WO2005033668A1 - Micro-dissection - Google Patents

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WO2005033668A1
WO2005033668A1 PCT/EP2004/010905 EP2004010905W WO2005033668A1 WO 2005033668 A1 WO2005033668 A1 WO 2005033668A1 EP 2004010905 W EP2004010905 W EP 2004010905W WO 2005033668 A1 WO2005033668 A1 WO 2005033668A1
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WO
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preparation
dissectate
gripper
slide
layer
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PCT/EP2004/010905
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German (de)
French (fr)
Inventor
Norbert Leclerc
Kay Haupt
Original Assignee
Norbert Leclerc
Kay Haupt
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/2813—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides

Definitions

  • the m-RNA is a very short-lived product of the cells, which is why the concentration of m-RNA in the cells is very low. If you want the m-RNA z. B. determine a tumor cell, the largest possible number of tumor cells must therefore be collected. To do this, the tumor cells must be from diseased tissue be isolated. For this purpose, the tumor cells can be cut out (dissected) from tissue sections and collected in isolation. The isolated tumor cells are then disrupted. The m-RNA is isolated from the cells by suitable purification steps. It is then translated into c-DNA using the reverse transcriptase. This is usually amplified using linear PCR. The c-DNA thus obtained is z. B. qualitatively or quantitatively analyzed using suitable DNA chips.
  • the present invention is concerned with the isolation or cutting out of cells to be examined, with so-called dissection. If individual cells - with diameters in the range of a few micrometers - are cut out of tissue, this is also called microdissection.
  • Microdissection may a. to work extremely cleanly, i.e. in particular to work without RNAsen, since these break down the m-RNA. Avoid touching it with your bare hand.
  • the tissue section is prepared in air, for example on a slide.
  • a closed curve around the diseased tissue (dissectate) is described with the help of a laser.
  • the tissue is ablated on the curve, separating the diseased tissue to be isolated from the rest of the tissue.
  • the cut dissectate can, for example, be sucked into a pipette if it is in liquid.
  • DE 198 04 800 C2 describes a method in which dissectates are cut out of a preparation. After cutting out, the dissected specimens are sucked in by a gripper.
  • the gripper has a hollow channel with a small round opening, in front of which the dissectates adhere after suction. With the help of the gripper, the dissected specimens can be transported into a collecting vessel.
  • a disadvantage of this method is that the dissectates are not fixed during ablation and therefore often roll up. Complete ablating is then not possible, nor is suctioning with the gripper.
  • WO 03/008934 AI describes slides and methods for producing the slide, which can be used for dissecting a preparation, for example a biological sample.
  • a preparation section i.e. the area of a carrier substrate, which can be separated from the carrier substrate together with a preparation section when dissecting a preparation
  • mobilization means are provided for forming an electromagnetic force interaction in response to an application of an electromagnetic force, so that the dissecting section is targeted as a result of the force interaction shifted, ie can be transported.
  • a disadvantage of this method is that the dissectates are not fixed during ablation, so that complete ablation is difficult or is no longer possible.
  • the object of the invention is to provide a microdissection method which is suitable for automation.
  • a suitable microdissection method must fix the specimen during cutting so that the latter is not affected by the action of e.g. B. the laser moves. After cutting, the dissectate must be safely isolated from the rest of the tissue. A reliable transport of the dissectate by means of a gripper into different collecting vessels and the safe detachment from the gripper for depositing the dissectate in the different collecting vessels must be guaranteed. A high degree of automation should be achievable with comparatively little effort.
  • the layer of biological material is first applied to one side of a stabilization layer.
  • the stabilization layer can be omitted if the mechanical properties of the layer of biological material permit this.
  • the layer of biological material, possibly together with the stabilizing layer, is referred to below as a preparation.
  • the layer of biological material can e.g. B. a tissue section, a cell smear, seeded cells or a cell culture.
  • Glass slides are particularly suitable for microscopy.
  • other fixed documents can also be used, provided they are dielectric. You also don't have to be transparent.
  • An electric field of sufficient strength (for example between approximately 100 kV / m and 10 MV / m, preferably 1 MV / m) is then applied between the side of the slide facing away from the specimen and the side of the specimen facing away from the specimen slide. This results in dielectric polarization of both the slide and the specimen. If the charge carriers collecting on the side of the specimen facing away from the specimen slide are removed by a suitable first electrode (e.g. a wire with zero potential / grounding that is not insulated from the specimen), a residual charge remains in the specimen. This causes an increased areal attraction between the dielectrically polarized slide and the electrically charged preparation, which goes far beyond the naturally existing adhesion. The specimen for the dissection to be carried out is thus securely fixed.
  • a suitable first electrode e.g. a wire with zero potential / grounding that is not insulated from the specimen
  • the described method for electrostatically fixing a layer of biological material (preparation) on a specimen slide can also be used in parts to lift a dissectate from a specimen or from a specimen slide, since electrostatic fixation is always accompanied by an electrostatic charge that is required for the removal can be exploited.
  • the focus of a laser beam describes a closed or approximately closed curve around the dissectate.
  • the preparation is ablated on this curve, i. H. essentially evaporated. This separates the dissectate from the rest of the specimen.
  • the dissectate initially remains together with the preparation in its original position on the slide, especially since it adheres electrostatically to the slide. However, it is - at least essentially - mechanically separated from the rest of the preparation.
  • a second electrode is brought up to the dissectate from the side of the specimen facing away from the slide.
  • the direction of the applied electric field is then reversed and, if necessary, its strength is changed in such a way that the dissectate detaches from the slide and moves along the field lines to the second electrode.
  • the electrode is preferably covered with an electrically insulating plastic. An electrical high voltage applied from the outside is therefore used to fix the specimen and to isolate the dissectate.
  • the dissectate adheres to the second electrode, it can be transported to a vessel holding the dissectate. There it can be separated from the second electrode by removing the electrostatic adhesion of the dissectate to the second electrode. This can e.g. B. can be achieved by charging the second electrode with an electric charge of the same sign as the electric charge of the dissectate.
  • the dissectate can be specifically cut out, isolated, transported and set down. This creates the possibility of extensive automation.
  • the second electrode can also be designed such that it, as a whole or individual parts, can be fed together with the collected dissectates for further biochemical processing.
  • the gripper is either brought into contact with the preparation or in its immediate vicinity.
  • the gripper preferably has a continuous hollow channel with an opening on the preparation side that is smaller than the part of the preparation to be isolated.
  • the gripper can be a thin pipette.
  • the opening can be round or slit-shaped. It is crucial that at least one dimension of the opening is smaller than the dissectate. This prevents the dissectate from entering the opening.
  • a preferably largely flat contact surface is formed, with which the gripper can touch the preparation.
  • the contact surface of the gripper can also consist of a porous material with irregular openings.
  • the part of the preparation to be isolated is sucked onto the gripper by a pressure difference. As a rule, this is done by reducing the pressure in the hollow channel or ..- in the openings of the gripper and an associated
  • the fixation is preferably carried out before the part of the layer of biological material to be isolated has been cut out of the preparation.
  • the part to be insulated is fixed by the gripper during the cut.
  • the dissectate is then cut out of the specimen. This is preferably done with the help of laser microdissection.
  • the gripper is advantageously transparent in order to avoid disturbing reflections and scattering. It also makes sense to manufacture the gripper from a transparent material so that the illumination of the preparation is not impaired.
  • the dissectate can also be cut out first and only then can the gripper pick up the dissectate.
  • the specimen is fixed electrostatically on the slide beforehand.
  • the dissectate remains attached to the gripper, even if the gripper is removed from the specimen.
  • At least one opening of the gripper must be at least partially covered by the dissectate. This can be achieved by positioning the gripper before the dissection. This isolates the dissectate from the rest of the layer.
  • the dissectate With the help of the gripper, the dissectate is sucked in but not sucked in. This allows the dissectate to be transported and put down again in a collecting vessel. To do this, it is sufficient to change the pressure difference in such a way that the dissectate is no longer held by the gripper and falls off the gripper. For this purpose, the pressure difference z. B. weakened or vice versa.
  • a collecting vessel is a place where the dissectate is kept for further processing or is fed to further processing.
  • the described method is relatively easy to carry out. It fixes the specimen during cutting and allows the dissectate to be reliably transported to a collecting vessel, where it can be placed or deposited in a targeted manner.
  • the method described is therefore particularly suitable for automation.
  • the gripper can have a plurality of preparation-side openings that are smaller than the dissectates and enable a corresponding plurality of dissectates to be fixed in front of the respective preparation-side openings.
  • the gripper is placed again on the preparation and / or at the same time is placed on the preparation with its plurality of openings on the preparation side, so that the plurality of dissectates can be picked up and fixed at different positions. This makes it easy to collect multiple dissectates on one gripper.
  • An advantage of this procedure is that the gripper always picks up the sample or picks up the complete dissectate without complicated grasping and aiming, which is a considerable relief from the previously known methods. In this way, several samples can be taken or additional samples taken. A plurality of grippers can also be attached in a common holder and successively go through different phases of the method.
  • the gripper can travel with the cutting, for example when the cutting movement through the table on which e.g. the gripper is attached, is executed.
  • the gripper can also be used for the cutting movement e.g. follow a moving laser focus.
  • a layer also provided with openings can be located between the gripper and the preparation. This is referred to below as the intermediate layer.
  • the intermediate layer Before the gripper is lowered onto the specimen, one of the openings in this intermediate layer is brought into alignment with an opening of the gripper. The diameters of the openings do not have to match. It is only important that one of the openings - preferably the opening in the intermediate layer - is smaller than the dissectate to be picked up.
  • the intermediate layer can be moved in such a way that: a) another free opening is covered with an opening of the gripper; b) the opening covered with a dissectate reaches a device equivalent to the gripper, on which the dissectate is detached by changing the pressure difference.
  • the intermediate layer can be made of, for example. Polycarbonate exist.
  • the receptacle can be stored, the process is very flexible. Furthermore, the isolated dissectates can easily be checked on the gripper, since the gripper can be examined with the existing microscope.
  • the described processes complement each other and can be combined appropriately to improve the automation options.
  • the preparation can first be applied to a dielectric slide. It can be fixed electrostatically on the slide in the manner described. The part to be isolated (dissectate) of the preparation is then cut out of the preparation. Finally, the dissectate is created using the second electrode described above or separated from the rest of the preparation with the aid of the gripper.
  • the dissectates adhere to the gripper or the second electrode are cut out and are to be placed and / or placed in a targeted manner, they can also be placed on an adhesive base, for example on an adhesive film and / or a silicone rubber base. To place it on an adhesive surface, the pressure difference may not have to be changed for the gripper, nor the voltage difference for the second electrode reversed.
  • Such an adhesive base also opens up the possibility of storing the dissectates in a regular pattern, for example in the form of a matrix.
  • the adhesive base can be flat and form a reaction vessel with an attached frame, in size and shape thereby z. B. similar to a microtiter plate.
  • Another possibility for the spatial separation of the cut dissectates from the rest of the preparation is to lift the rest of the preparation from the slide in a suitable manner, e.g. B. with tweezers.
  • the electrostatically adhering dissectates then remain on the slide. These can be transferred to a collecting vessel using the gripper.
  • 1A shows a schematic illustration of the polarization step of the electrostatic fixing of a preparation on a slide
  • 1B shows a schematic illustration of the charging step of the electrostatic fixing of a preparation on a slide
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of the electrostatic lifting of a dissectate
  • 3A shows a schematic illustration of the approach of a pneumatic gripper to a preparation
  • 3B the suction of the preparation or dissectate onto the gripper
  • 3C the lifting off of the dissectate with the aid of the gripper
  • 3D the depositing of the dissectate in a collecting vessel
  • FIG. 4 shows a schematic illustration of the use of an intermediate layer between the gripper and the preparation.
