DE10128574A1

DE10128574A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Manipulation von Vesikeln

Info

Publication number: DE10128574A1
Application number: DE2001128574
Authority: DE
Inventors: Martin Jenkner; Roland Thewes
Original assignee: Infineon Technologies AG
Current assignee: Infineon Technologies AG
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2003-01-02
Also published as: WO2002101001A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Manipulation, insbesondere zum Positionieren, Selektieren, Transportieren und/oder Fixieren von Vesikeln (10) mit einem Siebelement (6; 16; 26) mit einer Vielzahl von Poren (8; 28) zur Aufnahme von vorzugsweise jeweils einem einzelnen Vesikel (10), wobei die Poren (8; 28) eine vorbestimmte Größe aufweisen und in vorbestimmten Abständen zueinander angeordnet sind, sowie ein Verfahren zur Manipulation und Positionierung von Vesikeln (10), bei welchem die Vesikel (10) in einer Lösung auf ein Siebelement (6; 16, 26) aufgebracht werden, indem Poren (8; 28) zur Aufnahme vorzugsweise einzelner Vesikel (10) ausgebildet sind, wobei die einzelnen Poren (8; 28) eine vorbestimmte Größe und Position in dem Siebelement (6; 16, 26) aufweisen und die Vesikel (10) in den Poren (8; 28) abgelagert werden.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Manipulation, insbesondere zum Positionieren, Selektieren, Transportieren und/oder Fixieren von Vesikeln.
Vesikel, d. h. biologische Objekte aus geschlossener, biologischer Membran wie beispielsweise einzelne Zellen, stellen ein häufig manipuliertes, biologisches Objekt dar. Dies gilt insbesondere im Bereich der künstlichen Befruchtung, der Biosensoren und Transfektion von Genen. Bei derartigen Verfahren und Anwendungen müssen einzelne Zellen aussortiert, transportiert und bei Bedarf festgehalten bzw. positioniert werden. Hierzu werden aufgrund der geringen Größe der Vesikel, typischerweise 10 µm bis 50 µm, technische Hilfsmittel wie Mikromanipulatoren oder Laserpinzetten verwendet. Bei allen diesen Verfahren werden jedoch immer einzelne Zellen manipuliert. Dies führt insbesondere bei der Genamplifikation sowie bei der Kontaktierung biologischer, neuronaler Netze durch aktive Array- Halbleiterstrukturen zu Problemen, da die Anordnung und Positionierung der einzelnen Vesikel bzw. Zellen sehr zeitaufwendig ist.
Besonders bei dem Einsatz von Mikroelektroden- bzw. -kontaktarrays muß eine Vielzahl von Vesikeln genau positioniert werden. Unter einem Mikrokontaktarray ist eine zweidimensionale, feldartige Anordnung von Mikroelementen zu verstehen, die mit Vesikeln in Kontakt treten bzw. zusammen wirken. Wenn Vesikel bzw. Zellen auf solchen Mikrokontaktarrays positioniert werden müssen, ist eine korrekte Positionierung des Vesikels auf den jeweiligen Sensoren, Elektroden bzw. sonstigen Mikroelementen sehr wichtig für eine erfolgreiche extrazelluläre Detektion oder Stimulation biologischer Signale in den Vesikeln bzw. Zellen oder einen Austausch von Stoffen mit den Vesikeln. Mikrokontaktarrays weisen eine immer höhere Anzahl von einzelnen Kontakten bzw. Elektroden auf. Bei Mikrokontaktarrays mit 10 bis 100 Mikroelementen ist eine individuelle manuelle Manipulation bzw. Positionierung der Vesikel noch möglich. Bei größeren Mikrokontaktarrays mit mehr als 10 000 Elektroden, in Zukunft möglicherweise mehr als 100 000 Elektroden bzw. Elementen erscheint dies jedoch unmöglich.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Manipulation und Positionierung von Vesikeln zu schaffen, welche eine vereinfachte und beschleunigte Positionierung bzw. Manipulation einer großen Anzahl von Vesikeln ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen, eine Verwendung mit den im Anspruch 9 angegebenen Merkmalen sowie ein Verfahren mit den im Anspruch 11 angegebenen Merkmalen gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung verbessert bzw. vereinfacht die Manipulation von Vesikeln. Unter Vesikeln werden hier Objekte, insbesondere biologische Objekte aus einer geschlossenen Lipidmembran verstanden, welche in flüssigen Phase, vorzugsweise Wasser handhabbar sind. Allgemein sind dies Partikel, welche eine Lipidmembran mit zumindest einer Lipidschicht umfassen. Beispiele für solche Vesikel sind Zellen, insbesondere Nervenzellen, gentechnisch manipulierte Zellen mit spannungsabhängigen Ionenkanälen, aus Erythrozyten fusionierte Riesenzellen, sog. "Ghosts" oder Kugeln aus Lipiddoppelschichten. Die Vesikel, zu deren Handhabung sich die Erfindung eignet, haben vorzugsweise eine Größe zwischen 1 und 500 µm. Ferner läßt sich die Erfindung auch zur Manipulation und Positionierung von sonstigen Partikeln wie z. B. Latex-Beads verwenden, welche eine entsprechende Größe aufweisen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist ein Siebelement mit einer Vielzahl von Poren zur Aufnahme oder zum Zurückhalten von vorzugsweise jeweils einem einzelnen Vesikel auf, wobei die Poren eine vorbestimmte Größe aufweisen und in vorbestimmten Abständen zueinander, d. h. an vorbestimmten Positionen angeordnet sind. Eine solche Vorrichtung ermöglicht eine sehr leichte Positionierung der einzelnen Vesikel, insbesondere Zellen, da diese in einem flüssigen Medium bzw. einer Lösung, insbesondere Wasser auf das Siebelement aufgetragen bzw. aufgebracht werden können, wobei die einzelnen Vesikel oder Zellen in die einzelnen Poren eingebracht bzw. eingespült und dort abgelagert werden. Das Siebelement ermöglicht somit ein sehr leichtes definiertes Anordnen einer Vielzahl von Vesikeln, ohne daß diese einzeln gehandhabt bzw. manipuliert werden müssen. Vielmehr können diese durch Aufbringen in einer Lösung bzw. einem Fluid im wesentlichen automatisch in den einzelnen Poren positioniert werden. Die Poren können in dem Siebelement in gewünschten Positionen insbesondere in Form eines Musters bzw. Rasters angeordnet werden, welches die Anordnung der Vesikel in genau vorbestimmten Positionen ermöglicht. Ein solches Raster bzw. Anordnung der Poren kann insbesondere auf eine gewünschte Anordnung von Vesikeln an einem Träger bzw. Substrat wie beispielsweise einem Mikrokontaktarray abgestimmt werden. Somit können die in den einzelnen Poren positionierten und angeordneten Vesikel an vorbestimmten Positionen, beispielsweise an den Stellen von Elektroden auf dem Substrat angeordnet bzw. abgelegt werden. Ferner weisen die einzelnen Poren einen vorbestimmten Querschnitt, d. h. Querschnittsgröße auf. Die Poren sind vorzugsweise auf die Größe der Vesikel abgestimmt, d. h. ihr Durchmesser liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 500 µm. Beispielsweise kann durch die Größe bzw. den Querschnitt der Poren bestimmt werden, daß maximal ein Vesikel in einer Pore aufgenommen werden kann. Ferner kann durch die Wahl der Größe eine Selektion der Vesikel stattfinden, da die Pore beispielsweise so klein ausgebildet werden kann, daß bestimmte Vesikel nicht in sie eindringen können, d. h. an der Öffnung der Pore zurückgehalten werden. Die einzelnen Poren weisen zueinander vorzugsweise einen Abstand auf, der etwa dem zweifachen Porendurchmesser entspricht. Bevorzugt wird der Abstand zwischen den Poren durch die zu erzeugende Anordnung der Vesikel bestimmt, d. h. die Poren werden so beabstandet, wie die Vesikel z. B. auf einem Substrat positioniert werden sollen. Der minimale Abstand wird im wesentlichen durch die mechanische Stabilität des Siebelementes bestimmt und kann je nach verwendeten Material und geometrischer Form des Siebelementes variieren. Das Siebelement hat ferner den Vorteil, daß es abnehmbar an einem Substrat, auf dem die Vesikel angeordnet werden sollen, positioniert und fixiert werden kann. Es kann somit insbesondere im Fall eines Mikrokontaktarrays auf eine dreidimensionale Oberflächengestaltung von diesem verzichtet werden, da die Positionierung der Vesikel allein von dem Siebelement vorgenommen wird. Somit kann die Oberfläche des Substrats oder Mikrokontaktarrays leicht zu reinigen ausgebildet werden. Zum Zwecke der Reinigung kann das Siebelement abgenommen werden und separat gereinigt werden. Somit können auch speziell auf das Siebelement und beispielsweise ein Mikrokontaktarray abgestimmte Reinigungsverfahren verwendet werden, d. h. das Siebelement kann beispielsweise mittels Ultraschall gereinigt werden, während das Mikrokontaktarray durch Polieren gereinigt werden kann.
