DE102004025080A1

DE102004025080A1 - Multizelluläre Testsysteme

Info

Publication number: DE102004025080A1
Application number: DE102004025080A
Authority: DE
Inventors: Charli Dr. Kruse; Günter R. Prof. Dr. Fuhr
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Celltec Systems De GmbH
Priority date: 2003-06-23
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2024-05-22
Also published as: DE102004025080B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Substanzen unter Verwendung multizellulärer, insbesondere organähnlicher, in vitro-Testsysteme und Vorrichtungen und Kits zur Durchführung dieser Verfahren.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Testen von Substanzen unter Verwendung multizellulärer, insbesondere organähnlicher, in vitro-Testsysteme und Vorrichtungen und Kits zur Durchführung dieser Verfahren.
Die Durchführung von Tierversuchen für pharmazeutische und kosmetische Untersuchungen stellt einen enormen Kostenfaktor dar und ist oftmals ethisch problematisch. Für die Kosmetikindustrie sind sie sogar in vielen Ländern, z.B. in Europa, völlig verboten. Die Entwicklung multizellulärer, insbesondere humaner, in vitro-Testsysteme stellt für viele Untersuchungen eine gute Alternative dar und solche humanen Testsysteme können natürlichen menschlichen Geweben/Organen in ihren Eigenschaften sogar näher als Tiermodelle kommen.

Im Stand der Technik wurden als in vitro-Testsysteme bisher sowohl Gewebekulturen aus explantierten Gewebeproben (siehe z.B. US 5726009 und US 2002/192638) als auch Kulturen differenzierter Zellen, die aus Stammzellen erhalten wurden, eingesetzt. Der erstere Ansatz hat den Nachteil, daß es schwierig ist, die Kulturen über längere Zeiträume aufrechtzuerhalten und größere Mengen an Zellen zu produzieren, ohne die Eigenschaften der Zellen bzw. des Gewebes zu verändern. Beim zweiten Ansatz werden die Stammzellen herkömmlicherweise durch Zugabe spezieller Faktoren gezielt zur Differenzierung in einzelne Zelltypen, z.B. Nervenzellen, Fibroblasten etc., veranlaßt und dann die Wirkung verschiedener Chemikalien, z.B Arzneiwirkstoffe, auf diese speziellen Zellen untersucht. Zur Untersuchung eines breiten Spektrums von differenzierten Zel len müssen verschiedene spezielle Zellkulturen hergestellt und getestet werden. Bei Verwendung herkömmlicher adulter Stammzellen mit einem begrenzten Differenzierungsspektrum efordert dies gewöhnlich die Züchtung der differenzierten Zellkulturen aus unterschiedlichen Ausgangsstammzellen mit oft sehr unterschiedlichen Anforderungen an die Wachstumsbedingungen. Dies ist in der Regel mit einem Mehraufwand an Zeit und Kosten verbunden. Dieser Nachteil kann durch Verwendung pluripotenter embryonaler Stammzellen, die in unterschiedlichste Zelltypen aller drei Keimblätter differenzieren können, teilweise vermieden werden. Allerdings ist die Verwendung humaner embryonaler Stammzellen aus ethischen Gründen ebenfalls bedenklich und deren Verfügbarkeit ist begrenzt. Überdies sind selbst bei der Verwendung pluripotenter embryonaler Stammzellen in diesen herkömmlichen Testsystemen mehrere verschiedene und räumlich getrennte Zellkulturen erforderlich. Ein weiterer, wesentlicher Nachteil dieser Zellmonokulturen besteht darin, daß die Wirkung einer Substanz auf einen Verbund verschiedener Zellen, wie er in einem natürlichen Gewebe oder Organ vorliegt, nicht untersucht werden kann.

Demgemäß besteht die Aufgabe der Erfindung darin, verbesserte multizelluläre, insbesondere humane, in vitro-Testsysteme und Verfahren bereitzustellen, mit denen die Wirkung von Substanzen auf verschiedene Zelltypen und insbesondere auf einen Verbund verschiedener Zelltypen, wie er in natürlichen Geweben und Organen vorliegt, schnell und einfach festgestellt werden kann.

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß multipotente oder pluripotente adulte Stammzellen, wie sie aus exokrinem Drüsengewebe gewonnen werden können (PCT 2004/003810), mit einfachen Mitteln zur Aggregierung und Differenzierung in dreidimensionale Zellaggregate, sogenannte organoide Körper oder Organoid Bodies, veranlasst werden können, welche bereits ohne Zugabe spezieller Differenzierungsfaktoren ein Spektrum von mindestens zwei Zelltypen enthalten. Diese organoiden Körper wachsen bei ausreichender Nährstoffversorgung ständig weiter und entwickeln gewebe- oder organartige Strukturen, in diesem Stadium werden sie auch als Gewebekörper bezeichnet. Setzt man diese organoiden Körper chemischen Substanzen aus, kann deren Wirkung, falls vorhanden, durch eine morphologische oder anderweitig nachweisbare Veränderung dieser organoiden Körper bzw. der darin enthaltenen Zelltypen festgestellt werden. Auf diese Weise können verschiedene Zelltypen gleichzeitig oder nacheinander schnell getestet werden und insbesondere auch gewebe- bzw. organähnliche Zellverbände untersucht werden.

Somit werden die obengenannten Probleme erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Testen von Substanzen gemäß Anspruch 1 sowie von Vorrichtungen und Kits zur Durchführung dieses Verfahrens nach den Ansprüchen 23, 24 und 28. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Zur Bildung der erfindungsgemäß verwendeten organoiden Körper oder Organoid Bodies werden multipotente oder pluripotente adulte Stammzellen verwendet. Vorzugsweise werden diese pluripotenten Stammzellen aus exokrinem Drüsengewebe isoliert.

Das exokrine Drüsengewebe kann von einem erwachsenen Individuum oder juvenilen Individuum stammen. Der Begriff "adult", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich somit auf das Entwicklungsstadium des Ausgangsgewebes und nicht auf dasjenige des Donors, aus dem das Gewebe stammt. "Adulte" Stammzellen sind nicht-embryonale Stammzellen.

Vorzugsweise wird das exokrine Drüsengewebe aus einer Speicheldrüse, Tränendrüse, Talgdrüse, Schweißdrüse, aus Drüsen des Genitaltrakts, einschließlich Prostata, oder aus gastrointestinalem Gewebe, einschließlich Pankreas, oder sekretorischem Gewebe der Leber isoliert. In einer stark bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um acinäres Gewebe. Ganz besonders bevorzugt stammt das acinäre Gewebe aus dem Pankreas, der Ohrspeicheldrüse oder Unterkieferspeicheldrüse.

Die aus solchen Quellen erhaltenen adulten Stammzellen sind leicht zu isolieren und in einer stabilen Langzeitkultur ohne Feederzellschicht oder spezielle Zusätze im weitgehend undifferenzierten Zustand zu halten. Der Begriff Feederzellen, wie hier verwendet, umfasst alle Zellen, die das Wachstum der eigentlich zu kultivierenden Zellen dadurch fördern, dass sie Wachstumsfaktoren freisetzen und/oder eine extrazelluläre Matrix bereitstellen, bzw. die Differenzierung der Stammzellkultur verhindern.

Diese adulten Stammzellen können ohne Zusatz spezieller Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren auf einfache Weise zur Differenzierung angeregt werden, indem sie unter räumlichen Bedingungen kultiviert werden, welche für einen dreidimensionalen Kontakt der Zellen sorgen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Bedingungen die Kultivierung in hängenden Tropfen, wie sie für embryonale Stammzellen bereits beschrieben wurde (Wobus et al., Biomed. Biochim. Acta 47:965–973 (1988). Dieses Verfahren wird nachfolgend in den Beispielen noch näher beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass alternative Kultivierungsverfahren, die für den ge wünschten dreidimensionalen Kontakt der Zellen sorgen und dem Fachmann bekannt und verfügbar sind, ebenso verwendet werden können. Beispiele für solche alternativen Verfahren sind die Kultivierung in bewegter Suspensionskultur, die Kultivierung in einem elektromagnetischen Feldkäfig oder Laser-Tweezer, die Kultivierung auf Oberflächen, an denen die Zellen nicht oder schlecht haften, oder die Aussaat nicht resuspendierter Zellen der Primärkultur. Solche Oberflächen können z.B. Glas, Polystyrol oder mit einer Anti-Adhäsionsschicht behandelte Oberflächen, z.B. PTFE- oder Poly-HEMA-beschichtete Oberflächen, sein.