  • FIG. 1A In the following, reference is made to FIG. 1A.
  • Tissue embedded or frozen in paraffin is broken up into thin tissue sections 10 by a planer. These usually roll up.
  • a dielectric microscope slide 12 is sprayed with alcohol.
  • the film 14 is, for. B. from 2 micron thick, UV absorbing PET or PEN. It serves as a stabilization layer. The paper is then removed.
  • the rolled-up tissue section 10 is then brought onto the film 14.
  • the microscope slide 12 with film 14 and tissue section 10 is heated to 60 °, as a result of which the paraffin melts and the tissue section 10 rolls out.
  • the structure of film 14 and tissue section 10 - which is referred to collectively as a preparation - can then be turned over, as a result of which the tissue section 10 comes to lie on the slide 12.
  • the tissue section 10 then lies between the slide and the stabilization layer or film 14.
  • the specimen is placed together with the dielectric slide 12 in the object plane of an inverted microscope in such a way that the slide is at the bottom and the layer of biological material is accessible from above.
  • the microscope has a motorized x-y table that can move the specimen. Collection vessels are also attached to the table, into which the parts to be insulated are to be placed after the dissection.
  • an electric field 18 (see FIG. 1A) of sufficient strength (preferably 1 MV / m) between that of the The side of the slide 12 facing away from the specimen and the side of the specimen, ie the film 14, facing away from the slide.
  • an electric field 18 (see FIG. 1A) of sufficient strength (preferably 1 MV / m) between that of the The side of the slide 12 facing away from the specimen and the side of the specimen, ie the film 14, facing away from the slide.
  • two electrodes, an electrode 15 on the specimen side and an electrode 16 on the slide side are used.
  • the latter has a cutout 17 so as not to hinder the objective of the inverse microscope.
  • Slide 12 collects positive charges.
  • negative charges accumulate on the side of the tissue section 10 lying on the slide 12 and positive charges in turn accumulate on the side of the film 14 facing away from the slide.
  • a suitable electrode 20 for example by a wire with zero potential / grounding that is not insulated from the specimen
  • a residual charge remains in the specimen (FIG. 1B).
  • the positive charges are drawn off on the side of the film 14 facing away from the slide 12. The preparation remains negatively charged.
  • the preparation is then cut using laser microdissection. If the microdissection takes place on a closed contour, the dissectate 22 remains together with the preparation in the original position on the slide 12. It is now mechanically separated from the rest of the preparation.
  • a second electrode 24 is brought up to the dissectate 22 from the side of the specimen facing away from the slide 12. Now the direction of the applied electric field is reversed and, if necessary, its
  • the dissectate 22 will detach itself from the slide 12 and move along the field lines to the second electrode 24. In order to prevent immediate transfer of the dissectate 22, this electrode must be electrically insulated from the dissectate 22. This is preferably done by a plastic coating 26.
  • a transparent gripper 28 is attached over the specimen (Fig. 3A). It can be lowered onto the specimen and moved in the lowered state with the specimen on the microscope stage if the microscope stage for the ablation or microdissection moves relative to the laser focus.
  • the gripper 28 has at its lower end a largely flat contact surface 30 which has a number of small openings 32.
  • the contact surface 30 is expediently so large that that several dissectates can fit on it.
  • the contact surface 30 preferably has a diameter of 500 ⁇ m.
  • the openings 32 have a diameter of approximately 8 ⁇ m and are arranged in the form of a 10 ⁇ 10 matrix.
  • openings 32 are connected via hollow channels 34 to a pneumatic device (not shown) which can generate negative and positive pressure.
  • the part 22 of the preparation to be insulated is selected and the transparent gripper 28 is brought into contact with the preparation from above such that an opening 32 of the contact surface 30 lies within the contour to be cut.
  • the direction of movement of the gripper 28 is indicated in FIG. 3A by an arrow printed in bold.
  • a negative pressure is then generated in the hollow channel 34 of the gripper 28 and the preparation is thereby sucked onto the gripper and thus fixed.
  • the different pressures are indicated in Fig. 3B by thin arrows.
  • the negative pressure can be distributed equally over all openings or channels, or can be formed individually for each channel.
  • 3D schematically indicates how the dissectate 22, after being lifted off the specimen slide 12, is transported to a collecting vessel 36 with the aid of the gripper 28.
  • the hollow channel 34 is subjected to an overpressure (indicated by a thin arrow). This dissolves the dissectate 22 from the opening 32. The dissectate 22 then falls (indicated by the bold arrow) into the collecting vessel 36.
  • the gripper 28 is always brought into contact with the stabilization layer 14 on the side facing away from the specimen. Contamination and carryover of biological material is effectively prevented in this way since the gripper 28 never comes into direct contact with the biological layer 10.
  • a layer 38 can be located between the gripper 28 and the preparation. This is referred to below as the intermediate layer 38.
  • One of the openings 40 of this intermediate layer 38 is brought into alignment with an opening 32 of the gripper 28 before the gripper 28 is lowered onto the preparation.
  • the diameters of the openings do not have to match. It is only important that one of the openings - preferably the opening 40 in the Intermediate layer 38 - is smaller than the dissectate 22 to be picked up.
  • the intermediate layer can be moved (indicated by the bold arrow in FIG. 4) such that: a) again a free opening 40 with an opening 32 of the gripper 28 comes to cover; or b) the opening 40 covered with a dissectate 22 arrives at a device equivalent to the gripper 28, on which the dissectate 22 is detached as described above.
  • the gripper 28 is lifted off and the collecting vessel 36 is transported to the gripper 28 or else the gripper 28 is transported to the collecting vessel 36 22. They then fall into the collecting vessel 36.
  • the pressure can be increased, for example, by one or more short pressure surges or by sound waves.

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Abstract

A method for micro-dissection is disclosed, whereby a preparation (10, 14) is firstly fixed to an object support (12) electrostatically, or by means of a gripper. A dissection is then cut from the preparation, by means of laser micro-dissection. The dissection does not move during the laser micro-dissection as a result of the electrostatic attraction. The dissection is subsequently lifted off electrostatically. Alternatively, the dissection can be lifted off by suction with a gripper, said dissection clinging to the outside surface thereof in front of a small opening.

Description

Beschreibung description
Zur Aufklärung der molekularen Ursachen von Krankheiten werden sogenannte Genexpressionsstudien durchgeführt. Dabei wird versucht, die tatsächlich in einer Zelle exprimierten Gene zu bestimmen, da die zugehörigen Proteine für die krankhafte Entwicklung der Zellen verantwortlich sind. Eine Möglichkeit, die tatsächlich vorhandenen Proteine zu bestimmen, besteht darin, die in der Zelle synthetisierten m-RNA zu bestimmen, da aus ihnen die Proteine gebildet werden.So-called gene expression studies are carried out to elucidate the molecular causes of diseases. An attempt is made to determine the genes actually expressed in a cell, since the associated proteins are responsible for the pathological development of the cells. One way of determining the proteins actually present is to determine the m-RNA synthesized in the cell, since the proteins are formed from them.
Die m-RNA ist jedoch ein sehr kurzlebiges Produkt der Zellen, weshalb die Konzentration an m-RNA in den Zellen sehr gering ist. Will man die m-RNA z. B. einer Tumorzelle bestimmen, so muss daher eine möglichst große Zahl von Tumorzellen gesammelt werden. Die Tumorzellen müssen dazu aus krankem Gewebe isoliert werden. Dazu können die Tumorzellen beispielsweise aus Gewebeschnitten ausgeschnitten (dissektiert ) und isoliert gesammelt werden. Anschließend werden die isolierten Tumorzellen aufgeschlossen. Durch geeignete Aufreinigungsschritte wird die m-RNA aus den Zellen isoliert. Danach wird sie mittels der Reversen Transkriptase in c-DNA übersetzt. Diese wird mit i. d. R. linearer PCR amplifiziert . Die so gewonnene c-DNA wird z. B. mit Hilfe von geeigneten DNA-Chips qualitativ bzw. quantitativ analysiert.However, the m-RNA is a very short-lived product of the cells, which is why the concentration of m-RNA in the cells is very low. If you want the m-RNA z. B. determine a tumor cell, the largest possible number of tumor cells must therefore be collected. To do this, the tumor cells must be from diseased tissue be isolated. For this purpose, the tumor cells can be cut out (dissected) from tissue sections and collected in isolation. The isolated tumor cells are then disrupted. The m-RNA is isolated from the cells by suitable purification steps. It is then translated into c-DNA using the reverse transcriptase. This is usually amplified using linear PCR. The c-DNA thus obtained is z. B. qualitatively or quantitatively analyzed using suitable DNA chips.
In diesem Zusammenhang befasst sich die vorliegende Erfindung mit dem Isolieren bzw. Ausschneiden von zu untersuchenden Zellen, mit der sogenannten Dissektion. Werden dabei einzelne Zellen - mit Durchmessern im Bereich einiger Mikrometer - aus Gewebe ausgeschnitten, spricht man auch von Mikrodissektion.In this context, the present invention is concerned with the isolation or cutting out of cells to be examined, with so-called dissection. If individual cells - with diameters in the range of a few micrometers - are cut out of tissue, this is also called microdissection.
Bei der Mikrodissektion kommt es u. a. darauf an, äußerst sauber zu arbeiten, d.h. insbesondere RNAsen-frei zu arbeiten, da diese die m-RNA abbauen. Schon eine Berührung mit der bloßen Hand ist zu vermeiden.Microdissection may a. to work extremely cleanly, i.e. in particular to work without RNAsen, since these break down the m-RNA. Avoid touching it with your bare hand.
Bei bekannten Verfahren zum Schneiden von Gewebe wird der Gewebeschnitt (Präparat) beispielsweise auf einem Objektträger an Luft präpariert. Mit Hilfe eines Lasers wird eine geschlossene Kurve um das kranke Gewebe (Dissektat) beschrieben. Auf der Kurve wird das Gewebe ablatiert, wodurch das zu isolierende kranke Gewebe vom restlichen Gewebe getrennt ist. Das ausgeschnittene Dissektat kann beispielsweise in eine Pipette eingesaugt werden, sofern es in Flüssigkeit vorliegt. Nachteilig an dem bekanntenIn known methods for cutting tissue, the tissue section (preparation) is prepared in air, for example on a slide. A closed curve around the diseased tissue (dissectate) is described with the help of a laser. The tissue is ablated on the curve, separating the diseased tissue to be isolated from the rest of the tissue. The cut dissectate can, for example, be sucked into a pipette if it is in liquid. A disadvantage of the known
Verfahren ist, dass es sehr zeitaufwändig ist. Um die für eine Analyse benötigte Menge an m-RNA zu sammeln ist eine Person mehrere Tage mit dem Schneiden von Gewebe beschäftigt. Ein verbessertes Verfahren ist in der DE 196 16 216 AI beschrieben. Ein auf einem Objektträger präparierter Gewebeschnitt wird auf ein inverses Mikroskop gelegt. Über dem Gewebeschnitt wird ein Deckel eines verschließbarenThe procedure is that it is very time consuming. In order to collect the amount of m-RNA required for an analysis, a person is busy cutting tissue for several days. An improved method is described in DE 196 16 216 AI. A tissue section prepared on a slide is placed on an inverted microscope. A cover of a closable is placed over the tissue section
Röhrchens (Tube) angeordnet. Die Unter- bzw. Innenseite des Deckels ist mit Öl beschichtet. Mittels Laserablation werden Teile des Gewebes ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Teile des Gewebes werden mittels eines Lichtpulses von unten nach oben katapultiert. Dabei treffen sie auf den mit Öl beschichteten Deckel und haften am Öl. Nachteilig an diesem Verfahren ist die schlecht kontrollierbare Bewegung des gelösten Gewebestücks. Dieses erreicht nicht immer den Deckel .Tube arranged. The underside and inside of the cover is coated with oil. Parts of the tissue are cut out by laser ablation. The cut out parts of the tissue are catapulted from bottom to top by means of a light pulse. They hit the oil-coated cover and adhere to the oil. A disadvantage of this method is the poorly controllable movement of the loosened piece of tissue. This does not always reach the lid.
