DE10154458B4

DE10154458B4 - Peptide zur Analyse von Gluten in Lebensmitteln und anderen Substanzgemischen und deren Verwendung

Info

Publication number: DE10154458B4
Application number: DE2001154458
Authority: DE
Inventors: Thomas Prof. Dr. Mothes
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2001-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2009-10-29
Anticipated expiration: 2021-11-09
Also published as: DE10154458A1

Abstract

Peptide MHNHPRF, SHFTTRS, QPIPQLW, NLPRLYE, WHASWLL.

Description

Die Erfindung betrifft Peptide zur Analyse von Gluten in Lebensmitteln und anderen Substanzgemischen und deren Verwendung gemäß der Patentansprüche. Die Erfindung betrifft somit den Nachweis von Gliadinen und weiteren Prolaminen durch den Einsatz von Affinitätspeptiden. Das Einsatzgebiet ist vorwiegend die Lebensmittelanalytik.
Zöliakie (Sprue, glutensensitive Enteropathie) ist Erkrankung, bei der eine Unverträglichkeit gegenüber der Fraktion der alkohollöslichen Kleberproteine (Prolamine) aus Weizen (Gliadine), Roggen (Secaline), Gerste (Hordeine) und möglicherweise auch aus Hafer (Avenine) besteht (aktuelle Übersichten bei Feighery C: Coeliac disease. BMJ. 1999; 319: 236–9, Schuppan D: Current concepts of celiac disease pathogenesis. Gastroenterology 2000; 119: 234–242, Sollid LM: Molecular Basis of celiac disease. Annu Rev Immunol 2000; 18: 53–81, Stern M et al: Analysis and clinical effects of gluten in coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001; 13: 741–747). Die Toxizität der Prolamine aus Hafer (Avenine) ist auf jeden Fall sehr viel geringer als die aus Weizen, Roggen und Gerste, wahrscheinlich sind Haferprolamine sogar als harmlos für Zöliakiepatienten anzusehen (Janatuinen EK et al: A comparison of diets with and without oats in adults with celiac disease. N Engl J Med 1995; 333: 1033–1037, Srinivasan U et al: Absence of oats toxicity in adult coeliac disease. BMJ 1996; 13: 1300–1301, Janatuinen EK et al: Lack of cellular and humoral immunological responses to oats in adults with coeliac disease. Gut 2000; 46: 327–331, Picarelli A et al: Immunologic evidence of no harmful effect of oats in celiac disease. Am J Clin Nutr 2001; 74: 137–140). Von der Deutschen Zöliakiegesellschaft werden Haferprodukte jedoch noch nicht für die Ernährung von Zöliakiepatienten empfohlen, da sie häufig durch toxische Weizen-, Roggen- oder Gerstenprolamine kontaminiert sind (Janssen FW, Hägele G: Contamination of oatflakes with other cereals. Proc 10th Meeting Working Group Prolamin Analysis Toxicity 1995, Janssen F et al: Contamination of rolled oats with wheat, rye and barley. Proc 13th Meeting Working Group Prolamin Analysis Toxicity 1998).
Die genannten Getreideproteinfraktionen rufen bei disponierten Personen eine Schädigung der Darmschleimhaut, verbunden mit Durchfall und Malabsorptionserscheinungen hervor. Die klassische klinische (gastrointestinale) Symptomatik muß jedoch nicht immer im Vordergrund stehen, sondern es finden sich auch weniger typische Symptome wie Kleinwüchsigkeit und selektive Mangelzustände, die zu Anämie und Osteoporose führen können, aber auch psychiatrische Symptome. Die Häufigkeit liegt in Mitteleuropa bei etwa 1:250.
Die Darmschleimhaut ist charakterisiert durch (partielle bis komplette) Zottenatrophie und Infiltration mit Lymphozyten. Es werden Antikörper gegen die auslösenden Prolamine, meßbar als Gliadinantikörper, sowie gegen körpereigene Moleküle (Autoantikörper) gefunden. Kürzlich wurde die Gewebstransglutaminase als das Hauptautoantigen identifiziert (Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, Donner P, Volta U, Riecken EO, Schuppan D. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of coeliac disease. Nature Med 1997; 3: 797–801). Die Erkrankung ist assoziiert mit dem Auftreten des MHC-Allels DQ2 (DQα1*0501 β1*0201) bei der Mehrzahl der Patienten (Übersicht bei: Lundin KE, Gjertsen HA, Scott H, Sollid LM, Thorsby E. Function of DQ2 and DQ8 as HLA susceptibility molecules in celiac disease. Hum Immunol 1994; 41: 24–7, Brett PM et al: Common HLA alleles, rather than rare mutants, confer susceptibility to coeliac disease. Ann Hum Genet 1999; 63: 217–225), es müssen jedoch noch weitere genetische Faktoren oder Umweltfaktoren in Betracht gezogen werden.
