zugabe eines SP-1 Antikörpers sowie die Verdrängung der Bindung durch ein kommerzielles SP-1 Oligonukleotid zeigt, dass es sich bei dem bindenden Transkriptionsfaktor um SP-1 handelt.

Zum funktionellen Nachweis einer geänderten Promotoraktivität abhängig von bestimmten Genotypen wurden unterschiedliche Fragmente des Promoters mit dem GC- bzw. mit dem TT-Genotyp in den Vektor pSEAP kloniert um nach Expression des Vektors in HEK-Zellen die Promotoraktivität mittels eines sog. „Reporterassays" zu quantifizieren (5). Hierzu werden die Konstrukte vor ein Gen kloniert, das für sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) kodiert. Falls das Konstrukt eine Promoteraktivität hat, wird das SEAP-Gen vermehrt transkribiert und die vermehrte Sekretion von alkalischer Phosphatase ins Zellkulturmedium ist messbar. Wie 5 zeigt, weist das Konstrukt -798/+89 die höchste Promotoraktivität auf (die Zahlenangaben beziehen sich auf den Transkriptionsstartpunkt, der im GNAQ-Gen bei -214 liegt). Da sich der Polymorphismus in dieser Region befindet (-694/-695 relativ vom Transkriptionsstartpunkt), die die höchste Reporteraktivität zeigt und außerdem eine Transkriptionsfaktorbindungsstelle durch den Nukleinsäureaustausch beeinflusst wird, wurde nun untersucht, ob die Stimulation von HEK Zellen einen Einfluss auf die Reporteraktivität dieser Konstrukte hat. Hierfür wurde das Konstrukt -789/+89 mit jeweils den Polymorphismen GC(-909/-908) und TT(-909/-908) in HEK-Zellen transfiziert und die Zellen wurden mit Serum bzw. Angiotensin II stimuliert (6). Bei Konstrukten mit dem GC-Genotyp führt die Stimulation mit Serum oder 10 nM Angiotensin II zu einer signifikant (p < 0,05) um das 2-4-fach gesteigerten Promotoraktivität im Vergleich zum TT-Genotyp. Umgekehrt führt eine Hemmung der Bindung von SP-1 beim GC-Genotyp durch Mithramycin zu einer signifikant (p < 0.05) stärkeren Abnahme der Promotoraktivität als beim TT-Genotyp.

Der GC-Polymorphismus im Promotor des GNAQ-Gens führt also dazu, dass die Promotoraktivität gesteigert ist und demnach das Gαq-Protein vermehrt exprimiert wird. Um zu überprüfen, ob diese Regulation auch in vivo stattfindet, wurde die Expression von Gαq auf mRNA- Ebene mittels Realtime-PCR in Herzgewebe untersucht.

Dazu wurde mRNA aus menschlichem Operationsgewebe bei Herzoperationen gewonnen und mittels reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Das Verfahren ist dem Fachmann geläufig. Nachfolgend wurde das Expressionsniveau mittels Realtime -PCR (Tagman-Verfahren) bestimmt und mit dem Expressionsniveau des Housekeeping-Gens β-Actin abgeglichen. Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Der GCGC Genotyp führt zu einer Steigerung der Gαq Transkription von mindestens 25% gegenüber dem T-Allel.

Um weiterhin zu untersuchen, ob der GC(-909/-908)TT Polymorphismus an der Entstehung kardialer Hypertrophie beteiligt sein kann, wurde der Proteingehalt im Vergleich zum DNA-Gehalt von Herzproben von Patienten im chronischen Vorhofflimmern und Patienten im Sinusrhythmus bestimmt. 8 zeigt, dass der relative zelluläre Proteingehalt bei Proben von Patienten mit Vorhofflimmern gegenüber Proben von Patienten im Sinusrhyhtmus erhöht ist. Da das Auftreten einer Herzhypertrophie bei Patienten mit chronischen Vorhofflimmern gegenüber Patienten im Sinusrhythmus erhöht ist, stellt der Protein/DNA Index einen Marker für die Herzhypertrophie dar. 8 zeigt den Protein/DNA Index aufgeteilt nach dem GC(-909/-908)TT Polymorphismus. Diese Fig. zeigt, dass sowohl bei Proben von Patienten mit chronischem Vorhofflimmern als auch bei Proben von Patienten im Sinusrhyhtmus der Protein/DNA Index bei GC/GC-Genotypen am höchsten ist.

Damit wurde nachgewiesen, dass es im Gen GNAQ Genveränderungen gibt, die zum einen eine Expressionsänderung von Gαq im Herzgewebe bewirken und zum anderen zu einer Veränderung der Proteinmenge in Herzen führen kann. Dies kann der GC(-909/-908)TT-Polymorphismus sein oder Polymorphismen, die mit diesen im Kopplungsungleichgewicht stehen. Bestandteil der hier beschrieben Erfindung ist damit auch, die Expression von Gαq auf mRNA-Ebene oder Proteinebene zu quantifizieren, mit bekannten Polymorphismen des GNAQ zu assoziieren und neue, noch besser geeignete Polymorphismen zu entdecken und zu validieren.

Die hier gezeigten Befunde einer genotypabhängigen Expression von Gαq und veränderter Gesamtproteinmenge in menschlichen Herzen ist überaus bedeutsam. Bei transgenen Tieren führt die Überexpression von Gαq zur vermehrten Apoptose kardialer Myozyten als Ursache einer Herzinsuffizienz {Adams, 2001 102/id}{Mende, 2001 100 /id}. Gleiche Effekte sind daher auch bei Menschen zu erwarten, die auf Grund einer Genveränderung in GNAQ das Gαq-Protein überexprimieren. Hier erwarten wir ein erhöhtes kardiovaskuläres Risiko. Dazu gehört ein erhöhtes Risiko für Adipositas, Hypertonie, Schlaganfall, koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt, Präeklampsie etc. Außerdem erwarten wir ein geändertes Ansprechen auf Substanzen, deren Rezeptoren Gαq aktivieren oder Substanzen, die indirekt Agonisten induzieren, deren Wirkungen über Gαq vermittelt werden. Die geänderte Apoptoseneigung kann eine Vielzahl von Krankheitsverläufen (z. B. von Tumor- und Immunerkrankungen) beeinflussen und das Ansprechen auf Pharmaka bestimmen.

Verwendung einer Genveränderung in GNAQ zur Vorhersage von Erkrankungsrisiken und Krankheitsverläufen

Aufgrund der Schlüsselfunktion der Gαq-Untereinheit für die Zellaktivierung ist es ein wesentlicher Bestandteil der Erfindung, dass unter Verwendung von Genveränderungen in GNAQ generell Erkrankungsrisiken und Krankheitsverläufe vorhergesagt werden können. Menschliche heterotrimere G-Proteine sind aus den Untereinheiten α, β und γ zusammengesetzt. Hiervon sind wiederum eine Reihe von Isoformen bekannt, die durch unterschiedliche Gene kodiert werden. Beispielweise gibt es 13 unterschiedliche γ-Isoformen (γ1-γ13), mindestens 5 unterschiedliche β-Isoformen (β1-β5) und eine Vielzahl unterschiedlicher α-Isoformen (αs (short and long), αo, αi1-3, αq, α11-16, αolf etc.) Da G-Proteine bekannterweise eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Funktion aller menschlichen Zellen einnehmen, unabhängig davon, welche Zellrezeptoren aktiviert werden, ist unmittelbar zu erwarten, dass der Verlauf vielfältiger und ganz unterschiedlicher Erkrankungen bei einer genetisch determinierten, verstärkten Aktivierbarkeit von G-Proteinen beeinflusst wird. Gerade bei den vielfältigen Funktionen von G-Proteinen erlangen funktionsverändernde Mutationen eine ganz besonders herausragende Bedeutung und Vorhersagekraft. Diese steht im Gegensatz zu Mutationen in anderen Genen, welche für andere Proteine, z.B. Hormone oder Hormonrezeptoren kodieren.

Dies bedeutet, dass durch Genveränderungen in Proteinen, die in allen menschlichen Körperzellen exprimiert werden und dort an zentraler Stelle eingehende Hormonsignale bündeln und dadurch Zellfunktionen regulieren, alle physiologischen und pathophysiologischen Vorgänge entscheidend beeinflusst oder zumindest moduliert werden. Daneben werden auch Antworten auf Pharmaka in besonderer Weise beeinflusst. Hiervon sind erwünschte, aber auch unerwünschte Arzneimittelwirkungen betroffen.