Vorzugsweise ist das Siebelement als flache Scheibe, vorzugsweise aus Silizium oder Siliziumoxid ausgebildet und die Poren sind in Form von Durchgangslöchern ausgebildet. Das Siebelement bzw. die Scheibe weisen vorzugsweise eine Dicke von 100 µm bis 600 µm und besonders bevorzugt von etwa 500 µm auf. Silizium bzw. Siliziumoxid bzw. Siliziumdioxid sind besonders bevorzugte Materialien, weil sich in diesen die Poren bzw. Durchgangslöcher mittels bekannter photolithographischer Prozesse herstellen lassen. Entsprechend können andere Halbleiter verwendet werden. Ein Verfahren zur Herstellung der Poren bzw. Durchgangslöcher ist aus der WO 99/58746 bekannt. Ferner ist Silizium bzw. Siliziumoxid besonders geeignet, da ein Siebelement aus diesem Material inert gegenüber elektrolytischen Lösungen, jedoch kompatibel zu biologischen Geweben ist. Ferner können deren Oberflächeneigenschaften mit einem breiten Spektrum von Reagenzien, wie z. B. Silanen vorübergehend oder auch dauerhaft definiert werden. Zusätzlich weist Silizium bzw. Siliziumdioxid den Vorteil auf, daß sich sehr leicht elektrisch aktive Strukturen integrieren lassen, welche zum Beispiel Sensor- oder Aktuatorfunktionen übernehmen können. So kann über einen Aktuator insbesondere ein dielektrophoretisch kontrollierter Eintritt von Vesikeln bzw. Partikeln in die Poren erreicht werden.
Das Siebelement kann jedoch auch aus anderen Materialen, wie z. B. aus Glas, Zirkonoxid, Titanoxid, Boroxid, Aluminiumoxid, ITO gefertigt werden. Das Material muß ausreichend stabil sein und die Ausbildung von Durchgangslöchern mit einem hohen Aspektverhältnis, d. h. Verhältnis von Länge zu Durchmesser ermöglichen. Bevorzugt ist das Material photolithographisch strukturierbar und mit einem anisotropen Ätzverfahren behandelbar, um die Poren auszubilden. Die Ausgestaltung der Poren als Durchgangslöcher hat den Vorteil, daß beim Einspülen bzw. Einbringen der Vesikel, welche sich in einer Lösung befinden, die Lösung bzw. das Trägerfluid durch die Bohrungen abfließen kann. Ferner ermöglichen Durchgangslöcher einzelne Vesikel, welche im Querschnitt größer als die Durchgangslöcher sind, an der Oberfläche des Siebelementes in bzw. an den einzelnen Löchern zu positionieren. Dabei können die einzelnen Vesikel insbesondere durch Unterdruck jeweils an der Eintrittsöffnung einer Pore bzw. eines Durchgangslochs gehalten werden.
Weiter bevorzugt sind die Durchgangslöcher zylindrisch und vorzugsweise kreiszylindrisch ausgebildet. Generell werden die Poren bzw. Durchgangslöcher bevorzugt an die Querschnittsform bzw. äußere Form der zu positionierenden Vesikel angepaßt. Hierzu eignet sich insbesondere eine runde Querschnittform, wobei der Durchmesser je nach Einsatzzweck auf die zu positionierenden bzw. zu manupulierenden Vesikel abgestimmt werden kann. Für einen bevorzugten Anwendungsfall weisen die Durchgangslöcher eine Querschnittsfläche bzw. einen Durchmesser auf, welcher geringfügig größer ist als der Querschnitt bzw. Durchmesser der zu positionierenden Vesikel. Durch die Größengestaltung kann gewährleistet werden, daß die Vesikel in die Durchgangslöcher eintreten können und sich in diesen entlang bewegen können, ohne an den Seitenwänden der Löcher anzuhaften.
Ferner kann eine Größenselektion der Vesikel stattfinden, da größere Vesikel, welche einen Durchmesser aufweisen, welcher größer als derjenige der Durchgangslöcher bzw. Poren ist, nicht in diese eintreten können. Dieser Effekt wird auch genutzt, um Vesikel, welche größer als die Poren bzw. Durchgangslöcher sind, in deren Eintrittsöffnung zu positionieren und gegebenenfalls, beispielsweise durch Unterdruck, zu fixieren.
Bevorzugt erweitern sich die Durchgangslöcher zu einer Seite der Scheibe trichterförmig. Diese trichterförmige Erweiterung kann beispielsweise konisch ausgebildet sein. Durch die Trichterform wird eine größere Öffnung geschaffen, welche ein leichtes Eintreten der Vesikel in das Durchgangsloch ermöglicht. So kann eine noch leichtere automatische Positionierung in den Poren bzw. Durchgangslöchern erreicht werden. Ferner ist diese Ausgestaltung bevorzugt, wenn größere Vesikel an der Eintrittsöffnung der Durchgangslöcher fixiert bzw. positioniert werden sollen. Die Vesikel können dann in den trichterförmigen Teil eintreten und werden in diesem positioniert und gehalten. Dabei wird der trichterförmige Teil vorteilhafterweise so dimensioniert, daß die Tiefe des Trichters größer als der Vesikeldurchmesser ist. Dadurch kann das Vesikel in dem Transportfluid, insbesondere Wasser gehalten werden, ohne das es mit Luft in Kontakt kommt. Dies ermöglicht einen Transport der Vesikel zwischen zwei nicht zusammenhängenden Flüssigkeiten wie z. B. Wasser, ohne daß die Vesikel durch die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit und Luft treten müssen. Bei dieser Ausgestaltung darf jedoch der größte Durchmesser des Trichters nicht so groß sein, daß sich die Oberfläche des Fluids bzw. Wassers derart konkav nach innen beult, daß das Vesikel mit der Oberfläche in Kontakt kommt. Dies hängt von dem Verhältnis der Tiefe zum Durchmesser des Trichters ab.