Die DE 198 04 800 C2 beschreibt ein Verfahren, bei dem Dissektate aus einem Präparat ausgeschnitten werden. Nach dem Ausschneiden werden die Dissektate von einem Greifer angesaugt. Der Greifer hat einen Hohlkanal mit einer kleinen runden Öffnung, vor der die Dissektate nach dem Ansaugen haften. Mit Hilfe des Greifers können die Dissektate in ein Auffanggefäß transportiert werden. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass die Dissektate während des Ablatierens nicht fixiert sind und sich daher häufig aufrollen. Ein vollständiges Ablatieren ist dann nicht möglich, ebenso wenig wie ein Ansaugen mit dem Greifer.DE 198 04 800 C2 describes a method in which dissectates are cut out of a preparation. After cutting out, the dissected specimens are sucked in by a gripper. The gripper has a hollow channel with a small round opening, in front of which the dissectates adhere after suction. With the help of the gripper, the dissected specimens can be transported into a collecting vessel. A disadvantage of this method is that the dissectates are not fixed during ablation and therefore often roll up. Complete ablating is then not possible, nor is suctioning with the gripper.
Ein weiteres Verfahren ist in der DE 100 03 588 C2 beschrieben. Dabei wird eine Folie mit einem Gewebeschnitt mit dem Gewebeschnitt nach unten auf einen Mikroskop-Another method is described in DE 100 03 588 C2. A film with a tissue section is placed with the tissue section down on a microscope.
Objektträger gelegt. Anschließend wird der Mikroskop- Objektträger in die Objektebene eines inversen Mikroskops gelegt. Ein Klebeband wird mit einem Haftmittel nach unten über der Folie und damit über dem Gewebeschnitt angeordnet. Anschließend wird zu isolierendes Gewebe durch einen fokussierten Laserstrahl ausgeschnitten. Dabei wird auch die Folie durchtrennt. Danach wird das Klebeband aus dem Mikroskop entfernt. Die Dissektate haften am Klebeband. Der Rest der Folie und des Gewebeschnitts bleibt am Mikroskop- Objektträger haften. Ein Ablösen des Dissektats vom Klebeband ist anschließend nicht mehr möglich, so dass dem nachfolgenden biochemischen Prozess das Klebeband mit zugeführt werden muss . Damit verbunden ist ein hoher Bedarf an teuren Verbrauchsmaterialien.Slide placed. The microscope slide is then placed in the object plane of an inverted microscope. An adhesive tape comes down with an adhesive arranged over the film and thus over the tissue section. The tissue to be isolated is then cut out by a focused laser beam. The film is also cut. The adhesive tape is then removed from the microscope. The dissectates stick to the adhesive tape. The rest of the slide and tissue section will stick to the microscope slide. It is then no longer possible to detach the dissectate from the adhesive tape, so that the adhesive tape must also be added to the subsequent biochemical process. This is associated with a high demand for expensive consumables.
In der WO 03/008934 AI werden Objektträger und Verfahren zur Herstellung des Objektträgers beschrieben, die zum Dissezieren eines Präparates, beispielsweise einer biologischen Probe, verwendet werden können. Hierbei sind im Dissezierabschnitt , d.h. dem Bereich eines Trägersubstrates, welcher beim Dissezieren eines Präparates zusammen mit einem Präparatabschnitt von dem Trägersubstrat getrennt werden kann, sogenannte Mobilisierungsmittel zum Ausbilden einer elektro-magnetischen Kraftwechselwirkung als Reaktion auf eine Anwendung einer elektro-magnetischen Kraft vorgesehen, sodass der Dissezierabschnitt als Folge der Kraftwechselwirkung gezielt verlagert, d.h. transportiert, werden kann. Nachteilig an diesem Verfahren ist, wie schon in dem zuvor beschriebenen Verfahren, dass die Dissektate während des Ablatierens nicht fixiert werden, sodass ein vollständiges Ablatieren erschwert wird bzw. nicht mehr möglich ist.WO 03/008934 AI describes slides and methods for producing the slide, which can be used for dissecting a preparation, for example a biological sample. Here, in the dissection section, i.e. the area of a carrier substrate, which can be separated from the carrier substrate together with a preparation section when dissecting a preparation, so-called mobilization means are provided for forming an electromagnetic force interaction in response to an application of an electromagnetic force, so that the dissecting section is targeted as a result of the force interaction shifted, ie can be transported. A disadvantage of this method, as in the previously described method, is that the dissectates are not fixed during ablation, so that complete ablation is difficult or is no longer possible.
Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Verfahren ist die unzureichende Automatisierbarkeit , da die Dissektate nicht kontrolliert aufgenommen, transportiert und wieder abgegeben werden können. Dies spielt insbesondere dann eine Rolle, wenn mehrere verschiedene Dissektat-Typen in verschiedene Auffanggefäße transportiert werden müssen.Another disadvantage of the previously known methods is the insufficient automatability, since the dissected specimens are not picked up, transported and released in a controlled manner can be. This is particularly important when several different types of dissectate have to be transported to different receptacles.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mikrodissektionsverfahren anzugeben, das sich zur Automatisierung eignet.The object of the invention is to provide a microdissection method which is suitable for automation.
Ein geeignetes Mikrodissektionsverfahren muss das Präparat beim Schneiden fixieren, damit sich letzteres nicht durch die Einwirkung z. B. des Lasers bewegt. Nach dem Schneiden muss das Dissektat sicher aus dem restlichen Gewebe isoliert werden. Ein zuverlässiger Transport des Dissektats mittels eines Greifers in verschiedene Auffanggefäße und das sichere Loslösen vom Greifer zum Absetzten des Dissektats in den verschiedenen Auffanggefäßen muss gewährleistet sein. Ein hoher Automatisierungsgrad sollte mit vergleichbar geringem Aufwand erreichbar sein.A suitable microdissection method must fix the specimen during cutting so that the latter is not affected by the action of e.g. B. the laser moves. After cutting, the dissectate must be safely isolated from the rest of the tissue. A reliable transport of the dissectate by means of a gripper into different collecting vessels and the safe detachment from the gripper for depositing the dissectate in the different collecting vessels must be guaranteed. A high degree of automation should be achievable with comparatively little effort.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet .This object is achieved by the inventions with the features of the independent claims. Advantageous developments of the inventions are characterized in the subclaims.
Bei der Mikrodissektion wird typischerweise mit Hilfe eines Lasers eine geschlossene Kurve um das kranke Gewebe beschrieben. Auf der Kurve wird das Gewebe ablatiert. Bevor die Kurve ganz geschlossen ist, kommt es häufig dazu, dass sich das Dissektat aufrollt oder aufstellt und in manchen Fällen den letzten noch zu schneidenden Kurvenabschnitt verschattet, weshalb es nicht mehr möglich ist, den Schnitt zu vollenden und das Dissektat tatsächlich zu isolieren. Wichtig ist also zunächst ein Verfahren, das eine gute Fixierung des gesamten Gewebes während des Schneidens gewährleistet .In microdissection, a closed curve around the diseased tissue is typically described using a laser. The tissue is ablated on the curve. Before the curve is completely closed, it often happens that the dissectate rolls up or stands up and in some cases shadows the last section of the curve to be cut, which is why it is no longer possible to complete the cut and actually isolate the dissectate. First of all, it is important to use a method that ensures that the entire tissue is well fixed during cutting.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst dasAccording to the method according to the invention, the
Präparat auf einen dielektrischen Objektträger aufgebracht.Specimen applied to a dielectric slide.
Häufig wird dazu zunächst die Schicht biologischen Materials auf einer Seite einer Stabilisierungsschicht aufgebracht. Die Stabilisierungsschicht kann entfallen, sofern die mechanischen Eigenschaften der Schicht biologischen Materials dies zulassen. Die Schicht biologischen Materials eventuell zusammen mit der Stabilisierungsschicht wird im Folgenden als Präparat bezeichnet.Often, the layer of biological material is first applied to one side of a stabilization layer. The stabilization layer can be omitted if the mechanical properties of the layer of biological material permit this. The layer of biological material, possibly together with the stabilizing layer, is referred to below as a preparation.
Die Schicht biologischen Materials kann z. B. ein Gewebeschnitt, ein Zellenausstrich, ausgesäte Zellen oder eine Zellkultur sein.The layer of biological material can e.g. B. a tissue section, a cell smear, seeded cells or a cell culture.
Als Objektträger kommen insbesondere Objektträger aus Glas für die Mikroskopie in Betracht. Es können aber auch sonstige feste Unterlagen verwendet werden, sofern sie dielektrisch sind. Sie müssen auch nicht zwingend transparent sein.Glass slides are particularly suitable for microscopy. However, other fixed documents can also be used, provided they are dielectric. You also don't have to be transparent.
Danach wird ein elektrisches Feld ausreichender Stärke (beispielsweise zwischen ca. 100 kV/m und 10 MV/m, vorzugsweise 1 MV/m) zwischen der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats angelegt. Dabei kommt es zu einer dielektrischen Polarisation sowohl des Objektträgers als auch des Präparats . Werden die auf der dem Objektträger abgewandten Seite des Präparates sich sammelnden Ladungsträger durch eine geeignete erste Elektrode (z. B. ein gegenüber dem Präparat nicht isolierter Draht mit Nullpotential / Erdung) entfernt, verbleibt im Präparat eine Restladung. Diese bewirkt eine verstärkte flächige Anziehung zwischen dem dielektrisch polarisierten Objektträger und dem elektrisch geladenen Präparat, die deutlich über die natürlich vorhandene Adhäsion hinausgeht . Damit ist das Präparat für die auszuführende Dissektion sicher fixiert.An electric field of sufficient strength (for example between approximately 100 kV / m and 10 MV / m, preferably 1 MV / m) is then applied between the side of the slide facing away from the specimen and the side of the specimen facing away from the specimen slide. This results in dielectric polarization of both the slide and the specimen. If the charge carriers collecting on the side of the specimen facing away from the specimen slide are removed by a suitable first electrode (e.g. a wire with zero potential / grounding that is not insulated from the specimen), a residual charge remains in the specimen. This causes an increased areal attraction between the dielectrically polarized slide and the electrically charged preparation, which goes far beyond the naturally existing adhesion. The specimen for the dissection to be carried out is thus securely fixed.
Das geschilderte Verfahren zum elektrostatischen Fixieren einer Schicht biologischen Materials (Präparat) auf einem Objektträger kann in Teilen auch zum Abheben eines Dissektats aus einem Präparat bzw. von einem Objektträger eingesetzt werden, da mit dem elektrostatischen Fixieren stets ein elektrostatisches Aufladen einhergeht, das für das Abheben ausgenutzt werden kann.The described method for electrostatically fixing a layer of biological material (preparation) on a specimen slide can also be used in parts to lift a dissectate from a specimen or from a specimen slide, since electrostatic fixation is always accompanied by an electrostatic charge that is required for the removal can be exploited.
