DE10137665A1

DE10137665A1 - Vorrichtung und Verfahren zum Erfassen und Klassifizieren von biologischen Partikeln oder Molekülen

Info

Publication number: DE10137665A1
Application number: DE10137665A
Authority: DE
Inventors: Kilian Hennes; Walter Zwisler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2001-08-03
Publication date: 2002-11-14

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Erfassen und Klassifizieren von in Lösung suspendierten magnetisierbaren Partikeln, insbesondere von biologischen Partikeln oder Molekülen, die mit den magnetischen Partikeln magnetisiert sind und in einer flüssigen Lösung durch ein Magnet-Wechselfeld geführt werden, mit Mitteln zum Erzeugen des mit einer Anregungsfrequenz oszillierenden Magnet-Wechselfeldes und Sensormitteln, die zum Zusammenwirken mit den magnetischen Partikeln und zum Detektieren eines Magnetisierungszustandes derselben ausgebildet sind, wobei den Sensormitteln elektronische Auswertmittel nachgeschaltet sind, die als Reaktion auf ein Detektionssignal der Sensormittel das Erfassen und Klassifizieren durchführen, wobei die Sensormittel mindestens eine separat von den Magnet-Wechselfeld-Erzeugungsmitteln vorgesehene Spulenanordnung aufweisen, die zum Detektieren eines gegenüber der Anregungsfrequenz insbesondere ganzzahlig mehrfach höherfrequenten magnetischen Schwingungssignals der mit dem Magnet-Wechselfeld angeregten magnetischen Partikel ausgebildet ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie ein Verfahren zum Erfassen und Klassifizieren von in Lösung suspendierten magnetisierbaren Partikeln, insbesondere von biologischen Partikeln oder Molekülen, die mit magnetischen Partikeln magnetisiert sind und in einer flüssigen Lösung durch ein Magnet-Wechselfeld geführt werden.

Eine gattungsgemässe Vorrichtung ist aus der DE 199 39 208 bekannt. Hier werden die magnetisierbarer Partikel (nachfolgend auch: Beads) zunächst mit biologischen Parti keln konjugiert. Diese Konjugate durchfließen in einer Ka pillare eine Spule mit Kern. Durch Induktivitätsänderungen in der Spule und die Änderung der Eigenfrequenz eines ange schlossenen Schwingkreises wird die Anzahl passierender Beadkonjugate ermittelt.

Die Klassifizierung magnetisierbarer Partikel erfolgt nach dem weiteren Stand der Technik gemäss WO 99/27369 durch Ma gnetisierung mit einem Magneten mit Ferritkern und Detek tion der Magnetisierung von Konglomeraten (0,25 mm im Durchmesser) der Partikel mittels Sensorspulen, die im Ma gnetfeld angebracht sind. Hierzu müssen die Partikel auf einer manipulierbaren Trägeroberfläche aufgebracht werden. Diese wird durch den Spalt Elektromagneten mit zwei phasen sensitiven Spulen geführt. Wird ein Partikel an den Spulen vorbeigeführt, so wird die Phasenverschiebung des Signals gemessen. Es wird nur die Grundfrequenz als Signal erfasst, Oberfrequenzen werden mittels Tiefpass-Filter eliminiert.

Die in der Praxis etablierten Technologien wie z. B. Durch flußcytometrie und Coulter-Counter als Anwendungsumgebungen der beschriebenen gattungsbildenden Technologien werden in der Medizin, Hygiene und Forschung z. B. zur Zählung von Bakterien und Blutzellen verwendet. Sie sind dabei aber entweder relativ ungenau (Koch'sches Plattengußverfahren), zeitaufwendig (mikroskopischen Verfahren), extrem kosten aufwendigen (Durchflußcytometrie) oder auf große Partikel wie Blutzellen limitiert (Coulter-Counter-Verfahren).