Weiter bevorzugt sind an einer Seite des Siebelementes zwischen benachbarten Poren Kanäle ausgebildet, welche diese miteinander verbinden. Dabei erstrecken sich die Kanäle vorzugsweise im wesentlichen quer zu den einzelnen Poren bzw. Durchgangslöchern. Diese Kanäle haben zum einen den Vorteil, daß sie, wenn das Siebelement auf ein Substrat aufgesetzt ist, dazu dienen können, eine Lösung bzw. ein Trägerfluid abzuführen, mit dem die Vesikel in die einzelnen Poren gespült werden. Dabei wird das Siebelement so angeordnet, daß die Seite des Siebelementes, in der die Kanäle ausgebildet sind auf der Oberseite des Substrats zu liegen kommt. Die Vesikel treten dann von der entgegengesetzten Seite her mit der Lösung bzw. dem Fluid in die Poren ein. Die Lösung fließt durch die Poren hindurch und durch die Kanäle zur Außenseite des Siebelementes ab. Die Kanäle werden vorzugsweise so ausgebildet, daß sie kleiner als die zu manipulierenden Vesikel sind, so daß diese in den Poren zurückgehalten werden. Ferner können die Kanäle dazu genutzt werde, neuronale Strukturen zwischen den Vesikeln, welche in einzelnen Poren angeordnet sind, aufzubauen, da sie ein neuronales Wachstum zwischen den Vesikeln bzw. Zellen, insbesondere Nervenzellen ermöglichen. Dabei wird das neuronale Wachstum durch die Kanäle geführt bzw. gerichtet. Dies ist insbesondere deshalb von Vorteil, da die geometrischen Verhältnisse in neuronalen Netzen ein wichtiger Faktor für eine neuronale Informationsverarbeitung sind.
Zweckmäßigerweise sind die Teile des Siebelementes, die mit Vesikeln in Kontakt kommen, und insbesondere die Poren passiv, d. h. vorzugsweise mit oberflächenaktiven Substanzen ausgebildet, so daß sie keine Anhaftpunkte für Vesikel aufweisen. Auf diese Weise wird verhindert, daß die Vesikel an dem Siebelement, welches lediglich als Positionier- bzw. Manipulierhilfe dienen soll, anhaften. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn die Vesikel lediglich beispielsweise durch Unterdruck an den Poren gehalten werden sollen und anschließend auf einem Substrat wie beispielsweise einem Mikrokontaktarray abgelegt werden sollen. Solche Oberflächeneigenschaften können insbesondere durch entsprechende Beschichtungen erreicht werden. Insbesondere muß die Hydrophilizität der Siebelementoberflächen an die gewünschten Einsatzzwecken angepaßt werden, um ihre Funktion sicherzustellen und ein Anhaften von Vesikeln zu verhindern. Dies kann beispielsweise durch Beschichtung mit Silanen erfolgen. Ferner kann eine Oberflächenmodifizierung der Seite des Siebelementes gewünscht sein, welche mit einem Substrat wie beispielsweise einem Mikrokontaktarray in Kontakt gebracht werden soll. Dabei kann die Oberfläche so eingestellt werden, daß das Siebelement durch Adhäsion an einem Substrat wie z. B. einem Mikrokontaktarray gehalten bzw. fixiert werden kann. Damit kann ein unbeabsichtigtes Verschieben des Siebelementes nach dem Aufsetzen auf ein Substrat ausgeschlossen werden. Mittels einer elektrisch kontrollierbaren Oberflächenspannung des Substrats kann ferner bevorzugt die Adhäsion über das Substrat bzw. Mikrokontaktarray elektrisch eingestellt werden.
Weiter bevorzugt sind an dem Siebelement optische und/oder mechanische Positionierhilfen ausgebildet. Diese dienen dazu, das Siebelement mit einem vorgegebenen Porenraster genau positioniert auf einem Träger bzw. Substrat aufzusetzen, um zu gewährleisten, daß die Vesikel, welche an bzw. in den Poren angeordnet sind, genau an den gewünschten Positionen auf dem Substrat positioniert werden. Im Falle eines Mikrokontaktarrays sind diese Positionen, an denen die Vesikel positioniert werden sollen, Elektroden bzw. Mikroelemente. In diesem Fall soll das Siebelement so an dem Mikrokontaktarray positioniert werden, daß die einzelnen Mikroelemente bzw. Elektroden jeweils genau mit einer zugehörigen Pore ausgerichtet sind, so daß die Vesikel genau zentriert auf den Elektroden angeordnet werden können. Eine leichte Positionierung des Siebelementes an dem Substrat kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß vorzugsweise am Rand eines Mikrokontaktarrays die Mikroelemente in einem Raster angeordnet werden, dessen Rasterweite leicht von der Rasterweite der Poren an dem Siebelement abweicht. Alternativ können am Siebelement und dem Substrat zusätzliche Muster oder Raster aufgebracht werden, die sich in ihrer Rasterweite leicht unterscheiden. Auf diese Weise entsteht beim Aufsetzen des Siebelementes auf das Mikrokontaktarray durch die Raster mit unterschiedlicher Rasterweite ein Moire- Effekt, welcher eine exakte Ausrichtung des Siebelementes ohne weitere optische Hilfsmittel erlaubt. Es ist jedoch auch denkbar andere, insbesondere optomechanische Positionierhilfen insbesondere an den Rändern des Siebelementes und eines Substrats bzw. Mikrokontaktarrays vorzusehen. Alternativ kann eine rein mechanische Positionierhilfe in Form von Zapfen und Ausnehmungen vorgesehen sein. Dabei können vorteilhafterweise die Ausnehmungen in dem Siebelement ausgebildet werden und dieses dann als Formwerkzeug zur Ausbildung der Zapfen an dem Substrat, beispielsweise in einem noch nicht ausgehärteten Polymer verwendet werden. Ein solches Verfahren entspricht im wesentlichen dem micro-contact-printing (µCP). Auf diese Weise kann vorzugsweise ein Paar bestehend aus einem Substrat bzw. Trägerelement und einem zugehörigen Siebelement geschaffen werden.
Das Siebelement kann an in einer bevorzugten Ausführungsform an einer Pipette angebracht sein. Es wird dabei so angeordnet, daß eine Lösung mit den Vesikeln von der Pipette durch das Siebelement, d. h. die darin ausgebildeten Durchgangslöcher bzw. Poren angesaugt wird. Dabei können abhängig vom Querschnitt der Poren nur Vesikel einer vorgegebenen Maximalgröße in die Pipette eintreten, größere Vesikel werden an den Öffnungen der Poren an dem Siebelement zurückgehalten. Dabei können sie positioniert an den Öffnungen der Poren gehalten werden, um sie zu transportieren oder in einem bestimmten Muster oder Raster entsprechend der Anordnung der Poren abzulegen. Dabei sind die Öffnungen der Poren vorzugsweise derart trichterförmig ausgebildet, daß die Vesikel in den Trichtern vollständig aufgenommen werden und dort in der Lösung bzw. in Wasser gehalten werden können, ohne mit Luft in Kontakt zu kommen. Es wird somit ein Transport der Vesikel in einer geschlossenen Wasserpahse möglich. Ferner ist durch das Siebelement eine Selektion der Vesikel nach Größe möglich.