Dazu kann z. B. nach dem elektrostatischen Fixieren der zu isolierende Teil (Dissektat) des Präparats aus dem Präparat z. B. mittels Laser-Mikrodissektion ausgeschnitten werden.For this, e.g. B. after electrostatic fixation of the part to be isolated (dissectate) of the preparation from the preparation z. B. cut out by means of laser microdissection.
Bei der Laser-Mikrodissektion beschreibt der Fokus eines Laserstrahls eine geschlossene oder annähernd geschlossene Kurve um das Dissektat. Auf dieser Kurve wird das Präparat ablatiert, d. h. im Wesentlichen verdampft. Dadurch ist das Dissektat vom Rest des Präparats getrennt.In laser microdissection, the focus of a laser beam describes a closed or approximately closed curve around the dissectate. The preparation is ablated on this curve, i. H. essentially evaporated. This separates the dissectate from the rest of the specimen.
Es genügt, wenn das Präparat nicht auf einer vollständig geschlossenen Kurve sondern nur auf einer annähernd geschlossenen Kurve abgetragen wird, sofern der verbleibende Abschnitt so klein ist, dass er beim anschließenden Entfernen des Dissektats aus dem Präparat durchgerissen wird und das Entfernen nicht hindert.It is sufficient if the preparation is not removed on a completely closed curve but only on an approximately closed curve, provided the remaining section is so small that it can be removed when it is subsequently removed the dissectate is torn out of the specimen and does not prevent removal.
Für das folgende Abheben des Dissektats vom Objektträger ist es unerheblich, ob zunächst elektrostatisch fixiert und aufgeladen wird und dann ausgeschnitten wird, oder umgekehrt Da das elektrostatische Fixieren jedoch das Ausschneiden fördert, wird in der Regel zunächst elektrostatisch fixiert und aufgeladen und dann ausgeschnitten.For the subsequent lifting of the dissectate from the specimen slide, it is irrelevant whether it is first fixed and charged electrostatically and then cut out, or vice versa, since electrostatic fixing promotes cutting out, as a rule it is first fixed and charged electrostatically and then cut out.
Das Dissektat verbleibt zunächst zusammen mit dem Präparat an seiner ursprünglichen Stelle auf dem Objektträger, zumal es elektrostatisch am Objektträger haftet. Es ist aber vom restlichen Präparat - zumindest im Wesentlichen - mechanisch getrennt.The dissectate initially remains together with the preparation in its original position on the slide, especially since it adheres electrostatically to the slide. However, it is - at least essentially - mechanically separated from the rest of the preparation.
Nun wird eine zweite Elektrode von der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats an das Dissektat herangeführt. Daraufhin wird die Richtung des angelegten elektrischen Feldes umgekehrt und ggf. seine Stärke derart verändert, dass sich das Dissektat vom Objektträger löst und sich entlang der Feldlinien zu der zweiten Elektrode bewegen.Now a second electrode is brought up to the dissectate from the side of the specimen facing away from the slide. The direction of the applied electric field is then reversed and, if necessary, its strength is changed in such a way that the dissectate detaches from the slide and moves along the field lines to the second electrode.
Um eine sofortige Umladung des Dissektats durch die zweite Elektrode zu verhindern - woraufhin das Dissektat nicht mehr an der zweiten Elektrode haften würde -, müssen die zweite Elektrode und das Dissektat durch eine elektrisch isolierende Schicht voneinander getrennt werden. Dazu wird vorzugsweise die Elektrode mit einem elektrisch isolierenden Kunststoff überzogen. Es wird also eine von außen angelegte elektrische Hochspannung für das Fixieren des Präparates und zum Isolieren des Dissektats benutzt.In order to prevent immediate transfer of the dissectate by the second electrode - whereupon the dissectate would no longer adhere to the second electrode - the second electrode and the dissectate must be separated from one another by an electrically insulating layer. For this purpose, the electrode is preferably covered with an electrically insulating plastic. An electrical high voltage applied from the outside is therefore used to fix the specimen and to isolate the dissectate.
Es können mehrere Dissektate an einer zweiten Elektrode gesamme11 werden .Several dissectates can be collected on a second electrode.
Haftet das Dissektat an der zweiten Elektrode, so kann es zu einem das Dissektat aufnehmenden Gefäß transportiert werden. Dort kann es dadurch von der zweiten Elektrode getrennt werden, dass die elektrostatische Haftung des Dissektats an der zweiten Elektrode aufgehoben wird. Dies kann z. B. erreicht werden, indem die zweite Elektrode mit einer elektrischen Ladung gleichen Vorzeichens aufgeladen wird, wie die elektrische Ladung des Dissektats.If the dissectate adheres to the second electrode, it can be transported to a vessel holding the dissectate. There it can be separated from the second electrode by removing the electrostatic adhesion of the dissectate to the second electrode. This can e.g. B. can be achieved by charging the second electrode with an electric charge of the same sign as the electric charge of the dissectate.
Das Dissektat kann auf diese Weise gezielt ausgeschnitten, isoliert, transportiert und abgesetzt werden. Es wird dadurch die Möglichkeit einer weitgehenden Automatisierung geschaffen.In this way, the dissectate can be specifically cut out, isolated, transported and set down. This creates the possibility of extensive automation.
Die zweite Elektrode kann auch so ausgebildet sein, dass sie insgesamt oder einzelne Teile von ihr zusammen mit den gesammelten Dissektaten der weiteren biochemischen Prozessierung zugeführt werden kann.The second electrode can also be designed such that it, as a whole or individual parts, can be fed together with the collected dissectates for further biochemical processing.
Eine weitere Möglichkeit, das Dissektat vom Objektträger abzuheben und damit vom Rest des Präparats zu trennen, besteht darin, dass ein Greifer an den zu isolierenden Teil der Schicht biologischen Materials (Präparat) herangeführt wird. Der Greifer wird dazu entweder in Kontakt mit dem Präparat oder in dessen unmittelbare Nähe gebracht. Der Greifer hat vorzugsweise einen durchgängigen Hohlkanal mit einer präparatseitigen Öffnung, die kleiner ist als der zu isolierende Teil des Präparats. Z. B. kann der Greifer eine dünne Pipette sein.Another possibility of lifting the dissectate from the slide and thus separating it from the rest of the specimen is to bring a gripper to the part of the layer of biological material (specimen) to be isolated. For this purpose, the gripper is either brought into contact with the preparation or in its immediate vicinity. The gripper preferably has a continuous hollow channel with an opening on the preparation side that is smaller than the part of the preparation to be isolated. For example, the gripper can be a thin pipette.
Die Öffnung kann rund oder schlitzförmig ausgebildet sein. Entscheidend ist, dass zumindest eine Dimension der Öffnung kleiner als das Dissektat ist. Somit wird das Eintreten des Dissektats in die Öffnung verhindert.The opening can be round or slit-shaped. It is crucial that at least one dimension of the opening is smaller than the dissectate. This prevents the dissectate from entering the opening.
Unmittelbar um die praparatseitige Öffnung des Greifers herum ist eine vorzugsweise weitgehend ebene Kontaktfläche ausgebildet, mit der der Greifer das Präparat berühren kann. Die Kontaktfläche des Greifers kann auch aus einem porösen Material mit unregelmäßigen Öffnungen bestehen.Immediately around the opening of the gripper on the preparation side, a preferably largely flat contact surface is formed, with which the gripper can touch the preparation. The contact surface of the gripper can also consist of a porous material with irregular openings.
Der zu isolierende Teil des Präparats wird durch eine Druckdifferenz an den Greifer angesaugt. In der Regel erfolgt dies durch eine Druckerniedrigung im Hohlkanal bzw..- in der Öffnungen des Greifers und einer damit einhergehendenThe part of the preparation to be isolated is sucked onto the gripper by a pressure difference. As a rule, this is done by reducing the pressure in the hollow channel or ..- in the openings of the gripper and an associated
Druckerniedrigung auf einer Seite des Präparats. Der zu isolierende Teil wird dann durch den relativen Überdruck des Umgebungsmediums an die Kontaktfläche des Greifers gepresst . Bei Aufrechterhaltung der Druckdifferenz bleibt die Anpresskraft dauerhaft erhalten. Damit ist das Präparat am Greifer fixiert. Das Fixieren lässt sich z. B. ohne Schwierigkeiten an Luft oder in Flüssigkeit durchführen.Decrease in pressure on one side of the preparation. The part to be isolated is then pressed against the contact surface of the gripper by the relative overpressure of the surrounding medium. If the pressure difference is maintained, the contact pressure is permanently maintained. The specimen is now fixed to the gripper. Fixing can be done e.g. B. perform without difficulty in air or in liquid.
Das Fixieren erfolgt vorzugsweise, bevor der zu isolierende Teil der Schicht biologischen Materials aus dem Präparat ausgeschnitten wurde. Dadurch wird der zu isolierende Teil während des Schnitts vom Greifer fixiert. Anschließend wird das Dissektat aus dem Präparat ausgeschnitten. Dies erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Laser-Mikrodissektion.The fixation is preferably carried out before the part of the layer of biological material to be isolated has been cut out of the preparation. As a result, the part to be insulated is fixed by the gripper during the cut. The dissectate is then cut out of the specimen. This is preferably done with the help of laser microdissection.
Vorteilhafterweise ist der Greifer transparent, um störende Reflexionen und Streuung zu vermeiden. Außerdem bietet es sich an, den Greifer aus einem transparenten Material zu fertigen, damit die Beleuchtung des Präparates nicht beeinträchtigt wird.The gripper is advantageously transparent in order to avoid disturbing reflections and scattering. It also makes sense to manufacture the gripper from a transparent material so that the illumination of the preparation is not impaired.
Es kann auch zunächst das Dissektat ausgeschnitten werden und erst danach der Greifer das Dissektat aufnehmen. Dazu wird das Präparat vorher elektrostatisch am Objektträger fixiert.The dissectate can also be cut out first and only then can the gripper pick up the dissectate. For this purpose, the specimen is fixed electrostatically on the slide beforehand.
Da die praparatseitige Öffnung des Greifers kleiner ist als das Dissektat, bleibt letzteres vor der Öffnung des Greifers haften.Since the opening of the gripper on the preparation side is smaller than the dissectate, the latter remains stuck before the opening of the gripper.
Nach erfolgter Dissektion bleibt das Dissektat am Greifer haften, auch wenn der Greifer vom Präparat entfernt wird.After dissection, the dissectate remains attached to the gripper, even if the gripper is removed from the specimen.
Dafür muss mindestens eine Öffnung des Greifers von dem Dissektat zumindest teilweise bedeckt sein. Das kann durch die Positionierung des Greifers vor der Dissektion erreicht werden. Dadurch wird das Dissektat von der übrigen Schicht isoliert.For this, at least one opening of the gripper must be at least partially covered by the dissectate. This can be achieved by positioning the gripper before the dissection. This isolates the dissectate from the rest of the layer.