Das in der WO 99/27369 beschriebene Verfahren nebst ent sprechender Vorrichtung hat den Nachteil, dass hier die Partikel auf eine Trägeroberfläche aufgebracht werden müs sen und nicht direkt in Lösung gemessen werden können. Au ßerdem besteht die Problematik des Luftspaltes zwischen Probe und Sensorspule was die Nachweisbarkeit kleiner Par tikelansammlungen verschlechtert.

Das Verfahren der Patentschrift DE 199 39 208 nutzt dagegen die Änderung der Eigenfrequenz eines an die Sensorspule an geschlossenen Schwingkreises beim Durchtritt von Beads durch die Spule. Hier ist die elektronische Auswertung re lativ komplex, da nicht ein Signal mit einem Nullwert zu vergleichen ist, sondern unterschiedliche aber insgesamt hohe Amplituden zweier Signale zu verrechnen sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Möglich keiten zu schaffen, die Anregungsfrequenz in einfacher Weise von den Resonanzfrequenzen im Wechselsignal der Sen sorspule zu trennen. Es sollten insbesondere die Sensorspu len im Vergleich zu dem anregenden Magneten in der Größe minimiert werden, um diese so der Größenordnung des Reso nanzsignals anzupassen.

Damit soll die Nachweisgrenze des Standes der Technik beim Klassifizieren von mit biologischen Partikeln und/oder Mo lekülen (im Weiteren nur noch als biologische Partikel bezeichnet) verbundenen magnetisierbaren Beads wesentlich herabgesetzt werden, indem ein deutlicheres analoges Si gnal, mit geringerem Störanteil für die digitale Auswertung bereitgestellt wird.

Die Aufgabe wird durch die Vorrichtung nach dem Hauptan spruch gelöst, vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Erfindungsgemäss werden die Beads durch ein oszillierendes Magnetfeld angeregt. Die Resonanz auf die oszillierenden magnetischen Momente der angeregten Beads wird mit separa ten Sensorspulen gemessen. Dabei werden die Beads durch solche Frequenzen klassifiziert, welche größer als die An regungsfrequenz sind.

Im Rahmen der Erfindung ist es insbesondere vorgesehen, die Sensorspule separat und miniaturisiert (im sub-Millimeter bereich) auszubilden, während der anregende Elektromagnet eine Größe von mehreren cm haben kann, um ein starkes anre gendes Feld zu erzeugen. Als "separat" im Rahmen der vor liegenden Erfindung ist dabei die physische Trennung von Magnetspule für das Magnet-Wechselfeld von der Spulenanord nung für die Sensormittel zu verstehen, die zudem bevorzugt über getrennte Zuleitungen angesteuert werden.

Die zu detektierenden Konjugate bestehen typischerweise aus Beads und biologischen Partikeln, wie Bakterien, Blutzel len, Zellbestandteilen, Viren oder Molekülen. Beads sind vor allem Kügelchen mit Durchmessern von 10 nm bis 10 µm aus superparamagnetischem Material ohne magnetischem Gedächtnis (z. B. silanisiertes Eisenoxid, Magnetit) und meistens einer biologisch inerten Matrix (z. B. Polystyren oder Dextran, crosslinked) mit oder ohne Beschichtung von funktionellen Gruppen wie -COOH bzw. -NH₂ oder mit Proteinbeschichtungen wie Protein A, mit einer Massendichte von 1-10 g/cm³ und mit einer Magnetisierbarkeit von z. B. 30 emu/g. Die Beads werden mit biologischen Partikeln über Antikörperfragmente, Gen-Sonden oder Viren konjugiert.

