DE10135091A1 - Method, device and slide for microdissection - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Mikroskopiereinrichtung zur Mikrodissektion und insbesondere Objektträger für mikroskopische Präparate zur Isolation eines interessierenden Präparatanteils, wobei die Objektträger insbesondere in Gestalt von Mehrfachfolien-Objektträgern (MFOT) der Lasermikrodissektion ausgebildet sind und die Objektträger aus mindestens einem magnetisierbaren oder magnetischen Träger bestehen. The invention relates to a method and a microscope device for microdissection and in particular microscope slide specimens for isolating a preparation portion of interest, the slides in particular in the form of Multiple film slides (MFOT) of the laser microdissection are formed and the Slides consist of at least one magnetizable or magnetic carrier.
In der Mikroskopie werden mikroskopische Präparate auf transparente Glas- oder Plastikobjektträger aufgebracht, um diese anschließend in die optische Achse eines Mikroskops einzubringen (Mikroskopie in Forschung und Praxis, H. Robenek (Hrsg.); GIT Verlag, Darmstadt, 1995). In microscopy, microscopic specimens are placed on transparent glass or Plastic slides applied to then in the optical axis of a Introduce microscopes (microscopy in research and practice, H. Robenek (ed.); GIT Verlag, Darmstadt, 1995).
Die Mikrodissektion ist ein Verfahren der Biowissenschaften, mit dem isolierte oder in einem Gewebe lokalisierte zelluläre, supra- und subzelluläre Strukturen abgetrennt werden und somit weiteren analytischen und präparativen Verfahren zugänglich gemacht werden können (Microdissection and its downstream tools, J Mol Med 2000; 78(7): B19-B34). Microdissection is a process in life sciences, using the isolated or in one Tissue localized cellular, supra- and subcellular structures are separated and thus can be made accessible to other analytical and preparative methods (Microdissection and its downstream tools, J Mol Med 2000; 78 (7): B19-B34).
Unter den Mikrodissektionsverfahren spielen die LCM-(Laser Capture Microdissection)-
Verfahren eine besondere Rolle, so
- - bei der Gewebeübertragung gemäß WO 98/36261 mit Hilfe der Folie/des Films aus EVA (E/VA - Ethylen/Vinylacetat-Copolymere) als Material, wobei dem Film eine Dotiersubstanz zugesetzt wird; EVA als Polymer findet auch in anderen Fällen Verwendung (US 6157446, WO 00/68662),
- - zur Selektion kleiner Zelltrauben (small clusters of cells) und biologischer Moleküle (WO 01/26460),
- - bei der Entnahme von Gewebeproben (WO 99/00658) oder
- - zur Verringerung der Kontaminationsraten (WO 01/33190, auch US 6215550).
- - In the tissue transfer according to WO 98/36261 using the film / film made of EVA (E / VA - ethylene / vinyl acetate copolymers) as a material, a dopant being added to the film; EVA as a polymer is also used in other cases (US 6157446, WO 00/68662),
- for the selection of small clusters of cells and biological molecules (WO 01/26460),
- - when taking tissue samples (WO 99/00658) or
- - To reduce the contamination rates (WO 01/33190, also US 6215550).
Die Mikrodissektion kann manuell oder mikromanipulativ mechanisch mit Skalpell oder
Nadel in direktem Kontakt mit der Probe oder kontaktfrei mittels fokussierten Lasern
("Lasermikrodissektion", LMD) realisiert werden. In der US 5,998,129 z. B. wird ein LMD-
Verfahren beschrieben: In einem ersten Schritt wird der interessierende Bereich einer auf
konventionelle Glasobjektträger aufgebrachten Probe mit einem Laserstrahl in seiner
Zirkumferenz vom umgebenden Gewebe abgetrennt. In einem zweiten Schritt wird der
isolierte, noch dem Objektträger aufliegende Probenbereich mittels eines zusätzlichen, auf ihn
gerichteten Laserimpulses in Richtung des Laserstrahles mobilisiert und in einem
Reaktionsbehältnis aufgefangen. Dieses Verfahren wirkt auf den Gewebezusammenhang des
interessierenden Probenbereichs zerstörend und erlaubt in den meisten Fällen keine
morphologische Nachbeobachtung des Mikrodissektats. Besonders problematisch ist die
direkte Exposition des interessierenden Probenbereichs mit hochenergetischer biologisch
aktiver Laserstrahlung (z. B. N2-Laser emittiertes UV-Licht der Wellenlänge 322 nm).
Mögliche schädigende Einwirkungen können durch Aufziehen des Präparateschnittes auf UV-
absorbierende Folien in noch mittels Laser schneidbarer Dicke reduziert werden. Hierzu
können transparente Polymerfolien entweder auf dem Objektträger randlich verklebt oder über
einem Rahmen frei gespannt werden. In beiden Fällen kann bei hinreichend großen
interessierenden Arealen durch die Verwendung eines aufrechten Mikroskops und die
Anordnung des Gewebeschnitts über einem Reaktionsgefäß auf den zusätzlichen Laserimpuls
zur Mobilisierung verzichtet werden, da ausreichend schwere Mikrodissektate allein durch die
Erdanziehungskräfte in entsprechend positionierte Auffangbehältnisse verbracht werden.
LMD-Verfahren werden in der Patentliteratur des weiteren genannt
- - bei der membrangestützten Mikrodissektion, wobei als Trägermembranen UV-absorbierende Polymere vorgeschlagen worden sind, z. B. Polyester, Polyethylen oder Polycarbonat (DE 198 18 425 A1),
- - zur Gewinnung von Gewebeproben (US 6204030),
- - bei der Tumorerkennung (EP 1067374 = DE 199 32 032 A1) oder
- - zur Gewinnung von biologischen Objekten, z. B. zur Separation von Zellen oder Zellorganellen aus Gewebeschnitten; wobei auf planaren Trägern mit Hilfe von Laserstrahlen Objektfelder ausgeschnitten werden sollen (WO 97/29354, auch WO 97/29355).