Unter diesen Bedingungen entwickeln sich spontan dreidimensionale Zellverbände oder Zellaggregate, welche in Anlehnung an bereits für embryonale Stammzellen beschriebene "embryoid bodies" als "organoid bodies" oder organoide Körper bezeichnet wurden. Diese organoiden Körper oder Organoid Bodies können in Suspensionskulturen oder Adhäsionskulturen überführt und weiter kultiviert werden. Bei ausreichender Nährstoffversorgung wachsen diese organoiden Körper weiter und können Durchmesser von einigen Millimetern oder mehr erreichen. Diese großen Organoid Bodies zeigen eine gewebeartige Struktur und werden in diesem Stadium zur Unterscheidung von den einfachen Zellaggregaten auch als "Gewebekörper" bezeichnet.

Bringt man die Organoid Bodies wieder in Oberflächenkultur, entsteht aus auswachsenden einzelnen Zellen eine zelluläre Monoschicht, aus der Multilayerbereiche hervorgehen, aus denen spontan sekundäre Organoid Bodies mit vergleichbaren Eigenschaften wie denjenigen der primären Organoid Bodies gebildet werden. Die erfindungsgemäßen Organoid Bodies können z.B. bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs eingefroren gelagert werden, ohne ihre Lebensfähigkeit, Vermehrungsfähig keit, Wachstumsfähigkeit und Differenzierbarkeit zu verlieren.

Die organoiden Körper enthalten verschiedene Zelltypen aller drei Keimblätter. Zur Differenzierung sind keine Differenzierungsfaktoren notwendig und die Zellen müssen auch nicht transplantiert werden, um zu differenzieren. Es kann jedoch von Vorteil sein, solche Differenzierungsfaktoren einzusetzen, um gezielt größere Mengen eines bestimmten Zelltyps herzustellen bzw. um organoide Körper mit einer bestimmten Zelltypzusammensetzung zu erzeugen.

Differenzierungsfaktoren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen z.B. bFGF ("basic fibroblast growth factor") zur verstärkten Bildung von Herzzellen und Fibroblasten, VEGF ("vascular endothelial growth factor"), DMSO und Isoproterenol, Fibroblastenwachstumsfaktor 4 (FGF4), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) zur verstärkten Bildung von Herz- und Leberzellen, TGF-beta1 ("transforming growth factor beta1") zur verstärkten Bildung von Herzzellen, EGF ("epidermal growth factor") zur verstärkten Bildung von Haut- und Herzzellen, KGF ("keratinocyte growth factor") (machmal zusammen mit Cortison) zur Bildung von Keratinozyten, Retinsäure zur verstärkten Bildung von Nerven-, Herz- und Nierenzellen, beta-NGF ("beta nerve growth factor") zur verstärkten Bildung von Gehirn-, Leber-, Pankreas- und Nierenzellen, BMP-4 ("bone morphogenic protein 4") und Activin-A zur Bildung mesodermaler Zellen generell, sind jedoch nicht darauf beschränkt.

Differenzierte Zellen, die in den organoiden Körpern enthalten sein können, umfassen Knochenzellen (Osteoblasten und Osteoclasten), Chondrozyten, Adipozyten, Fibroblasten (z.B. Haut- und Sehnenfibroblasten), Muskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, hematopoetische Zellen, sensorische Zellen, endokrine und exokrine Drüsenzellen, Gliazellen, neuronale Zellen, Oligodendrozyten, Blutzellen, Darmzellen, Herz-, Lungen-, Leber-, Nieren- oder Pankreaszellen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.

Bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren wird die zu testende Substanz in Kontakt mit den organoiden Körpern gebracht und deren Wirkung gegebenenfalls durch eine morphologische oder anderweitig nachweisbare Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen festgestellt. Bei diesem Testverfahren handelt es sich beispielsweise um ein Verfahren zur Analyse der Wirkung bekannter oder potenzieller Wirkstoffe oder Giftstoffe oder Mutagene auf alle oder spezielle Zelltypen der organoiden Körper. In einer spezielleren Ausführungsform handelt es sich um ein Verfahren zum Screenen von Arzneiwirkstoffen oder Kosmetika.

Die Testsubstanz kann von unterschiedlichster chemischer Natur sein, z.B ein Protein, Lipid, eine Nukleinsäure, z.B. RNA, DNA oder ein Derivat davon, eine niedermolekulare oder hochmolekulare chemische Verbindung, ein chemisches Element oder eine Mischung dieser Substanzen. Es können auch zwei oder mehr Testsubstanzen nacheinander oder gleichzeitig mit denselben organoiden Körpern getestet werden, um beispielsweise Wechselwirkungen der Testsubstanzen festzustellen.

Das Kontaktieren der Testsubstanz(en) mit den organoiden Körpern kann, abhängig von der Art der Testsubstanz, auf jede geeignete Weise erfolgen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt. Falls es sich bei der Testsubstanz um eine Nukleinsäure, z.B. RNA, DNA oder ein Derivat davon, handelt, kann diese(s) mit irgendeinem bekannten Verfahren der Gen technik, einschließlich der Verwendung von Vektoren, Viren, Elektroporation etc., in die Zellen der organoiden Körper eingeführt werden. Eine im Kulturmedium lösliche oder solubilisierbare Testsubstanz wird vorzugsweise einfach dem Zellkulturmedium, in dem sich die organoiden Körper befinden, zugegeben und die Organoide werden mit der Testsubstanz in geeigneten Konzentrationen für verschiedene gewünschte Zeiträume inkubiert. Gewünschtenfalls kann verbrauchtes Zellkulturmedium während der Inkubation durch frisches Medium mit der gewünschten Konzentration an Testsubstanz ersetzt werden, z.B. um die Wirkstoffkonzentration im Medium etwa konstant zu halten. Je nach Art des Wirkstoffes können die wirksamen Konzentrationen der Testsubstanz in großem Umfang variieren, können jedoch vom Fachmann unschwer durch Routineversuche bestimmt werden. Der Kontaktzeitraum kann von einigen Minuten bis einigen Stunden und mehren Tagen und Wochen variieren. Kontaktzeiträume von mehreren Wochen sind dabei nicht unüblich. Geeignete Kontaktzeiträume werden ebenfalls von der Art des Wirkstoffs abhängen und können vom Fachmann durch Routineversuche bestimmt werden. Anschließend werden die behandelten Organoide und eine Kontrolle ohne Testsubstanz, die genauso lange inkubiert wurde, einem Nachweisverfahren unterworfen.

Das Nachweisverfahren wird von der Art des Wirkstoffes und Art der zu beobachtenden Veränderung der organoiden Körper bzw. der darin enthaltenen differenzierten Zellen abhängen.

Eine Reihe von Methoden zum Nachweis der Wirkung von Arzneistoffen oder Giftstoffen auf Säugerzellen wird von A. Vickers in „In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997, beschrieben. Grundlegende Methoden für das Arzneiwirkstoff-Screening werden von Smith, C.G., „The process of New Drug Development, CRC Press, 1992, und in „Advances in Drug Discovery Tchniques", Hrsg. Alan L. Harvey, John Wiley & Sons, 1998, beschrieben.

In speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Nachweis der Wirkung einer Substanz die Anwendung eines oder mehrerer Verfahren, das oder die aus der Gruppe aus Protein-Assays, Immunoassays, enzymatischen Assays, Rezeptorbindungs-Assays, ELISA-Assays, RIA-Assays, elektrophoretischen und chromatographischen Assays, einschließlich HPLC, Northernblots, Southernblots, Westernblots, kolorimetrischen Assays, immunhistochemischen, elektrophysiologischen Methoden (d.h. Strom- Spannungs- und Impedanzmessungen), mikroskopischen und spektroskopischen Nachweismethoden ausgewählt ist bzw. sind.

Die Wirkung der Substanz kann z.B. eine Veränderung der Morphologie oder des Proliferationsvermögens, Wachstumsvermögens oder der Lebensfähigkeit aller Zelltypen oder spezieller Zelltypen der organoiden Körper sein. In diesem Fall können z.B. direkte visuelle und optische Nachweisverfahren, einschließlich zytometrischer, mikroskopischer und colorimetrischer Verfahren, günstig eingesetzt werden.

Alternativ oder gleichzeitig kann die Wirkung eine Veränderung der Aktivität spezieller oder aller Zelltypen der organoiden Körper sein. Bespielsweise kann sich diese Aktivitätsänderung in einem vermehrten oder verringerten oder erstmaligen Auftreten einer nachweisbaren Markersubstanz in oder auf den betroffenen Zellen äußern. In diesem Fall erfolgt der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz vorzugsweise über den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge einer Markersubstanz, die von speziellen oder allen Zelltypen der organoiden Körper gebildet wird.