Die Konjugate aus Beads und biologischen Partikeln sollen gemäss günstiger Weiterbildungen der Erfindung die Sensor spule oder ein eng angeordnetes Paar von Sensorspulen in optimiertem räumlichem Verhältnis in einem 10-100 µm dicken Kanal im Innern einer Multilayerplatine durchfließen, um durch die größere räumliche Nähe der Beads zu der/den Sen sorspule/n ein stärkeres Signal zu ergeben. Anstelle des Nachweisprinzips vom Stand der Technik über die Induktivi tätsänderung einer Spule soll die Resonanz der Beads auf ein typischerweise sinusförmig oszillierendes, starkes Ma gnetfeld gemessen werden, wobei die Magnetisierung der Beads annähernd rechteckförmig erfolgt und entsprechend die Erzeugung (zur nachfolgenden Detektion im Rahmen der Erfin dung) von Oberwellen bewirkt.

Das anregende Magnetfeld soll bevorzugt durch die Aufhebung des Wechselsignals bei Parallelschaltung der Sensorspule mit einer zweiten spiegelbildlich im Feld angeordneten Spule - die nicht von Beads durchflossenen ist - nicht miterfasst werden (Gradiometerkonfiguration). Die Resonanz der Frequenz, mit welcher die Beads angeregt wurden, im Si gnal der durchflossenen Sensorspule wird weiterbildungsge mäss durch einen (Hochpass-)Filter entfernt. Die markierten biologischen Partikel werden durch die Resonanzfrequenzen charakterisiert, welche ein Mehrfaches der Anregungsfre quenz betragen bzw. welche sich aus der digitalen (Sättigungs-)Magnetisierung der Beads ergeben. Die Oberfre quenz-Signale werden mit der Spulenanordnung erfasst, mit tels geeigneter Elektronik ausgewertet und mittels ange schlossenem PC gezählt.

Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele sowie anhand der Zeichnungen; diese zeigen in:

Fig. 1 eine Prinzipansicht gemäss einer ersten Ausfüh rungsform der vorliegenden Erfindung mit auf ei nem Elektromagnetkern sitzender Spulenanordnung

Fig. 1a eine alternative Ausführungsform mit planarer Sensorspule;

Fig. 1b-1d mögliche weitere Ausführungsformen

Fig. 2a ein Wickelschema zur Verdeutlichung der Ausfüh rungsform gemäss Fig. 1d;

Fig. 2b-2d Ansichten einer Multilayerplatine zur Reali sierung einer Ausführungsform der Erfindung; und

Fig. 3 eine beispielhafte Magnetisierungskennlinie.

In einem ersten Ausführungsbeispiel werden zunächst Koli bakterien aus Trinkwasser mittels primären Antikörpern mit monovalenten Komplexen aus jeweils einem Fab-Fragment eines sekundären Antikörpers und einem Bead der Größe <50 µm ver bunden. Eine beispielhafte Magnetisierungskennlinie (Hysteresis-Kurve) ist in Fig. 3 dargestellt. Die Konjugate werden in einer geeigneten Vorrichtung gereinigt und auf konzentriert (siehe DE 199 39 208).

Die so erzeugten Konjugate werden über eine Piezopumpe in die Kapillare (A) einer Multilayerplatine (Fig. 2b-d) ge pumpt, deren einzelne Lagen bis 0,05 mm dünn sein können. Diese Platine enthält eine oder mehrere parallele, durch Ätztechnik erzeugte planare Sensorspulen aus Kupfer. Eine Kapillarleitung in der Multilayerplatine führt die Konju gate durch das Zentrum (30) einer Sensorspule (1) oder zwi schen den Zentren mehrerer Sensorspulen hindurch. Die Ka pillarleitung kann z. B. auf eine Breite von 50 µm in das Basismaterial gefräst werden, bevor diese Lage mit weiteren Lagen verpresst wird. Die Achsen der Sensorspulen müssen so angeordnet sein, dass sie im Spalt eines C-förmigen Elek tromagneten angeordnet sind UND parallel zu dessen Feldli nien im Spalt ausgerichtet sind (Fig. 1a bis 1d).