Es wurde in der wissenschaftlichen Literatur wiederholt postuliert, dass Funktionsveränderungen von G-Proteinen einen nachhaltigen Einfluss auf vielfältige Erkrankungen bzw. auf den Verlauf vielfältiger Erkrankungen haben. Solche Genveränderungen können strukturverändernde Mutationen in G-Protein-Untereinheiten sein, die beispielsweise die Aktivierbarkeit durch einen Rezeptor verändern, die enzymatische GTPase Aktivität betreffen oder die Dimerisierung von βγ-Untereinheiten beeinflussen. Daneben könnten solche Veränderungen die Zusammensetzung heterotrimerer G-Proteine verändern. Ferner kann das Expressionsniveau solcher G-Proteinuntereinheiten verändert sein oder es können Spleißvarianten mit geänderter Funktion auftreten (Farfel Z et al., The expanding spectrum of G protein diseases. N Engl J Med. 1999 Apr 1;340(13):1012-20; Iiri T et al., G-protein diseases furnish a model for the turn-on switch. Nature. 1998 Jul 2;394(6688):35-8; Iiri T et al., G proteins propel surprise.Nat Genet. 1998 Jan;18(1):8-10. Spiegel AM. Hormone resistance caused by mutations in G proteins and G protein-coupled receptors. J Pediatr Endocrinol Metab. 1999 Apr;l2 Suppl 1:303-9. Spiegel AM. Inborn errors of signal transduction: mutations in G proteins and G protein-coupled receptors as a cause of disease. J Inherit Metab Dis. 1997 Jun;20(2):113-21. Spiegel AM. The molecular basis of disorders caused by defects in G proteins. Horm Res. 1997;47(3):89-96. Spiegel AM. Mutations in G proteins and G protein-coupled receptors in endocrine disease. J Clin Endocrinol Metab. 1996 Ju1;81(7):2434-42. Review. Spiegel AM. Defects in G protein-coupled signal transduction in human disease. Annu Rev Physiol. 1996;58:143-70).

Aus den genannten Beispielen geht folgendes hervor:

1. Genveränderungen in Genen, die für ubiquitär exprimierte Proteine kodieren, beeinflussen vielfältige Erkrankungen bzw. verursachen vielfältige Erkrankungsrisiken
2. G-Proteine steuern nahezu alle Signaltransduktionsvorgänge im menschlichen Körper
3. Während aus der zitierten Literatur eindeutig hervorgeht, dass. man ganz allgemein davon auszugehen hat, dass Mutationen und Polymorphismen in Genen, die für G-Proteine kodieren, solche Erkrankungen hervorrufen können, so wurde ein Zusammenhang mit genomischen Mutationen im Gen GNAQ für die Gαq-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine mit Erkrankungsrisiken in der Literatur weder beschrieben noch vermutet.

Als Erkrankungen, die mit einer Genveränderung in GNAQ einhergehen, und beispielsweise durch ein geändertes Expressionsniveau von Gαq-Protein bestimmt werden, können genannt werden:

1. Herz-Kreislauferkrankungen. Darunter fallen insbesondere Hypertonie, Schlaganfall, koronare Herzkrankheit und Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen, Präeklampsie bzw. Gestose.
2. Enokrinologische und Stoffwechselerkrankungen. Darunter fallen insbesondere Adipositas, metabolisches Syndrom, Typ-2 Diabetes-mellitus, Gicht, Osteoporose, Schilddrüsenerkrankungen wie Hyper- und Hypothyreose und M.Basedow, Hyper- und Hypoparathyreodismus, Morbus Cushing, Hyper- und Hypoaldosteronismus und viele mehr.
3. Psychiatrische Erkrankungen wie Depression, Schizophrenie, Alkoholismus und Angststörungen, Phobien, Neurosen
4. Neurologische Erkrankungen wie Morbus Parkinson, multiple Sklerose, Epilepsien
5. Dermatologische Erkrankungen wie Psoriasis, Neurodermitis
6. Tumorerkrankungen

Verwendung von Genveränderungen im Gen GNAQ zur Vorhersage des Risikos für Herz-Kreislauferkrankungen

Bei transgenen Tieren, die im Herzen Gαq überexprimieren beobachtet man eine vermehrte Neigung zur Herzhypertrophie, Herzinsuffizienz und Apoptose. Es ist daher davon auszugehen, dass eine gesteigerte Expression von Gαq beim Menschen, wie sie beim GC-Genotyp des GC(-909/-908)TT-Polymorphismus, zu einem gesteigerten kardiovaskulären Risiko führt.

Wie in 9 dargestellt, findet man bereits bei jungen Männern, die den GC-Genotyp tragen, ein erhöhtes Schlagvolumen des Herzens bei reduziertem peripheren Widerstand. Dies ist bekanntlich Ausdruck einer hyperdynamischen Kreislaufsituation, die mit einem erhöhten Risiko für Hypertonie und Herzhypertrophie einhergeht.

Bei älteren Menschen finden wir eine deutliche Abhängigkeit des linksventrikulären Massenindex vom GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus (p < 0,05):

Somit besteht für GC-Genotypen eine erhöhte Gefahr für Linksherzhypertrophie mit erhöhtem Risiko für Vorhofflimmern, andere Rhythmusstörungen und den plötzlichen Herztod.

Risiko von Stoffwechselstörungen

Eine der häufigsten Stoffwechselstörungen ist Hypercholesterinämie, die bekanntlich mit einem erhöhten Risiko für koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt, Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit assoziiert ist. Bereits bei jungen gesunden Personen findet man, dass der GC(-909/-908)TT-Polymorphismus mit einer geänderten Cholesterinkonzentration im Serum assoziiert ist (10).

Grundlegende Eigenschaften von malignen Tumoren

Bei malignen Tumoren, auch als Krebs bezeichnet, kommt es zu charakteristischen Veränderungen grundlegender Funktionen, die das Wachstum solcher Zellen in ungünstiger Weise befördern. Krebszellen sind gekennzeichnet durch einen Verlust der Kontaktinhibition und ein unkontrolliertes Zellwachstum. Ausgelöst werden solche Veränderungen durch eine Vielzahl von Noxen, sog. Kanzerogene, welche das Erbgut schädigen. Zu solchen Noxen gehören viele Chemikalien, Tabakrauch, aber auch UV-Licht. Daneben spielen genetische Faktoren bei der Krebsentstehung eine herausragende Rolle. Kennzeichnend für Krebszellen ist neben ihrem ungehemmten Wachstum auch die Neigung, Tochtergeschwülste (Metastasen) in anderen Organen abzusiedeln. Die Ausbreitung der Metastasen erfolgt regelmäßig über die Blutbahn oder über Lymphgefäße. Krebserkrankungen sind bei einem Großteil der Fälle nicht heilbar und führen zum Tode. Therapeutisch wird versucht, den Ausgangstumor und Metastasen operativ zu entfernen. Daneben können Tumore bestrahlt werden. Mittels sogenannter Zytostatika, Antikörper gegen bestimmte Proteine oder Oberflächenmarker oder immunmodulierender Substanzen (Zytokine, Interferone) wird versucht, die sich schnell teilenden Krebszellen abzutöten oder in den programmierten Zelltod (Apoptose)zu überführen. Die derzeit verfügbaren therapeutischen Maßnahmen führen in den meisten Fällen nur zu einem verlängerten Überleben, nicht zur definitiven Heilung.