- - In membrane-assisted microdissection, UV-absorbing polymers have been proposed as support membranes, e.g. B. polyester, polyethylene or polycarbonate (DE 198 18 425 A1),
- - for obtaining tissue samples (US 6204030),
- - in tumor detection (EP 1067374 = DE 199 32 032 A1) or
- - For the extraction of biological objects, e.g. B. for the separation of cells or cell organelles from tissue sections; whereby object fields are to be cut out on planar supports with the aid of laser beams (WO 97/29354, also WO 97/29355).
Nicht beeinflusst durch die Verwendung aufrechter Mikroskope und freigespannter Folien werden aber elektrostatische oder Kohäsionseffekte, die zu einem Anhaften des Mikrodissektates am darunterliegenden Glasobjektträger oder der umgebenden Folie führen. Dies macht die kontaktfreie Überführung besonders kleiner Mikrodissektate, bestehend etwa aus einzelnen Zellen oder subzellulären Strukturen, in die gewünschten Reaktionsgefäße aufwendig bzw. unmöglich. Weitere Phänomene, die oft zu einem Verlust besonders kleiner interessierender Probenbereiche führen, sind die unregelmäßigen Flugbahnen der Mikrodissektate unmittelbar nach vollständiger zirkumferentieller Isolation durch den Laserstrahl. Das letztere Phänomen tritt besonders häufig bei einzelnen freigespannten Folien auf. Eine weitere Limitation freigespannter Einzelfolien in der Lasermikrodissektion ist eine nicht selten während der Lasertrennung zu beobachtende Verziehung des Mikrodissektats aus der Fokusebene heraus. Diese bewirkt im schlimmsten Falle eine Verschiebung des Mikrodissektats auf die objektivnahe, d. h. dem Auffangbehältnis abgewandte Seite der einzelnen Trägerfolie, von wo eine kontaktfreie gravitationell oder Laser-vermittelte Gewinnung nicht mehr ohne größeren Aufwand möglich ist. Not affected by the use of upright microscopes and freely stretched foils but electrostatic or cohesion effects, which lead to an adhesion of the Guide microdissectates on the underlying glass slide or the surrounding film. This makes the contact-free transfer of particularly small microdissectates, such as existing from individual cells or subcellular structures, into the desired reaction vessels complex or impossible. Other phenomena that often result in a particularly small loss areas of interest are the irregular trajectories of the Microdissectates immediately after complete circumferential isolation by the Laser beam. The latter phenomenon occurs particularly frequently with individual free-stretched foils on. Another limitation of free-stretched individual foils in the laser microdissection is one distortion of the microdissectate not infrequently observed during laser separation the focus level. In the worst case, this causes a shift of the Microdissectate on the objective, d. H. the side of the receptacle facing away from the single carrier film, from where a non-contact gravitationally or laser-mediated Extraction is no longer possible without major effort.
Besonders die Mikrodissektion von Einzelzellen oder subzellulärer Strukturen (z. B. Organellen, Zellkerne, ganze Chromosomen oder Chromosomenabschnitte) erfordern den Einsatz hochvergrößernder Immersionsobjektive (63x, 100x). Im Falle der Verwendung freigespannter Folien kommt es dabei zu direktem Kontakt von Immersionsöl und Objektiv mit der Unterseite der präparattragenden Folie. Die so gewonnenen Strukturen sind dadurch einer für die weitere Analytik empfindlich störenden Kontaminationsgefahr ausgesetzt. Dieses Problem gewinnt besondere Bedeutung beim Einsatz hochempfindlicher Nachweisverfahren von Nukleinsäuren an kleinsten Mikrodissektaten. Especially microdissection of single cells or subcellular structures (e.g. Organelles, cell nuclei, whole chromosomes or sections of chromosomes) require that Use of high-magnification immersion lenses (63x, 100x). In case of use Free-stretched foils result in direct contact between the immersion oil and the lens with the underside of the product-carrying film. The structures thus obtained are thereby exposed to a contamination hazard which is sensitive to further analysis. This Problem gains special importance when using highly sensitive detection methods of nucleic acids on the smallest microdissectates.
Der Einsatz von Mikrodissektion zur selektiven Gewinnung von auf Objektträgern unter Verwendung von Standardverfahren der Zellzucht kultivierten lebenden Zellen ist mit herkömmlichen Verfahren kontaktfreier Lasermikrodissektion nicht zuverlässig möglich. Um die Viabilität der Zellen während der Mikrodissektion zu erhalten, müssen diese möglichst konstant von einer wenngleich dünnen Schicht von isotoner Nährstofflösung umgeben sein. In den herkömmlichen Lasermikrodissektionsverfahren verhindern kohäsive Kräfte der Nährstofflösung eine effektive Mobilisierung isolierter Einzelzellen oder Gewebsareale in die Auffanggefäße durch gravitationelle Kräfte allein. Noch problematischer wird die Gewinnung von lebenden Zellen bei Verwendung von freigespannten Einzelfolien unter hochvergrößernden Immersionsobjektiven, da das Immersionsöl durch seinen objektivseitigen Kontakt mit der Einzelfolie zusätzlich adhäsiv wirksam wird. The use of microdissection for the selective extraction of slides on Using standard methods of cell culture cultured living cells is with conventional methods of contactless laser microdissection not reliably possible. Around To maintain the viability of the cells during microdissection, they must be as possible be constantly surrounded by a thin layer of isotonic nutrient solution. In the conventional laser microdissection methods prevent cohesive forces of the An effective mobilization of isolated single cells or tissue areas in the nutrient solution Collecting vessels by gravitational forces alone. Extraction becomes even more problematic of living cells when using free-stretched single foils under high magnification immersion lenses, because the immersion oil through its lens-side Contact with the single film also has an adhesive effect.