Dieser C-förmige Elektromagnet erzeugt ein sinusförmig os zillierendes Magnetfeld beispielsweise in der Größenordnung von <100 kHz. Hierbei muß die Anregungsfrequenz so groß sein, daß die Dauer einer Schwingung deutlich kürzer ist als die durchschnittliche Zeitspanne, während der die rela tive Rotationsbewegung (bei Raumtemperatur aufgrund der Brown'schen Molekularbewegung) eines konjugierten Bead we niger als 1% beträgt. Der Elektromagnet sollte über einen (Ferrit-)Kern (Fig. 1; 50) verfügen dessen Enden zum Spalt hin konisch zugespitzt sind (Fig. 1a bis 1d; 54). So kann im Spalt die Felddichte erhöht werden. Dabei muß die Ampli tude der Magnetisierung so groß sein, dass Beads beim Durchfließen der Sensorspule (1) sättigend magnetisiert werden. Diese Sättigung wird bei typischerweise verwendeten Beads bei 80 [emu/g] sicher erreicht (Fig. 3). An einem Wi derstand (60) in Serie mit der/den Sensorspule/n kann die Wechselspannung abgenommen werden. In einer geeigneten Elektronik mit Hochpass-Filter wird aus diesem Signal die Frequenz des anregenden Magnetfeldes herausfiltriert. Das übrige Spektrum dieses analogen Signals dient nach der Um wandlung in ein digitales Signal der Quantifizierung von Einzelsignalen mit charakteristischem Frequenzspektrum, charakteristischer Amplitude und einer Dauer, welche der Verweildauer der Konjugate in/an den Sensorspulen ent spricht.

Die Anzahl der Signale entspricht der Anzahl der mit Beads markierten Kolibakterien in dem Volumen von Trinkwasser, welches während der Dauer der Signalerfassung mittels einer Piezopumpe mit z. B. 50 µm Kanaldurchmesser durch den Multi layer gepumpt wurde.

Die Fertigung der Sensorspulen in Multilayertechnologie er folgt gemäß Fig. 2b bis 2d (korrespondierend zu den Sche mata in Fig. 1b bis 1d) In Basismaterial (20), z. B. PTFE oder Epoxidharz wird mittels Laserstrahl lineare und außer halb des Spulenbereichs gebogene Niveaufräsungen mit einer Breite und Tiefe von ca. 50 µm vorgenommen werden. An Enden der Fräsung, die in Bohrungen durch eine Lage Basismaterial münden, werden schalenförmige Vertiefungen (31) angebracht, um hydrodynamische Belastungen der Proben zu minimieren. Die entstandenen Rillen (A und B) werden mit nichtfließen dem (no-flow) Prepreg (32) der Dicke <50 µm verschlossen. In eine aufliegende <80 µm dicke Kupferschicht wird eine planare Spirale (1) bzw. eine Leiterbahn von der Spulen mitte an deren Rand geätzt. Die Leiterbahnen werden als Mi krofeinstleiter (<80 µm Breite und 17 µm Höhe) ausgebildet. Die geätzten Spulen werden mittels "blind via" (3) oder "end via" (4) in der Mitte mit der Leiterbahn (Fig. 1a; 5) durchkontaktiert. Das Basismaterial mit der Spule und das obere (und ggf. untere) Basismaterial mit Niveaufräsung werden verpresst.