Diese Markersubstanz kann z. B. ein Protein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper, Rezeptor, Enzym, Hormon, Ionenkanal, Neurotransmitter, Oberflächenmarker, RNA, DNA, ein Proteoglycan, ein Lektin oder eine andere geeignete Substanz sein. Einige zelltypspezifische Beispiele von Markersubstanzen werden im folgenden genannt, sind jedoch keineswegs als beschränkend anzusehen: PGP 9.5 und NF für Nervenzellen, S 100 und GFAP für Gliazellen, SMA für Muskelzellen (bzw. Myofibroblasten), Kollagen Typ II für Knorpelzellen, Amylase und Trypsin für exokrine Drüsenzellen, Insulin für endokrine Drüsenzellen, Vigilin für stark translatierende Zellen und Cytokeratin für epidermale Zellen, Kollagen Typ II für Chondrozyten, Osteonektin für Osteoblasten und Vorläuferzellen, Osteocalcin für reife Osteoblasten, CD45, CD34, CD13 für hematopoetische Zellen, cTNI („cardiac troponin I"), cTNT („cardiac troponin T") und ANF („atrial natriuretic factor") für Kardiomyozyten, Kollagenase 1 und TIMP-1 („tissue inhibitor of metalloproteinase I") für Fibroblasten, Skelett-Alpha-Aktin und Tropomyosin für gestreifte Muskelzellen, Lipoproteinlipase (LPL) für Adipozyten, Alpha-Fetoprotein für Leberzellen. Eine sehr große Anzahl solcher Markersubstanzen ist im Stand der Technik bekannt.

Diese Markersubstanzen können z.B durch Bindung an einen spezifischen Bindungspartner, der mit einer nachweisbaren Gruppe konjugiert ist, nachgewiesen werden. Die nachweisbare Gruppe kann z.B. ein Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff, eine radiaktive Markierung, Enzymmarkierung, Lumineszenzmarkierung, Magnetresonanzmarkierung oder eine andere im Stand der Technik bekannte Markierung sein. Falls die Markersubstanz ein Prote in ist, wird der Bindungspartner vorzugsweise ein markierter oder markierbarer Antikörper sein. Solche markierten Antikörper sind bereits für eine Vielzahl von Markersubstanzen bekannt und können entweder im Handel bezogen oder unschwer nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Gegebenenfalls können auch markierte oder markierbare sekundäre Antikörper verwendet werden. Der spezifische Bindungspartner kann auch ummarkiert, jedoch an eine Affinitätsäule oder einen anderen Träger gebunden sein. In diesen Fällen können Zellen, welche die Markersubstanzen auf ihrer Oberfläche aufweisen, durch die spezifische Bindung an diese Träger nachgewiesen werden.

In einigen Fällen kann die Markersubstanz auch durch ihre eigene Aktivität nachgewiesen werden, so z.B. wenn es sich um einen Ionenkanal oder Neurotransmitter handelt oder um ein Enzym, das mit einem nachweisbaren Substrat umgesetzt werden kann. Falls die Markersubstanz eine DNA oder RNA ist, kann sie entweder direkt durch komplementäre und gegebenenfalls markierte Sonden nachgewiesen werden oder indirekt durch den Nachweis eines Genprodukts, falls es sich um eine vollständige kodierende Sequenz oder um eine regulatorische Sequenz handelt. Ein weitere Möglichkeit ist eine gesteigerte DNA- oder RNA-Synthese an sich oder eine gesteigerte DNA-Reparatur-Aktivität. Solche Aktivitäten können z.B. durch den Einbau von radioaktiv oder anderweitig markierten Nukleotiden festgestellt werden.

Der Nachweis kann unter Erhalt der Zellstruktur, z.B. in mikroskopischen und immunhistochemischen Verfahren, oder unter Zerstörung der Zellstruktur, z.B. in einem Elektrophoreseverfahren wie Southernblots, Northernblots oder Westernblots, erfolgen.

In einem fortgeschrittenen Stadium der Differenzierung weisen die organoiden Körper gewebe- oder organähnliche Strukturen auf, die von zwei oder oder mehr verschiedenen Zelltypen gebildet werden (vgl. 2–4). Solche Strukturen sind z.B. neuromuskuläre Strukturen oder Glia-Nervenzell-Strukturen oder Hautzellstrukturen. Durch Kultivierung der organoiden Körper in einem Medium mit speziellen Differenzierungsfaktoren kann die Ausbildung gewünschter Strukturen gefördert werden.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bewirkt die Testsubstanz eine Veränderung dieser Strukturen. Diese Veränderung kann z.B eine Zerstörung der Strukturen, Hemmung oder Stimulation der Entwicklung der Strukturen oder eine Veränderung der Aktivität eines oder mehrerer Zelltypen, aus denen sich diese Strukturen zusammensetzen, sein. Demgemäß kann der Nachweis der Wirkung der Testsubstanz in einem Nachweis der Veränderung dieser Strukturen bestehen. Geeignete Nachweismethoden können z.B. eine direkte Beobachtung der morphologischen Veränderungen, gegebenenfalls gekoppelt mit immunologischen, immunhistochemischen oder anderen Nachweismethoden, umfassen.

Nachdem, wie bereits oben erwähnt, die Zelltypzusammensetzung der organoiden Körper durch deren Kultivierung in Gegenwart spezifischer Differenzierungsfaktoren festgelegt werden kann, bedeutet dies, daß die Zelltypzusammensetzung der organoiden Körper in spezielleren Ausführungsformen auf die mutmaßliche zelltypspezifische Wirkung der Testsubstanz abgestimmt werden kann. Das bedeutet konkret, daß z.B organoide Körper mit einem hohen Anteil an Nervenzellen oder organoide Körper, die vorwiegend oder ausschließlich neuromuskuläre Strukturen oder Nerven-Gliazell-Strukturen aufweisen, in einem Testsystem verwendet werden, bei dem Testsubstanzen mit einer mutmaßlichen Wirkung auf das Nervensystem untersucht werden. Analog dazu können organoide Körper mit einem hohen Anteil an Epithelzellen oder mit hautähnlichen Strukturen bei einem Test von Testsubstanzen, die mutmaßlich über die Oberfläche wirken, eingesetzt werden. Weitere derartige spezielle Testsysteme werden für den Fachmann unschwer ersichtlich und realisierbar sein.

In weiteren spezielleren Ausführungsformen befinden sich die organoiden Körper in Hohlräumen, Matrices oder anderen Träger- und/oder Formgebungssystemen. Das Einbringen der Organoiden kann beispielsweise durch Einwachsenlassen geschehen. Die Hohlräume können beispielsweise Mikrokanäle oder Kapillaren zur Impedanzmessung sein. Der Nachweis der Wirkung der Testsubstanz kann dann z.B. in einer Impedanzänderung bestehen. Alternativ kann auch ein Gradient (z.B pH, elektrochemisch, Signalfaktoren etc.) über einen organoiden Körper erzeugt werden und die Wirkung der Testsubstanz durch eine Änderung dieses Gradienten angezeigt werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend die organoiden Körper in einem geeigneten Behälter, Träger- oder Formgebungssystem, Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden chemischen Substanz sowie Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen. In einer spezielleren Ausführungsform dieses Aspekts befinden sich die organoiden Körper in Hohlräumen, z.B. Mikrokanälen oder Kapillaren, oder in Matrices.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Kits bereitgestellt. Ein solcher Kit umfaßt adulte Stammzellen oder die davon abgeleiteten organoiden Körper oder differenzierten Zellen in einem geeigneten Kulturmedium zur Aufrechterhaltung der Zellen bzw. der organoiden Körper, gegebenenfalls kryokonserviert. Ferner kann der Kit weitere Hilfsmittel, z.B. Reagenzien zur Kultivierung und Differenzierung der Stammzellen zu organoiden Körpern einer gewünschen Zelltypzusammensetzung, Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden chemischen Substanz, Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen, umfassen.

FIGURENBESCHREIBUNG

1: zeigt schematisch die Kultivierung der Stammzellen in Oberflächenkultur und in hängenden Tropfen sowie die Bildung und weitere Kultivierung von organoiden Körpern.