Aufgabe der Erfindung ist es, Mikrodissektionsverfahren und Mikroskopiereinrichtungen zu
entwickeln, die eine zuverlässige Gewinnung auch kleinster Probenbereiche ermöglichen.
Die Aufgabe wird in erster Linie durch Objektträger gelöst, die aus mindestens zwei
Schichten von Trägermaterialien gebildet sind, wobei die eine - die Barrierefolie -
objektivnah das Immersionsöl aufnimmt und kontaminationsverhindernd wirkt, während die
andere - eine Trägerfolie mit magnetischen Eigenschaften - Schnitten von fixiertem oder
lebendem Gewebe sowie fixierten oder lebenden Zellen anheftet - und vom Laserstrahl
mitdurchtrennt wird. Mit folgendem Verfahren kann nun ein interessierender Anteil des
mikroskopischen Präparats zuverlässig gewonnen werden:
- - Sachgerechtes Aufbringen und Färbung eines Präparates oder Aufbringen und Kultivierung lebender Zellen oder von Gewebe auf der laserschneidbaren Seite eines Mehrfachfolien-Objektträgers (MFOT) - Zell- oder Gewebe-Trägerfolien-Verbunde des MFOT - mittels Standardverfahren der histologischen, immunhistologischen oder Zellkultur-Technik;
- - Einbringen des Präparates auf dem Objektträger zwischen Objektiv und Auffanggefäß in einer Weise, dass die laserschneidbare Seite des Mehrfachfolien-Objektträgers dem Auffanggefäß zugewandt ist;
- - Auswählen der interessierenden mikroskopischen Struktur unter Verwendung hochauflösender Objektive;
- - Isolation des interessierenden Anteils mittels planar zirkumferentieller Laserablation;
- - Aufnahme des Mikrodissektats in das Auffanggefäß mittels magnetischer Anziehung, ausgehend von unter dem Boden des Reaktionsgefäßes/Auffanggefäßes lokalisierten Magneten.
- - Proper application and staining of a preparation or application and cultivation of living cells or tissue on the laser-cutable side of a multi-slide microscope slide (MFOT) - Cell or tissue-carrier film composites of the MFOT - using standard methods of histological, immunohistological or cell culture technology;
- - Introducing the preparation on the slide between the lens and the collection vessel in such a way that the laser-cutable side of the multi-slide slide faces the collection vessel;
- - Selecting the microscopic structure of interest using high resolution lenses;
- - Isolation of the portion of interest using planar circumferential laser ablation;
- - Picking up the microdissectate in the collecting vessel by means of magnetic attraction, starting from magnets located under the bottom of the reaction vessel / collecting vessel.
Die erfindungsgemäße Verwendung der Mikroskopiereinrichtung und der Objektträger liegt in der Isolation mikroskopischer Präparatanteile und der Gewinnung auch kleinster Probenbereiche. Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung der Lasermikrodissektion zur selektiven Gewinnung von lebenden Zellen. The use according to the invention of the microscope device and the slide is in the isolation of microscopic specimen parts and the extraction of even the smallest Sample areas. The invention also relates to the use of laser microdissection for selective extraction of living cells.
Durch Verwendung von Mehrfachfolien-Objektträgern (MFOT) als Substrate für die Zell- oder Gewebekultur können unter Verwendung von zellbiologischen Standardverfahren der Zellzucht lebende Zellen auf der Trägerfolienseite des MFOT adhärent aufgezogen und/oder kultiviert werden. By using multiple film slides (MFOT) as substrates for the cell or tissue culture can be performed using standard cell biological techniques Cell growing cells adherently grown and / or on the carrier film side of the MFOT be cultivated.
Die nutzbaren Flächen der Mehrfachfolien-Objektträger (MFOT) sind vorgegeben durch die Abmessungen der Standardglasobjektträger (76 mm × 25 mm), im weiteren aber nur durch die Möglichkeit, glatte parallele Folienoberflächen zu erhalten. The usable areas of the multi-slide (MFOT) are specified by the Dimensions of the standard glass slides (76 mm × 25 mm), but only by the following Possibility to get smooth parallel foil surfaces.
Die Dicken der verschiedenen Folien richten sich nach den Anforderungen an die Stabilität der Barrierefolie (vorzugsweise 10-20 µm) bzw. leichte Schneidbarkeit der Trägerfolie (vorzugsweise < 1 µm). The thicknesses of the various foils depend on the requirements for stability the barrier film (preferably 10-20 µm) or easy to cut the carrier film (preferably <1 µm).
Als Folienmaterialien kommen bevorzugt transparente, zugfeste, inerte und temperaturstabile Polymere mit und ohne Absorption im Bereich der Wellenlänge des zu verwendenden Lasers in Frage. Bei Verwendung eines N2-Lasers eignen sich z. B. im UV-Lichtbereich von 322 nm gut absorbierende Polyethylenterephthalate (PET) oder Polyethylennaphthalate (PEN; http:/ / www.dupontteijinfilms.com/datasheets/q71.htm) als Träger- und gering absorbierende Polyethersulfone (PES) als Barrierefolien. Transparent, tensile, inert and temperature-stable are preferred as film materials Polymers with and without absorption in the range of the wavelength of the laser to be used in question. When using an N2 laser, z. B. in the UV light range of 322 nm highly absorbent polyethylene terephthalate (PET) or polyethylene naphthalate (PEN; http: / / www.dupontteijinfilms.com/datasheets/q71.htm) as carrier and low absorbent Polyethersulfones (PES) as barrier films.