Bei der Ausführung mit einer Spule (Fig. 1b) wird der Mitte der Spule von oben oder unten eine Bohrung (30) bis an das Ende der einen Niveaufräsung angebracht und von aussen ver schlossen (22). Suspensionen von mit Beads markierten bio logischen Partikeln werden durch Fräsung (A) zur Spulen mitte geführt und durch Fräsung (B) wieder abgeführt. Bei einer strömungsmechanisch streßfreieren Ausführung, mit 2 übereinanderliegenden Spulen und keinen engen Kurven des Probenflusses, (Fig. 1c) entfällt die Bohrung durch die Mitte einer Spule. Dagegen wird auf einen gefrästen Kanal eine weitere Lage Basismaterial mit Spule aufgepresst. Mit tels "end-vias" (4,7) werden die Spulen derart angeschlos sen, daß sich ihre Messsignale addieren. Die Partikel wer den in einer geraden Kapillare durch die verschlossene Ni veaufräsung (A) des Multilayer gepumpt. In einer weiteren Ausführung in Gradiometerkonfiguration (mit gegenläufig ge wickelten, identisch bemessenen Spulen) wird mit der oben beschriebenen Spule oder dem beschriebenen Spulenpaar eine spiegelbildliche Spulenanordnung in Reihe geschalten. Dabei entfällt aber bei dem spiegelbildlichen Anteil der Reihen schaltung der Durchfluß mit markierten Partikeln. Durch diese Anordnung (Fig. 1d) heben sich die entgegengesetzten Resonanzen der Sensorspulen auf das anregende Feld des C- förmigen Elektromagneten auf und nur die Resonanz auf die magnetischen Momente der Beads werden als Signal erfasst. Die spiegelbildlichen Sensorspulen können entweder direkt neben den durchflossenen Sensorspulen auf dem selben Basis material aufgebracht werden oder wie in Fig. 2d gezeigt in größerer Entfernung (<1 mm) unterhalb der durchflossenen Spule angeordnet sein.

Auf beiden Seiten der Multilayer kann eine bis zu 5 µm dünne Metallschicht (33) zur Abschirmung des anregenden Magnet feldes mit zentraler Durchlaßöffnung (34) aufgebracht wer den.

Auf den Multilayer kann in direktem Kontakt eine Piezopumpe angebracht werden um eine Integration der Bauelemente zu erreichen. Die Piezopumpe fördert beispielsweise 100 µl pro Minute. Es können Pumpenteile aus einer äußeren Lage des Multilayers mittels Lasertechnologie gefertigt sein. Eine solche Einheit wird in verschiedenen Abmessungen der Spulen und Kapillardurchmesser als Verschleißteil gefertigt. Zum schnellen Ein- und Ausbau eignet sich eine Steckverbin dung.

Eine solche Steckverbindung besteht aus zwei gegenüberlie genden, schlitzförmigen Führungen in welche der planare Multilayer eingeführt wird, aus den Schleifkontakten (Fig. 2b bis 2d; 9), die mit elektrischen Leitern in den Schlit zen kontaktieren und aus Stutzen zwischen den Führungs schlitzen oder aus Öffnungen in den Schlitzen. Die Öffnun gen oder Stutzen münden beim Einbau in die Öffnungen der Leitungen (A) und (B) bzw. der Ein- und Ausgänge des Kanals (A) in den Multilayern und werden mit Dichtungen versehen.

In einer weiteren Ausführungform wird vor dem Eintritt in die Spule- bzw. zwischen die Spulen - mittels einer Hüll flußzelle der Strom der markierten biologischen Partikel mit einem rohrförmigen Strom von Hüllflüssigkeit umgeben und strömt laminar durch den Multilayer.

Der anregende C-förmige Elektromagnet wird durch geeignetes Material magnetisch abgeschirmt, wobei ein äußerer Schlitz das Einführen der Spule in der Multilayerplatine in den Spalt zwischen die konisch zugespitzten Enden (54) des Ma gnetkernes des Elektromagneten ermöglicht.