Vorzugsweise wird die oben beschriebenen Vorrichtung dazu verwendet, Vesikel zu manipulieren, insbesondere zu positionieren, selektieren, transportieren und/oder zu fixieren.
Besonders bevorzugt ist eine Verwendung, bei welcher die Anordnung der Poren des Siebelementes einem Raster von Mikroelementen eines Mikrokontaktarrays entspricht und das Siebelement dazu verwendet wird, um einezelne Vesikel an den Mikroelementen zu positionieren. Unter einem Mikrokontaktarray ist eine zweidimensionale, feldartige Anordnung von Mikroelementen zu verstehen, die mit Vesikeln in Kontakt treten bzw. zusammen wirken. Die Mikroelemente sind beispielsweise Elektroden, an denen einzelne Vesikel angeordnet werden sollen. Die Elektroden sollen dabei vorzugsweise nichtinvasive Kontakte herstellen, beispielsweise, um elektrische Potentiale abzuleiten oder den pH-Wert zu messen. Die Elektroden können jedoch auch invasive Kontakte bewirken, wobei ein besserer Kontakt geschaffen wird, die Lebensdauer allerdings verkürzt wird. Das Siebelement weist ein Poren- bzw. Lochraster auf, welches der Anordnung der Elektroden entspricht. Durch Aufbringen einer Lösung, vorzugsweise Wasser mit den Vesikeln auf das Siebelement können die Vesikel leicht in die Poren eingebracht bzw. an oder in diesen angeordnet werden. Diese Anordnung entspricht dann genau der gewünschetn Anordnung bzw. dem gewünschten Raster der Mikroelemente. Auf diese Weise ist es möglich, eine große Anzahl von Vesikeln sehr leicht und schnell in einem gewünschten Muster oder Raster anzuordnen.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet bevorzugt eine Vorrichtung gemäß der vorangehenden Beschreibung. Die zu positionierenden bzw. zu manipulierenden Vesikel befinden sich in einer Lösung und werden mit dieser gemeinsam auf ein Siebelement aufgebracht. In dem Siebelement sind einzelne Poren zur Aufnahme vorzugsweise einzelner Vesikel ausgebildet. Die Vesikel werden mittels der Lösung in die Poren eingebracht bzw. in diese eingespült und somit in diesen angeordnet bzw. fixiert. Da die einzelnen Poren eine vorbestimmte Größe und Position in dem Siebelement aufweisen, werden die Vesikel dabei durch die Poren in vorgegebenen Positionen angeordnet. Auf diese Weise ist es möglich, sehr schnell eine große Anzahl von Vesikeln in vorbestimmten Positionen anzuordnen. Die Vesikel müssen nicht mehr wie bisher einzeln mittels entsprechender Hilfsmittel an vorbestimmten Positionen angeordnet werden. Durch das Aufbringen in einer Lösung werden sie im wesentlichen selbsttätig in den einzelnen Poren abgelagert und damit an vorgegebenen Positionen angeordnet.
Vorzugsweise sind die Poren als Durchgangslöcher ausgebildet und weisen jeweils einen Querschnitt auf, welcher der Größe der zu manipulierenden bzw. zu positionierenden Vesikel entspricht. Somit ist gewährleistet, daß die Vesikel einer bestimmten Größe, welche manipuliert bzw. positioniert werden sollen, in die Durchgangslöcher eintreten können und dabei in diesen fixiert und somit an einer definierten Position angeordnet werden. Dabei kann der Querschnitt bzw. die Größe der Durchgangslöcher vorzugsweise geringfügig größer als die Vesikel sein, so daß die Vesikel in den Löchern ein geringes Spiel haben und sich in deren Längsrichtung bewegen können, ohne festzuhängen oder zu verklemmen.
Weiter bevorzugt sind die Poren des Siebelementes derart voneinander beabstandet angeordnet, daß die Anordnung der Poren einer gewünschten Anordnung von Anbringungspunkten der Vesikel auf einem Substrat entspricht, wird das Sieb derart auf dem Substrat positioniert, daß die Poren zu den gewünschten Anbringungspunkten ausgerichtet sind, und wird eine Lösung mit den Vesikeln auf das Siebelement aufgebracht. Die Anbringungspunkte an dem Substrat sind zum Beispiel im Falle eines Mikrokontaktarrays einzelne Elektroden bzw. Mikroelemente, welche in einem vorgegebenen Raster angeordnet sind und mit einzelnen Vesikeln kontaktiert werden sollen. Dadurch, daß die Poren in dem Siebelement in einem den Anbringungspunkten entsprechendem Raster angeordnet sind, werden die einzelnen Vesikel so positioniert, daß sie jeweils auf einem Anbringungspunkt bzw. einem Mikroelement zu liegen kommen. Hierzu wird das Siebelement vorzugsweise flach auf das Substrat aufgelegt, so daß jeweils eine Pore über jedem Anbringungspunkt zentriert ausgerichtet ist. Anschließend wird die Lösung mit den Vesikeln auf das Siebelement aufgebracht, wobei die Vesikel in die Poren eindringen und somit auf den einzelnen Anbringungspunkten zu liegen kommen. Die Größe der Poren wird vorzugsweise so gewählt, daß die Poren nur geringfügig größer als die einzelnen Vesikel sind. Auf diese Weise kann sichergestellt werden, daß jeweils nur ein Vesikel genau auf jedem Anbringungspunkt zu liegen kommt.
Vorzugsweise ist das Substrat ein Mikrokontaktarray und die Anbringungspunkte sind Mikroelemente, entsprechend denen die Vesikel positioniert werden. Insbesondere bei Mikrokontaktarrays ist sehr wichtig, daß die Vesikel genau an den Mikroelementen, beispielsweise Elektroden positioniert werden, um eine gleichmäßige Stärke der Signalübertragung zwischen Vesikel und Elektrode sicherzustellen. Die Stärke der Signalübertragung sinkt mit der Abdeckung einer Elektrode bzw. eines Sensors durch das Vesikel. Beispielsweise können Vesikel, die neben einem Sensor bzw. einer Elektrode liegen, nicht detektiert bzw. kontaktiert werden.
Bevorzugt wird das Siebelement vorzugsweise lösbar an dem Substrat durch Adhäsion fixiert. Dies ermöglicht eine sehr leichte Fixierung des Siebelementes an dem Substrat, wobei eine genaue Positionierung des Siebelementes sichergestellt und beibehalten werden kann, so daß die Poren genau an vorbestimmten Positionen über dem Substrat liegen. Es ist zweckmäßig, daß das Siebelement wieder von dem Substrat getrennt werden kann, da Siebelement und Substrat dann unabhängig voneinander gereinigt werden können. Dies ermöglicht zum einen eine leichtere Reinigung von Substrat und Siebelement und ermöglicht ferner, daß für jedes Element ein geeignetes Reinigungsverfahren eingesetzt werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Form des Verfahrens werden an dem Siebelement zwischen den Poren ausgebildete Kanäle an dem Substrat zur Anlage gebracht und die Lösung durch die Kanäle abgeführt. D. h. in diesem Verfahrensschritt liegen die Kanäle, welche an einer Seite des Siebelementes ausgebildet sind, auf der Oberfläche des Substrats auf. Somit wird es möglich, die Lösung, in der sich die Vesikel befinden und welche von der Oberseite des Siebelements in die Poren eintritt, am unteren Ende der Poren bzw. Durchgangslöcher durch die Kanäle abzuführen. Auf diese Weise wird erreicht, daß die Vesikel, welche am oberen Ende in die Poren eintreten, recht schnell in den Poren absinken und an der Substratoberfläche zu liegen kommen. Dabei werden die Kanäle vorzugsweise kleiner als die Vesikel ausgebildet, so daß die Vesikel nicht durch die Kanäle hindurchtreten können und folglich in den Poren zurückgehalten werden.