Prognosefaktoren bei Krebserkrankungen

Es ist von medizinisch großer Relevanz, Prognosefaktoren für den Verlauf von Krebserkrankungen zu definieren, die Auskunft über das Ansprechen auf bestimmte Therapieformen geben oder die prädiktiv für das Auftreten von Metastasen, die Tumorprogression und das Überleben sind. Bislang werden in der Medizin dem Fachmann allgemein bekannte Prognosefaktoren eingesetzt. Hierzu gehören beispielsweise die Größe des Tumors, seine Eindringtiefe in das umgebende Gewebe, organüberschreitendes Wachstum, das Eindringen in Blut- oder Lymphgefäße oder in Lymphknoten, sowie der Differenzierungsgrad der Tumorzellen. Daneben existieren einige relativ unspezifische serologische Marker. Das Verfahren zur Klassifikation der Tumore wird generell als „Staging" und „Grading" bezeichnet. Generell gilt, dass das Vorhandensein von Fernmetastasen und ein geringer Differenzierungsgrad prognostisch sehr ungünstige Parameter darstellen. Dennoch ist es die allgemeine Erfahrung in der Medizin, dass Patienten bei gleichem Tumorstadium drastisch unterschiedliche Krankheitsverläufe aufweisen. Während man bei manchen Patienten eine schnelle Progression der Erkrankung und das Auftreten von Metastasen und Rezidiven beobachtet, kommt die Erkrankung bei anderen Patienten aus unklaren Gründen zum Stillstand. Metastasen können hierbei lokal, regional und fern der Muttergeschwulst auftreten. Dazu ist es notwendig, dass eine hohe Zahl von Geschwulstzellen über den Lymph- oder Blutweg durch einfache Fortschwemmung in Flüssigkeit oder durch Abklatschen in benachbartes Gewebe gelangt. Unter Rezidivneigung versteht man das erneute Auftreten einer Geschwulst nach operativer unvollständiger oder Teilentfernung des Tumors. Hierbei handelt es sich nicht um eine erneute maligne Transformation, sondern um das Nachwachsen eines nicht vollständig entfernten Tumorgewebes. Eine Rezidivbildung ist auch durch Metastasen möglich, die viele Jahre latent bleiben können. Unter Progression versteht man das Wiederauftreten eines Tumors mit höherem Grading (mehr Entdifferenzierung) oder das Neuauftreten von Metastasen. Ganz offensichtlich gibt es eine Vielzahl individueller, unerkannter biologischer Variablen die den Verlauf einer Tumorerkrankung unabhängig von Staging und Grading in hohem Masse determinieren. Zu solchen Faktoren gehören genetische Wirtsfaktoren.

Daneben ist es wünschenswert, genetische Marker zu entwickeln, die prädiktiv für das Auftreten von Tumoren sind. Solche Marker erfüllen die Funktion, die betroffenen Individuen frühzeitig weiteren Screening -Maßnahmen (Serologie, Röntgen, Ultraschall, NMR etc.) zuzuführen. Damit können Krebserkrankungen im Frühstadium erkannt und therapeutisch angegangen werden, wobei die Heilungs- und Überlebenschancen bei Tumoren im Frühstadium wesentlich besser sind als bei fortgeschrittenen Tumoren.

Arten von Tumoren

Generell können alle Zellen des menschlichen Körpers maligne entarten und zu einer Krebserkrankung führen. Die hier und im weiteren gemachten Ausführungen beschreiben generelle Mechanismen der Tumorprogression, der Metastasierung und des therapeutischen Ansprechens. Insofern gelten die hier beschriebenen Mechanismen und Ansprüche für alle Tumore des Menschen, beispielsweise für die folgende Tumoren:
Tumoren des Urogenitaltrakts: Hier sind zu nennen das Harnblasenkarzinom, das Nierenzellkarzinom, das Prostatakarzinom und das Seminom.
Tumoren der weiblichen Geschlechtsorgane: Das Mammakarzinom, das Korpuskarzinom, das Ovarialkarzinom, das Zervixkarzinom.
Tumoren des Gastrointestinaltraktes: Das Mundhöhlenkarzinom, das Ösophaguskarzinom, das Magenkarzinom, das Leberkarzinom, das Gallengangskarzinom, das Pankreaskarzinom, das Kolonkarzinom, das Rektumkarzinom.
Tumore des Respirationstraktes: Das Kehlkopfkarzinom, das Bronchialkarzinom.
Tumore der Haut: das maligne Melanom, das Basaliom, das T-Zell-Lymphom
Tumorerkrankungen des blutbildenden Systems: Hodgkin- und non-Hodgkin-Lymphome, akute und chronische Leukämien etc.
Tumorerkrankungen des Gehirns bzw. des Nervengewebes: Glioblastom, Neuroblastom, Medulloblastom, meningeales Sarkom, Astrozytom.

Weichteiltumore, beispielsweise Sarkome und Kopf-Hals-Tumore.

G Proteine und maligne Transformation von Zellen

Experimentelle in vitro Untersuchungen belegen, dass Mutationen in G-Proteinuntereinheiten eine maligne Transformation von Zellen bewirken können. Die Expression einer konstitutiv aktiven Gαq-Untereinheit mit fehlender GTPase-Aktivität führt zur malignen Transformation von Fibroblasten (Kalinec G et al., Mutated alpha subunit of the Gq protein induces malignant transformation in NIH 3T3 cells. Mol Cell Biol. 1992 Oct;12(10):4687-93).

G-Protein-Mutationen und Krebserkrankungen beim Menschen

Beim Menschen wurden bei einigen selten Adenomen somatische Mutationen in den Untereinheiten Gαs und Gαi2 nachgewiesen. Diese werden als Gip2 (Gαi2-Untereinheit)bzw. als Gsp (Gαs-Untereinheit) bezeichnet. Hierbei handelt es sich dagegen nicht um genetische Wirtsfaktoren, die den Krankheitsverlauf modulieren, sondern um kausal wirkende Faktoren (Übersicht bei: Farfel Z et al. The expanding spectrum of G protein diseases. N Engl J Med. 1999;340(13):1012-20).

Verwendung von Genveränderungen im Gen GNAQ zur Vorhersage des Verlaufs von Tumorerkrankungen

Ein wesentlicher Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung diagnostisch relevanter Genveränderungen im Gen GNAQ als Prognosefaktor für alle Tumorerkrankungen des Menschen. Naturgemäß können hierbei nicht alle Tumorerkrankungen beschrieben werden. Das Prinzip wird daher an ausgewählten Beispielen erläutert, welche die generelle Verwendbarkeit demonstrieren:

Beispiel 1: Chronisch lymphatische Leukämie (CLL)
Bei der chronischen lymphatischen Leukämie handelt es sich um eine chronisch verlaufende Form einer Leukämie. Charakteristisch für die Krankheit ist eine große Zahl von entarteten Lymphozyten. Insgesamt 30 Prozent aller leukämischen Erkrankungen sind chronisch lymphatische Leukämien. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 65 Jahren. Nur zehn Prozent der Patienten sind jünger als 50 Jahre. Männer sind etwa zwei- bis dreimal häufiger betroffen als Frauen. Risikofaktoren für die Entstehung einer CLL sind nicht bekannt. Jedoch tritt die Krankheit in Japan und China selten auf. Auch Japaner, die in die USA eingewandert sind, erkranken äußerst selten an einer CLL. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass genetische Faktoren eine Rolle spielen. Die Therapie richtet sich nach dem Stadium der Erkrankung. Eine CLL kann bis zu 20 Jahre lang gutartig verlaufen, das heißt, der Patient zeigt außer vergrößerten Lymphknoten und eventueller Müdigkeit sowie Appetitlosigkeit keine Symptome. Die Behandlung setzt erst dann ein, wenn die Zahl der Lymphozyten über ein bestimmtes Maß anzusteigen beginnt, der Anteil der roten Blutkörperchen und die Zahl der Blutplättchen absinkt oder andere Komplikationen auftreten. Eine frühzeitige Behandlung hat keinen Einfluss auf den Verlauf und den Ausgang der Krankheit. Die wichtigste therapeutische Maßnahme ist die Chemotherapie. In bestimmten Fällen muss sich der Patient auch bestrahlen oder operieren lassen. Patienten können bis zu 20 Jahre mit der Diagnose CLL leben, ohne dass sich schwer wiegende Symptome zeigen. Je weiter die Erkrankung fortgeschritten ist, desto größer sind allerdings auch die Gesundheitsstörungen durch die Veränderung des Organsystems. Je nach Binet-Stadium der Krankheit kann der Arzt die Prognose abschätzen. Das Stadium einer CLL ist unter anderem dadurch gekennzeichnet, wie viele Lymphozyten sich im Blut und Knochenmark befinden, wie groß Milz und Leber sind und ob eine Blutarmut vorliegt oder nicht. Eine CLL führt zu Veränderungen im Immunsystem, so dass Menschen, die an dieser Krankheit leiden, stärker gefährdet sind, andere Arten von Krebs zu entwickeln. Bei gleichem Binet-Stadium zeigen Patienten jedoch ganz unterschiedliche Krankheitsverläufe. Bestandteil der Erfindung ist es zu zeigen, dass Genveränderungen im Gen GNAQ geeignet sind, den Verlauf der CLL vorherzusagen. Hierzu wurden Patienten mit CLL bezüglich der beschrieben Genveränderungen in GNAQ genotypisiert und der Genstatus mit der Krankheitsprogression verglichen. Unter Progression definieren wir hier das Zeitintervall zwischen Erstdiagnose der CLL und der Therapiebedürftigkeit.
11 zeigt einen signifikanten Unterschied bezüglich Therapiefreiheit in Abhängigkeit vom GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus, wobei der CC-Genotyp mit einer um das Zweifache beschleunigten Krankheitsprogression assoziiert ist (Hazard Ratio 2.07; p = 0.02).
Beispiel 2: Harnblasenkarzinom
Blasenkrebs ist ein bösartiger Tumor der Schleimhaut der Harnblase. Blasenkrebs tritt am häufigsten zwischen dem 60. und 70. Lebensjahr auf. Männer sind davon dreimal so häufig betroffen wie Frauen. Bei Männern ist Blasenkrebs nach Lungen- und Prostatakrebs die dritthäufigste Krebsform. Blasenkrebs kann durch äußere Einflüsse hervorgerufen werden. Zu den Risikofaktoren gehören, Rauchen, ständige Belastung des Organismus durch Chemikalien beispielsweise Farbstoffe, Schmerzmittelmissbrauch. Bei vielen Patienten ergeben die Untersuchungen, dass es sich um einen oberflächlichen Tumor handelt. Dieser kann operativ mit Hilfe des Zystoskops entfernt werden. Mehr als 70 % der Patienten, die wegen eines oberflächlichen Blasenkarzinoms behandelt wurden, zeigen im Verlauf ein Tumorrezidiv. Dabei kommen in mehr als der Hälfte Rezidivtumoren mit nichtmuskelinvasiver Erkrankung vor. Diese können durch transurethrale Resektion kurativ behandelt bzw. kontrolliert werden. Es ist deshalb wichtig, diese Läsionen frühzeitig zu erkennen und den Patienten regelmäßig und engmaschig nachzusorgen. Dabei steht an 1. Stelle die Zystoskopie mit Urinzytologie. In regelmäßigen Intervallen dienen Ausscheidungsurogramme zur Kontrolle möglicher Tumormanifestationen in Nierenbecken und Harnleitern. Bislang gibt es kaum valide Marker, die für den weiteren Verlauf der Erkrankung prädiktiv sind. Derzeit werden daher die klassischen Faktoren wie Eindringtiefe, Differenzierungsgrad, Metastasierung, Lymphknotenbefall etc. für die Prognose herangezogen. Genetische Marker für Tumorprogression, Rezidivneigung, Überlebenswahrscheinlichkeit und Therapieansprechen würden die Betreuung von Patienten mit Harnblasenkarzinom wesentlich verbessern. Ein weiterer Bestandteil der Erfindung besteht darin, dass die Verwendung von Genveränderungen in GNAQ dazu geeignet den weiteren verlauf der Erkrankung vorherzusagen. 12A zeigt den Zeitpunkt bis zum Auftreten von Metastasen in Abhängigkeit vom GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus.
Hierbei ist das Metastasierungsririko bei Patienten mit C-Allel um ca. das 2-fache erhöht. Die mediane Zeit bis zur Metastasierung beträgt 108 Monate bei GC/TT- und GC/GC Genotyp, hingegen 64 Monate beim TT/TT-Genotyp. Eine ähnliche Beziehung wird gefunden, wenn die Zeit bis zur Tumorprogression untersucht wird (12B). Hierunter verstehen wir, das Auftreten von Metastasen oder das Wiederauftreten des Tumors mit höherem Staging oder Grading. Der Kurvenverlauf ist für die Genotypen signifikant verschieden (p = 0.045, Logrank-Test, wobei den GC-Genotypträgern der günstigere Verlauf zugeordnet wird. Schließlich wird der Zusammenhang zwischen GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus und Überleben dargestellt (12C). Auch hier erkannt man wiederum, dass Patienten mit dem GNAQ TT//TT-Genotyp früher versterben als Patienten mit dem GC-Allel. Die Überlebenszeit beträgt im Median 102 Monate bei Patienten mit dem GC-Allel, hingegen nur 66 Monate für den TT/TT-Genotyp.
Verwendung von Genveränderungen im Gen GNAQ zur Vorhersage von Krankheitsrisiken und Verläufen
Da die vielfältigen Funktionen von Gαq gut bekannt sind können Genveränderungen im Gen GNAQ das Risiko für viele unterschiedliche Krankheiten erhöhen bzw. Krankheitsverläufe beeinflussen. Es ist generell nicht möglich, alle Krankheiten des Menschen und der Verläufe zu untersuchen. Wir haben dies hier jedoch exemplarisch für drei unterschiedliche Krankheiten gezeigt: die Linksherzhypertrophie, CLL, und Harnblasenkarzinom. Diese Daten belegen eindeutig die Verwendbarkeit der Genveränderungen im Gen GNAQ für den hier beschriebenen Zweck. Diese Erkrankungen stehen a priori in keinerlei Zusammenhang.
Pharmakogenetik-Diagnostik der Wirksamkeit von Pharmaka, der Potenz und Effizienz von Pharmaka und dem Auftreten unerwünschter Wirkungen
Grundlagen und Ziele der Pharmakogenetik
Die Wirksamkeit von Arzneimitteln und/oder das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen wird neben den spezifischen Stoffeigenschaften der chemisch definierten Produkte durch eine Reihe von Parametern definiert. Zwei wichtige Parameter, die erzielbare Plasmakonzentration und die Plasmahalbwertszeit bestimmen in hohen Maße die Wirksamkeit oder Unwirksamkeit von Pharmaka oder das Auftreten unerwünschter Wirkungen. Die Plasmahalbwertszeit wird unter anderem dadurch bestimmt mit welcher Geschwindigkeit bestimmte Pharmaka in der Leber oder anderen Körperorganen zu wirksamen oder unwirksamen Metaboliten verstoffwechselt und mit welcher Geschwindigkeit sie aus dem Körper ausgeschieden werden, wobei die Ausscheidung über die Nieren, über die Atemluft, über den Schweiß, über die Spermaflüssigkeit, über den Stuhl oder über andere Körpersekrete erfolgen kann. Daneben wird die Wirksamkeit bei oraler Gabe durch den sog. "first-pass-Effekt" limitiert, da nach Resorption von Pharmaka über den Darm ein bestimmter Anteil in der Leber zu unwirksamen Metaboliten verstoffwechselt wird.
Mutationen oder Polymorphismen in Genen metabolisierender Enzyme können die Aktivität derselben in der Weise verändern, dass deren Aminosäurezusammensetzung verändert wird, wodurch die Affinität zum metabolisierende Substrat erhöht oder erniedrigt wird und damit der Metabolismus beschleunigt oder verlangsamt sein kann. In ähnlicher Weise können Mutationen oder Polymorphismen in Transportproteinen die Aminosäurezusammensetzung in der Weise verändern, dass der Transport und damit die Ausscheidung aus dem Körper beschleunigt oder verlangsamt wird.