2 zeigt die Expression von Markern neuronaler Zellen, glialer Zellen und glatter Muskelzellen sowie von Amylase und Insulin in den differenzierten Zellen der organoiden Körper.
a,b: PGP 9.5-markierte Nervenzellen zeigen multipolare Ausläufer, welche zahlreiche Varikositäten zeigen. c,d: das Neurofilament-System (helle Pfeile, im Originalfoto grün markiert) reicht durch das Pericaryon in die cytoplasmatischen Ausläufer. In enger Nachbarschaft liegen GFAP-immunreaktive Gliazellen (dunkle Pfeile, im Originalfoto rot markiert). e,f: α-SMA-markierte Zellen (dunkle Pfeile, im Original rot) und NF-markierte Nervenzellen (helle Pfeile, im Original Grün) bilden ein primitives neuro-muskuläres Netzwerk (e), wobei Kontakte über beträchtlich lange Entfernungen etabliert werden (f). g: Immunfärbung von GFAP (dunkle Pfeile, im Original rot) und NF (helle Pfeile, im Original grün) in 3 Wochen alten OB mit Konzentrationen an Nerven- und Gliazellen. h: Immunfärbung von α-SMA (dunkle Pfeile, im Original rot) und NF (helle Pfeile, im Original grün) in 3 Wochen alten OBs in einem fortgeschrittenen Stadium der Bildung eines neuro-muskulären Netzwerks. i,j: in Querschnitten von 8 Wochen alten OBs wurden für NF immunreaktive Zellen in direkter Nachbarschaft von Zellen gefunden, die immunreaktiv für α-SMA waren, ähnlich wie in nativen Geweben. k: eine Untergruppe von Zellen zeigt eine positive Färbung für Amylase (helle Pfeile, im Original grün). 1: Eine weitere Zelluntergruppe enthält granuläre Vesikel mit Immunreaktivität für Insulin. Die Kerne sind mit DAPI kontrastgefärbt (im Original blau).

3 zeigt die Expression von extrazellulären Matrixkomponenten und Cytokeratinen.
a,b: Globuläre (a) und fibrilläre (b) Speicher von Proteoglycanen ergaben eine Färbung mit Alcianblau.
c–e: Die globulären (c) und fibrillären (d) Bereiche sind immunreaktiv für das Knorpelmatrixprotein Kollagen II. Zwei individuelle Zellen (e) zeigen eine cytoplasmatische Markierung von Kollagen II.
f: Zellen, die für Cytokeratine immunreaktiv sind, sind in Clustern angeordnet. g: konfokale Laserscanningmikroskopie eines OB. Die Kollagen II-Immunreaktivität (dunkle Pfeile, im Original rot markiert) nimmt zur Mitte des OB hin zu. Vigilinimmunreaktive Zellen (helle Pfeile, im Original grün markiert) sind hauptsächlich am äußeren Rand des OB lokalisiert, was deren hohe Translationsaktivität anzeigt. Die Kerne sind mit DRPI kontrastgefärbt.

4 zeigt die Transmissionselektronenmikroskopie differenzierter OB.
a–c: glatte Muskelzellen mit Myofilamenten. Das Myofilamentsystem erstreckt sich über das Cytoplasma in disseminierten Bündeln (a) und zeigt typische dichte Körper (Pfeile) (b). Die Myoblasten zeigen sternförmige Zellausläufer, die ein verbindendes Netzwerk bilden (c). d: Zellausläufer mit einer Ansammlung von zahlreichen Vesikeln kleiner Größe, die höchstwahrscheinlich Nervenfaservarikositäten entsprechen. e: Kollagen- und Retikulumfasern.
f–h: Sekretorische Zellen zeigen elektrodichte Vesikel. f). Häufig kontaktieren sekretorische Zellen einander, um acinusartige Strukturen zu bilden (g). Ein Untergruppe von sekretorischen Zellen enthält Vesikel (Pfeil) die Ultrastruktur-Merkmalen von endokrinen Granula entsprechen (h), z.B. Beta-Granula von insulinproduzierenden Zellen. l: Beginn der Ausbildung einer Epitheloberfläche (Pfeil) in acht Wochen alten OBs. j: typische Zellkontakte zwischen Keratinozyten und Desmosomen (Pfeile)

5A: zeigt mikroskopische Vergleichsaufnahmen eines unbehandelten und eines mit Puromycin behandelten organoiden Körpers.

5B: zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Homogenisate der in 5A gezeigten Organoide mit dem Nachweis des Translationsmarkers Vigilin.

6: zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Homogenisate von mit Retinsäure behandelten und unbehandelten organoiden Körpern mit dem Nachweis des Proteinmarkers α-SMA (6A) bzw. dem Nachweis von Neurofilamenten (NF)(6B).

7: zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Homogenisate von mit HGFR behandelten und unbehandelten organoiden Körpern mit dem Nachweis des Leberproteins α-Fetoprotein.

8: zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Homogenisate von mit konditioniertem Medium von Chondrozyten-Primärkulturen behandelten und unbehandelten organoiden Körpern mit dem Nachweis des Knorpelproteins Kollagen-II.

9: zeigt einen prinzipiellen Aufbau und Versuchsablauf für das Testen von Substanzen unter Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren und Systeme.

Entsprechend dem in 1 dargestellten Schema wird zur Gewinnung der Stammzellen exokrines Drüsengewebe, z.B. acinäres Gewebe – bevorzugt einer Speicheldrüse oder der Bauchspeicheldrüse (Pankreas) – mechanisch und enzymatisch zerkleinert in Kultur genommen (Schritt 10 in 1). Entgegen den Angaben von Bachem et al., Gastroenterol. 115:421–432 (1998), und Grosfils et al., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 79:99–115 (1993), werden keine Gewebeblöcke kultiviert, aus denen Zellen auswachsen sollen, sondern unter der Bedingung, dass die Zellverbände der Acini weitestgehend intakt bleiben, das Gewebe stärker zerkleinert.

Über mehrere Wochen werden diese Zellen und Zellverbände in Kulturgefäßen kultiviert. Alle 2 bis 3 Tage wird das Medium gewechselt, wobei alle differenzierten Zellen entfernt werden. Bei den in Kultur persistierenden Zellen handelt es sich um undifferenzierte Zellen mit uneingeschränkter Teilungsfähigkeit.

Ähnliche Zellen sind unter gleichen Bedingungen aus dem Pankreas isoliert und beschrieben und als eine Art Myofibroblasten bzw. pankreatische Sternzellen bezeichnet worden (Bachem et al., 1998). Im Gegensatz zu den Zellen der vorliegenden Erfindung konnte eine uneingeschränkte Teilungsfähigkeit jedoch nicht beobachtet werden. Weiterhin konnten diese Zellen auch nicht unbegrenzt passagiert werden, ohne an Vitalität zu verlieren.

In einem zweiten Schritt (12) werden ungefähr 400 bis 800 Zellen in je 20 μl Medium in hängenden Tropfen kultiviert. Dazu werden die Tropfen auf Deckel von bakteriologischen Petrischalen gegeben, umgedreht und über die mit Medium gefüllte Petrischale gelegt, so dass die Tropfen nach unten hängen.

Durch diese Art der Kultivierung bilden sich innerhalb von 48h die als organoide Körper bezeichneten Zellaggregate (14), die für ungefähr 6 Tage in eine Suspensionskultur umgesetzt werden (16). Die Teilansicht (18) aus 1 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines solchen organoiden Körpers.

Die in Suspensionskultur wachsenden Organoid Bodies bilden neue Organoid Bodies, die auch bei Einzelzellen die Bildung von neuen Organoid Bodies induzieren. Die Zellen sind sowohl als Organoid Bodies als auch als Einzelzellen einfrierbar und behalten dabei ihre Vitalität und ihr Differenzierungspotenzial.

Die 2–4 zeigen mikroskopische und elektronenmikroskopische Aufnahmen von differenzierten Zellen, die aus solchen Organoid Bodies oder organoiden Körpern erhalten wurden.