Dermatitis herpetiformis (M. Duhring) ist eng mit der Zöliakie assoziiert (Reunala T: Dermatitis herpetiformis: coeliac disease of the skin. Ann Med 1998; 30: 416–8). Bei vielen der Patienten finden sich ebenfalls (zumindest geringgradige) Dünndarmschädigung. Zusätzliche Belastung mit den toxischen Prolaminen kann die vollen Darmveränderungen auslösen.
Eine Besserung wird sowohl bei Zöliakie als auch bei Dermatitis herpetiformis durch eine sogenannte glutenfreie Diät erreicht, die frei von Gliadinen aus dem Weizen sowie von anderen toxischen Prolaminen ist. Unter Gluten versteht man ein Getreideproteingemisch aus Prolaminen sowie den (wahrscheinlich nicht zölia kietoxischen) Glutelinen, die beide in wäßrigen Lösungen unlöslich sind und im Gluten in einem Verhältnis von etwa 1:1 vorkommen. Nichteinhaltung der Diät steigert das Risiko für Tumorerkrankungen (Holmes GK: Celiac disease and malignancy. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1997; 24: S20–3).
Leider kann Gluten in vielen Lebensmitteln versteckt sein, ohne daß es für die Verbraucher ersichtlich ist (Ciacci C, Mazzacca G: Unintentional gluten ingestion in celiac patients. Gastroenterology 1998; 115: 243–250). Dies kann sogar manchmal für Lebensmittel zutreffen, die als ”glutenfrei” gekennzeichnet sind. Die Erklärung liegt darin, daß selbst moderne Methoden der Lebensmitteluntersuchung bei der Glutenanalyse versagen können. Die maximale von Zöliakiepatienten täglich aufgenommene Gliadinmenge sollte 10 mg (entsprechend 20 mg Gluten) nicht übersteigen (Codex Alimentarius Commission, Alinorm 97/26, 1997; Stern M: Proc. 12^th Meeting Working Group Prolamin Analysis Toxicity. 1997, pp. 89–92). Entsprechend sollten Lebensmittel, die als ”glutenfrei” deklariert werden, einen Gliadingehalt von weniger als 10 mg/100 g besitzen (entsprechend von weniger als 20 mg Gluten/100 g). Gegenwärtig wird diskutiert, den Grenzwert für Gluten in glutenfreien Lebensmitteln niedriger anzusetzen (zum Beispiel 1 mg Gliadin oder 2 mg Gluten/100 g Lebensmittel) (Codex Alimentarius Commission Alinorm 01/26, 2000). Das erfordert die Verbesserung der gegenwärtig verfügbaren Methoden zur Bestimmung von Gluten in Lebensmitteln.
Vorzugsweise werden heute Antikörper zur Glutenbestimmung eingesetzt, meist in Enzymimmunoassays (ELISA), seltener in Immunblots, letztere sind jedoch schwer quantifizierbar. Weniger gebräuchlich sind nichtimmunologische Methoden (z. B. HPLC, MALDI-TOF), die aufwendiger und teilweise ebenfalls schwer quantifizierbar sind.
Am weitesten verbreitet ist zur Zeit der Einsatz eines monoklonalen Antikörpers gegen ω-Gliadine im Enzymimmunoassay (Skerrit JH, Hill AS: Enzyme immunoassay for determination of gluten in foods: collaborative study. J ADAC Int 1991; 74: 257–264), der in Form von Testkits von verschiedenen Herstellern angeboten wird (Cortecs Diagnostics, r-Biopharm Darmstadt Deutschland, Transia GmbH Ober-Mörlen Deutschland). Der Einsatz weiterer monoklonaler Antikörper mit anderer Spezifität in der Glutenanalyse wurde beschrieben (Ellis HJ et al: Measurement of gluten using a monoclonal antibody to a coeliac toxic peptide of A gliadin. Gut 1998; 43: 190–195, Chirdo FG et al: Development of high-sensitivity enzyme immunoassays for gliadin quantification using the streptavidin-biotin amplification system. Food Agric Immunol 1998, 10: 143–155). Gegenwärtig befindet sich ein neuer Testkit zur Glutenanalyse in Entwicklung, in dem ein monoklonaler Antikörper gegen ω-Secaline aus Roggen eingesetzt wird, der jedoch gleichermaßen auch die toxischen Prolamine aus Weizen und Gerste erkennt (Osman AA et al: A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001, im Druck). Polyklonale Antikörper werden in der Glutenanalyse nur noch selten verwendet.
Die gegenwärtig verfügbaren immunologischen Methoden zur Bestimmung von Gluten in Lebensmitteln sind durch folgende Probleme und Schwierigkeiten charakterisiert:

1. Monoklonale Antikörper lassen sich zwar besser reproduzierbar herstellen als polyklonale, ihre Herstellung ist jedoch teuer. Neben den Herstellungskosten wird der Preis der monoklonalen Antikörper auch durch die mit ihnen verbundenen Patente bestimmt.
2. Monoklonale Antikörper sind biologische Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 100.000 Da. Sie bestehen aus mehreren Peptidketten, die durch Disulfidbrücken miteinander in verbunden sind. Wie andere Makromoleküle weisen Antikörper einen bestimmten Grad an Instabilität auf (zum Beispiel Denaturierung bei Temperaturveränderungen, Einfrieren/Auftauen, Einwirkung von Reduktionsmitteln).
3. Viele kommerzielle Nahrungsmittel enthalten Gluten in prozessierter Form. Nahrungsmitteltechnologisch besonders bedeutsam ist die Behandlung mit Hitze oder Proteasen. Hitzebehandlung verursacht die Bildung von intermolekularen Disulfidbrücken zwischen den einzelnen Prolaminmolekülen und beeinträchtigt damit die Extrahierbarkeit von Gluten sehr stark. Werden zur Verbesserung der Extraktion Reduktionsmittel eingesetzt, stören diese in der nachfolgenden immunologischen Nachweisreaktion, indem sie die Antikörperstruktur und damit die Bindung des Antikörpers an das Antigen stören.

Als Lösungsweg wird das Screening von Phagenpeptidbibliotheken beschritten. Dabei werden Milliarden von kurzen Peptiden mit unterschiedlicher Peptidsequenz, die als Bestandteil von Oberflächenproteinen auf Phagen exprimiert werden, auf Ihre Bindung an Gliadin untersucht. Solche Phagenpeptidbibliotheken können individuell hergestellt werden, sind aber auch kommerziell erhältlich (New England BioLabs, 1998/99 Catalog S. 140, 141). Die Technik kann erfolgreich auch zum Screening von Antikörperepitopen eingesetzt werden ( DE 100 05 932 A1 ).
Das Ziel der Erfindung besteht darin, anstelle der monoklonalen Antikörper, die mit verschiedenen Nachteilen – wie oben dargestellt – behaftet sind, andere Moleküle zur Detektion von Gluten in Lebensmitteln und anderen Proben zu verwenden.
Diese sollen folgende Eigenschaften umfassen.