Die Trägerfolien werden erfindungsgemäß mittels verschiedener Verfahren mit magnetischen
Eigenschaften versehen:
Durch einseitiges Auftrocknen einer Lösung oder Suspension von magnetischen Partikeln,
insbesondere von Lösungen bzw. Suspensionen kubischen Magnetits (Fe3O4) oder von
Dextranpartikeln sowie durch Koextrusion einer Dispersion von Magnetit und PET/PEN bei
der Folienherstellung.
According to the invention, the carrier films are provided with magnetic properties using various methods:
By drying on one side a solution or suspension of magnetic particles, in particular solutions or suspensions of cubic magnetite (Fe 3 O 4 ) or dextran particles, and by coextruding a dispersion of magnetite and PET / PEN during film production.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nutzbare Mikrodissektionseinrichtungen können entweder einen feststehenden Laserstrahl und einen verfahrbaren xy-Tisch oder einen ablenkbaren Laserstrahl bei feststehender Probe aufweisen. Ein überraschender Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die oben beschriebenen Verluste des Mikrodissektats durch Verziehen während des Schneideprozesses durch die Barrierefolie effektiv verhindert werden. Durch den Einsatz magnetischer Kräfte in Richtung auf das Auffanggefäß werden ferner mechanische Verkeilungs- und/oder elektrostatische Adhäsionseffekte zwischen Mikrodissektat und dem restierenden Präparat überwunden und tragen so zur Erreichung einer deutlich gesteigerten Gewinnungsrate gegenüber Einzelfolienobjektträger verwendenden Verfahren bei. Microdissection devices that can be used with the method according to the invention either a fixed laser beam and a movable xy table or one have deflectable laser beam with a fixed sample. A surprising advantage of Invention is that the loss of microdissectate described above by Warping can be effectively prevented by the barrier film during the cutting process. Through the use of magnetic forces in the direction of the collecting vessel mechanical wedging and / or electrostatic adhesion effects between Microdissectate and the remaining preparation are overcome and thus contribute to achieving one significantly increased recovery rate compared to single slide slides Procedure at.
Ferner kann das Mikrodissektat sowohl nach oben im Falle einer inversen Mikroskop- Architektur als auch nach unten im Falle der aufrechten Mikroskop-Architektur in das Reaktionsgefäß/Auffanggefäß verbracht werden. Furthermore, the microdissectate can be moved upwards in the case of an inverse microscope Architecture as well in the case of the upright microscope architecture in that Reaction vessel / collecting vessel are brought.
Das Reaktionsgefäß/Auffanggefäß besteht aus einem transparenten Napf, in dessen Basis konzentrisch ein Magnet unterlegt ist. Dieser kann als ringförmiger Dauermagnet in die Kunststoffform integriert sein oder als Elektromagnet dem Gefäß als Halterung dienen. The reaction vessel / collecting vessel consists of a transparent bowl in the base a magnet is placed concentrically. This can be in the form of an annular permanent magnet Be integrated plastic mold or serve as a holder for the vessel as an electromagnet.
Als eine besondere erfindungsgemäße Ausführungsform sind Mehrfachfolien-Objektträger (MFOT) für die Lasermikrodissektion (LMD) entwickelt worden. Multi-slide slides are a special embodiment of the invention (MFOT) for laser microdissection (LMD).
Die Herstellung von qualitativ hochwertigem Verbrauchsmaterial stellt eine besonders kritische Voraussetzung für die Operationalität sämtlicher Mikrodissektionsverfahren dar. Für eine zuverlässige Mobilisierbarkeit auch kleinster interessierender Gewebestrukturen von MFOT wurden die im folgenden spezifizierten Faktoren als besonders kritisch erkannt: The production of high quality consumables represents a special is a critical prerequisite for the operationality of all microdissection processes reliable mobilization of even the smallest tissue structures of interest MFOT identified the following factors as particularly critical:
Die verwendeten Barriere- und Trägerfolienmaterialien müssen generell vollständig fett- und klebstofffrei sein, um eine leichte Lösung der beiden im freigespannten Bereich möglichst planar einander anliegenden Folien im Mikrodissektatareal zu erreichen. The barrier and carrier film materials used must generally be completely grease and be adhesive-free, so that the two can be easily solved in the free area to achieve planar contact with each other in the microdissectar area.