Ferner können Nervenzellen als Vesikel in den Poren angeordnet werden, welche in den Kanälen, die zwischen den Poren in dem Siebelement angeordnet sind, ein neuronales Wachstum ausbilden. Die Kanäle sind vorzugsweise an einer Seite des Siebelementes in Form von Rinnen bzw. Nuten ausgebildet und verbinden die einzelnen Poren rasterartig miteinander. Auf diese Weise kann in den Kanälen ein gerichtetes und geometrisch definiertes neuronales Wachstum stattfinden, um ein neuronales Netz aufzubauen. Vorzugsweise kann auch hierbei das Siebelement mit den Kanälen auf der Oberfläche eines Substrats wie beispielsweise eines Siliziumchips angeordnet werden, so daß auf dem Siliziumchip ein geometrisch vorgegebenes neuronales Netz entsteht.
Bei einer weiteren Verfahrensvariante weisen die Poren eine Größe auf, welche geringer als die Größe der zu manipulierenden oder zu positionierenden Vesikel ist. Auf diese Weise eignet sich das Siebelement zur Selektion von Vesikeln bestimmter Größe, insbesondere, wenn sich Vesikel unterschiedlicher Größe in ein und derselben Lösung befinden. Ferner können Vesikel, welche größer als die Poren sind, an der Oberfläche des Siebelements in den Eintrittsöffnungen des Siebelementes positioniert und gehalten werden. Das Siebelement bildet somit ein Transportsieb zum Transport von Vesikeln. Es kann eine Einzelschicht von Vesikeln, d. h. ein Vesikel pro Pore transportiert werden. Zusätzlich wird dabei eine definierte Anordnung der Vesikel sichergestellt, beispielsweise um sie in der definierten Anordnung auf einem Substrat abzulegen.
Weiter bevorzugt kann das Siebelement an einer Pipette angeordnet werden und anschließend durch die Pipette eine Lösung mit Vesikeln aufgenommen werden, wobei Vesikel mit einer vorgegebenen Mindestgröße an den Poren des Siebelementes fixiert werden. Kleinere Vesikel, deren Durchmesser geringer als die Größe der Poren ist, werden durch die Poren hindurch in die Pipette eintreten. Vesikel mit einem größeren Querschnitt oder Durchmesser bleiben an den Eintrittsöffnungen der Poren bzw. Durchgangslöcher hängen und werden so an den Poren positioniert. Solange über die Pipette ein Sog aufrechterhalten wird, werden die Vesikel ferner an den Poren festgehalten, so daß sie leicht mit der Pipette und dem an dieser angebrachten Siebelement transportiert und gehandhabt werden können. Dabei halten die Vesikel eine vorgegebene Anordnung bzw. Positionierung gemäß der Anordnung der Poren in dem Siebelement bei. Somit ist der Transport einer Einzelschicht von Vesikeln möglich, welche zusätzlich noch genau definierte Positionen einnehmen. Vorzugsweise sind die Endbereiche der Durchgangslöcher trichterförmig ausgestaltet, so daß die Vesikel vollständig in den größeren trichterförmigen Bereich aufgenommen werden, bevor sie am Anfang bzw. Eingang des engeren Durchgangsloches zurückgehalten werden. Dabei wird die Tiefe des Trichterbereiches so gewählt, daß das Vesikel nach außen auch beim Transport ständig von der Lösung bzw. Wasser überdeckt wird. Die Vesikel können somit in einer geschlossenen Flüssigkeitsphase wie einer Wasserphase zwischen zwei nicht zusammenhängenden Flüssigkeiten, z. B. Wasser in zwei getrennten Gefäßen, transportiert werden, ohne durch die Grenzfläche von Luft und der Flüssigkeit treten zu müssen. Die Vesikel kommen somit bei deren Transport nicht mit Luft in Kontakt.
Die Poren vorzugsweise in einem vorbestimmten Raster angeordnet, welches einer Anordnung von Poren an einem zweiten Siebelement entspricht, wobei die Poren in dem zweiten Siebelement größer sind als die Poren in dem ersten Siebelement. Das zweite Siebelement kann beispielsweise ein Siebelement sein, welches in der oben beschriebenen Weise auf einem Substrat wie einem Mikrokontaktarray angeordnet ist, um einzelne Vesikel auf Elektroden oder Mikroelementen zu positionieren. Dadurch, daß das Raster an dem ersten Siebelement dem Raster der Poren in dem zweiten Siebelement entspricht, können die beiden Siebelemente derart übereinander positioniert werden, daß die einzelnen Poren an dem ersten Siebelement jeweils über einer Pore an dem zweiten Siebelement angeordnet sind. Somit können Vesikel, welche an dem ersten Siebelement positioniert gehalten werden, genau an vorgegebenen Positionen über dem zweiten Siebelement abgesetzt werden, so daß sie in die Poren in dem zweiten Siebelement eintreten. Ferner kann durch die Einstellung eines Maximaldurchmessers an dem zweiten Siebelement erreicht werden, daß nur Vesikel einer bestimmten Maximalgröße in die Poren in dem zweiten Siebelement eintreten. Es ergibt sich somit ein Verfahren, welches einen Bandpaß für die Vesikelgröße darstellt. Damit können aus einer heterogenen Dispersion Vesikel extrahiert werden, deren Durchmesser innerhalb frei einstellbarer Grenzen liegt, welche durch die Porengrößen in dem ersten und zweiten Siebelement vorgegeben werden.
Vorzugsweise sind die Poren als Durchgangslöcher ausgebildet, deren eines Ende sich jeweils konisch erweitert und welche ein Querschnitt aufweisen, welche kleiner ist als die zu positionierenden Vesikel, und die Vesikel werden im Bereich der konischen Erweiterung positioniert und vorzugsweise durch Unterdruck an den Durchgangslöchern fixiert. Die Vesikel treten dabei in die konische Erweiterung eines jeden Durchgangsloches ein und werden in dieser positioniert und gehalten. Aufgrund ihrer größeren Größe können sie nicht weiter in das Durchgangsloch eintreten. Durch Unterdruck, welcher in den Durchgangslöchern erzeugt wird, können die Vesikel in dieser Position festgehalten werden. Ein solches Verfahren eignet sich insbesondere zur gleichzeitigen Handhabung und zum Transport einer großen Anzahl von Vesikeln. Ferner können die Vesikel in einer festen, definierten Position gehalten werden, wo sie z. B. zur intrazellulären Masseninjektion zur Verfügung stehen. Auf diese Weise könnte z. B. ein ganzes Feld von Eizellen, deren Position durch das Sieb vorgegeben ist, von einer automatisierten Injektionskanüle befruchtet werden. Dabei werden die Eizellen mechanisch, vorzugsweise durch Unterdruck an dem Siebelement fixiert, so daß eine Positionsauswertung über eine aufwendige Bilderkennung entfallen kann. Ähnliche Anwendungen ergeben sich auf dem Feld der Molekularbiologie, wo ebenfalls zelluläre Injektionen eingesetzt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielhaft anhand der beigefügten Abbildungen beschrieben. In diesen zeigt:
Fig. 1 eine schematische Querschnittansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung beim Einsatz als Positioniersieb,
Fig. 2 eine schematische Draufsicht des in Fig. 1 gezeigten Anwendungsfalles,
Fig. 3 eine schematische Querschnittansicht eines Positioniersiebes mit Kanälen,
Fig. 4 eine schematische Draufsicht des in Fig. 3 gezeigten Anwendungsfalles,
Fig. 5 eine schematische Querschnittansicht eines Positioniersiebes mit Kanälen für ein neuronales Wachstum,
Fig. 6 eine schematische Draufsicht des in Fig. 5 gezeigten Anwendungsfalles,
Fig. 7 eine schematische Querschnittansicht der Anwendung als Transportsieb,
Fig. 8 schematisch das Absetzen von Vesikeln mit einem Transportsieb gemäß Fig. 7,
Fig. 9 eine Detailansicht eines Transportsiebes, und
Fig. 10 eine schematische Querschnittansicht einer Anwendung als Fixiersieb.