Mit Hilfe des Greifers wird somit das Dissektat angesaugt, aber nicht eingesaugt. Dies erlaubt es, dass Dissektat zu transportieren und in einem Auffanggefäß wieder abzulegen. Dazu genügt es, die Druckdifferenz derart zu verändern, dass das Dissektat vom Greifer nicht mehr gehalten wird und von diesem abfällt. Dazu kann die Druckdifferenz z. B. abgeschwächt oder umgekehrt werden. Mit Auffanggefäß wird ein Ort bezeichnet, an dem das Dissektat für eine weitere Prozessierung aufbewahrt oder einer weiteren Prozessierung zugeführt wird.With the help of the gripper, the dissectate is sucked in but not sucked in. This allows the dissectate to be transported and put down again in a collecting vessel. To do this, it is sufficient to change the pressure difference in such a way that the dissectate is no longer held by the gripper and falls off the gripper. For this purpose, the pressure difference z. B. weakened or vice versa. A collecting vessel is a place where the dissectate is kept for further processing or is fed to further processing.
Das beschriebene Verfahren ist relativ einfach durchzuführen. Es fixiert das Präparat während des Schneidens und es erlaubt einen zuverlässigen Transport des Dissektats in ein Auffanggefäß, wo es gezielt platziert bzw. abgelegt werden kann. Damit eignet sich das beschriebene Verfahren in besonderer Weise zur Automatisierung.The described method is relatively easy to carry out. It fixes the specimen during cutting and allows the dissectate to be reliably transported to a collecting vessel, where it can be placed or deposited in a targeted manner. The method described is therefore particularly suitable for automation.
Zum Fixieren einer Mehrzahl von Dissektaten auf einem Greifer an unterschiedlichen Positionen kann der Greifer eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen aufweisen, die kleiner sind als die Dissektate und das Fixieren von einer entsprechenden Mehrzahl von Dissektaten vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen ermöglichen. Dazu wird der Greifer nach Aufnahme des ersten Dissektats erneut auf dem Präparat aufgesetzt und/oder mit seiner Mehrzahl an präparatseitigen Öffnungen gleichzeitig auf das Präparat aufgesetzt, sodass die Mehrzahl von Dissektaten an unterschiedlichen Positionen aufgegriffen und fixiert werden können. Damit lassen sich mehrere Dissektate einfach auf einem Greifer sammeln. Ein Vorteil dieser Vorgehensweise besteht darin, dass der Greifer ohne kompliziertes Erfassen und Zielen der Probe diese immer aufgreift bzw. das komplette Dissektat aufnimmt, was eine erhebliche Erleichterung zu den bisher bekannten Verfahren darstellt. So können mehrere Proben aufgenommen bzw. weitere Proben dazugenommen werden. Es können auch mehrere Greifer in einer gemeinsamen Halterung angebracht sein und nacheinander unterschiedliche Phasen des Verfahrens durchlaufen.In order to fix a plurality of dissectates on a gripper at different positions, the gripper can have a plurality of preparation-side openings that are smaller than the dissectates and enable a corresponding plurality of dissectates to be fixed in front of the respective preparation-side openings. For this purpose, after the first dissectate has been picked up, the gripper is placed again on the preparation and / or at the same time is placed on the preparation with its plurality of openings on the preparation side, so that the plurality of dissectates can be picked up and fixed at different positions. This makes it easy to collect multiple dissectates on one gripper. An advantage of this procedure is that the gripper always picks up the sample or picks up the complete dissectate without complicated grasping and aiming, which is a considerable relief from the previously known methods. In this way, several samples can be taken or additional samples taken. A plurality of grippers can also be attached in a common holder and successively go through different phases of the method.
Die unterschiedlichen Öffnungen eines solchen Greifers lassen sich entweder einzeln oder gemeinsam mit einer Druckdifferenz beaufschlagen. Um sie einzeln zu beaufschlagen ist ein Kanalsystem innerhalb des Greifers denkbar, bei dem jede Öffnung an einen eigenen Hohlkanal angeschlossen ist.The different openings of such a gripper can be acted upon either individually or together with a pressure difference. A channel system within the gripper, in which each opening is connected to its own hollow channel, is conceivable for loading it individually.
Weiterhin kann der Greifer beim Schneiden mitfahren, beispielsweise wenn die Schnittbewegung durch den Tisch, auf dem z.B. der Greifer angebracht ist, ausgeführt wird. Alternativ dazu kann der Greifer auch der Schnittbewegung z.B. eines beweglichen Laserfokus nachfolgen.Furthermore, the gripper can travel with the cutting, for example when the cutting movement through the table on which e.g. the gripper is attached, is executed. Alternatively, the gripper can also be used for the cutting movement e.g. follow a moving laser focus.
Zwischen dem Greifer und dem Präparat kann sich eine ebenfalls mit Öffnungen versehene Schicht befinden. Diese wird im Folgenden als Zwischenschicht bezeichnet. Eine der Öffnungen dieser Zwischenschicht wird vor dem Absenken des Greifers auf das Präparat mit einer Öffnung des Greifers in Deckung gebracht. Die Durchmesser der Öffnungen müssen dabei nicht übereinstimmen. Wichtig ist nur, dass eine der Öffnungen - vorzugsweise die Öffnung in der Zwischenschicht - kleiner ist als das aufzunehmende Dissektat.A layer also provided with openings can be located between the gripper and the preparation. This is referred to below as the intermediate layer. Before the gripper is lowered onto the specimen, one of the openings in this intermediate layer is brought into alignment with an opening of the gripper. The diameters of the openings do not have to match. It is only important that one of the openings - preferably the opening in the intermediate layer - is smaller than the dissectate to be picked up.
Nach erfolgter Dissektion und dem Abheben des Greifers und der Zwischenschicht vom Präparat kann die Zwischenschicht so bewegt werden, dass: a) erneut eine freie Öffnung mit einer Öffnung des Greifers zur Deckung kommt ; b) die mit einem Dissektat belegte Öffnung zu einer dem Greifer äquivalenten Vorrichtung gelangt, an der die Ablösung des Dissektats durch Veränderung der Druckdifferenz erfolgt.After the dissection has taken place and the gripper and the intermediate layer have been lifted off the specimen, the intermediate layer can be moved in such a way that: a) another free opening is covered with an opening of the gripper; b) the opening covered with a dissectate reaches a device equivalent to the gripper, on which the dissectate is detached by changing the pressure difference.
Da der Greifer nur mit der kontaminationsfreien Zwischenschicht in Berührung kommt, besteht keine Kontaminations- oder Verschleppungsgefahr, so dass das Verfahren unbegrenzt wiederholt werden kann.Since the gripper only comes into contact with the contamination-free intermediate layer, there is no risk of contamination or carryover, so that the process can be repeated indefinitely.
Durch die Wahl eines geeigneten Materials der Zwischenschicht kann erreicht werden, dass die Dissektate nach der Isolation an der Zwischenschicht adhäsiv haften und sich auch dann nicht von der Zwischenschicht lösen, wenn der Greifer und/oder die Druckdifferenz nicht mehr unmittelbar anliegen. Dazu kann die Zwischenschicht beispielsweise aus. Polycarbonat bestehen.By selecting a suitable material for the intermediate layer, it can be achieved that the dissectates adhere to the intermediate layer after isolation and do not detach from the intermediate layer even when the gripper and / or the pressure difference are no longer in direct contact. For this purpose, the intermediate layer can be made of, for example. Polycarbonate exist.
Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens liegt in der sicheren Probenaufnahme und in der Möglichkeit der einfachen Automatisierung. Da die Proben einfach in verschiedenenThe advantage of the described method lies in the safe sampling and the possibility of simple automation. Because the samples are simply in different
Auffanggefäßen abgelegt werden können, ist das Verfahren sehr flexibel. Des weiteren können die isolierten Dissektate einfach auf dem Greifer kontrolliert werden, da der Greifer mit dem vorhandenen Mikroskop untersucht werden kann.The receptacle can be stored, the process is very flexible. Furthermore, the isolated dissectates can easily be checked on the gripper, since the gripper can be examined with the existing microscope.
Die geschilderten Verfahren ergänzen sich und lassen sich geeignet kombinieren, um die Automatisierungsmöglichkeiten zu verbessern. So kann beispielsweise zunächst das Präparat auf einen dielektrischen Objektträger aufgebracht werden. Auf dem Objektträger kann es in der beschriebenen Weise elektrostatisch fixiert werden. Anschließend wird der zu isolierende Teil (Dissektat) des Präparats aus dem Präparat ausgeschnitten. Schließlich wird das Dissektat mit Hilfe der oben geschilderten zweiten Elektrode oder mit Hilfe des Greifers vom Rest des Präparats getrennt.The described processes complement each other and can be combined appropriately to improve the automation options. For example, the preparation can first be applied to a dielectric slide. It can be fixed electrostatically on the slide in the manner described. The part to be isolated (dissectate) of the preparation is then cut out of the preparation. Finally, the dissectate is created using the second electrode described above or separated from the rest of the preparation with the aid of the gripper.
Wenn die Dissektate an dem Greifer oder der zweiten Elektrode haften, herausgeschnitten sind und gezielt platziert und/oder abgelegt werden sollen, können sie auch auf einer haftenden Unterlage abgelegt werden, etwa auf einem klebenden Film und/oder einer Silikon-Kautschuk Unterlage. Zum Ablegen auf einer haftenden Unterlage muss unter Umständen weder beim Greifer die Druckdifferenz verändert werden, noch bei der zweiten Elektrode die Spannungsdifferenz umgekehrt werden.If the dissectates adhere to the gripper or the second electrode, are cut out and are to be placed and / or placed in a targeted manner, they can also be placed on an adhesive base, for example on an adhesive film and / or a silicone rubber base. To place it on an adhesive surface, the pressure difference may not have to be changed for the gripper, nor the voltage difference for the second electrode reversed.
Dies verhindert ein unkontrolliertes Umherfliegen des Dissektats. Außerdem wird dadurch der Greifer bzw. die Elektrode gleichzeitig gereinigt. Auch eröffnet eine solche haftende Unterlage die Möglichkeit, die Dissektate in einem regelmäßigen Muster, etwa in Form einer Matrix, abzulegen. Die haftende Unterlage kann flach sein und mit einem aufgesetzten Rahmen ein Reaktionsgefäß bilden, in Maß und Form dadurch z. B. einer Mikrotiterplatte ähnlich.This prevents the dissectate from flying around in an uncontrolled manner. This also cleans the gripper or the electrode at the same time. Such an adhesive base also opens up the possibility of storing the dissectates in a regular pattern, for example in the form of a matrix. The adhesive base can be flat and form a reaction vessel with an attached frame, in size and shape thereby z. B. similar to a microtiter plate.
Eine weitere Möglichkeit der räumlichen Trennung der ausgeschnittenen Dissektate vom restlichen Präparat besteht darin, das restliche Präparat auf geeignete Weise vom Objektträger abzuheben, z. B. mit einer Pinzette. Die elektrostatisch anhaftenden Dissektate verbleiben dann auf dem Objektträger. Diese können mittels des Greifers in ein Auffanggefäß überführt werden.Another possibility for the spatial separation of the cut dissectates from the rest of the preparation is to lift the rest of the preparation from the slide in a suitable manner, e.g. B. with tweezers. The electrostatically adhering dissectates then remain on the slide. These can be transferred to a collecting vessel using the gripper.