Unter den für die Gewebsfixierung, Entparaffinierung und Färbung verwendeten Chemikalien stellen organische Lösungsmittel, wie Xylol, die aggressivsten Substanzen dar. Um kapillarattraktionsvermittelte Folien-Adhärenzphänomene zu vermeiden, muss die randliche Verklebung der Barriere- und Trägerfolienmaterialien flüssigkeitsdicht sein. Ferner kann bei einem Einsatz der MFOT in der Gewebekultur der Gebrauch von Sterilisationsverfahren und damit eine Stabilität der MFOT unter herkömmlichen Autoklavierbedingungen notwendig werden. Um dies zu erreichen, wurden 75 mm × 21 mm messende Plättchen aus handelsüblichem Epoxydharz-Leiterplattenbasismaterial (FR-4) von 1 mm Dicke vollflächig mit Transferfolienkleber (z. B. der Acrylatdispersionskleberfolie 467MP der Firma 3M Deutschland GmbH) laminiert und in dieses Laminat rechteckige Fenster der Dimension 51 mm × 18 mm gefräst. Kleberseitig wurden dann PES-Folie von 20 µm Dicke straff auflaminiert und dieses komplexe Laminat PES-folienseitig im Siebdruckverfahren unter Auslassung der ausgefrästen Areale mit einer etwa 20-30 µm dünnen Kleberschicht (wässriger Acrylatdispersions-Siebdruck-Klebstoff SP4533 der Firma 3M Deutschland GmbH) versehen. Auf diese Kleberschicht wurden dann PEN- (TEONEX Q71 der Firma DuPont Teijin; http:/ / www.dupontteijinfilms.com/datasheets/q71.htm) oder PET-Folien von < 2 µm bzw. < 1 µm Dicke straff auflaminiert. Wesentlich ist, dass die beiden Folien im freigespannten Bereich möglichst distanzfrei planar anliegen. Among the chemicals used for tissue fixation, dewaxing and staining organic solvents, such as xylene, are the most aggressive substances To avoid capillary traction-mediated film adherence phenomena, the marginal Bonding of the barrier and carrier film materials should be liquid-tight. Furthermore, at use of the MFOT in tissue culture, the use of sterilization processes and This means that stability of the MFOT under conventional autoclaving conditions is necessary become. In order to achieve this, 75 mm × 21 mm measuring plates were made Commercial epoxy resin circuit board base material (FR-4) of 1 mm thickness over the entire surface with transfer film adhesive (e.g. the acrylic dispersion adhesive film 467MP from 3M Deutschland GmbH) laminated and in this laminate rectangular windows of dimension 51 mm × 18 mm milled. PES film 20 µm thick was then taut on the adhesive side laminated and this complex laminate on the PES film side using the screen printing process Omission of the milled out areas with an approximately 20-30 µm thin adhesive layer (more watery Acrylic dispersion screen printing adhesive SP4533 from 3M Deutschland GmbH). PEN (TEONEX Q71 from DuPont Teijin; http: / / www.dupontteijinfilms.com/datasheets/q71.htm) or PET films of <2 µm or <1 µm thick, laminated tightly. It is essential that the two foils are stretched out Area should be planar with as little distance as possible.
Bei Verwendung von Methoden zur hitzeinduzierten Wiedergewinnung von Epitopen (sog. "heat induced epitope retrieval" - HIER) werden üblicherweise die auf speziell oberflächenbehandelte Objektträger aufgezogenen Paraffinschnitte zwischen 1 und 10 Minuten in Zitrat- oder Ethylendiamin-Tetraessigsäure-(EDTA)Puffern im Dampfdrucktopf gekocht. Dies stellt sowohl für die Adhärenz der Schnitte auf der Trägerfolie als auch für die Dichtigkeit der Folienverbindung eine besondere Belastung dar. Es konnte erfindungsgemäß ein Herstellungsverfahren für Mehrfachfolienobjektträger (MFOT) entwickelt werden, welches zweiminütiges HIER in pH 6.0 Zitratpuffer bei guter Funktionalität ermöglicht. When using methods for the heat-induced recovery of epitopes (so-called "heat induced epitope retrieval" - HERE) are usually those on special surface-treated slides drawn paraffin sections between 1 and 10 Minutes in citrate or ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) buffers in a steam pressure pot cooked. This represents both for the adherence of the cuts on the carrier film and for the Tightness of the film connection represents a particular burden a manufacturing process for multiple film slides (MFOT) are developed, which enables two-minute HERE in pH 6.0 citrate buffer with good functionality.
4. Kompatibilität mit Verfahren der Zell- und Gewebekultur4. Compatibility with methods of cell and tissue culture
Durch Verwendung von MFOT als Substrate für die Zell- oder Gewebekultur können unter Verwendung von zellbiologischen Standardverfahren der Zellzucht lebende Zellen auf der Trägerfolienseite des MFOT adhärent aufgezogen und/oder kultiviert werden. Dies ermöglicht die Verwendung der Lasermikrodissektion zur selektiven Gewinnung von lebenden Zellen. Um die Viabilität der Zellen während der Lasermikrodissektion nicht zu beeinträchtigen, müssen diese möglichst immer von einer wenngleich dünnen Schicht von Kulturmedium auf der Trägerseite des MFOT umgeben sein. In den herkömmlichen Lasermikrodissektionsverfahren verhindern kohäsive Kräfte in der Mediumflüssigkeit eine effektive Mobilisierung isolierter Einzelzellen oder Gewebsareale in die Auffanggefäße. Völlig unmöglich wird die Gewinnung von lebenden Zellen bei Verwendung von freigespannten Einzelfolien unter hochvergrößernden Immersionsobjektiven, da das Immersionsöl durch seinen objektivseitigen Kontakt mit der Einzelfolie zusätzlich adhäsiv wirksam wird. Durch die erfindungsgemäße Verwendung einer magnetischen Trägerfolie im MFOT-Format wird eine leichtere Gewinnbarkeit von lebenden Zellen mit der Mikrodissektion ermöglicht. By using MFOT as substrates for cell or tissue culture, you can Use of standard cell biological methods of cell culture on the living cells Carrier film side of the MFOT adhered and / or cultivated. this makes possible the use of laser microdissection for the selective extraction of living cells. In order not to impair the viability of the cells during laser microdissection, if possible, they always have to be coated with a thin layer of culture medium be surrounded on the carrier side of the MFOT. In the conventional Laser microdissection methods prevent cohesive forces in the medium liquid from effective mobilization isolated single cells or tissue areas in the collecting vessels. It will be completely impossible Extraction of living cells when using free-stretched individual foils high magnification immersion lenses, because the immersion oil through its lens-side Contact with the single film also has an adhesive effect. By the invention Using a magnetic carrier sheet in MFOT format will be easier With microdissection, living cells can be recovered.
In der Tabelle sind die Eigenschaften und Einsatzgebiete herkömmlicher Folienobjektträger
und Beispiele erfindungsgemäßer Mehrfachfolienobjektträger zusammengestellt.