Dabei konnte z.B. die Bildung eines neuro-muskulären Netzwerks beobachtet werden:
Aus OBs erhaltene Zellen exprimierten stark α-SMA ("smooth-muscle-actin") (2e–f). Die Anwesenheit verbreiteter Bündel von Myofilamenten, welche sich über das Cytoplasma erstreckten, wurde durch Elektronenmikroskopie bestätigt (4a–c). Ferner wurden Zellen identifiziert, welche für den pan-Neuronenmarker PGP 9.5 und für Neurofilamente (NF) immunreaktiv waren. Das Neurofilamentsystem reichte vom Pericaryon in die radialen cytoplasmatischen Ausläufer (2c, d). PGP 9.5-immunreaktive Zellen zeigten zahlreiche Varikositäten entlang ihrer verzweigten Ausläufer (2a, b, 4d) und entsprachen damit typischen morphologischen Merkmalen autonomer Nervenfasern. Zellen, die für GFAP ("glial fibrillary acidic protein") immunreaktiv waren, befanden sich in enger Nachbarschaft zu Zellen, die neuronale Marker exprimierten (2c, d). Häufig erstreckten sich die filamentösen Proteine nicht durch das gesamte Cytoplasma, sondern waren auf Gebiete neben den Nervenzellen beschränkt. Ferner waren glatte Muskelzellen und Nervenzellen nicht willkürlich verstreut, sonden bildeten zusammenhängende Netzwerke mit unschwer unterscheidbaren Verbindungen (2e, f). Nervenfaserausläufer erstreckten sich über beträchtlich große Entfernungen, um benachbarte glatte Muskelzellen als ihre mutmaßlichen Ziele zu kontaktieren. Somit zeigten die beiden Zelltypen aufgrund ihrer topographischen Anordnung Merkmale eines primitiven neuromuskulären Netzwerks. Bei 3 Wochen alten OBs wurde eine beginnende Bildung von gewebeähnlichen Strukturen festgestellt (2g–j). Hier wurde ein Cluster von faserförmigen Nerven zellen in Kontakt mit Gliazellen gefunden (2g) oder weiter entwickelt zu einem dreidimensionalen neuro-muskulären Netzwerk (2h), was in Querschnitten von 8 Wochen alten OBs bestätigt wurde (2i, j).

Nachweis der Expression exokriner und endokriner pankreatischer Proteine:

Immunhistochemische Anfärbungen zeigten, dass zelluläre Untergruppen positiv für Amylase waren (2k). Das Immunreaktionssignal war auf klar unterscheidbare Vesikel inerhalb des apikalen Cytoplasmas beschränkt. Darüber hinaus waren die meisten Zellcluster, die für Amylase immunreaktiv waren, in Kreisen angeordnet, wobei die sekretorischen Vesikel eine Position zur Mitte hin aufwiesen, welches eine morphologische Anordnung ähnlich der von exokrinen Pankreas-Acini ist. Andere zelluläre Untergruppen zeigten Immunreaktivität für Insulin (2l). Ähnlich wie bei den Amylase-positiven Zellclustern, war das sekretorische Produkt in vesikulären Strukturen gespeichert, die an einem Zellpol konzentriert waren. Die Anwesenheit sekretorischer Zellen wurde durch Elektronenmikroskopie bestätigt, welche dicht verteilte elektrodichte Partikel zeigte, wie sie charakteristisch für exkretorische oder inkretorische Funktionen sind (4f–h).

Ebenfalls beobachtet wurde eine Differenzierung in chondrogene Zellen und Epithelzellen:

Nach einer Wachstumsperiode von zwei Monaten zeigten OBs chondrogene Eigenschaften. Eine Alcianblaufärbung offenbarte Bereiche mit hohen Konzentrationen an Proteoglycanen (Chondroitinsulfat), die entweder als globuläre (3a) oder fibrilläre (3b) Ablagerungen vorkamen. Immunhistochemische Anfärbungen mit Antikörpern, die gegen das Knorpelmatrixprotein Kollagen II gerichtet waren, belegten zusätz lich die chondrogene Aktivität innerhalb dieser globulären (3c) und fibrillären (3d) Bereiche. Die Immunreaktivität war am höchsten in der Mitte der zellulären Aggregate, die am wahrscheinlichsten Bereichen von sich entwickelnder extrazellulärer Knorpelmatrix entsprach. Diese Beobachtung wurde durch konfokale Mikroskopie bestätigt (3g): während die Menge der Kollagen-Speicher zur Mitte der zellulären Agregate hin zunahm, waren die Randbereiche durch aktiv translatierende Zellen charakterisiert, wie durch deren hohe Vigilin-Expression demonstriert, die gewöhnlich bei Zellen mit aktiver Translationsmaschinerie, z.B. Kollagen-synthetisierenden Chondrozyten oder in Fibroblasten während der Chondroinduktion, gefunden wird. Typische einzelne Kollagen II-trans-latierende Chondrozyten wurden auch in auswachsenden Zellen von OBs beobachtet, die eine Kollagen II-haltige Matrix produzierten, welche die Einzelzellen umgab (3e). Eine Ultrastruktur-Untersuchung dieser Bereiche konnte klar ein Netzwerk von Retikulumfasern und Kollagenfasern zeigen, wobei die letzteren durch ihre charakteristisches Bandenmuster identifiziert wurden (4e). Einige Zellen exprimierten neben mesenchymalen Markern auch mehrere Cytokeratine, was deren Potenzial zur Differenzierung in Epithelzellen anzeigt. Jedoch wurden Zellen, die für Cytokeratine immunreaktiv waren, weniger häufig gefunden als Zellen, die Marker von glatten Muskelzellen und Neuronen exprimierten. Typischerweise waren sie in Clustern angeordnet, die innerhalb der OBs disseminiert waren (3f). Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden typische Zellkontakte zwischen Keratinozyten gefunden (4j) und bei 8 Wochen alten OBs wurden Epithelzellen auf der Oberfläche gefunden, welche aus dem Zellkulturmedium in die Luft wuchs.

Insgesamt konnten bisher z.B. folgende Marker für spezifische Zellen positiv getestet werden: PGP 9.5 und NF für Nervenzellen, S 100 und GFAP für Gliazellen, SMA für Muskelzellen (bzw. Myofibroblasten), Kollagen Typ II für Knorpelzellen, Amylase und Trypsin für exokrine Drüsenzellen, Insulin für endokrine Drüsenzellen, Vigilin für stark translatierende Zellen und Cytokeratin für epidermale Zellen. Neben den lichtmikroskopischen Untersuchungen konnten auch elektronenmikroskopisch verschiedene Zelltypen morphologisch charakterisiert werden, sowie Zell-Zell-Kontakte als Zeichen für zelluläre Interaktionen gefunden werden.

Es wurden bisher u.a. glatte Muskelzellen, Neuronen, Gliazellen, Epithelzellen, Fettzellen, Herzzellen, Nierenzellen, Fibroblasten (z.B. Haut- und Sehnenfibroblasten), Chondrozyten, endokrine und exokrine Drüsenzellen und damit Zelltypen aller drei Keimblätter in diesen organoiden Körpern morphologisch/histologisch und/oder immunochemisch nachgewiesen.

In den folgenden, nicht-beschränkenden Beispielen soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden.

Die allgemeinen Arbeitsanweisungen, wie sie für Verfahren zur Kultivierung von Säugerzellen, insbesondere humanen Zellen, gebräuchlich sind, sind zu beachten. Eine sterile Umgebung, in der das Verfahren durchgeführt werden soll, ist – auch wenn hierzu keine weitere Beschreibung erfolgt – in jedem Fall einzuhalten. Folgende Puffer und Medien wurden verwendet:

Statt fötalem Kalbserum (FKS) im Nährmedium und Differenzierungsmedium kann gegebenenfalls auch Plasma oder Serum einer anderen geeigneten Spezies, insbesondere Humanplasma oder, weniger bevorzugt, Humanserum, verwendet werden.

Das Nährmedium kann als Basismedium statt des verwendeten DMEM-Mediums auch ein anderes für die Kultivierung von eukaryotischen Zellen, insbesondere Säugerzellen, bekanntes geeignetes Basismedium enthalten, in dem die differenzierten Zellen absterben und sich die gewünschten Stammzellen vermehren. Auch Isolationsmedium, Inkubationsmedium und Differenzierungsmedium können ein anderes übliches und geeignetes Basismedium enthalten.

Die folgenden Beispiele 1 bis 3 beschreiben Arbeitsprotokolle zur Isolierung und Kultivierung adulter pluripotenter Stammzellen aus acinärem Gewebe des Pankreas bzw. aus acinärem und tubulösem Gewebe der Speicheldrüse.