Fig. 1 zeigt schematisch den Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Positioniersieb. Im gezeigten Fall ist ein Substrat 2 in Form eines Mikrokontaktarrays vorgesehen, auf dem Vesikel positioniert angeordnet werden. In dem Mikrokontaktarray 2 sind an einer Oberfläche in regelmäßigen Abständen rasterartig Mikroelemente 4 in Form von beispielsweise Sensoren oder Elektroden angeordnet. Auf dem Mikrokontaktarray 2 ist ein Sieb bzw. Siebelement 6 angeordnet. Das Siebelement 6 bildet in diesem Fall ein Positioniersieb. Das Siebelement 6 wird vorzugsweise aus einer Siliziumscheibe bzw. einem Siliziumwafer gebildet, in dem Poren bzw. Durchgangslöcher 8 ausgebildet sind. Diese Durchgangslöcher 8 sind vorzugsweise kreiszylindrisch ausgebildet und erstrecken sich im wesentlichen senkrecht zur Oberfläche des Siebelementes 6. Ein Verfahren zum Ausbilden solcher Durchgangslöcher 8 in einem Siliziumwafer ist in der WO 99/58746 beschrieben. Die Durchgangslöcher 8 sind in dem Siebelement 6 derart voneinander beabstandet angeordnet, daß ein Raster gebildet wird, welches der Anordnung bzw. dem Raster der Mikroelemente 4 auf dem Substrat 2 entspricht. Das Siebelement 6 wird auf die Oberfläche des Mikrokontaktarrays 2 aufgesetzt und wird an dieser vorzugsweise durch Adhäsion gehalten oder in anderer geeigneter Weise fixiert. Dabei ist das Siebelement 6 derart positioniert, daß jedes der Durchgangslöcher 8 jeweils genau über einem Mikroelement 4 angeordnet ist. Der Durchmesser der Durchgangslöcher 8 ist so gewählt, daß er gleich oder vorzugsweise geringfügig größer ist als der Durchmesser eines Vesikels 10. Auf diese Weise ist es dem Vesikeln 10 möglich von der Oberseite her in die Durchgangslöcher 8 einzutreten und sich in diesen bis zur Unterseite des Siebelementes 6 zu bewegen, so daß sie auf den Mikroelementen 4 des Mikrokontaktarrays 2 genau positioniert zu liegen kommen. Die Vesikel 10, beispielsweise Zellen oder Nervenzellen, befinden sich dabei in einem Fluid bzw. einer Lösung, vorzugsweise Wasser, mit der sie auf das Siebelement 6 aufgebracht werden. Dabei treten die Vesikel 10 in die Durchgangslöcher 8 ein bzw. werden in diese eingespült. Dadurch, daß die Durchgangslöcher 8 nur geringfügig größer als die Vesikel 10 sind, wird gewährleistet, daß jeweils nur ein Vesikel 10 auf einem Mikroelement 4 zu liegen kommt.
Fig. 2 zeigt eine Draufsicht der entsprechenden Anordnung. Es ist zu erkennen, daß die Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 6 genau ausgerichtet über den Mikroelementen 4 des Substrats bzw. Mikrokontaktarrays 2 liegen. In einige der Löcher bzw. Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 6 in Fig. 2 sind schon Vesikel 10 eingetreten, während andere Durchgangslöcher 8 derart dargestellt sind, daß noch keine Vesikel 10 eingetreten und die Mikroelemente 4 sichtbar sind.
Fig. 3 zeigt eine alternative Ausgestaltung der in Fig. 3 gezeigten Anordnung. Die Anordnung entspricht im wesentlichen der in Fig. 1 gezeigten Anordnung mit dem Unterschied, daß in dem Siebelement 6 zusätzlich Kanäle 12 ausgebildet sind, welche die Durchgangsbohrungen 8 miteinander verbinden. Wie in der Aufsicht in Fig. 4 zu erkennen sind, erstrecken sich die Kanäle 12 als lange Kanäle über die gesamte Länge des Siebelementes 6 und sind jeweils über kurze, im wesentlichen querverlaufende Verbindungskanäle 13 mit den angrenzenden Durchgangslöchern 8 verbunden. Die Kanäle 12 öffnen sich zur Seite des Siebelementes 6. Die Kanäle 12, 13 sind in der Oberfläche des Siebelementes 6 als Nuten bzw. Rinnen ausgebildet. Wenn die Oberfläche mit den Rinnen auf das Substrat 2 aufgelegt wird, werden durch die Rinnen gemeinsam mit der Substratoberfläche geschlossene Kanäle 12, 13 zwischen dem Siebelement 6 und dem Substrat 2 ausgebildet. Beim Zuführen der Lösung mit den Vesikeln 10 kann in den Durchgangslöchern 8 eine derartige Strömung erzeugt werden, daß die Lösung von der Oberseite her in die Durchgangslöcher 8 eintritt und dann durch die untere Öffnung der Durchgangslöcher 8 in die Verbindungskanäle 13 und die Kanäle 12 strömt und durch diese nach außen abgeleitet wird. Auf diese Weise werden die sich in der Lösung befindenden Vesikel 10 in die Durchgangslöcher 8 eingespült, wobei sie schnell auf die Mikroelemente 4 absinken, da die Lösung durch die Kanäle 12, 13 abgeführt wird. Die Kanäle 12 und insbesondere die Verbindungskanäle 13 weisen dabei einen Querschnitt auf, welcher kleiner als derjenige der Durchgangslöcher 8 und der Vesikel 10 ist, so daß die Vesikel 10 in den Durchgangslöchern 8 auf den Mikroelementen 4 zurückgehalten werden.