Tabelle
Eigenschaften und Einsatzbereiche unterschiedlicher Folienobjektträger(FOT)-
Varianten
The table summarizes the properties and areas of application of conventional film slides and examples of multiple film slides according to the invention. Table of properties and areas of application for different film slides (FOT) variants
Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Merkmale aus bekannten und neuen Elementen ergeben in ihrer Gesamtheit einen synergistischen Effekt, der zu den erfindungsgemäßen neuen Mikroskopier- und Lasermikrodissektionseinrichtungen führt. The features of the invention go from the elements of the claims and from the Description, with both individual features and several in the form of Combinations represent advantageous versions for which protection is provided with this document is requested. The characteristics of known and new elements result in their Together a synergistic effect that leads to the new microscopy according to the invention and laser microdissection devices.
Zusammengefasst besteht die Erfindung in einem Mikrodissektionsverfahren zur Isolation mikroskopischer Präparatanteile in einer Mikroskopiereinrichtung, in der Objektträger eingesetzt werden, die aus mindestens einem magnetisierbaren oder magnetischen Träger bestehen. In summary, the invention consists in a microdissection method for isolation microscopic specimen portions in a microscope, in the slide are used, which consist of at least one magnetizable or magnetic carrier consist.
Die Objektträger, die aus mindestens zwei Schichten von Trägermaterialien aus Kunststoff bestehen, werden in der Lasermikrodissektion zum einen als Barrierefolie und zum anderen als Trägerfolie mit magnetischen Eigenschaften eingesetzt. Die Objektträger sind als Einzelfolien- oder Mehrfachfolien-Objektträger ausgelegt. The slides, which consist of at least two layers of plastic support materials exist, are in the laser microdissection on the one hand as a barrier film and on the other used as a carrier film with magnetic properties. The slides are as Single-slide or multi-slide slides designed.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Mehrfachfolienobjektträger besteht darin, dass auf einen Rahmen, auf den flächig ein Kleber A aufgebracht ist, der eine Barrierefolie aus Kunststoff fixiert, flächig ein weiterer Kleber B aufgebracht wird, der eine Trägerfolie aus einem weiteren Kunststoff fixiert und der zweite Kleber B so stark komprimiert wird, dass im freigespannten Bereich beide Folien einander planar aufliegen und die der Barrierefolie zugewandte Seite magnetische Partikel trägt. The method according to the invention for producing the multi-slide slide consists in that on a frame to which an adhesive A is applied flatly, the one Barrier film made of plastic fixed, another adhesive B is applied to the surface, the one Carrier film made of another plastic fixed and the second adhesive B so strong is compressed that in the free area, both foils lie on each other and planar the side facing the barrier film carries magnetic particles.
Die erfindungsgemäßen Trägerfolien bestehen aus Kunststofffolien und magnetischen oder magnetisierbaren Verbindungen bzw. Partikeln, insbesondere Dextranpartikeln oder kubischem Magnetit (Fe3O4). Hergestellt werden sie dadurch, dass man auf Kunststofffolien die Suspensionen von magnetischen Dextranpartikeln oder Lösungen bzw. Suspensionen kubischen Magnetits (Fe3O4) einseitig auftrocknet. Sie lassen sich auch durch Koextrusion einer Dispersion von Magnetit und Kunststofffolien herstellen. Verfahren zur Herstellung von magnetischen PET- oder PEN-Trägerfolien beruhen darauf, dass auf PEN oder PET die Suspensionen von magnetischen Dextranpartikeln oder Lösungen kubischen Magnetits (Fe3O4) einseitig aufgetrocknet werden oder Dispersionen von Magnetit und PEN oder PET koextrudiert werden. The carrier films according to the invention consist of plastic films and magnetic or magnetizable compounds or particles, in particular dextran particles or cubic magnetite (Fe 3 O 4 ). They are produced by drying the suspensions of magnetic dextran particles or solutions or suspensions of cubic magnetite (Fe 3 O 4 ) on one side on plastic films. They can also be produced by coextruding a dispersion of magnetite and plastic films. Processes for the production of magnetic PET or PEN carrier films are based on the fact that the suspensions of magnetic dextran particles or solutions of cubic magnetite (Fe 3 O 4 ) are dried on one side on PEN or PET, or dispersions of magnetite and PEN or PET are coextruded.
Die erfindungsgemäßen Zell- oder Gewebe-Trägerfolien-Verbunde des MFOT bestehen aus einem Mehrfachfolien-Objektträger und einer Zell- oder Gewebe-Kultur auf der laserschneidbaren Seite des MFOT. Hergestellt werden sie dadurch, dass man unter Verwendung von zellbiologischen Standardverfahren der Zellzucht Gewebe oder lebende Zellen auf der Trägerfolienseite des MFOT adhärent aufzieht und/oder kultiviert. The MFOT cell or tissue carrier film composites according to the invention consist of a multi-slide and a cell or tissue culture on the laser-cut side of the MFOT. They are made by being under Use of standard cell biological methods of cell culture tissue or living Cells adherently and / or cultivated on the carrier film side of the MFOT.
Die Anwendung der Erfindung liegt in der Isolation mikroskopischer Präparatanteile und in der Gewinnung auch kleinster Probenbereiche, wie der selektiven Gewinnung von lebenden Zellen. The application of the invention lies in the isolation of microscopic preparation parts and in the extraction of even the smallest sample areas, such as the selective extraction of living ones Cells.
In den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen: In the drawings, the subject of the invention is shown schematically and is based on of the figures described below. Show:
Fig. 1 einen erfindungsgemäßen Mehrfachfolienobjektträger mit Gewebeschnitt im Querschnitt; Figure 1 shows a multi-slide slide according to the invention with tissue section in cross section.
Fig. 2 einen erfindungsgemäßen Mehrfachfolienobjektträger in perspektivischer Ansicht; Figure 2 shows a multiple-film specimen slide according to the invention in a perspective view.