Zur Auswahl der für einen Patienten optimal geeigneten Substanz, der optimalen Dosierung, der optimalen Darreichungsform und zur Vermeidung unerwünschter, z.T. gesundheitsschädlicher oder tödlicher Nebenwirkungen ist die Kenntnis von genetischen Polymorphismen oder von Mutation, die zur Änderung der Genprodukte führen, von herausragender Bedeutung.
Die Wirkung von Hormonen im menschlichen Körper und die Bedeutung von Polymorphismen in Hormonrezeptoren
Ein Vielzahl von Hormonen und Peptidhormonen des menschlichen Körpers aber auch Rezeptorantagonisten üben ihre Wirkung an sogenannten Rezeptoren der Körperzellen aus. Dies sind Proteine unterschiedlicher Zusammensetzung. Nach Aktivierung dieser Rezeptoren müssen diese Signale ins Zellinnere geleitet werden, was über die Aktivierung von heterotrimeren G-Proteinen vermittelt wird. Solche G-Proteine sind aus unterschiedlichen α-, β- und γ- Untereinheiten zusammengesetzt. Diese Rezeptoren lassen sich, je nach Aktivierbarkeit durch definierte Hormone, in bestimmte Gruppen unterteilen. Dem Fachmann ist bekannt, dass Mutationen oder Polymorphismen in bestimmten Rezeptoren die Wirksamkeit bestimmter Agonisten oder Antagonisten an diesen Rezeptoren determinieren können. So beeinflusst ein häufiger Gly16Arg- Polymorphismus im Gen, das für den β2-Adrenozeptor kodiert, die Stärke der Ansprechbarkeit auf das β2-Sympathomimetikum Salbutamol (Martinez FD, et al. Association between genetic polymorphisms of the beta2-adrenoceptor and response to albuterol in children with and without a history of wheezing. J Clin Invest. 1997 Dec 15;100(12):3184-8). Polymorphismen im D2-Rezeptorgen bestimmen die Häufigkeit des Auftretens von Dyskinesien bei der Behandlung des Morbus Parkinson (Parkinson's disease) mit Levadopa (Oliveri RL, et al.; Dopamine D2 receptor gene polymorphism and the risk of levodopa-induced dyskinesias in PD. Neurology. 1999 Oct 22;53(7):1425-30): Polymorphismen im μ-Opiatrezeptor-Gen bestimmen die analgetische Wirksamkeit von Opiaten (Uhl GR, et al. The mu opiate receptor as a candidate gene for pain: polymorphisms, variations in expression, nociception, and opiate responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jul 6;96(14):7752-5).
Die genannten Genveränderungen in spezifischen Rezeptoren können nur in der Weise zur Diagnostik der Wirkungen von Pharmaka benützt werden, als diese Pharmaka spezifische Agonisten oder Antagonisten an den betrachteten Rezeptoren sind. Wünschenswert ist hingegen eine individuelle Diagnostik der generellen Ansprechbarkeit gegenüber allen Pharmaka und die individuelle Vorhersage des Risikos unerwünschter Wirkungen unter Therapie mit Pharmaka.
Die Diagnostik der Aktivierbarkeit von G-Proteinen erlaubt eine generelle Diagnostik der Wirksamkeit von Pharmaka, deren optimale Dosierung und das Auftreten von Nebenwirkungen.
Unter Pharmaka verstehen wir generell Stoffe, die dem menschlichen Körper von außen zugeführt werden, um bestimmte Zustände herzustelle. Solche Stoffe können Hormone, nieder- oder hochmolekulare Substanzen, Peptide- oder Proteine, Antikörper u.v.m. sein.
Die meisten zur Behandlung von Krankheiten, körperlichen Fehlfunktionen oder Befindlichkeitsstörungen eingesetzten Pharmaka sind Hormone, Agonisten an Hormonrezeptoren, Antagonisten an Hormonrezeptoren oder andere Substanzen, welche die Expression von Rezeptoren oder die Konzentration von Hormonen direkt oder indirekt beeinflussen. Eine Reihe von Pharmaka übt diesen Einfluss dadurch aus, dass unter Therapie mit solchen Substanzen physiologische Gegenregulationen erfolgen, welche die Konzentrationen von Hormonen erhöhen, die G-Proteingekoppelte Rezeptoren aktivieren. Als allgemein bekanntes Beispiel sei hier die Therapie mit harntreibenden Substanzen (Diuretika), insbesondere Schleifendiuretika und Thiaziddiuretika genannt. Der bei Therapie auftretende Verlust von Kochsalz und die Blutdrucksenkung führen zur Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteronsystems. Das vermehrt gebildete Hormon Angiotensin II stimuliert eine vermehrte Resorption von Natrium in der Niere, stimuliert die Salzaufnahme, erhöht den Blutdruck durch einen direkten vasokonstriktorischen Effekt auf glatte Gefäßmuskelzellen und induziert Proliferationsvorgänge. Es ist allgemein bekannt, dass diese von Angiotensin II hervorgerufenen Mechanismen nach Kopplung des Hormons an Rezeptoren erfolgt, welche Ihre Wirkung über eine Aktivierung heterotrimerer G-Proteine vermitteln. Die Effizienz dieser Wirkungen sind dann vorhersagbar, wenn die Stärke der Aktivierbarkeit von G-Proteinen diagnostiziert werden kann. Andere Pharmaka üben Ihre Wirkung dadurch aus, dass sie die Wiederaufnahme von aus Neuronen freigesetzten Transmittern, z.B. Noradrenalin, Adrenalin, Serotonin oder Dopamin, hemmen. Hier kann als Beispiel das Pharmakon Sibutramin genannt werden, welches im Zentralnervensystem die Wiederaufnahme von Serotonin und Noradrenalin hemmt, dadurch das Hungergefühl reduziert und die Thermogenese steigert. Entsprechend kann Sibutramin zur Therapie der Adipositas eingesetzt werden. Da Noradrenalin und Serotonin G-Protein-gekoppelte Rezeptoren aktivieren, ist die Diagnostik der Aktivierbarkeit von G-Proteinen zur Vorhersage der Wirksamkeit von Sibutramin und dem Auftreten typischer, Sibutramin-assoziierter Nebenwirkungen (z.B. Anstieg von Herzfrequenz und Blutdruck) in besonderem Maße geeignet.
Der Erfindung liegt nun zugrunde, dass ein Verfahren entwickelt wurde, das generell zur Diagnostik der Aktivierbarkeit von G-Proteinen geeignet ist. Hierzu werden eine oder mehrere Polymorphismen im Gen GNAQ untersucht, das für die humane Gαq-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine kodiert. Besonders geeignet sind hierfür Polymorphismen, welche die Diagnose des Auftretens oder des Nichtauftretens eines alternativen Spleißvorgangs des Gens oder eine geänderte Expression von Gαq vorhersagen. Bei Überexpression kommt es vorhersagbar zu einer gesteigerten Aktivierbarkeit von heterotrimeren G-Proteinen und zur verstärkten Aktivierbarkeit aller Zellen des menschlichen Körpers. Damit erlaubt eine Bestimmung des Vorliegens von Polymorphismen in GNAQ die Diagnostik der Wirksamkeit und unerwünschten Wirkungen von Arzneimitteln, insbesondere Agonisten und Antagonisten aller Rezeptoren, deren Wirkungen über heterotrimere G-Proteine vermittelt werden. Daneben können solche Polymorphismen in GNAQ dazu verwendet werden, die Wirkungen von Pharmaka zu diagnostizieren, die entweder indirekt oder infolge von Gegenregulationsmechnanismen des Körpers die Konzentrationen von endogenen Hormonen erhöhen oder erniedrigen, deren Rezeptoren heterotrimere G-Proteine aktivieren. Somit erlaubt die Erfindung eine Diagnostik von Wirkungen und unerwünschten Wirkungen aller Pharmaka und beschränkt sich nicht auf Pharmaka die in agonistischer oder antagonistischer Weise spezifische Rezeptoren beeinflussen. Zusätzlich kann die Diagnostik des Allel- oder Haplotypstatus in GNAQ dazu eingesetzt werden, die individuell optimale und verträgliche Dosierung von Arzneimitteln zu ermitteln.
Zur Diagnostik einer gesteigerten oder reduzierten Aktivierbarkeit von G-Proteinen dient insbesondere der Nachweise des GC(-909/-908)TT-Polymorphismus entweder alleine oder in allen denkbaren Kombination.
Daneben können zur Diagnostik alle weiteren Genveränderungen in GNAQ verwendet werden, die in einem Kopplungsungleichgewicht zu diesen Polymorphismen stehen und/oder den alternativen Spleißvorgang oder die Expression zusätzlich fördern oder hemmen.
Diese Genveränderungen können mit beliebigen, dem Fachmann geläufigen Verfahren nachgewiesen werden, z.B. direkte Sequenzierung, Restriktionsanalyse, reverse Hybridisierung, Dot-blot- oder Slot-blot-Verfahren, Massenspektrometrie, Tagman^®- oder Light-Cycler^®-Technologie, Pyrosequencing etc. Ferner können diese Genpolymorphismen gleichzeitig nach Mulitplex-PCR und Hybridisierung an ein DNA-Chip detektiert werden. Daneben können zur Diagnostik einer gesteigerten Aktivierbarkeit von G-Proteinen auch andere Verfahren eingesetzt werden, die den direkten Nachweis des Expressionsniveaus von Gαq oder Spleißvarianten von Gαq ermöglichen.
Das genannte Verfahren eignet sich insbesondere zur Diagnostik der Wirkung von Agonisten oder Antagonisten an Rezeptoren, deren Wirkungen bekanntermaßen von G-Proteinen vermittelt werden. Hierzu werden die folgenden Beispiele genannt, wobei die Liste der Beispiele verlängert werden könnte:

1. Adrenerge Rezeptoren, inbesondere α- und β-Adrenozeptoren und deren Isoformen und Untergruppen, d.h. α1- und α2-Adrenozeptoren sowie β1-, β2-, β3 und β4-Adrenozeptoren
2. Muskarinrezeptoren und deren Isoformen, z.B. m1-, m2-, m3-, m4 und m5-Muskarinrezeptoren und deren Subtypen. Typische Antagonisten an Muskarinrezeptoren sind beispielsweise Atropin, Scopolamin, Ipratroprium, Pirenzepin und N-Butylscopolamin. Typische Agonisten sind Carbachol, Bethanechol, Pilocarpin etc.
3. Dopaminrezeptoren, z.B. D1-, D2-, D3-, D4-, und D5-Rezeptoren und deren Isoformen und Spleißvarianten
4. Serotoninrezeptoren, z.B. 5-HT1- 5-HT2-, 5-HT3-, 5-HT4-, 5HT-5, 5HT-6 und 5-HT7-Rezeptor und deren Subtypen, Isoformen und Spleißvarianten. Typische Agonisten sind Sumatriptan und Cisaprid, Antagonisten sind beispielsweise Ondansetron, Methysergid, Buspiron und Urapidil.
5. Endothelinrezeptoren und deren Subtypen, Isoformen und Spleißvarianten
6. Bradykininrezeptoren, z.B. B1- und B2-Rezeptoren und deren Subtypen, Isoformen und Spleißvarianten
7. Angiotensinrezeptoren, z.B. AT II Typ1 und Typ2 Rezeptor, typische Antagonisten am AT II-Rezeptor sind Losartan und andere Sartane.
8. Rezeptoren für Endorphine und Opiate, z.B. der μ-Opiatrezeptor
9. Chemokinrezeptoren CCR1-12 und CXCR1-8 für z.B. Interleukin-1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, stromal cell-derived factor, MCP1-5, TARC, Lymphotactin, Fractalkine, Eotaxin 1-2, NAP-2, LIX etc.
10. Adenosinrezeptoren und deren Subtypen, Isoformen und Spleißvarianten
11. Rezeptoren für Thrombin (Protease-aktivierte Rezeptoren)
12. Rezeptoren für Lyso-Phophatidsäure, Phosphatidsäure, Rezeptoren für Sphingosinphosphate und deren Derivate
13. Rezeptoren für Prostaglandine und Thromboxane, z. B. für PGE1, PGE2, PGF, PGD2, PGI2, PGF2α, Thromboxan A2, etc.
14. Rezeptoren für Neuropetide, z.B. NPY1-5
15. Histaminrezeptoren, z.B. H1-H3-Rezeptoren
16. Rezeptoren für Plättchen-aktivierender Faktor (PAF-Rezeptor)
17. Rezeptoren für Leukotriene
18. Rezeptoren für Insulin, Glucagon, Insulin-like growth factor (IGF-1 und IGF-2), Epidermal Growth Factor (EGF) und platelet-derived growth factor (PDGF)
19. Rezeptoren für Wachstumshormon (GH), Somatostatin (SSTR1-5), thyreotropes Hormon (TSH), Oxytocin, Prolactin, Gonadotropine
20. Rezeptoren für Zytokine, z.B. Interferone
21. Rezeptoren für Purine
22. Orphanrezeptoren, deren Wirkungen durch G-Proteine vermittelt werden.
23. Rezeptoren für Leptin
24. CpG-Oligonucleotide