1. Die Moleküle sollen billiger herstellbar sein als monoklonale Antikörper.
2. Sie sollen eine höhere Stabilität besitzen als monoklonale Antikörper und deshalb härteren Bedingungen ausgesetzt werden können.
3. Sie sollen nicht empfindlich gegenüber Reduktionsmitteln sein. Dann können Reduktionsmittel zur effizienten Extraktion der Prolamine aus Lebensmitteln eingesetzt werden, ohne daß diese anschließend bei der Glutenanalyse stören würden.

Die Aufgabe der Erfindung besteht im Auffinden von Stoffen, die eine hohe Affinität zu den toxischen Prolaminen aus Weizen, Roggen und Gerste besitzen, sich jedoch nicht an Prolamine aus anderen Getreiden bindet und auch nicht an weitere harmlose Nahrungseiweiße, und die anstelle von Antikörpern zur Glutenanalyse sowie zur Analyse von Gluten in anderen Proben eingesetzt werden können. Damit entfallen die wesentlichen der vorstehend genannten Nachteile.
Der Erfindung liegt die wissenschaftliche Erkenntnis zugrunde, daß Peptide, wahrscheinlich insbesondere kurze Peptide, zum Lösen der gestellten Aufgabe geeignet sein können.
Die vielfältigen Eigenschaften von Peptiden und Proteinen ergeben sich aus der Tatsache, daß als Bausteine zwanzig verschiedene Aminosäuren existieren, die in linearer Folge miteinander verbunden sind (”Aminosäuresequenz”). Die Aminosäuresequenz bestimmt die Eigenschaften des Peptids bzw. des Proteins. Während somit für ein Dipeptid nur 20² verschiedene Sequenzen möglich sind, existieren 20³ verschiedene Tri-, 20⁴ verschiedene Tetra-, 20⁵ verschiedene Pentapeptide usw. Die Zahl verschiedener Heptapeptide liegt demzufolge bereits bei über einer Milliarde. Die Wahrscheinlichkeit ist hoch, daß sich unter der Vielzahl von verschiedenen Peptiden mit einer Länge von 7 und mehr Aminosäuren einige Peptide befinden werden, die die Eigenschaft besitzen, sich an Gliadine und andere zöliakietoxische Prolamine zu binden.

Zum Auffinden von Peptiden mit der gewünschten Eigenschaft wurden Phagenpeptidbibliotheken durchsucht. Zur Anwendung kamen eine Hepta- und eine Dodecapeptidbibliothek der Firma New England Biolabs (Schwalbach, Deutschland). Phagen mit Peptiden, die sich an Prolamine binden, die harmlos für Zöliakiepatienten sind, wurden vor den Versuchen aus der Bibliothek durch Vorabsorption mit Avenin und Zein entfernt. Die Phagen wurden auf Gliadin der Weizenvarietät ”Kanzler” selektiert, wie bereits für andere Liganden beschrieben (Birkenmeier G et al: Epitope mapping by screening of phage display libraries of a monoclonal antibody directed against the receptor binding domain of human α2-macroglobulin. FERS Lett 1997; 416: 193–196). Die selektierten Phagen wurden in E. coli vermehrt und ihre Bindung an Gliadin, beschichtet auf Mikrotiterplatten, in Form eines ”Phage-ELISA” getestet. Von 128 mittels Phage-Display isolierten Phagenklonen ergab sich nur bei 33 Klonen eine Bindung an Gliadin. Die Klone wurden amplifiziert und die DNA sequenziert und aus der DNA-Sequenz die Aminosäuresequenz des Peptids abgeleitet, das auf der Phagenoberfläche zugängig ist und von dem anzunehmen ist, daß es für die Bindung der Phagen an Gliadin verantwortlich ist. Peptide mit den entsprechenden 33 Sequenzen wurden auf Zellulosemembranen synthetisiert und die Bindung von Gliadin und anderen Prolaminen an die synthetisierten Peptide mit einem Lumineszenzassay (Osman AA: Use of phage display technique for detection of epitopes recognized by polyclonal rabbit gliadin antibodies. FERS Lett 1998; 433: 103–107) überprüft. Bei 5 Peptiden ergab sich eine starke Bindung an Gliadin. Diese Peptide waren sämtlich Heptapeptide und besaßen Aminosäuresequenzen, die in Tabelle 1 wiedergegeben sind. Tabelle 1: Heptapeptide mit gliadinbindenden Eigenschaften