Fig. 3 ein erfindungsgemäßes Auffanggefäß für auf magnetische Trägerfolie aufgezogene Gewebeschnitte im Querschnitt; Figure 3 shows an inventive receptacle for drawn onto magnetic carrier foil tissue sections in cross-section.
Fig. 4 ein erfindungsgemäßes Auffanggefäß für auf magnetische Trägerfolie aufgezogene Gewebeschnitte in perspektivischer Ansicht; Fig. 4 shows an inventive receptacle for drawn onto magnetic carrier foil tissue sections in a perspective view;
Fig. 5 Verwendung eines erfindungsgemäßen Mehrfachfolienobjektträgers bei der Mikrodissektion in einer aufrechten Mikroskop-Architektur; Fig. 5 using a multiple-film specimen slide according to the invention in the microdissection in an upright microscope architecture;
Fig. 6 Verwendung eines erfindungsgemäßen Mehrfachfolienobjektträgers bei der Mikrodissektion in einer inversen Mikroskop-Architektur. Fig. 6 Use of a multiple slide according to the invention in microdissection in an inverse microscope architecture.
Fig. 1 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen Objektträger 1 mit einem Präparat 2 im Querschnitt. Der Objektträger 1 besteht aus einem Rahmen 3, auf den flächig ein Kleber A 4 aufgebracht ist, der eine 20 µm dicke Barrierefolie 5 aus Polyethersulfon (PES) fixiert. Auf die. Folie 5 ist flächig ein weiterer Kleber B 6 aufgebracht, der eine 0,9 µm dicke Trägerfolie 7 aus Polyethylenterephthalat (PET) fixiert. Abweichend von der schematisierten Darstellung ist der mittels Siebdruck aufgebrachte Kleber 6 nach Lamination der Trägerfolie 7 so stark komprimiert, dass diese im freigespannten Bereich der Barrierefolie 5 planar aufliegt. Die der Barrierefolie zugewandte Seite der Trägerfolie 7 ist mit magnetischen Polymeren, insbesondere mit magnetischen Dextranpartikeln 8 (Grüttner C, Teller J New types of silicafortified magnetic nanoparticles as tools for molecular biology applications. J Magn Magn Mat 1999; 194: 8-15) beschichtet. Fig. 1 shows schematically a slide 1 according to the invention with a preparation 2 in cross section. The slide 1 consists of a frame 3 , on the surface of which an adhesive A 4 is applied, which fixes a 20 μm thick barrier film 5 made of polyethersulfone (PES). On the. Another adhesive B 6 is applied to the surface of the film 5 and fixes a carrier film 7 made of polyethylene terephthalate (PET) with a thickness of 0.9 μm. In a departure from the schematic representation, the adhesive 6 applied by means of screen printing is compressed so strongly after lamination of the carrier film 7 that it lies planar in the exposed area of the barrier film 5 . The side of the carrier film 7 facing the barrier film is coated with magnetic polymers, in particular with magnetic dextran particles 8 (Grüttner C, Teller J New types of silicafortified magnetic nanoparticles as tools for molecular biology applications. J Magn Magn Mat 1999; 194: 8-15) ,
Fig. 2 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen Objektträger 1 mit einem Präparat 2 in perspektivischer Ansicht. Der Objektträger 1 besteht aus einem Rahmen 3, auf den flächig ein Kleber 4 aufgebracht ist, der eine 20 µm dicke Barrierefolie 5 aus Polyethylensulfon (PES) fixiert. Auf die Folie 5 ist flächig ein weiterer Kleber 6 aufgebracht, der eine 0.8 µm dicke Trägerfolie 7 aus Polyethylenterephthalat (PET) fixiert. Der Rahmen 3 ist exzentrisch ausgeschnitten, um die Nahebringung hochvergrößernder Immersionsobjektive zu ermöglichen. Fig. 2 schematically illustrates a slide 1 according to the invention with a preparation 2 in perspective view. The slide 1 consists of a frame 3 , on the surface of which an adhesive 4 is applied, which fixes a 20 μm thick barrier film 5 made of polyethylene sulfone (PES). A further adhesive 6 , which fixes a 0.8 μm thick carrier film 7 made of polyethylene terephthalate (PET), is applied flat to the film 5 . The frame 3 is cut out eccentrically in order to enable the proximity of high-magnification immersion lenses.
Fig. 3 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Auffanggefäß 9 für die gewonnenen Mikrodissektate. Ein Napf 10 aus transparentem Kunststoff mit 7,5 mm Durchmesser und 4 mm Wandhöhe ist unterlegt von einem NdFeB-Ringkernmagneten 11 mit einem Außendurchmesser von 7,5 mm, einem Innendurchmesser von 3,0 mm und einer Höhe von 1,5 mm. Die linke Zeichnung zeigt das Auffanggefäß in unbeschicktem Zustand, während in der rechten Zeichnung ein Mikrodissektat 12 durch die magnetische Anziehungskraft zwischen Ringkernmagnet und der magnetischen Trägerfolie auf dem Boden des Gefäßes lokalisiert ist. Fig. 3 schematically shows an inventive collecting vessel 9 for the recovered microdissectates. A bowl 10 made of transparent plastic with a diameter of 7.5 mm and a wall height of 4 mm is supported by an NdFeB toroidal magnet 11 with an outer diameter of 7.5 mm, an inner diameter of 3.0 mm and a height of 1.5 mm. The left drawing shows the collecting vessel in the unloaded state, while in the right drawing a microdissectate 12 is located on the bottom of the vessel by the magnetic attraction between the ring core magnet and the magnetic carrier film.