Vorhergesagt werden können ferner die Wirkungen von Pharmaka, welche die Wiederaufnahme, den Abbau oder die Neusynthese von Neurotransmittern beeinflussen oder bei denen unter Therapie Veränderungen bei der Expression oder Ansprechbarkeit der oben genannten Rezeptoren auftreten (z.B. Sibutramin, Fluoxetin). Diagnostiziert werden können außerdem die Wirkungen aller Pharmaka, welche auf direktem oder indirektem Wege auch in Folge einer physiologischen Gegenreaktion die Konzentrationen von Agonisten, welche die oben genannten Rezeptoren aktivieren, verändern. Vorausgesagt werden kann ferner der Einfluss der Strahlentherapie bei Krebspatienten.
Insbesondere die Wirkungen und unerwünschten Wirkungen der folgenden Pharmaka aus den folgenden Indikationsbereichen können diagnostiziert werden:

1. Antihypertensiva, z.B. β-Blocker (Propanolol, Bisprolol, etc.), Diuretika (Hydrochlorothiazid und weitere Thiaziddiuretika; Furosemid, Piretanid und weitere Schleifendiuretika, Chlorthalidon), α1-Adrenozeptorblocker (z.B. Doxazosin, Prazosin), Angiotensinrezeptor-Blocker (z.B. Losartan), ACE-Hemmer (Enalapril, Captopril, Ramipril etc.), Ca²⁺-Kanalblocker (z.B. Nifedipin, Verapamil, Amlodipin, Felodipin), Clonidin, Reserpin, Renin- Inhibitoren
2. Pharmaka zur Behandlung der Herzinsuffizienz, z.B. β-Blocker (z.B. Propanolol, Metoprolol), ACE-Hemmer (z.B. Captopril, Enalapril, Ramipril, etc.), Angiotensin-Rezeptorblocker (z.B. Losartan), Digitalisglykoside, Katecholamine, Diuretika.
3. Pharmaka zur Behandlung des niedrigen Blutdrucks oder einer Herzinsuffizienz, z.B. α- und β-Smpathomimetika (Effortil, Adrenalin, Noradrenalin, Dobutamin, β-Adrenozeptorblocker, ACE-Hemmer, Angiotensin II-Rezeptorblocker.)
4. Pharmaka zur Behandlung der Migräne, z.B. Sumatriptan, Rizatriptan, Zolmitriptan und weitere Agonisten an Serotoninrezeptoren, β-Blocker (Propanolol, Timolol), Ergotamin und Dihydroergotamin
5. Analgetika vom Morphintyp (Morphin, Codein, etc.)
6. Pharmaka zur Behandlung der koronaren Herzkrankheit wie Adenosin, β-Blocker (z.B. Propanolol, Acebutolol), Nitrate und Ca²⁺-Kanalblocker
7. Pharmaka zur Behandlung psychiatrischer Erkrankungen (Schizophrenie, manisch-depressive Erkrankungen, Psychosen, Depressionen) und von Suchtkrankheiten wie Alkoholismus, (z.B. Fluoxetin, Paoxetin, Imipramin, Desipramin, Doxepin, Mianserin, Trazodon, Lofepramin), Angstsyndrome (Diazepam, etc.), welche z.B. das dopaminerge, serotonerge oder adrenerge System beeinflussen. Aber auch Pharmaka, die ihre Wirkung über Rezeptoren für GABA-, Glycin- oder Glutamat bzw. deren Derivate vermitteln.
8. Pharmaka zur Behandlung des Morbus Alzheimer (z.B. Tacrin) und zur Behandlung des Morbus Parkinson (z.B. Bromocriptin, L-DOPA, Carbidopa, Biperiden, Seleginil, etc.) welche Transmitterkonzentrationen an z.B. muskarinergen oder dopaminergen Substanzen, beeinflussen
9. Pharmaka zur Behandlung von Asthma bronchiale, welche z.B. entweder direkt bronchodilatierend oder antiinflammatorisch wirken, z.B. Salbutamol, Terbutalin, Albuterol, Theophyllin, Montelukast, Zafirlukast, Cromoglicinsäure, Ipratropiumbromid. Zu solchen Pharmaka gehören auch Antikörper die gegen bestimmte Proteine und Rezeptoren gerichtet sind.
10. Pharmaka zur Behandlung von Motilitätsstörungen des Magens oder Darms und Pharmaka zur Behandlung des Reizdarmsyndroms (irritable bowel syndrome) z.B. N-Butylscopolamin, Pirenzepin, Metoclopramid)
11. Pharmaka zur Behandlung der Adipositas, welche entweder direkt lipolytisch wirksame Rezeptoren aktivieren, z.B. β3-adrenerge Agonisten, oder zentral wirksam sind, z.B. Sibutramin, oder ähnliche Substanzen, die das Sättigungsgefühl verändern oder welche die Thermogenese beeinflussen. Dazu gehören auch Pharmaka, welche die Magenentleerung beeinflussen.
12. Pharmaka zur Behandlung chronischer Entzündungsvorgänge oder von Störungen des Immunsystems, z.B. Zytokine (Interferone) bei der Therapie von Virushepatitiden oder Interleukin-2 bei HIV-Infektion. Zu solchen Erkrankungen zählen auch Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Asthma, Psoriasis, Neurodermitits, Heuschnupfen. Dazu gehören auch Antikörper gegen Zytokine oder gegen Zytokinrezepotren, z:b. gegen TNFα
13. Pharmaka zur Behandlung der Gestose und der Präeklampsie/Eklampsie und des HELLP-Syndroms
14. Pharmaka zur Behandlung von Fertilitätsstörungen oder zur Beseitigung von Zyklusstörungen bei der Frau oder zur Empfängnisverhütung
15. Pharmaka zur Behandlung von Herzrhythmusstörungen
16. Antidiabetika (Acarbose, Insulin, Troglitazone, Metformin, etc.)
17. Hypnotika, Antiemetika und Antiepileptika
18. Pharmaka zur Behandlung von Störungen des Sexuallebens, z.B. der erektilen Dysfunktion, der weiblichen sexuellen Dysfunktion, Libidomangel, Orgasmusstörungen (Phosphodiesteraseinhibitoren wie Sildenafil, Prostaglandin E1, Agonisten an Dopamin-Rezeptoren, z.B. Apomorphin, Yohimbin, Phentolamin)
19. Pharmaka zur Therapie von Krebserkrankungen und Chemotherapeutika, z.B. 5-Fluoruracil, Antikörper gegen Proteine und Rezeptoren (z.B. gegen HER-2), Substanzen, die Tyrosinkinasen blockieren, etc.
20. Pharmaka zur Behandlung von allergischen und Tumorerkrankungen, bei denen die Wirkung über die Verabreichung von CpG-Nukleotiden erzielt wird.
21. Pharmaka zur Behandlung des Adipositas, des metabolischen Syndroms oder des Diabetes, z. B. Sibutramin, Orlistat, Leptin, Topiramat, Glinide, Glitazone, Biguanide etc.
22. Pharmaka zur Behandlung der HIV-Infektion, auch Antikörper und Rezeptorblocker. Vorhersage des Entstehens einer Lipodystrophie unter Therapie mit Proteinaseinhibitoren.