BEISPIEL 1
Zur Isolierung und Kultivierung von humanen adulten Stammzellen wurde humanes Gewebe von erwachsenen Patienten unmittelbar nach einem chirurgischen Eingriff erhalten und sofort aufgearbeitet. Aus dem chirurgisch entfernten Gewebe, z.B. Pankreasgewebe, wurde gesundes Gewebe abgetrennt und in Digestionsmedium, enthaltend HEPES-Eagle-Medium (pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH, 7,6), 70% (Vol./Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 0,5 % (Vol./Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), 1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin), 2,4 mM CaCl₂ und Kollagenase (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg, Deutschland), aufgenommen (bei 20 °C, geringerer Stoffwechsel). Das Pankreasgewebe wurde mit einer Schere sehr fein zerkleinert, oben schwimmendes Fettgewebe abgesaugt und die Gewebesuspension mit Carbogen (Messer, Krefeld, Deutschland) begast, ohne dass die Düse in das Medium mit den Zellen gelangt (Verringerung von mechanischem Streß) und damit auf pH 7,4 eingestellt. Danach wurde die Suspension in einem 25-ml-Erlenmeyerkolben (mit Alufolie bedeckt) unter konstantem Schütteln (150–200 Zyklen pro Minute) bei 37 °C in 10 ml Digestionsmedium inkubiert. Nach 15–20 Minuten wurde das oben schwimmende Fett und das Medium abgesaugt und das Gewebe wurde erneut zerkleinert und mit Medium ohne Kollagenase gespült (Vorgang mindestens zweimal wiederholen, vorzugsweise solange bis Zellfraktion transparent), worauf Digestionsmedium zugegeben und erneut etwa 1 Minute lang mit Carbogen begast wurde . Es folgte wiederum eine Digestion mit Kollagenase für 15 Minuten bei 37°C im Schüttler unter Verwendung desselben Puffers. Nach der Digestion wurden die Acini durch sukzessives Hochziehen und Ausstossen durch 10 ml-, 5 ml- und 2 ml-Glaspipetten mit engen Öffnungen dissoziiert und durch ein einlagiges Nylonsieb (Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zürich, Schweiz) mit einer Maschengröße von etwa 250 μm filtriert. Die Acini wurden zentrifugiert (bei 37°C und 600–800 UpM in einer Beckman-GPR-Zentrifuge, entspricht etwa 50–100 g) und weiter gereinigt durch Waschen in Inkubationsmedium, enthaltend 24,5 mM HEPES (pH 7,5), 96 mM NaCl, 6 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2, 5 mM NaH₂PO₄, 0, mM CaCl₂, 11, 5 mM Glucose, 5 mM Natriumpyruvat, 5 mM Natriumglutamat, 5 mM Natriumfumarat, 1 (Vol./Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, mit Carbogen äquilibriert und auf pH 7,4 eingestellt. Die Waschprozedur (Zentrifugation, Absaugen, Resuspension) wurde fünfmal wiederholt. Soweit nicht anders angegeben, wird bei der obigen Isolierung bei etwa 20 °C gearbeitet.
Die Acini wurden in Inkubationsmedium resuspendiert und bei 37°C in einer angefeuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂-kultiviert. Das acinäre Gewebe starb dabei schnell (innerhalb von zwei Tagen) ab und. die sterbenden differenzierten Zellen lösten sich dabei von den benachbarten Zellen, ohne diese zu schädigen (schonende Isolierung), die nicht absterbenden Stammzel len sanken zu Boden und hefteten sieh an. Die differenzierten Acinizellen sind dazu nicht in der Lage. Das Inkubationsmedium wurde am zweiten oder dritten Tag nach dem Aussäen erstmals gewechselt, wobei ein Großteil der frei schwimmenden Acini und acinären Zellen entfernt wurde. Zu diesem Zeitpunkt hatten sich die ersten Stammzellen bzw. deren Vorläufer am Boden festgesetzt und begannen sich zu teilen. Der Mediumwechsel wurde danach an jedem dritten Tag wiederholt und differenzierte acinäre Pankreaszellen wurden bei jedem Mediumwechsel entfernt.
Am siebenten Tag in Kultur wurden die Zellen mit einer Lösung bestehend aus 2 ml PBS, 1 ml Trypsin (+ 0,05 % EDTA) und 2 ml Inkubationsmedium passagiert. Dabei lösen sich die Zellen vom Boden der Kulturschale. Die Zellsuspension wurde 5 Minuten bei etwa 1000 UpM (Beckmann GPR-Zentrifuge) zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.
Am vierzehnten Tag in Kultur wurden die Zellen erneut, aber diesmal mit 6 ml PBS, 3 ml Trypsin/EDTA und 6 ml Inkubationsmedium, passagiert. Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.
Am Tag 17 erfolgte ein drittes Passagieren auf insgesamt 6 mittlere Zellkulturflaschen und am Tag 24 ein viertes Passagieren auf insgesamt 12 mittlere Zellkulturflaschen. Spätestens jetzt waren alle primären Zellen bis auf die Stammzellen aus der Zellkultur entfernt.
Die Stammzellen können weiter kultiviert werden und so oft passagiert und ausgesät wie gewünscht. Das Aussäen erfolgt vorzugsweise jeweils in einer Dichte von 2–4 × 10⁵ Zellen/cm² in Inkubationsmedium.
BEISPIEL 2
Pankreas-Acini wurden von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (20–300 g) erhalten, die narkotisiert (CO₂) und über die dorsale Aorta ausgeblutet worden waren. Eine Kanüle wurde transduodenal in den Pankreasgang eingeführt und dem Pankreas wurde von hinten 10 ml Digestionsmedium, enthaltend HEPES-Eagle-Medium (pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH, 7,6), 70% (Vol./Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 0,5 % (Vol./Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), 1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin), 2,4 mM CaCl₂ und Kollagenase (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg, Deutschland) injiziert.
Vor der Entfernung wurde der Pankreas von anhaftendem Festgewebe, Lymphknoten und Blutgefäßen teilweise befreit. Dann wurde gesundes Pankreasgewebe in Digestionsmedium abgeholt (bei 20 °C, geringerer Stoffwechsel) und das Pankreasgewebe mit einer Schere sehr fein zerkleinert und verarbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben.
BEISPIEL 3
Die Isolierung und Kultivierung aus exokrinem Gewebe der Ohrspeicheldrüse erfolgte analog dem Pankreas-Protokoll mit den folgenden Abweichungen:

1. Das exokrine Gewebe der Ohrspeicheldrüse war eine Mischung von acinärem Gewebe und tubulösem Gewebe.
2. Nachdem Speicheldrüsen weniger Proteasen und Amylasen als Pankreas enthalten, ist es möglich, das Speicheldrüsengewebe vor der Aufarbeitung einige Zeit im Kühlschrank bei etwa 4°C aufzubewahren, ohne dass das Gewebe zu sehr geschädigt wird.