Fig. 4 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Auffanggefäß 9 für auf magnetische Trägerfolie aufgezogene Gewebeschnitte 12 in perspektivischer Ansicht. Ein Napf 10 aus transparentem Kunststoff mit 7,5 mm Durchmesser und 4 mm Wandhöhe ist unterlegt von einem NdFeB-Ringkernmagneten 11 mit einem Außendurchmesser 7,5 mm, einem Innendurchmesser von 3,0 mm und einer Höhe von 1,5 mm. Der Doppelpfeil markiert die magnetische Anziehungskraft zwischen Ringkernmagnet und der magnetischen Trägerfolie des Mikrodissektates 12. Fig. 4 schematically shows an inventive collecting vessel 9 for drawn onto magnetic carrier foil tissue sections 12 in a perspective view. A bowl 10 made of transparent plastic with a diameter of 7.5 mm and a wall height of 4 mm is supported by an NdFeB toroidal magnet 11 with an outer diameter of 7.5 mm, an inner diameter of 3.0 mm and a height of 1.5 mm. The double arrow marks the magnetic attraction between the ring core magnet and the magnetic carrier film of the microdissectate 12 .
Fig. 5 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen Aufbau zur Mikrodissektion. Das aufrechte Mikroskop 21 umfasst einen verfahrbaren Tisch 13, auf dem der MFOT 1 fixiert werden kann. An der Unterseite - das ist die der Barrierefolie zugewandte Seite der Trägerfolie 7 - des MFOT 1 ist das zu mikrodissezierende Präparat 2 aufgezogen. Das Präparat wird entlang der optischen Achse 16 von einer Beleuchtungsquelle 20 illuminiert und kann zur Auswahl des interessierenden Präparateanteils durch das Okular 15 inspiziert werden. Die Isolation des interessierenden Präparateanteils durch Laserablation kann entweder durch Verfahren des Objektträgertischs 13 oder durch optische Ablenkung des aus der Laserquelle 18 gespeisten Laserstrahls 19 erfolgen. Nach vollständig zirkumferentieller Isolation wird das Mikrodissektat durch die magnetische Anziehungskraft des NdFeB-Ringkernmagnet 11 in das auf der Auffanggefäßhalterung 17 angebrachte Auffanggefäß 9 hinein verbracht. Fig. 5 shows schematically a construction according to the invention for microdissection. The upright microscope 21 comprises a movable table 13 on which the MFOT 1 can be fixed. On the underside - that is the side of the carrier film 7 facing the barrier film - of the MFOT 1 is the preparation 2 to be microdissected. The specimen is illuminated along the optical axis 16 by an illumination source 20 and can be inspected through the eyepiece 15 to select the part of the specimen of interest. The portion of the preparation of interest can be isolated by laser ablation either by moving the slide table 13 or by optical deflection of the laser beam 19 fed from the laser source 18 . After completely circumferential isolation, the microdissectate is brought into the collecting vessel 9 attached to the collecting vessel holder 17 by the magnetic attraction force of the NdFeB toroidal magnet 11 .
Fig. 6 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen Aufbau zur Mikrodissektion. Das inverse
Mikroskop 21 umfasst einen verfahrbaren Tisch 13, auf dem der MFOT 1 fixiert werden
kann. An der der Barrierefolie zugewandten Seite der Trägerfolie 7 (Unterseite) des MFOT 1
ist das zu mikrodissezierende Präparat 2 aufgezogen. Das Präparat wird entlang der optischen
Achse 16 von einer Beleuchtungsquelle 20 illuminiert und kann zur Auswahl des
interessierenden Präparateanteils durch das Okular 15 inspiziert werden. Die Isolation des
interessierenden Präparateanteils durch Laserablation kann entweder durch Verfahren des
Objektträgertischs 13 oder durch optische Ablenkung des aus der Laserquelle 18 gespeisten
Laserstrahls 19 erfolgen. Nach vollständig zirkumferentieller Isolation wird das
Mikrodissektat durch die magnetische Anziehungskraft des NdFeB-Ringkernmagnet 11 in das
auf der Auffanggefäßhalterung 17 angebrachte Auffanggefäß 9 hinein verbracht.
Bezugszeichen
1 Folienobjektträger
2 Präparat
3 Rahmen
4 Kleber A
5 Barrierefolie
6 Kleber B
7 Trägerfolie
8 magnetische Dextranpartikel
9 Auffanggefäß
10 Napf aus transparentem Kunststoff
11 NdFeB-Ringkernmagnet
12 Mikrodissektat
13 Objektträgertisch
14 Objektiv
15 Okular
16 optische Achse
17 Auffanggefäßhalterung
18 Laserquelle
19 Laserstrahl
20 Beleuchtungsquelle
21 Mikroskop
Fig. 6 shows schematically a construction according to the invention for microdissection. The inverted microscope 21 comprises a movable table 13 on which the MFOT 1 can be fixed. The preparation 2 to be microdissected is attached to the side of the carrier film 7 (bottom side) of the MFOT 1 facing the barrier film. The specimen is illuminated along the optical axis 16 by an illumination source 20 and can be inspected through the eyepiece 15 to select the part of the specimen of interest. The portion of the preparation of interest can be isolated by laser ablation either by moving the slide table 13 or by optical deflection of the laser beam 19 fed from the laser source 18 . After completely circumferential isolation, the microdissectate is brought into the collecting vessel 9 attached to the collecting vessel holder 17 by the magnetic attraction force of the NdFeB toroidal magnet 11 . Reference numeral 1 film slides
2 preparation
3 frames
4 glue A
5 barrier film
6 glue B
7 carrier film
8 magnetic dextran particles
9 collecting vessel
10 bowl made of transparent plastic
11 NdFeB toroidal magnet
12 microdissectate
13 slide table
14 lens
15 eyepiece
16 optical axis
17 Collecting vessel holder
18 laser source
19 laser beam
20 lighting source
21 microscope
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