Selbstverständlich ist es nicht möglich, im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung den Nachweis zu führen, dass alle Pharmakawirkungen durch den GNAQ-Genstatus determiniert werden. Naturgemäß kann man auch nicht die genotypabhängigen Wirkungen von Pharmaka untersuchen, die erst in Zukunft entwickelt und eingesetzt werden. Dagegen sollen hier Beispiele für Pharmaka mit unterschiedlichen Wirkmechanismen exemplarisch gezeigt werden, so dass diese Befunde generalisiert werden können.
Als Beispiel für die allgemeine Verwendbarkeit des GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus zur Vorhersage von Arzneimittelwirkungen wurde bei Menschen die Vasokonstriktoren Angiotensin II, Noradrenalin oder Endothelin in die Haut gespritzt und die nachfolgende Änderung der Durchblutung registriert (13). Man erkennt nach Gabe aller drei Hormone, die an unterschiedliche Rezeptoren koppeln, dass die Reduktion der Hautdurchblutung beim GC/GC-Genotyp am stärksten ausgeprägt ist, was durch mit der gesteigerten Expression von Gαq erklärt werden kann.
Ein weiterer Beleg für die generelle Anwendung von Genveränderungen im Gen GNAQ zur Vorhersage von Pharmakawirkungen ergibt sich auch aus dem beobachteten Genotyp abhängigen Krankheitsverläufen bei Harnblasenkarzinom Diese Patienten wurden alle mit unterschiedlichen Pharmaka behandelt. Die durch Verwendung von Genveränderungen im Gen GNAQ sichtbar gemachten unterschiedlichen Krankheitsverläufe belegen ein unterschiedliches Ansprechen auf diese Therapieformen
Einheitlichkeit der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist einheitlich. Der erste Teil der Erfindung besteht aus dem Nachweis der Genveränderungen im Gen GNAQ. Der zweite Teil der Erfindung beschreibt die Verwendung der Genveränderungen zur Vorhersage für Erkrankungsrisiken und Krankheitsverläufen. Grundlage dafür ist die geänderte Expression von Gαq auf Grund der beschrieben Genveränderungen. Diese bestimmen dann gleichzeitig ein vom Genstatus abhängiges unterschiedliches Ansprechen auf Pharmaka. Hier stellt sich die Frage, ob die gleichzeitige Verwendung von Genveränderungen für die beschriebenen Zwecke unerwartet ist, oder ob diese dem Fachmann bekannt ist. Dies soll an einem Beispiel demonstriert werden.
Dieser enge Zusammenhang im Sinne einer Einheitlichkeit wurde bereits für Genveränderungen im Gen GNB3 beschrieben. Auch mit diesen Genveränderungen, die zur Funktionsveränderung einer Gβ-Untereinheit führen, können gleichzeitig Krankheitsrisiken, Krankheitsverläufe aber auch das Ansprechen auf unterschiedliche Pharmaka vorhergesagt werden. Ein C825T-Polymorphismus im Gen GNB3 steht im Kopplungsungleichgewicht mit weiteren Polymorphismen im selben Gen, so dass spezifische Haplotypen beschrieben werden können (D. Rosskopf et al., Identification and ethnic distribution of major haplotypes in the gene GNB3 encoding the G-protein beta3 subunit. Pharmacogenetics 12 (3):209-220, 2002). Diese Genveränderungen sind mit einem erhöhten Risiko für ganz unterschiedliche Erkrankungen assoziiert, z.B. Bluthochdruck, Adipositas, Schlaganfall, Herzinfarkt, Insulinresistenz, Diabetes, aber auch Depression (P. Zill et al., Evidence for an association between a G-protein beta3-gene variant with depression and response to antidepressant treatment. Neuroreport 11 (9):1893-1897, 2000.; W. Siffert et al., G protein b3 subunit 825T allele and its potential association with obesity in hypertensive subjects. J.Hypertens. 17:1095-1098, 1999.; W. Siffert et al. Association of a human G-protein beta3 subunit variant with hypertension. Nat.Genet. 18 (1):45-48, 1998; R. A. Hegele et al., G-protein beta3 Subunit Gene Splice Variant and Body Fat Distribution in Nunavut Inuit. Genome Res. 9 (10):972-977, 1999.C. K. Naber, et al., Interaction of the ACE D Allele and the GNB3 825T Allele in Myocardial Infarction. Hypertension 36 (6):986-989, 2000; A. C. Morrison et al., G-Protein beta3 Subunit and alpha-Adducin Polymorphisms and Risk of Subclinical and Clinical Stroke. Stroke 32 (4):822-829, 2001. T. C. Wascher et al. Associations of a human G protein beta3 subunit dimorphism with insulin resistance and carotid atherosclerosis. Stroke 34 (3):605-609, 2003. D. Rosskopf et al. Interaction of the G Protein beta3 Subunit T825 Allele and the IRS-1 Arg972 Variant in Type 2 Diabetes. Eur.J.Med.Res. 5 (11):484-490, 2000.)
Gleichzeitig sind diese Genveränderungen im Gen GNB3 mit dem Ansprechen auf ganz unterschiedliche Pharmaka assoziiert. Dazu gehören auch solche, deren Wirkung nicht direkt durch G-Proteine vermittelt werden. Als Beispiele sind zu nennen: Hyhdrochlorothiazid (Wirkung nicht direkt durch G-Protein vermittelt), Sildenafil (Wirkung nicht direkt G-Protein vermittelt), Impfung gegen Hepatitis B (Wirkung nicht direkt durch G-Protein vermittelt), unterschiedliche Antidepressiva (Wirkung nicht direkt durch G-Protein vermittelt), Sibutramin (Wirkung nicht direkt durch G-Protein vermittelt), Antidiabetika (Wirkung nicht direkt durch G-Protein vermittelt), Pharmaka zur Behandlung der Leukämie (Wirkung nicht direkt durch G-Protein vermittelt). Daneben findet man erwartungsgemäß eine Vorhersage der Wirkung von Pharmaka, die G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren oder hemmen, z.B. von Clonidin, Propanolol, Noradrenalin, Endothelin, Angiotensin etc. (J. M. Fernandez-Real et al, G Protein beta3 Gene Variant, Vascular Function, and Insulin Sensitivity in Type 2 Diabetes. Hypertension 41 (1):124-129, 2003; P. Zill et al; Evidence for an association between a G-protein beta3-gene variant with depression and response to antidepressant treatment. Neuroreport 11 (9):1893-1897, 2000. R. R. Wenzel et al., Enhanced vasoconstriction to endothelin-1, angiotensin II and noradrenaline in carriers of the GNB3 825T allele in the skin microcirculation. Pharmacogenetics 12 (6):489-495, 2002. S. T. Turner et al., C825T Polymorphism of the G Protein beta(3)-Subunit and Antihypertensive Response to a Thiazide Diuretic. Hypertension 37 (2 Part 2):739-743, 2001. R. F. Schäfers et al., Haemodynamic characterization of young normotensive men carrying the 825T-allele of the G-protein beta3 subunit. Pharmacogenetics 11 (6):461-470, 2001. M. Ryden et al., Effect of the (C825T) Gbeta(3) Polymorphism on Adrenoceptor-Mediated Lipolysis in Human Fat Cells. Diabetes 51 (5):1601-1608, 2002. H. Hauner et al., Prediction of successful weight reduction under sibutramine therapy through genotyping of the G-protein beta3 subunit gene (GNB3) C825T polymorphism. Pharmacogenetics 13 (8):453-459, 2003. OH. J. Lee et al., Association between a G-protein beta3 subunit gene polymorphism and the symptomatology and treatment responses of major depressive disorders. Pharmacogenomics.J., 2003. A. Mitchell et al., Venous response to nitroglycerin is enhanced in young, healthy carriers of the 825T allele of the G protein beta3 subunit gene (GNB3). Clin.Pharmacol.Ther. 74 (5):499-504, 2003. H. Nuckel et al., The CC genotype of the C825T polymorphism of the G protein beta 3 gene (GNB3) is associated with a high relapse rate in patients with chronic lymphocytic leukaemia. Leukemia & Lymphoma 44 (10):1739-1743, 2003. J. Nürnberger et al., Effect of the C825T polymorphism of the G protein beta3 subunit on the systolic blood pressure-lowering effect of clonidine in young, healthy male subjects. Clin.Pharmacol.Ther. 74 (1):53-60, 2003. A. Serretti et al., SSRIs antidepressant activity is influenced by Gbeta3 variants. Eur.Neuropsychopharmacol. 13 (2):117-122, 2003. H. Sperling et al., Sildenafil Response is Influenced by the G Protein beta3 Subunit Gnb3 C825t Polymorphism: A Pilot Study. J.Urol. 169 (3):1048-1051, 2003. M. Lindemann et al., Role of G protein beta3 subunit C825T and HLA class II polymorphisms in the immune response after HBV vaccination. Virology 297 (2):245-252, 2002)
Die hier formulierten Ansprüche, dass Genveränderungen im Gen GNAQ generell geeignet sind, Krankheitsrisiken, – verläufe und Ansprechen auf alle Pharmaka vorherzusagen, wurden am Beispiel von Genpolymorphismen im Gen GNB3 bereits realisiert.
Figurenbeschreibung
1: Der Gαq Signalweg. Das Diagramm zeigt wie der Gαq-Weg nach Rezeptorstimulation mit vielfältigen Signaltransduktionskomponenten verbunden ist, einschließlich Ionenkanäle, Transkriptionsfaktoren und Synthese von Eicosanodien . PLC, Phospholipase C; IP3, Inositoltrisphophat; PKC, Proteinkinase C; PLA2, Phospholipase A2; AA, Arachidonsäure; MLCK, Myosin Light Chain Kinase; CaM, Calmodulin; p42/p44; p42- und p44-MAP-Kinase;
2: Intron/Exon-Struktur des humanen GNAQ und Position des GC(-909/-908)TT – Polymorphismus (nicht maßstabsgetreu)
3: Putative Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren im Promoter des Gens GNAQ; Die Zahlen auf der rechten Seite repräsentieren den Bezug zum ATG, die Zahlen auf der linken Seite beziehen sich auf den Transkriptionsstartpunkt.
4: Ergebnisse des Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) mit Konstrukten, die den GC oder den TT-Genotyp im Promoter von GNAQ enthalten. Nach Zugabe von Zellkernextrakt erkennt man eine vermehrte Bindung von Kernprotein and das „GC-Konstrukt", das eine weitere Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor SP-1 aufweist. Die Bindung wird durch einen Anti-SP-1-Antikörper oder in Gegenwart eines verdrängenden SP-1-Oligonukleotids spezifisch gehemmt
5: Konstrukte zur Messung der Promoteraktivität mittels sezernierter alkalischer Phosphatase (SEAP). Im linken Teil der Fig. sind die verwendeten Konstrukte für den Reporterassay beschrieben. Der rechte Teil der Fig. zeigt die 24h nach Transfektion von HEK-Zellen gemessene SEAP-Aktivität.
6: Genotypabhängige Aktivität des GNAQ-Promotors. Das Promotorkonstrukt -798/+89 mit jeweils dem GC- oder dem TT-Genotyp wurde in HEK-Zellen. transfeziert. Die Sekretion von alkalischer Phosphatase wurde nach Stimulation mit Serum, Angiotensin II oder nach Zugabe von Mithramycin gemessen. Man erkennt eine gesteigerte Aktivierung des Promotors mit dem GC-Genotyp und eine vermehrte Hemmung des Promotors durch Mithramycin beim GC-Genotyp.
7: Expression von GNAQ mRNA in Gewebe in Abhängigkeit vom GC(-909/-908)TT-Polymorphismus. Dargestellt ist der Quotient Gαq/β-Actin mRNA
8: Protein/DNA -Quotient im menschlichen Herzen bei Vorhofflimmern (VF) und Sinusrhythmus (SR) und Abhängigkeit des Protein/DNA-Quotienten vom GC(-909/-908)TT-Polymorphismus.
9: GNAQ GC(-909/-908)TT- Polymorphismus und Kreislaufparameter beim Gesunden. Dargestellt sind Schlagvolumen des Herzen (links) und totaler peripherer Widerstand (rechts) in Abhängigkeit vom Genotyp
10: GNAQ GC(-909/-908)TT- Polymorphismus und Serum Cholesterin beim Gesunden.
11: GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus und Krankheitsprogression bei Patienten mit CLL. Dargestellt ist die Zeit von der Erstdiagnose bis zum Therapiebeginn als Maß für die Krankheitsprogression. Man erkennt den günstigeren Krankheitsverlauf beim TT/TT-Genotyp
12A: GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus und Zeit bis zur Metastasierung bei Patienten mit Harnblasenkarzinom
12B: GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus und Zeit bis zur Tumorprogression bei Patienten mit Harnblasenkarzinom
12C: GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus und Überleben bei Patienten mit Harnblasenkarzinom
13: GNAQ GC(-909/-908)TT-Polymorphismus Vasokonstriktion nach Injektion von Noradrenalin, Angiotensin, oder Endothelin in die Haut. Dargestellt ist die auf die Injektion folgende Veränderung der Hautdurchblutung.

Claims

Verwendung einer Genveränderung im humanen Gen GNAQ zur Vorhersage von Krankheitsrisiken.
Verwendung einer Genveränderung im humanen Gen GNAQ zur Vorhersage von Krankheitsverläufen.
Verwendung zur Auffinden von Drug-Targets.