Claims

1. Vorrichtung zum Erfassen und Klassifizieren von in Lösung suspendierten magnetisierbaren Partikeln, ins besondere von biologischen Partikeln oder Molekülen, die mit den magnetischen Partikeln magnetisiert sind und in einer flüssigen Lösung durch ein Magnet-Wech selfeld geführt werden, mit
Mitteln zum Erzeugen des mit einer Anregungsfrequenz oszillierenden Magnet-Wechselfeldes und
Sensormitteln, die zum Zusammenwirken mit den magne tischen Partikeln und zum Detektieren eines Magneti sierungszustandes derselben ausgebildet sind, wobei den Sensormitteln elektronische Auswertmittel nachgeschaltet sind, die als Reaktion auf ein Detek tionssignal der Sensormittel das Erfassen und Klassi fizieren durchführen,
dadurch gekennzeichnet, dass die Sensormittel mindestens eine separat von den Ma gnet-Wechselfeld-Erzeugungsmitteln vorgesehene Spu lenanordnung aufweisen, die zum Detektieren eines ge genüber der Anregungsfrequenz insbesondere ganzzahlig mehrfach höherfrequenten magnetischen Schwin gungssignals der mit dem Magnet-Wechselfeld angereg ten magnetischen Partikel ausgebildet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spulenanordnung in einem einem Spaltbereich eines das Magnet-Wechselfeld erzeugenden Elektroma gneten als Magnet-Wechselfeld-Erzeugungsmittel be nachbarten Kernabschnitt des Elektromagneten gebildet ist und eine Wickelachse von Spulen der Spulenanord nung senkrecht zu einer durch den Spalt beschriebenen Spaltfläche steht.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Spulenanordnung als mindestens eine, bevor zugt auf einem Träger realisierte Planarspule ausge bildet und in einem Spaltbereich eines das Magnet- Wechselfeld erzeugenden Elektromagneten als Magnet- Wechselfeld-Erzeugungsmittel angeordnet ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spulenanordnung als Paar von einander plan gegenüberliegenden Planarspulen ausgebildet und be vorzugt so verschaltet ist, dass eine Kompensations wirkung für einen Einfluss des Magnet-Wechselfeldes mit der Ausgangsfrequenz auf die Spulenanordnung er reicht wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekenn zeichnet, dass die Planarspule mittels einer auf dem Trägermaterial vorgesehenen Leiterschicht realisiert ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Planarspule mittels einer Multilayerplatine als Trägermaterial realisiert ist und in der Multilayerplatine ein Kanal oder eine Durchtrittsöffnung für die flüssige Lösung gebildet ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Spulenanordnung und eine Führung für die flüssige Lösung so ausgebildet sind, dass die magnetischen Partikel die Spule durchfließen.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel zwi schen einer Mehrzahl von Spülen hindurchfließen.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekenn zeichnet durch Mittel zum Abschirmen der Spulenanord nung gegenüber dem Magnet-Wechselfeld der Magnet- Wechselfeld-Erzeugungsmittel.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertmittel eine Hochpassanordnung aufweisen, die zum Filtern von Signalen der Anregungsfrequenz ausgebildet ist.

11. Verfahren zum Erfassen und Klassifizieren von in Lö sung suspendierten, magnetisierbaren Partikeln, ins besondere von biologischen Partikeln oder Molekülen, die mit den magnetisierbaren Partikeln magnetisiert sind und in einer flüssigen Lösung durch ein Magnet- Wechselfeld geführt werden, insbesondere Verfahren zum Betreiben der Vorrichtung nach einem der Ansprü che 1 bis 10, mit den Schritten:

- Erzeugen des Magnet-Wechselfeldes mit einer Anre gungsfrequenz,
- Leiten der flüssigen Lösung durch das Magnet- Wechselfeld,
- Detektieren eines Magnetisierungszustandes der magnetischen Partikel mittels einer Spulenanord nung, welche separat von das Magnet-Wechselfeld erzeugenden Spulen eines Elektromagneten gebildet ist, und
- Auswerten eines Detektions-Ausgangssignals der Spulenanordnung zum Erfassen und zum Klassifizie ren, wobei gegenüber der Anregungsfrequenz höhere spektrale Frequenzkomponenten des Detektions signals berücksichtigt und ausgewertet werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch den Schritt des Filterns des Detektions-Ausgangssignals der Spulenanordnung mittels einer Hochpass-Filter funktion zum Ausfiltern einer der Anregungsfrequenz entsprechenden spektralen Komponente.