Fig. 5 und 6 zeigen im Querschnitt und in Draufsicht eine weitere Abwandlung der in Fig. 1 und 2 gezeigten Anorndung. Die Anordnung enspricht im wesentlichen der in Fig. 1 und 2 gezeigten Anordnung, mit dem Unterschied, daß zusätzliche Kanäle 14 an der Seite des Siebelementes 6 angeordnet sind, welche an der Oberfläche des Substrats bzw. Mikrokontaktarrays 2 anliegt. Im Unterschied zu der anhand von Fig. 3 und 4 erläuterten Ausführungsform sind die Kanäle 14 so angeordnet, daß sie ein kreuzförmiges bzw. schachbrettartiges Raster bilden, wobei die Durchgangsbohrungen 8 jeweils an den Kreuzungspunkten der Kanäle 14 liegen. Somit verbinden die Kanäle 14 immer benachbarte Löcher bzw. Poren 8 miteinander. Die Kanäle 14 sind als Rinnen bzw. Nuten in der Oberfläche des Siebelementes 6 ausgebildet. Diese Nuten bilden gemeinsam mit der Substratoberfläche die geschlossenen Kanäle 14. Ein solches Raster von Kanälen 14, welche zwischen dem Siebelement 6 und dem Substrat 2 gebildet werden, ermöglicht eine Führung für ein gerichtetes neuronales Wachstum von Vesikeln, insbesondere Nervenzellen 10, welche in den Durchgangsbohrungen 8 auf den Mikroelementen 4 angeordnet sind. Die Positionierung der Nervenzellen 10 erfolgt wie anhand der Fig. 1 bis 4 erläutert über die Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 6. Nach dieser Anordnung und Positionierung auf dem Substrat bzw. Mikrokontaktarray 2 kann sich in den Kanälen 14 ein gerichtetes neuronales Wachstum entwickeln. Auf diese Weise kann ein gerichtetes neuronales Netz auf einem Substrat 2 beispielsweise in Form eines Siliziumchips ausgebildet werden. Das gerichtete Wachstum in vorgegebenen Formen ist vorteilhalft, da die geometrischen Verhältnisse in neuronalen Netzen ein wichtiger Faktor für eine neuronale Informationsverarbeitung sind.
Fig. 7 zeigt die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Transportsieb. Hier ist ein Siebelement 16, welches in der grundsätzlichen Ausgestaltung dem zuvor erläuterten Siebelement 6 entspricht, am Ende einer Pipette 18 angeordnet. Durch die Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 16 können ein Fluid bzw. eine Lösung und darin befindliche Vesikel 10 angesaugt werden. Dabei werden Vesikel 10a, welche eine geringere Größe als die Durchgangslöcher 8 aufweisen, durch diese hindurch in die Pipette 18 hineingesaugt. Größere Vesikel 10b, welche eine Größe aufweisen, die größer als der Durchmesser der Durchgangslöcher 8 ist, bleiben an den Eintrittsöffnungen der Durchgangslöcher 8 hängen und werden an diesen positioniert und fixiert. Diese Fixierung erfolgt lediglich durch den von der Pipette in den Durchgangslöchern 8 erzeugten Sog. Wird dieser Sog bzw. Unterdruck aufgehoben, werden die Vesikel 10b wieder von dem Siebelement 16 gelöst und können genau positioniert abgesetzt werden. Die Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 16 sind derart ausgebildet, daß ihre Eintrittsbereiche 20 trichterförmig sind bzw. sich in Strömungsrichtung konisch verengen. Dies ermöglicht einen leichteren Eintritt der Vesikel 10a in die Durchgangslöcher 8. Ferner können die größeren Vesikel 10b in den trichterförmigen bzw. konischen Eintrittsbereichen der Durchgangslöcher 8 besser gehalten und positioniert werden, da sie in diesen erweiterten Bereich der Löcher 8 eintreten können.
Während in Fig. 7 schematisch das Ansaugen bzw. Aufnehmen der Vesikel 10a, 10b mittels einer Pipette 18 gezeigt ist, wird in Fig. 8 das Absetzen der Vesikel 10b mit der Pipette 18 gezeigt. Der Sog in der Pipette 18 wird aufgehoben bzw. umgekehrt, so daß ein Druck erzeugt wird, der die in der Pipette befindliche Lösung durch die Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 16 hinausdrückt. Dadurch werden die Vesikel 10b von dem Transportsieb bzw. Siebelement 16 gelöst. Das Siebelement 16 ist vorzugsweise derart ausgestaltet, daß es eine möglichst nichthaftende Oberfläche hat, so daß die Vesikel 10b lediglich durch einen Unterdruck in den Durchgangslöchern 8 gehalten werden und nicht an dem Siebelement 16 anhaften. Unter der Pipette 18 mit dem Siebelement 16 ist ein zweites Siebelement 6 auf einem Substrat 2 angeordnet. Dieses zweite Siebelement 6 entspricht im wesentlichen dem anhand der Fig. 1 bis 4 erläuterten Positioniersieb, weshalb auf eine detaillierte Beschreibung an dieser Stelle verzichtet wird. In Fig. 8 sind in dem Siebelement 6 Kanäle gezeigt, welche den Kanälen 12 und 14 in Fig. 3 und 5 entsprechen können. Alternativ kann jedoch auch eine Anordnung gemäß Fig. 1, d. h. ohne Kanäle verwendet werden. Die Eintrittsbereiche 24 der Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 6 sind ebenfalls trichterförmig ausgebildet, d. h. sie erweitern sich zur Außenseite des Siebelementes 6 hin, um ein leichteres Eintreten der Vesikel 10b zu ermöglichen. Somit können die Vesikel 10b auch dann noch genau durch das Siebelement 6 positioniert werden, wenn das Siebelement 16 mit der Pipette nicht exakt ausgerichtet über dem Siebelement 6 angeordnet wird, so daß die Durchgangslöcher 8 in dem Siebelement 16 leicht versetzt zu den Durchgangslöchern 8 in dem Siebelement 6 sind.
Fig. 9 zeigt eine Detailansicht eines Transportsiebes entsprechend Fig. 7. Dargestellt ist eine Pore 8 in dem Transportsieb 16. Im Unterschied zu Fig. 7 ist der trichterförmige Eintrittsbereich 20 der Pore 8 größer ausgebildet. Der Eintrittsbereich 20 ist so groß, daß ein Vesikel 10b vollständig darin aufgenommen kann. Die Pore bzw. das Durchgangsloch 8 weist einen Querschnitt auf, welcher geringer als der Querschnitt des Vesikels 10b ist. Wie anhand von Fig. 7 erläutert wird die Lösung mit den Vesikeln 10 über eine Pipette angesaugt, wobei die größeren Vesikel 10b vor den Durchgangslöchern 8 zurückgehalten werden und dabei durch Unterdruckk an den Löchern festgehalten werden. Der trichterförmige Eintrittsbereich 20 der Pore ist so groß ausgebildet, daß das Vesikel 10b, wenn es an dem Durchgangsloch 8 gehalten wird, mit Lösung, vorzugsweise Wasser 25 überdeckt ist. Das Vesikel 12b befindet sich somit in einer geschlossenen Wasserphase. Dadurch wird ein Transport des Vesikels 12b durch die Grenfläche von Lösung bzw. Wasser und Luft möglich, beispielsweise von einem Behälter in einen anderen, da verhindert werden kann, daß das Vesikel mit Luft in Kontakt kommt. Dasbei ist es wichtig das Verhältnis von Durchmesser zu Tiefe des trichterförmigen Eintrittsbereiches 20 so einzustellen, daß sich die Oberfläche der Lösung bzw. des Wassers 25 nicht so stark konkav nach innen wölbt, daß sie mit dem Vesikel 12b in Kontakt tritt. Diese Ausgestaltung der Durchgangslöcher wird vorzugsweise bei einem Transportsieb 16 gemäß Fig. 7 eingesetzt, kann aber auch in anderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Siebelementes 6, 16, 26 eingesetzt werden.