Im konkreten Beispielsfall betrug die Aufbewahrungszeit 15 h und brachte keine nachteiligen Folgen für die Isolierung der gewünschten Stammzellen mit sich.
Die folgenden Beispiele 4 und 5 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokolle zur Herstellung von organoiden Körpern (Organoid Bodies) und differenzierten Zellen.
BEISPIEL 4
Die undifferenzierten Zellen werden mit einer Lösung aus 10 ml PBS, 4 ml Trypsin, 8 ml Differenzierungsmedium abtrypsiniert und 5 Minuten abzentrifugiert. Das resultierende Pellet wird so in Differenzierungsmedium resuspendiert, dass sich eine Verdünnung von 3000 Zellen je 100 μl Medium einstellt. Anschließend werden die Zellen nochmals gut mit einer 3 ml Pipette suspendiert.
Von bakteriologischen Petrischalen, die vorher mit jeweils 15 ml PBS (37 °C) pro Platte beschichtet worden sind, wird der Deckel abgenommen und umgedreht. Mit Hilfe einer automatischen Pipette werden auf einen Deckel ca. fünfzig 20 μl Tropfen gegeben. Der Deckel wird dann schnell umgedreht und auf die mit Differenzierungsmedium gefüllte Petrischale gegeben, sodass die Tropfen nach unten hängen. Die Petrischalen werden anschließend vorsichtig in den Brutschrank gestellt und für 48 h inkubiert.
Daraufhin werden die in den hängenden Tropfen aggregierten Zellen, die hier Organoid Bodies (OB) genannt werden sollen, aus jeweils vier Deckeln in je eine bakteriologische Petrischale mit 5 ml Inkubationsmedium mit 20 % FKS überführt und für weitere 96 h kultiviert.
Die Organoid Bodies werden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt, und in mit 0,1 % Gelatine beschichtete Zellkulturgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens verwendet man als Kulturgefäß mit 0,1 % Gelatine beschichtete 6 cm Petrischalen, in die 4 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und die anschließend mit je 6 Organoid Bodies beschickt werden. Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß sind mit 0,1 % Gelatine beschichtete Chamber Slides, in die 3 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und die anschließend mit je 3–8 Organoid Bodies beschickt werden. Daneben können auch 24-Mulden-Mikrotiterplatten verwendet werden, die mit 0,1 Gelatine beschichtet wurden und in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und anschließend mit je 4 Organoid Bodies beschickt werden.
Derart kultiviert, ist die Differenzierungsfähigkeit der Zellen in den Organoid Bodies aktiviert und die Zellen differenzieren sich in Zellen der drei Keimblätter Mesoderm, Entoderm und Ektoderm. Die Zellen können sowohl als Organoid Bodies als auch als einzelne Zellen gelagert und kultiviert werden und behalten ihre Pluripotenz.
BEISPIEL 5
Für die Induktion der Differenzierung wurden vorzugsweise Stammzellen nach dem 42. Tag der Kultivierung verwendet. Die Verwendung von Stammzellen nach der 3. oder 4. Passage oder von Zellen, die bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff 12–18 Monate lang gelagert worden waren, war ebenfalls problemlos möglich.
Zunächst wurden die Zellen in Differenzierungsmedium mit der oben angegebenen Zusammensetzung überführt und auf eine Dich te von etwa 3 × 10⁴ Zellen/ml eingestellt; z.B. durch Trypsinbehandlung einer Stammzellkultur in Nährmedium, 5-minütige Zentrifugation bei 1000 UpM und Resuspendierung des Pellets in Differenzierungsmedium und Verdünnung soweit erforderlich.
Anschließend wurden mit einer 20-μl-Pipette ca. 50 20-μl-Tropfen (600 Zellen/20 μl) auf die Innenseite des Deckels einer bakteriologischen Petrischale gegeben (gestopfte Spitzen) und die Deckel vorsichtig auf die mit PBS gefüllten Petrischalen gestülpt, sodass die Tropfen nach unten hängen. Für jeden Deckel wurde eine neue Spitze verwendet. Die Petrischalen wurden anschließend vorsichtig in den Brutschrank gestellt und 48 h lang bei 37°C inkubiert.
Danach wurden die in den hängenden Tropfen aggregierten Zellen, die Organoid Bodies (OB), aus jeweils vier Deckeln in je eine bakteriologische Petrischale mit 5 ml Inkubationsmedium mit 20 % FKS überführt (Deckel schräg halten und die OBs mit etwa 2,5 ml Nährmedium abspülen) und für weitere 5–9 Tage, vorzugsweise 96 h, kultiviert.
Die Organoid Bodies wurden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt und in mit 0,1 % Gelatine beschichtete Zellkulturgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. Die OB vermehrten sich nun und wuchsen in zum Teil einzelnen Zelkolonien, die wieder vermehrt, vereinzelt und vermehrt werden konnten. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wurden als Kulturgefäß mit 0,1 % Gelatine beschichtete 6 cm Petrischalen verwendet, in die 4 ml Differenzierungsmedium vorgelegt worden war, und diese mit je 6 Organoid Bodies beschickt. Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß waren mit 0,1 % Gelatine beschichtete Chamber Slides, in die 3 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und die anschlie- ßend mit je 3–8 Organoid Bodies beschickt wurden, und Thermanox-Platten (Nalge Nonc International, USA) für elektronenmikroskopische Studien. Eine weitere Alternative waren 24-Mulden-Mikrotiterplatten, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet wurden und in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und die anschließend mit je 4 Organoid Bodies beschickt wurden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wurden OBs etwa 7 Wochen lang in den gelatine-beschichteten 6-cm-Petrischalen kultiviert und danach wurden einzelne OBs mit dem Microdissector (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) nach den Anweisungen des Herstellers ausgeschnitten und dann z.B. auf frische 6-cm-Petrischalen, Chamber Slides oder Thermanox-Platten überführt. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wurden einzelne OBs mit Pipettenspitzen durch leichtes Ansaugen abgelöst und transferiert, anschließend z.B. Beobachtung unter dem inversen Mikroskop.
BEISPIEL 6
Charakterisierung differenzierter Zellen in den organoiden Körpern
1. Immunohistochemie
Organoid Bodies, die mindestens 3 Wochen lang auf Chamber Slides kultiviert worden waren, sowie Querschnitte von "Lang- zeit"-OBs wurden zweimal in PBS gespült, fünf Minuten lang mit Methanol:Aceton (7:3), enthaltend 1 g/ml DAPI (Roche, Schweiz) bei –20°C fixiert und dreimal in PBS gewaschen. Nach Inkubation in 10%igem normalem Ziegenserum bei Raumtemperatur für 15 Minuten wurden die Proben über Nacht mit primären Antikörpern bei 4°C in einer Befeuchtungskammer inkubiert. Die primären Antikörper waren gegen das Proteingenprodukt 9.5 (PGP 9.5, polyklonaler Kaninchenantikörper, 1:400, Ultraclone, Insel Wight), Neurofilamente (NF-Pan-Cocktail, polyklonaler Kaninchenantikörper, 1:200, Biotrend, Deutschland), α-Smooth-muscle-actin (α-SMA, monoklonaler Mausantikörper, 1:100, DAKO, Dänemark), gliales fibrilläres saures Protein (GFAP, monoklonaler Mausantikörper, 1:100, DAKO, Dänemark), Kollagen II (monoklonaler Mausantikörper II-II-6B3, 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA), Vigilin FP3 (1:200, Kügler et al., 1996), Cytokeratine (Pan Cytokeratin, monoklonaler Mausantikörper, 1:100, Sigma, USA), Alpha-Amylase (polyklonaler Kaninchenantikörper, 1:100, Calbiochem, Deutschland) und Insulin (monoklonaler Mausantikörper, 0,5 g/ml, Dianova, Deutschland) gerichtet. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden Objektträger 45 Minuten lang bei 37°C mit entweder Cy3-markiertem Antimaus-IgG oder FITC-markiertem Antikaninchen-IgG (Dianova), beide 1 200 verdünnt, inkubiert. Die Objektträger wurden dreimal in PBS gewaschen, mit Vectashield Mounting Medium (Vector, USA) beschichtet und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Axiosop Zeiss, Deutschland) oder mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM 510 Zeiss, Deutschland) analysiert. Eine Alcianblaufärbung wurde mittels Standardverfahren durchgeführt.
2. Transmissionselektronenmikroskopie
OBs wurden auf Thermanox-Platten (Nalge Nonc International, USA) mindestens 3 Wochen lang kultiviert. An den Thermanox-Platten haftende Proben wurden durch Eintauchen in 0,1 M Cacodylat-Puffer, enthaltend 2,5 % Glutaraladehyd und 2 % Paraformaldehyd, bei pH 7,4 24 h lang inkubiert. Nach einer Nachfixierung in 1% OsO₄, "en bloc"-Anfärbung mit 2% Uranylacetat und Dehydrierung in reinen Alkoholen wurden die Proben in Araldite eingebettet. Nach Entfernung der Thermanox-Platte wurden Semithin-Schnitte entweder tangential oder senkrecht zur eingebetteten en Zellkultur vorgenommen und mit Methylenblau und Azur II geschnitten. Ultradünne Schnitte wurden aus den Regionen von Interesse ausgeschnitten, mit Bleicitrat angefärbt und unter einem Transmissionselektronenmikroskop (Phillips, EM 109) untersucht.
Die folgenden Beispiele 7 bis 10 beschreiben das Kontaktieren von organoiden Körpern, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, mit verschiedenen Wirkstoffen und die Feststellung einer durch den jeweiligen Wirkstoff verursachten Veränderung der organoiden Körper und/oder der darin enthaltenen differenzierten Zellen durch direkten visuellen Nachweis bzw. den Nachweis von Markerproteinen.
BEISPIEL 7
Bei diesem und den folgenden Beispielen werden mehrere gemeinsam vermehrte organoide Körper einer Charge (z.B. durch Trennung geeigneter Organoide und erneute Vergrößerung bis zur gewünschten Anzahl erzeugt), üblicherweise mindestens 6 in einer Gruppe, für einen Versuch eingesetzt.