Die Aufgabe wird auch durch Vorrichtungen gelöst, die geeignet sind, die Erfindung auszuführen. Diese Vorrichtungen sind in den Vorrichtungsansprüchen beschrieben. Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt:The object is also achieved by devices which are suitable for carrying out the invention. These devices are described in the device claims. The invention is explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments which are illustrated schematically in the figures. However, the invention is not limited to the examples. The same reference numerals in the individual figures denote the same or functionally identical or corresponding in terms of their functions elements. In detail shows:
Fig. 1A eine schematische Darstellung des Polarisationsschrittes des elektrostatischen Fixierens eines Präparats auf einem Objektträger; Fig. 1B eine schematische Darstellung des Aufladungsschrittes des elektrostatischen Fixierens eines Präparats auf einem Objektträger;1A shows a schematic illustration of the polarization step of the electrostatic fixing of a preparation on a slide; 1B shows a schematic illustration of the charging step of the electrostatic fixing of a preparation on a slide;
Fig. 2 eine schematische Darstellung des elektrostatischen Abhebens eines Dissektats; Fig. 3A eine schematische Darstellung der Annäherung eines pneumatischen Greifers an ein Präparat; Fig. 3B das Ansaugen des Präparats bzw. Dissektats an den Greifer; Fig. 3C das Abheben des Dissektats mit Hilfe des Greifers; Fig. 3D das Absetzen des Dissektats in einem Auffanggefäß; und Fig. 4 eine schematische Darstellung des Einsatzes einer Zwischenschicht zwischen Greifer und Präparat.2 shows a schematic illustration of the electrostatic lifting of a dissectate; 3A shows a schematic illustration of the approach of a pneumatic gripper to a preparation; 3B the suction of the preparation or dissectate onto the gripper; 3C the lifting off of the dissectate with the aid of the gripper; 3D the depositing of the dissectate in a collecting vessel; and FIG. 4 shows a schematic illustration of the use of an intermediate layer between the gripper and the preparation.
Im Folgenden wird auf Fig. 1A Bezug genommen.In the following, reference is made to FIG. 1A.
In Paraffin eingebettetes oder gefrorenes Gewebe wird durch einen Hobel in dünne Gewebeschnitte 10 zerlegt. Diese rollen sich in der Regel auf . Ein dielektrischer Mikroskop-Objektträger 12 wird mit Alkohol besprüht . Ein wenige Quadratzentimeter großes Stück einer Folie 14, welches auf einer Papierschicht aufgetragen ist, wird auf die mit Alkohol besprühte Fläche des Mikroskop- Objektträgers 12 aufgebracht. Die Folie 14 besteht z. B. aus 2 μm dickem, UV absorbierendem PET oder PEN. Sie dient als Stabilisierungsschicht. Das Papier wird anschließend entfernt .Tissue embedded or frozen in paraffin is broken up into thin tissue sections 10 by a planer. These usually roll up. A dielectric microscope slide 12 is sprayed with alcohol. A piece of film 14 a few square centimeters in size, which is applied to a paper layer, is applied to the surface of the microscope slide 12 sprayed with alcohol. The film 14 is, for. B. from 2 micron thick, UV absorbing PET or PEN. It serves as a stabilization layer. The paper is then removed.
Anschließend wird der aufgerollte Gewebeschnitt 10 auf die Folie 14 gebracht. Der Mikroskop-Objektträger 12 mit Folie 14 und Gewebeschnitt 10 wird auf 60° erhitzt, wodurch das Paraffin schmilzt und sich der Gewebeschnitt 10 ausrollt.The rolled-up tissue section 10 is then brought onto the film 14. The microscope slide 12 with film 14 and tissue section 10 is heated to 60 °, as a result of which the paraffin melts and the tissue section 10 rolls out.
Danach kann der Aufbau aus Folie 14 und Gewebeschnitt 10 - der gemeinsam als Präparat bezeichnet wird - umgedreht werden, wodurch der Gewebeschnitt 10 auf dem Objektträger 12 zu liegen kommt. Der Gewebeschnitt 10 liegt dann zwischen Objektträger und Stabilisierungsschicht bzw. Folie 14.The structure of film 14 and tissue section 10 - which is referred to collectively as a preparation - can then be turned over, as a result of which the tissue section 10 comes to lie on the slide 12. The tissue section 10 then lies between the slide and the stabilization layer or film 14.
Das Präparat wird zusammen mit dem dielektrischen Objektträger 12 in die Objektebene eines inversen Mikroskops so eingelegt, dass der Objektträger unten liegt und die Schicht biologischen Materials von oben zugänglich ist.The specimen is placed together with the dielectric slide 12 in the object plane of an inverted microscope in such a way that the slide is at the bottom and the layer of biological material is accessible from above.
Das Mikroskop besitzt einen motorischen x-y-Tisch, der das Präparat verfahren kann. Ebenfalls am Tisch angebracht sind Auffanggefäße, in die die zu isolierenden Teile nach der Dissektion verbracht werden sollen.The microscope has a motorized x-y table that can move the specimen. Collection vessels are also attached to the table, into which the parts to be insulated are to be placed after the dissection.
Danach wird ein elektrisches Feld 18 (siehe Fig. 1A) ausreichender Stärke (vorzugsweise 1 MV/m) zwischen der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers 12 und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparates, also der Folie 14, angelegt. Dazu werden zwei Elektroden, eine praparatseitige Elektrode 15 und eine objektträgerseitige Elektrode 16 eingesetzt. Letztere weißt eine Aussparung 17 auf, um das Objektiv des inversen Mikroskops nicht zu behindern.Then an electric field 18 (see FIG. 1A) of sufficient strength (preferably 1 MV / m) between that of the The side of the slide 12 facing away from the specimen and the side of the specimen, ie the film 14, facing away from the slide. For this purpose, two electrodes, an electrode 15 on the specimen side and an electrode 16 on the slide side, are used. The latter has a cutout 17 so as not to hinder the objective of the inverse microscope.
Durch Anlegen des elektrischen Feldes 18 kommt es zu einer dielektrischen Polarisation sowohl des Objektträgers 12 als auch des Präparates .Applying the electric field 18 results in a dielectric polarization of both the slide 12 and the specimen.
Bei dem in Fig. 1A gezeigten Beispiel sammeln sich an der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers 12 negative Ladungen. An der dem Präparat zugewandten Seite desIn the example shown in FIG. 1A, 12 negative charges collect on the side of the specimen slide facing away from the specimen. On the side of the preparation facing the preparation
Objektträgers 12 sammeln sich positive Ladungen. Entsprechend sammeln sich an der auf dem Objektträger 12 liegenden Seite des Gewebeschnitts 10 negative Ladungen und an der vom Objektträger abgewandten Seite der Folie 14 wiederum positive Ladungen .Slide 12 collects positive charges. Correspondingly, negative charges accumulate on the side of the tissue section 10 lying on the slide 12 and positive charges in turn accumulate on the side of the film 14 facing away from the slide.
Werden die auf der dem Objektträger 12 abgewandten Seite des Präparates sich sammelnden Ladungsträger durch eine geeignete Elektrode 20 (z. B. durch einen gegenüber dem Präparat nicht isolierter Draht mit Nullpotential / Erdung) entfernt, verbleibt im Präparat eine Restladung (Fig. 1B) . Bei dem in Fig. 1 gezeigten Beispiel werden die positiven Ladungen an der vom Objektträger 12 abgewandten Seite der Folie 14 abgezogen. Das Präparat bleibt negativ geladen zurück.If the charge carriers collecting on the side of the specimen facing away from the specimen slide 12 are removed by a suitable electrode 20 (for example by a wire with zero potential / grounding that is not insulated from the specimen), a residual charge remains in the specimen (FIG. 1B). In the example shown in FIG. 1, the positive charges are drawn off on the side of the film 14 facing away from the slide 12. The preparation remains negatively charged.
Dies bewirkt eine verstärkte flächige Anziehung zwischen dem dielektrisch polarisierten Objektträger mit seinen positiven Ladungen auf der Seite des Präparats und dem elektrisch negativ geladenen Präparat. Diese elektrostatische Anziehungskraft geht deutlich über die natürlich vorhandene Adhäsion hinaus. Damit ist das Präparat sicher fixiert.This causes an increased areal attraction between the dielectric polarized slide with its positive charges on the side of the preparation and the electrical negatively charged preparation. This electrostatic attraction goes far beyond the naturally existing adhesion. The specimen is now securely fixed.
Anschließend wird das Präparat mittels Laser-Mikrodissektion geschnitten. Erfolgt die Mikrodissektion auf einer geschlossenen Kontur, verbleibt das Dissektat 22 zusammen mit dem Präparat an ursprünglicher Stelle auf dem Objektträger 12. Es ist jetzt vom restlichen Präparat mechanisch getrennt.The preparation is then cut using laser microdissection. If the microdissection takes place on a closed contour, the dissectate 22 remains together with the preparation in the original position on the slide 12. It is now mechanically separated from the rest of the preparation.
Im Folgenden wird auf Fig. 2 Bezug genommen. Nach der Mikrodissektion wird eine zweite Elektrode 24 von der vom Objektträger 12 abgewandten Seite des Präparats an das Dissektat 22 herangeführt. Wird jetzt die Richtung des angelegten elektrischen Feldes umgekehrt und ggf. seineIn the following, reference is made to FIG. 2. After microdissection, a second electrode 24 is brought up to the dissectate 22 from the side of the specimen facing away from the slide 12. Now the direction of the applied electric field is reversed and, if necessary, its
Stärke verändert, wird sich das Dissektat 22 vom Objektträger 12 lösen und sich entlang der Feldlinien zu der zweiten Elektrode 24 bewegen. Um eine sofortige Umladung des Dissektats 22 zu verhindern, ist diese Elektrode elektrisch gegenüber dem Dissektat 22 zu isolieren. Dies erfolgt vorzugsweise durch einen Kunststoff-Überzug 26.If the thickness changes, the dissectate 22 will detach itself from the slide 12 and move along the field lines to the second electrode 24. In order to prevent immediate transfer of the dissectate 22, this electrode must be electrically insulated from the dissectate 22. This is preferably done by a plastic coating 26.
Im Folgenden wird auf Fig. 3 Bezug genommen.In the following, reference is made to FIG. 3.
Ein transparenter Greifer 28 ist über dem Präparat angebracht (Fig. 3A) . Er kann auf das Präparat abgesenkt werden und im abgesenkten Zustand mit dem Präparat auf dem Mikroskoptisch mitbewegt werden, wenn sich der Mikroskoptisch für die Ablation bzw. Mikrodissektion relativ zum Laserfokus bewegt.A transparent gripper 28 is attached over the specimen (Fig. 3A). It can be lowered onto the specimen and moved in the lowered state with the specimen on the microscope stage if the microscope stage for the ablation or microdissection moves relative to the laser focus.
Der Greifer 28 besitzt an seinem unteren Ende eine weitgehend ebene Kontaktfläche 30, die mehrere kleine Öffnungen 32 aufweist. Zweckmäßigerweise ist die Kontaktfläche 30 so groß, dass mehrere Dissektate darauf Platz finden können. Vorzugsweise hat die Kontaktfläche 30 einen Durchmesser von 500 μm. Die Öffnungen 32 haben einen Durchmesser von ca. 8 μm und sind in Form einer 10 x 10 Matrix angeordnet.The gripper 28 has at its lower end a largely flat contact surface 30 which has a number of small openings 32. The contact surface 30 is expediently so large that that several dissectates can fit on it. The contact surface 30 preferably has a diameter of 500 μm. The openings 32 have a diameter of approximately 8 μm and are arranged in the form of a 10 × 10 matrix.
Diese Öffnungen 32 sind über Hohlkanäle 34 mit einer (nicht gezeigten) pneumatischen Vorrichtung verbunden, die Unter- und Überdruck erzeugen kann.These openings 32 are connected via hollow channels 34 to a pneumatic device (not shown) which can generate negative and positive pressure.