Peptid-Nr.	Aminosäuresequenz
Peptid-Nr.	Einbuchstaben-Code	Dreibuchstaben-Code
1	MHNHPRF	Met-His-Asn-His-Pro-Arg-Phe
2	SHFTTRS	Ser-His-Phe-Thr-Thr-Arg-Ser
3	QPIPQLW	Gln-Pro-lle-Pro-Gln-Leu-Trp
4	NLPRLYE	Asn-Leu-Pro-Arg-Leu-Tyr-Glu
5	WHASWLL	Trp-His-Ala-Ser-Trp-Leu-Leu

Ausführungsbeispiele
Die genannten Peptide wurden als freie Peptide synthetisiert. Peptid 1 und 2 wurden am C-terminus durch Glycin und Lysin verlängert, Peptide 3, 4 und 5 durch zwei Glycinreste und Lysin. Die ε-Aminogruppe des Lysins wurde bei allen Peptiden biotinyliert. Die N-terminale Aminogruppe war bei allen Peptiden frei. Diese Peptide wurden zur Bestimmung von Gliadinen und anderen Prolaminen wie folgt eingesetzt:
Gliadin aus der Weizensorte ”Kanzler”, Secalin aus den Roggensorten ”Amilo” und ”Danko”, Hordein aus der Gerstensorte ”Astrid”, Avenin aus den Hafersorten ”Alfred” und ”Flämingsnova”, Zein aus den Maissorten ”Bonny”, ”Mutin” und ”Diamant” (allesamt bezogen über das Bundessortenamt Hannover) und Oryzin aus der Reissorte ”Cartuna IRGC 10595 (International Rice Research Institute Manila, Philippinen) wurden durch Extraktion mit 60% Ethanol erhalten. Der ethanolische Extrakt wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde in 0,1 M Carbonatpuffer (pH 8,4) logarithmisch bis auf eine Konzentration von 1 ng/ml verdünnt. Jeweils 100 μl der verdünnten Proben wurden in die Kavitäten von Mikrotiterplatten der Sorte Polysorb (Nunc, Dänemark) aufgetragen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Kavitäten mit 160 µl Waschpuffer gewaschen (6,05 g/l Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 8,7 g/l NaCl, 0,5 g/l Tween-20; 160 µl/Kavität). Anschließend wurden die Oberfläche der Kavitäten mit je 200 µl Blockierungspuffer (Waschpuffer mit 0,5% Magermilchpulver, Fluka) blockiert und erneut zweimal gewaschen. Danach wurden 100 µl einer Lösung zugegeben, die das biotinylierte Peptid 1 in einer Konzentration von 6 µg/ml Blockierungspuffer enthielt. Die Kavitäten wurden zwei Stunden mit dieser Peptidlösung bei Raumtemperatur inkubiert und danach erneut fünfmal gewaschen. Anschließend wurde 100 µl einer Streptavidin-konjugierten Meerrettich-Peroxidase (Boehringer Mannheim, 1:5000 in Waschpuffer verdünnt) in die Kavitäten pipettiert. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Kavitäten fünfmal gewaschen und dann zur Farbentwicklung jeweils 100 µl o-Phenylendiaminlösung zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde die Frabreaktion mit 25 µl Schwefelsäure (2 M) abgestoppt und die Extinktion bei 492 nm gemessen.
Es ergab sich ein Abhängigkeit des Meßsignals bis zu einer Gliadinkonzentration von 1 ng/ml (1). Das Verfahren zur Detektion von Gliadin hat damit eine mit modernen Enzymimmunoassays vergleichbare Sensitivität.