Bei diesem Beispiel wurden organoide Körper für einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen verschiedenen mikromolaren Konzentrationen von Puromycin, einem Wirkstoff, der die Translation hemmt, ausgesetzt. Danach wurde die Größe der behandelten organoiden Körper mit derjenigen einer unbehandelten Kontrolle verglichen (siehe mikroskopische Vergleichsaufnahme in 5A). Bei einem zweiten Nachweisverfahren wurden die Organoide in 10 ml Lysispuffer, enthaltend 7,5 ml PBS, 2,5 ml NP-40 und 1 mM PEFA-Block aufgenommen, über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C gelagert und dann in Minihomogenisatoren für Eppendorfröhrchen homogenisiert. Das Homogenisat wurde zentrifugiert, der Überstand entnommen und nach Standardverfahren elektro phoretisch aufgetrennt und das Gel einem Western-Immunoblot unterworfen. 5B zeigt die Ergebnisse der Behandlung über den Nachweis des Translationsmarkers Vigilin. Die ersten vier Banden entstehen durch die verschiedenen Wirkmengen von Puromycin, die letzten beiden zeigen die Vigilinmenge in den unbehandelten Organoiden; pro Spur wurde immer die gleiche Menge Gesamtprotein aufgetragen.
BEISPIEL 8
Die organoiden Körper wurden mit 2 × 10^–6 M Retinsäure oder ohne Retinsäure 7, 11, 14 und 17 Tage lang inkubiert. Danach wurden die organoiden Körper wie in Beispiel 7 beschrieben homogenisiert und einem Westernblot-Assay unterworfen. Es wurden die Marker α-SMA (α-smooth muscle actin) und ein Gemisch von Neurofilamenten (NF) angefärbt (6). Während die Menge des Aktins während der gesamten Behandlungszeit höher ist als bei der Kontrolle, verändert sich die Menge der im Westernblot nachweisbaren synthetisierten NF nur am 7. und 11. Tag der Behandlung.
BEISPIEL 9
Die organoiden Körper wurden mit 40 ng/ml HGF („hepatocyte growth factor") oder ohne HGF 7, 11, 14 und 17 Tage lang inkubiert. Danach wurden die organoiden Körper wie in Beispiel 7 beschrieben homogenisiert und einem Westernblot-Assay unterworfen. Es wurde die Bildung des Leberproteins α-Fetoprotein untersucht (7). Nach 7 und 11 Tagen Inkubation ist eine deutliche Synthese des Fetoproteins zu beobachten, während eine längere Einwirkdauer die Bildung eher wieder hemmt.
BEISPIEL 10
Organoide Körper wurden ohne oder mit konditioniertem Medium von Chondrozyten-Primärkulturen inkubiert und das Vorhandensein von Kollagen-II als typischem Knorpelprotein wieder mit einem Westernblot wie oben untersucht (8). Beide Ansätze mit Chondrozyten-Kultur-Überständen zeigen eine leichte Zunahme des Kollagen-II gegenüber der Kontrolle mit einfachem Medium.
Die obigen Beispiele demonstrieren nur eine prinzipielle Vorgehensweise bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung mit einer kleinen Auswahl chemischer Wirkstoffe und Nachweisverfahren. Die Erfindung ist jedoch keineswegs auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt. Alternativen, insbesondere alternative Nachweisverfahren, sind dem Fachmann bekannt oder anhand der detaillierten Offenbarung dieser Anmeldung in Verbindung mit dem zitierten Stand der Technik unschwer aufzufinden.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Verfahren zum Testen von Substanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf biologische Zellen unter Verwendung multizellulärer Zellaggregate, als organoide Körper bezeichnet, dadurch gekennzeichnet, daß die zu testende Substanz in Kontakt mit den organoiden Körpern gebracht wird und deren Wirkung, falls vorhanden, durch eine morphologische oder anderweitig nachweisbare Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen festgestellt wird, wobei die organoiden Körper durch Aggregation und Differenzierung multipotenter oder pluripotenter adulter Stammzellen gebildet wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Verfahren zur Analyse der Wirkung bekannter oder potenzieller Wirkstoffe oder Mutagene auf alle oder spezielle Zelltypen der organoiden Körper handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Verfahren zum Screenen von Arzneiwirkstoffen oder Kosmetika handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellaggregate Säugerzellaggregate, insbesondere humane Zellaggregate, sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14, dadurch gekennzeichnet, daß die zu testende Substanz ein Protein, Peptid, eine Nukleinsäure, z.B DNA, RNA oder ein Derivat davon, oder eine niedermolekulare chemische Substanz ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, daß die multipotenten oder pluripotenten adulten Stammzellen aus exokrinem Drüsengewebe isoliert wurden.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem exokrinen Drüsengewebe um acinäres Gewebe handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkung der Substanz eine Veränderung der Morphologie oder des Proliferationsvermögens, Wachstumsvermögens oder der Lebensfähigkeit oder einer anderen Aktivität aller Zelltypen oder spezieller Zelltypen der organoiden Körper ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–8, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz über den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge einer Markersubstanz, die von speziellen oder allen Zelltypen der organoiden Körper gebildet wird, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz über den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge eines Markerproteins erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Markerprotein durch Bindung von Farbstoffen, Anti körpern oder Rezeptoren, durch einen Westernblot, durch enzymatische oder sonstige Aktivität des Markerproteins nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz über den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge einer Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA oder ein Derivat davon, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz die Anwendung eines oder mehrerer Verfahren ausgewählt aus der Gruppe aus Protein-Assays, Immunoassays, enzymatischen Assays, Rezeptorbindungs-Assays, ELISA-Assays, RIA-Assays, elektrophoretischen und chromatographischen Assays, einschließlich HPLC, Northernblots, Southernblots, Westernblots, kolorimetrischen Assays, immunhistochemischen, elektrophysiologischen, mikroskopischen und spektroskopischen Nachweismethoden umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelltypen der organoiden Körper aus der Gruppe aus Osteoblasten, Osteoclasten, Chondrozyten, Adipozyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, hematopoetischen Zellen, sensorischen Zellen, endokrinen und exokrinen Drüsenzellen, Gliazellen, neuronalen Zellen, Oligodendrozyten, Blutzellen, Darmzellen, Herz-, Lungen-, Leber-, Nieren- oder Pankreaszellen ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelltypzusammensetzung der organoiden Körper durch Kultivierung in einem Medium, welches zelltyp-spezifische Differenzierungs- und/oder Wachstumsfaktoren enthält, festgelegt wurde.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren aus der Gruppe bestehend aus bFGF, VEGF, DMSO und Isoproterenol, Fibroblastenwachstumsfaktor 4 (FGF4), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), TGF-beta1, EGF, KGF, Retinsäure, beta-NGF, BMP-4 und Activin-A ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–16, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr der verschiedenen Zelltypen der organoiden Körper gewebe- oder organähnliche Strukturen bilden.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr der verschiedenen Zelltypen der organoiden Körper neuromuskuläre Strukturen oder Glia-Nervenzell-Strukturen oder Hautzellstrukturen bilden.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Testsubstanz eine Veränderung dieser Strukturen bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung eine Zerstörung der Strukturen, Hemmung oder Stimulation der Entwicklung der Strukturen und/oder eine Veränderung der Aktivität eines oder mehrerer Zelltypen, aus denen sich diese Strukturen zusammensetzen, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–20, dadurch gekennzeichnet, daß sich die organoiden Körper in Hohlräumen, Matrices oder anderen Träger- und/oder Formgebungssystemen befinden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1–21, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr Testsubstanzen gleichzeitig oder nacheinander mit denselben organoiden Körpern getestet werden.
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–22, umfassend die organoiden Körper in einem geeigneten Behälter, Träger- oder Formgebungssystem, Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden Substanz sowie Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–22, umfassend die organoiden Körper wie in Anspruch 1 definiert in einem geeigneten Kulturmedium zur Aufrechterhaltung der organoiden Körper.
Kit nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sich die organoiden Körper in Hohlräumen, Matrices oder anderen Träger- und/oder Formgebungssystemen befinden.
Kit nach Anspruch 24 oder 25, umfassend ferner Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden Substanz.
Kit nach einem der Ansprüche 24–26, umfassend ferner Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen sowie gegebenenfalls weitere Reagenzien und Hilfsstoffe.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–22, umfassend multipotente oder pluripotente adulte Stammzellen, aus denen die organoiden Körper wie in Anspruch 1 definiert herstellbar sind, in einem geeigneten Kulturmedium zur Aufrechterhaltung dieser adulten Stammzellen, sowie Reagenzien, einschließlich gegebenenfalls Differenzierungsfaktoren, und Kulturmedien, um organoide Körper einer gewünschten Zelltypzusammensetzung herzustellen.
Kit nach Anspruch 28, umfassend ferner Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden Substanz.
Kit nach Anspruch 28 oder 29, umfassend ferner Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen sowie gegebenenfalls weitere Reagenzien und Hilfsstoffe.