Der zu isolierende Teil 22 des Präparats wird ausgewählt und der transparente Greifer 28 von oben mit dem Präparat so in Kontakt gebracht, dass eine Öffnung 32 der Kontaktfläche 30 innerhalb der zu schneidenden Kontur liegt. Die Bewegungsrichtung des Greifers 28 ist in Fig. 3A durch eine fett gedruckten Pfeil angedeutet.The part 22 of the preparation to be insulated is selected and the transparent gripper 28 is brought into contact with the preparation from above such that an opening 32 of the contact surface 30 lies within the contour to be cut. The direction of movement of the gripper 28 is indicated in FIG. 3A by an arrow printed in bold.
Dann wird ein Unterdruck im Hohlkanal 34 des Greifers 28 erzeugt und dadurch das Präparat an den Greifer angesaugt und damit fixiert. Die unterschiedlichen Drücke sind in Fig. 3B durch dünne Pfeile angedeutet.A negative pressure is then generated in the hollow channel 34 of the gripper 28 and the preparation is thereby sucked onto the gripper and thus fixed. The different pressures are indicated in Fig. 3B by thin arrows.
Der Unterdruck kann sowohl über alle Öffnungen bzw. Kanäle gleich verteilt sein, als auch für jeden Kanal individuell ausgebildet werden.The negative pressure can be distributed equally over all openings or channels, or can be formed individually for each channel.
Nun wird die Kontur geschnitten, um den zu isolierenden Teil 22 zu dissektieren. Danach wird der Greifer 28 mit dem anhaftenden Dissektat 22 nach oben herausgehoben. Die Bewegungsrichtung ist in Fig. 3C durch einen fett gedruckten Pfeil angedeutet. Um weitere Dissektate 22 auf dem Greifer 28 zu sammeln, wird dieser Vorgang mit den jeweils noch freien Öffnungen 32 des Greifers wiederholt.Now the contour is cut in order to dissect the part 22 to be isolated. Then the gripper 28 with the adhering dissectate 22 is lifted out. The direction of movement is indicated in FIG. 3C by an arrow printed in bold. In order to collect further dissectates 22 on the gripper 28, this process is repeated with the respectively free openings 32 of the gripper.
Fig. 3D deutet schematisch an, wie das Dissektat 22 nach Abheben vom Objektträger 12 mit Hilfe des Greifers 28 zu einem Auffanggefäß 36 transportiert wird. Über dem Auffanggefäß 36 wird der Hohlkanal 34 mit einem (durch einen dünnen Pfeil angedeuteten) Überdruck beaufschlagt. Dies löst das Dissektat 22 von der Öffnung 32. Daraufhin fällt (angedeutet durch den fett gedruckten Pfeil) das Dissektat 22 in das Auffanggefäß 36.3D schematically indicates how the dissectate 22, after being lifted off the specimen slide 12, is transported to a collecting vessel 36 with the aid of the gripper 28. Over the collecting vessel 36, the hollow channel 34 is subjected to an overpressure (indicated by a thin arrow). This dissolves the dissectate 22 from the opening 32. The dissectate 22 then falls (indicated by the bold arrow) into the collecting vessel 36.
Wird - wie im bevorzugten Beispiel - der Gewebeschnitt 10 unmittelbar auf den Objektträger 12 gelegt und durch die Stabilisierungsschicht 14 bedeckt, so wird der Greifer 28 stets auf der vom Präparat abgewandten Seite mit der Stabilisierungsschicht 14 in Kontakt gebracht. Eine Kontamination und Verschleppung von biologischem Material wird auf diese Weise wirkungsvoll verhindert, da der Greifer 28 nie direkt mit der biologischen Schicht 10 in Kontakt kommt .If - as in the preferred example - the tissue section 10 is placed directly on the specimen slide 12 and covered by the stabilization layer 14, the gripper 28 is always brought into contact with the stabilization layer 14 on the side facing away from the specimen. Contamination and carryover of biological material is effectively prevented in this way since the gripper 28 never comes into direct contact with the biological layer 10.
Im Folgenden wird auf Fig. 4 Bezug genommen.In the following, reference is made to FIG. 4.
Zwischen dem Greifer 28 und dem Präparat kann sich eine ebenfalls mit Öffnungen 40 versehene Schicht 38 befinden. Diese wird im Folgenden als Zwischenschicht 38 bezeichnet. Eine der Öffnungen 40 dieser Zwischenschicht 38 wird vor dem Absenken des Greifers 28 auf das Präparat mit einer Öffnung 32 des Greifers 28 in Deckung gebracht. Die Durchmesser der Öffnungen müssen dabei nicht übereinstimmen. Wichtig ist nur, dass eine der Öffnungen - vorzugsweise die Öffnung 40 in der Zwischenschicht 38 - kleiner ist als das aufzunehmende Dissektat 22.A layer 38, also provided with openings 40, can be located between the gripper 28 and the preparation. This is referred to below as the intermediate layer 38. One of the openings 40 of this intermediate layer 38 is brought into alignment with an opening 32 of the gripper 28 before the gripper 28 is lowered onto the preparation. The diameters of the openings do not have to match. It is only important that one of the openings - preferably the opening 40 in the Intermediate layer 38 - is smaller than the dissectate 22 to be picked up.
Nach erfolgter Dissektion und dem Abheben des Greifers 28 und der Zwischenschicht 38 vom Präparat kann die Zwischenschicht so bewegt werden (angedeutet durch den fett gedruckten Pfeil in Fig. 4) , dass : a) erneut eine freie Öffnung 40 mit einer Öffnung 32 des Greifers 28 zur Deckung kommt; oder b) die mit einem Dissektat 22 belegte Öffnung 40 zu einer dem Greifer 28 äquivalenten Vorrichtung gelangt, an der die Ablösung des Dissektats 22 wie oben beschrieben erfolgt.After the dissection has taken place and the gripper 28 and the intermediate layer 38 have been lifted off the specimen, the intermediate layer can be moved (indicated by the bold arrow in FIG. 4) such that: a) again a free opening 40 with an opening 32 of the gripper 28 comes to cover; or b) the opening 40 covered with a dissectate 22 arrives at a device equivalent to the gripper 28, on which the dissectate 22 is detached as described above.
Zum Abschluss des Verfahrens wird - entsprechend Fig. 3D - "der Greifer 28 abgehoben und das Auffanggefäß 36 zum Greifer 28 transportiert oder aber der Greifer 28 zum Auffanggefäß 36 transportiert. In dieser Stellung können durch eine Druckerhöhung im Hohlkanal 34 die am Greifer 28 fixierten Dissektate 22 abgelöst werden. Sie fallen dann in das Auffanggefäß 36. Die Druckerhöhung kann z. B. durch einen oder mehrere kurze Druckstöße oder durch Schallwellen erfolgen.At the end of the method, according to FIG. 3D, the gripper 28 is lifted off and the collecting vessel 36 is transported to the gripper 28 or else the gripper 28 is transported to the collecting vessel 36 22. They then fall into the collecting vessel 36. The pressure can be increased, for example, by one or more short pressure surges or by sound waves.
Da der Greifer 28 nur mit der kontaminationsfreien Zwischenschicht 38 in Berührung kommt, besteht keineSince the gripper 28 only comes into contact with the contamination-free intermediate layer 38, there is none
Kontaminations- oder Verschleppungsge ahr für den Greifer. Dieser kann unbegrenzt wiederholt eingesetzt werden.Contamination or carryover risk for the gripper. This can be used repeatedly, indefinitely.
Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele verwirklichbar. So kann z. B. auch ein aufrechtes Mikroskop verwendet werden. Dabei ordnen sich alle Komponenten entsprechend an. Numerous modifications and developments of the exemplary embodiments described can be implemented within the scope of the invention. So z. B. also an upright microscope be used. All components are arranged accordingly.
Bezugszeichenreference numeral
Gewebeschnitt Mikroskop-Objektträger Folie bzw. Stabilisierungsschicht praparatseitige Elektrode objektträgerseitige Elektrode Aussparung in der objekttragerseitigen Elektrode 16 elektrisches Feld erste Elektrode Dissektat zweite Elektrode Kunststoff-Überzug zum Isolieren der Elektrode 24 Greifer Kontaktfläche Öffnung des Greifers 28 in der Kontaktfläche 30 Hohlkanal im Greifer 28 Auffanggefäß Zwischenschicht Öffnungen der Zwischenschicht 38 Tissue section microscope slide film or stabilization layer preparation-side electrode slide-side electrode recess in the slide-side electrode 16 electrical field first electrode dissectate second electrode plastic coating for insulating the electrode 24 gripper contact surface opening of the gripper 28 in the contact surface 30 hollow channel in the gripper 28 collecting vessel intermediate layer openings the intermediate layer 38

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Fixieren einer Schicht biologischen Materials (Präparat) auf einem Objektträger (12) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird auf einen dielektrischen Objektträger (12) aufgebracht; b) ein elektrisches Feld (18) ausreichender Stärke wird zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats angelegt; und c) die auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger werden durch eine erste Elektrode (20) entfernt.1. A method for fixing a layer of biological material (preparation) on a slide (12) with the following steps: a) the preparation (10, 14) is applied to a dielectric slide (12); b) an electric field (18) of sufficient strength is applied between the side of the specimen slide (12) facing away from the specimen (10, 14) and the side of the specimen facing away from the specimen slide; and c) the charge carriers collecting on the side of the preparation (10, 14) facing away from the slide (12) are removed by a first electrode (20).
2. Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht bio- logischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird auf einen dielektrischen Objektträger (12) aufgebracht; b) das Präparat (10, 14) wird gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 auf dem Objektträger (12) elektrostatisch fixiert; c) der zu isolierende Teil (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) wird aus dem Präparat ausgeschnitten; d) eine zweite Elektrode (24) wird von der vom Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) an das Dissektat (22) herangeführt; und e) die Richtung des elektrischen Feldes (18) wird derart umgekehrt, dass das Dissektat (22) von der zweiten Elektrode (24) angezogen wird. 2. A method for isolating part of a layer of biological material (preparation) with the following steps: a) the preparation (10, 14) is applied to a dielectric slide (12); b) the preparation (10, 14) is electrostatically fixed on the slide (12) according to the method of claim 1; c) the part (dissectate) (22) of the preparation (10, 14) to be isolated is cut out of the preparation; d) a second electrode (24) is brought up to the dissectate (22) from the side of the preparation (10, 14) facing away from the slide (12); and e) the direction of the electric field (18) is reversed such that the dissectate (22) is attracted to the second electrode (24).
3. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrostatische Haftung des Dissektats (22) an der zweiten Elektrode (24) derart aufgehoben wird, dass sich das Dissektat von der zweiten Elektrode löst.3. The method according to the preceding claim, characterized in that the electrostatic adhesion of the dissectate (22) to the second electrode (24) is eliminated in such a way that the dissectate detaches from the second electrode.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Dissektat (22) auf einer haftenden Unterlage, vorzugsweise einem klebenden Film und/oder einer Silikon- Kautschuk Unterlage, abgelegt wird.4. The method according to claim 2, characterized in that the dissectate (22) is deposited on an adhesive base, preferably an adhesive film and / or a silicone rubber base.
5. Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten: a) ein Greifer (28) wird an den zu isolierenden Teil (22) der Schicht biologischen Materials herangeführt; b) der Greifer (28) wird derart ausgebildet, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen Öffnung (32) hat, die in mindestens einer Dimension kleiner ist als die entsprechende Dimension des zu isolierenden Teils (22) des Präparats; c) durch eine Druckdifferenz wird der zu isolierende Teil (22) vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28) fixiert ; d) danach wird der zu isolierende Teil (22) aus der5. A method for isolating a part of a layer of biological material (preparation) with the following steps: a) a gripper (28) is brought up to the part (22) of the layer of biological material to be isolated; b) the gripper (28) is designed such that it has a continuous hollow channel (34) with a preparation-side opening (32) which is at least one dimension smaller than the corresponding dimension of the part (22) of the preparation to be isolated; c) the part (22) to be isolated is fixed in front of the preparation-side opening (32) of the gripper (28) by means of a pressure difference; d) then the part to be isolated (22) from the
Schicht (10) biologischen Materials ausgeschnitten, wodurch ein Dissektat gebildet wird; und e) das Dissektat (22) wird vom Rest der Schicht (10) biologischen Materials durch Entfernen des Greifers (28) von der Schicht biologischen Materials getrennt.Cut out layer (10) of biological material, whereby a dissectate is formed; and e) the dissectate (22) is separated from the rest of the layer (10) of biological material by removing the gripper (28) from the layer of biological material.
6. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Greifer (28) derart ausgebildet wird, dass er eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen (32) aufweist, die kleiner sind als zu isolierende Teile (22) des Präparats (10, 14) und das Fixieren von einer entsprechenden Mehrzahl von Dissektaten vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen ermöglichen.6. The method according to the preceding claim, characterized in that that the gripper (28) is designed such that it has a plurality of preparation-side openings (32) which are smaller than parts (22) of the preparation (10, 14) to be insulated and the fixing of a corresponding plurality of dissectates in front of the enable the respective openings on the preparation side.
7. Verfahren nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, dass das Dissektat (22) mit Hilfe des Greifers (28) an einen Zielort (36) transportiert wird und dort durch Verändern der Druckdifferenz abgelegt wird.7. The method according to claim 5, characterized in that the dissectate (22) is transported with the aid of the gripper (28) to a destination (36) and is deposited there by changing the pressure difference.
8. Verfahren nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, dass das Dissektat (22) auf einer haftenden Unterlage, vorzugsweise einem klebenden Film und/oder einer Silikon- Kautschuk Unterlage, abgelegt wird. 8. The method according to claim 5, characterized in that the dissectate (22) is placed on an adhesive base, preferably an adhesive film and / or a silicone rubber base.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Greifer (28) und dem Präparat (10, 14) eine mit Öffnungen (40) versehene Zwischenschicht (38) angeordnet wird.9. The method according to claim 5, characterized in that an intermediate layer (38) provided with openings (40) is arranged between the gripper (28) and the preparation (10, 14).
10. Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird auf einen dielektrischen Objektträger (12) aufgebracht; b) das Präparat (10, 14) wird gemäß dem Verfahren nach10. A method for isolating part of a layer of biological material (preparation), comprising the following steps: a) the preparation (10, 14) is applied to a dielectric slide (12); b) the preparation (10, 14) according to the method
Anspruch 1 auf dem Objektträger (12) elektrostatisch fixiert; c) anschließend wird der zu isolierende Teil (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat ausgeschnitten; d) schließlich wird das Dissektat (22) gemäß dem Verfahren nach Anspruch 4 vom Rest des Präparats (10, 14) getrennt.Claim 1 electrostatically fixed on the slide (12); c) the part (dissectate) (22) of the preparation (10, 14) to be isolated is then cut out of the preparation; d) finally, the dissectate (22) is separated from the rest of the preparation (10, 14) according to the method of claim 4.
11. Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht bio- logischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 auf einem dielektrischen Objektträger (12) fixiert ; b) anschließend wird der zu isolierende Teil (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat ausgeschnitten ; c) schließlich wird das Dissektat (22) dadurch vom Rest des Präparats (10, 14) getrennt, dass der Rest des Präparats vom Objektträger (12) abgehoben wird. 11. A method for isolating part of a layer of biological material (preparation) with the following steps: a) the preparation (10, 14) is fixed on a dielectric slide (12) according to the method of claim 1; b) the part (dissectate) (22) of the preparation (10, 14) to be isolated is then cut out of the preparation; c) finally, the dissectate (22) is separated from the rest of the preparation (10, 14) in that the rest of the preparation is lifted off the slide (12).
12. Vorrichtung zum Fixieren einer Schicht biologischen Materials (Präparat) auf einem Objektträger (12) mit: a) einem dielektrischen Objektträger (12) zur Aufnahme des Präparats (10, 14); b) Mitteln zum Anlegen eines elektrischen Felds (18) aus- reichender Stärke zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats; und mit c) einer ersten Elektrode (20) zum Entfernen der auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger.12. Device for fixing a layer of biological material (preparation) on a slide (12) with: a) a dielectric slide (12) for receiving the preparation (10, 14); b) means for applying an electric field (18) of sufficient strength between the side of the specimen slide (12) facing away from the specimen (10, 14) and the side of the specimen facing away from the specimen slide; and with c) a first electrode (20) for removing the charge carriers collecting on the side of the preparation (10, 14) facing away from the specimen slide (12).
13. Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einem dielektrischen Objektträger (12) zur Aufnahme des Präparats (10, 14) ; b) Mitteln zum Anlegen eines elektrischen Felds (18) ausreichender Stärke zwischen der vom Präparat (10, 14) abge- wandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats; c) einer ersten Elektrode (20) zum Entfernen der auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger; d) Mitteln zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat; e) Mitteln zum Heranführen einer zweiten Elektrode (24) an das Dissektat (22) von der vom Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) ; und mit f) Mitteln zum Umkehren der Richtung des elektrischen Feldes (18) derart, dass das Dissektat (22) von der zweiten Elektrode (24) angezogen wird. 14. Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einem Greifer (28), der an den zu isolierenden Teil13. Device for isolating a part of a layer of biological material (preparation) comprising: a) a dielectric slide (12) for receiving the preparation (10, 14); b) means for applying an electric field (18) of sufficient strength between that of the preparation (10, 14) facing side of the slide (12) and the side of the specimen facing away from the slide; c) a first electrode (20) for removing the charge carriers collecting on the side of the preparation (10, 14) facing away from the slide (12); d) means for cutting out the part (dissectate) (22) of the preparation (10, 14) to be isolated from the preparation; e) means for leading a second electrode (24) to the dissectate (22) from the side of the preparation (10, 14) facing away from the slide (12); and with f) means for reversing the direction of the electric field (18) such that the dissectate (22) is attracted to the second electrode (24). 14. Device for isolating part of a layer of biological material (preparation) with: a) a gripper (28) attached to the part to be isolated
(22) der Schicht biologischen Materials herangeführt werden kann; b) wobei der Greifer (28) derart ausgebildet ist, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen(22) the layer of biological material can be introduced; b) wherein the gripper (28) is designed such that it has a continuous hollow channel (34) with a preparation-side
Öffnung (32) hat, die kleiner ist als der zu isolierende TeilHas opening (32) which is smaller than the part to be insulated
(22) des Präparats; c) Mitteln zum Fixieren des zu isolierenden Teils (22) durch eine Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung(22) the preparation; c) means for fixing the part (22) to be insulated by means of a pressure difference in front of the opening on the preparation side
(32) des Greifers (28); d) Mittel zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (22) aus der Schicht (10) biologischen Materials, wodurch ein Dissektat gebildet werden kann; und mit e) Mittel zum Entfernen des Greifers (28) vom Rest der Schicht (10) biologischen Materials; f) wobei der Greifer (28) eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen (32) aufweist, die kleiner sind als zu isolierende Teile (22) des Präparats (10, (32) of the gripper (28); d) means for cutting out the part (22) to be isolated from the layer (10) of biological material, whereby a dissectate can be formed; and with e) means for removing the gripper (28) from the rest of the layer (10) of biological material; f) wherein the gripper (28) has a plurality of preparation-side openings (32) which are smaller as parts (22) of the preparation (10,
14) und das Fixieren von einer entsprechenden Mehrzahl von Dissektaten (22) vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen (32) ermöglichen.14) and the fixing of a corresponding plurality of dissectates (22) in front of the respective preparation-side openings (32).
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch Mittel zum Transportieren des Dissektats (22) mit Hilfe des Greifers (28) an einen Zielort (36); und mit Mittel zum Verändern der Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28).15. The apparatus according to claim 14, characterized by means for transporting the dissectate (22) with the aid of the gripper (28) to a destination (36); and with means for changing the pressure difference in front of the preparation-side opening (32) of the gripper (28).
16. Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einem Greifer (28) , der an den zu isolierenden Teil (22) der Schicht biologischen Materials herangeführt werden kann; b) wobei der Greifer (28) derart ausgebildet ist, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen Öffnung (32) hat, die kleiner ist als der zu isolierende Teil (22) des Präparats; c) Mitteln zum Fixieren des zu isolierenden Teils (22) durch eine Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung16. Device for isolating a part of a layer of biological material (preparation) comprising: a) a gripper (28) which can be brought up to the part (22) of the layer of biological material to be isolated; b) the gripper (28) being designed such that it has a continuous hollow channel (34) with a preparation-side opening (32) which is smaller than the part (22) of the preparation to be isolated; c) means for fixing the part (22) to be insulated by means of a pressure difference in front of the opening on the preparation side
(32) des Greifers (28) ; d) Mittel zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (22) aus der Schicht (10) biologischen Materials, wodurch ein(32) of the gripper (28); d) means for cutting out the part (22) to be isolated from the layer (10) of biological material, whereby a
Dissektat gebildet werden kann; e) Mittel zum Entfernen des Greifers (28) vom Rest derDissectate can be formed; e) means for removing the gripper (28) from the rest of the
Schicht (10) biologischen Materials; und mit f) einer Zwischenschicht (38) zwischen dem Greifer (28) und dem Präparat (10, 14); g) wobei die Zwischenschicht (38) eine Mehrzahl vonLayer (10) of biological material; and with f) an intermediate layer (38) between the gripper (28) and the preparation (10, 14); g) the intermediate layer (38) having a plurality of
Öffnungen (40) aufweist. Has openings (40).
17. Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einer Vorrichtung nach Anspruch 12 zum Fixieren des Präparats (10, 14) auf einem dielektrischen Objektträger (12) ; b) Mitteln zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat; und mit c) einer Vorrichtung nach Anspruch 13, 14 oder 16 zum17. A device for isolating part of a layer of biological material (preparation) comprising: a) a device according to claim 12 for fixing the preparation (10, 14) on a dielectric slide (12); b) means for cutting out the part (dissectate) (22) of the preparation (10, 14) to be isolated from the preparation; and with c) a device according to claim 13, 14 or 16 for
Trennen des Dissektats (22) vom Rest des Präparats (10, 14) .Separate the dissectate (22) from the rest of the preparation (10, 14).
18. Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einer Vorrichtung nach Anspruch 12 zum Fixieren des Präparats (10, 14) auf einem dielektrischen Objektträger (12) ; b) Mitteln zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat; und mit c) Mitteln zum Trennen des Dissektats (22) vom Rest des Präparats (10, 14) dadurch, dass die Mittel den Rest des Präparats vom Objektträger (12) abheben können. 18. Device for isolating part of a layer of biological material (preparation) comprising: a) a device according to claim 12 for fixing the preparation (10, 14) on a dielectric slide (12); b) means for cutting out the part (dissectate) (22) of the preparation (10, 14) to be isolated from the preparation; and with c) means for separating the dissectate (22) from the rest of the preparation (10, 14) in that the means can lift the rest of the preparation off the slide (12).
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