Bei einer Prolaminkonzentration von 100 µg/ml ergeben sich mit Secalin aus Roggen und Hordein aus Gerste ähnlich hohe Signale wie bei Gliadin aus Weizen. Im Gegensatz dazu liegen die Meßsignale unter einer Extinktion von 0,1, wenn entsprechende Konzentrationen von Avenin aus Hafer oder Zein aus Mais eingesetzt werden.
Mit dem Einsatz von Heptapeptiden ist erstmals eine Möglichkeit gegeben, zöliakietoxische Prolamine nichtimmunologisch mit einem geringen apparativen Aufwand (konventioneller Microplattenreader ausreichend) zu bestimmen. Peptide sind billiger und reproduzierbarer herstellbar als Antikörper. Peptide besitzen eine höhere Stabilität als Antikörper und können damit auch prinzipiell in anderen als den vorstehend beschriebenen Verfahren universell eingesetzt werden.
Ein weiterer wichtiger Vorteil besteht darin, daß die Peptide die zöliakietoxischen Prolamine aus Weizen, Roggen und Gerste in vergleichbarer Stärke erkennen. Im Gegensatz dazu reagieren viele der bisher für die Glutenanalyse in Lebensmitteln gebräuchlichen Antikörper nicht mit allen Prolaminen aus Weizen, Roggen und Gerste in gleicher Intensität, sondern meist mit Weizengliadin viel stärker als mit den ebenfalls toxischen prolaminen aus Roggen und Gerste. Dies führt zur Unterschätzung des Gehalts an diesen Prolaminen in Nahrungsmitteln.
Legende zu 1
Nachweis von Gliadin, extrahiert aus der Weizensorte ”Kanzler”, mit dem biotinylierten Heptapeptid 1. Bei einer Konzentration von 1 ng Gliadin/ml liegt das Meßsignal immer noch signifikant über dem Leerwert. Die Kurve zeigt die Mittelwerte. Secalin und Hordein werden mit vergleichbarer Intensität nachgewiesen wie Gliadin. Die Reaktion mit Avenin ist schwach und mit Zein sehr gering. Die gestrichelte Linie zeigt, die die Reaktion des Peptids mit den harmlosen Prolaminen aus Mais, Zein, selbst bei 10.000fach höherer Konzentration (10 mg/ml) noch niedriger ist als mit den zöliakietoxischen Gliadinen (1 ng/ml). Die Peptide 2 bis 5 liefern vergleichbare Ergebnisse.
Sequenzprotokoll

Claims

Peptide MHNHPRF, SHFTTRS, QPIPQLW, NLPRLYE, WHASWLL.
Verwendung von Peptiden nach den Anspruch 1, jedes für sich oder in beliebiger Kombination miteinander zur Analyse von Gluten in Lebensmitteln und anderen Substanzgemischen, bei denen der Verdacht besteht, daß sie mit Prolaminen aus Weizen, Roggen oder Gerste versetzt wurden oder mit diesen kontaminiert sind.
Verwendung von Peptiden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Markersubstanz konjugiert sind.
Verwendung von Peptiden nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Markersubstanz Biotin ist oder eine gleichwirkende Substanz, welche die Detektion des gebundenen Peptids ermöglicht.
Verwendung von Peptiden nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie an Zellulosemembran fest gekoppelt sind.