Fig. 10 zeigt einen weiteren Anwendungsfall für das erfindungsgemäße Siebelement. Hier wird ein Siebelement 26 als Fixiersieb zur Positionierung und zum Fixieren einzelner Vesikel 10 wie beispielsweise Zellen verwendet. Das Siebelement bzw. Fixiersieb 26 weist eine Vielzahl von Durchgangslöcher 28 auf, welche in regelmäßigen Abständen in Form eines Rasters angeordnet sind. Die oberen Öffnungsbereiche der Durchgangslöcher 18 sind vorzugsweise konisch erweitert, so daß sie einen trichterförmigen Eintrittsbereich bilden. Die Durchgangslöcher 28 weisen einen geringeren Durchmesser auf als die zu positionierenden und zu fixierenden Vesikel 10. Die Vesikel 10 werden vorzugsweise in einem Fluid bzw. einer Lösung auf das Fixiersieb 26 aufgebracht, so daß sie sich in den einzelnen Durchgangsbohrungen 28 verteilen. Auf diese Weise wird vorzugsweise in jeder Durchgangsbohrung 28 ein Vesikel 10 derart angeordnet, daß es in dem trichterförmigen Eintrittsbereich eines Durchgangsloches 28 zu liegen kommt, aber nicht weiter in das Durchgangsloch 28 eintreten kann. Anschließend können die Vesikel 10 beispielsweise durch Unterdruck, welcher in den Durchgangslöchern 28 erzeugt wird, auf dem Fixiersieb 26 fixiert werden. Dabei sind die Vesikel 10 genau positioniert, da sie in den Eintrittsbereichen der Durchgangslöcher 28 liegen, welche in genau definierten Positionen in dem Fixiersieb 26 angeordnet sind.
Anschließend können Bearbeitungen oder Manipulationen der positionierten Vesikel 10 beispielsweise mittels einer Mikroelektrode 30 zur Injektion erfolgen. Dadurch, daß die Position der Vesikel 10 über die Durchgangslöcher 28 genau vorgegeben ist, kann auf eine Positionserfassung der Vesikel 10 zur Steuerung eines Mikromanipulators bzw. einer Mikroelektrode verzichtet werden, da zu deren Ansteuerung als Zielkoordinaten lediglich die Lochmittelpunkte der Durchgangslöcher 28 dienen können. Eine solche Anordnung kann insbesondere im Bereich einer intrazellulären Masseninjektion verwendet werden. Dabei kann auf eine einzelne Anordnung und Positionierung bzw. Fixierung der Vesikel 10 verzichtet werden, da durch die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren sehr leicht eine große Anzahl von Vesikeln 10 in vorgegebenen Positionen angeordnet werden können.
Allen diskutierten Anwendungsfällen ist gemeinsam, daß durch das erfindungsgemäße Siebelement eine sehr große Anzahl von Vesikeln sehr leicht an vorgegebenen Positionen angeordnet werden kann. Die Vesikel werden einfach in einer Lösung auf das Siebelement aufgebracht. Dabei ordnen sie sich selbsttätig bzw. automatisch in den Poren in dem Siebelement an, welche definierte Positionen für die Vesikel vorgeben. Bezugszeichenliste 2 Substrat, Mikrokontaktarray
4 Mikroelemente
6 Siebelement, Positioniersieb
8 Durchgangslöcher
10, 10a, 10b Vesikel
12, 13, 14 Kanäle
16 Siebelement, Transportsieb
18 Pipette
20, 24 Eintrittsbereich
25 Lösung
26 Siebelement, Fixiersieb
28 Durchgangsloch
30 Mikroelektrode

Claims

1. Vorrichtung zur Manipulation, insbesondere zum Positionieren, Selektieren, Transportieren und/oder Fixieren von Vesikeln (10) mit einem Siebelement (6; 16; 26) mit einer Vielzahl von Poren (8; 28) zum Aufnehmen oder Rückhalten von vorzugsweise jeweils einem einzelnen Vesikel (10), wobei die Poren (8; 28) einen vorbestimmten Querschnitt aufweisen und in vorbestimmten Abständen zueinander angeordnet sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher das Siebelement (6; 16; 26) als flache Scheibe, vorzugsweise aus Silizium oder Siliziumoxid ausgebildet ist und die Poren in Form von Durchgangslöchern (8; 28) ausgebildet sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, bei welcher die Durchgangslöcher (8; 28) zylindrisch, vorzugsweise kreiszylindrisch ausgebildet sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei welcher sich die Durchgangslöcher (8; 28) zu einer Seite der Scheibe trichterförmig erweitern.

5. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher auf einer Seite des Siebelementes (6) zwischen benachbarten Poren Kanäle (12, 13; 14) ausgebildet sind, weiche die Poren (8) miteinander verbinden.

6. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Teile des Siebelementes (6; 16; 26), die mit Vesikeln (10) in Kontakt kommen, und insbesondere die Poren (8; 28) passiv ausgebildet sind, so daß sie keine Anhaftpunkte für Vesikel (10) aufweisen.

7. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher an dem Siebelement (6; 16; 26) optische und/oder mechanische Positionierhilfen ausgebildet sind.

8. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüchen, bei welcher das Siebelement (16) an einer Pipette (18) angebracht ist.

9. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche zum Manipulieren, insbesondere zum Positionieren, Selektieren, Transportieren und/oder Fixieren von Vesikeln (10).

10. Verwendung nach Anspruch 9, bei welcher die Anordnung der Poren (8) des Siebelementes (6) einem Raster von Mikroelementen (4) eines Mikrokontaktarrays (2) entspricht und das Siebelement (6) verwendet wird, um einzelne Vesikel (10) an den Mikroelementen (4) zu positionieren.

11. Verfahren zur Manipulation, insbesondere zum Positionieren, Selektieren, Transportieren und/oder Fixieren von Vesikeln (10), bei welchem die Vesikel (10) in einer Lösung auf ein Siebelement (6; 16; 26) aufgebracht werden, in dem Poren (8; 28) zur Aufnahme vorzugsweise einzelner Vesikel (10) ausgebildet sind, wobei die einzelnen Poren (8; 28) eine vorbestimmte Größe und Position in dem Siebelement (6; 16; 26) aufweisen und die Vesikel (10) in den Poren (8; 28) abgelagert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem die Poren (8) als Durchgangslöcher ausgebildet sind und jeweils einen Querschnitt aufweisen, welcher im wesentlichen der Größe der zu manipulierenden bzw. zu positionierenden Vesikel (10) entspricht.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei welchem
die Poren (8) des Siebelementes (6) derart voneinander beabstandet angeordnet sind, daß die Anordnung der Poren (8) einer gewünschten Anordnung von Anbringungspunkten (4) der Vesikel (10) auf einem Substrat (2) entspricht,
das Siebelement (6) derart auf dem Substrat (2) positioniert wird, daß die Poren (8) zu den gewünschten Anbringungspunkten (4) ausgerichtet sind, und eine Lösung mit den Vesikeln (10) auf das Siebelement (6) aufgebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei welchem das Substrat (2) ein Mikrokontaktarray ist und die Anbringungspunkte Mikroelemente (4) sind, entsprechend denen die Vesikel (10) positioniert werden.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei welchem das Siebelement (6) an dem Substrat (2) durch Adhäsion vorzugsweise lösbar fixiert wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, bei welcher an dem Siebelement (6) zwischen den Poren (8) ausgebildete Kanäle (12, 13; 14) an dem Substrat (2) zur Anlage gebracht werden und durch die Kanäle (12, 13; 14) die Lösung abgeführt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, bei welchem Nervenzellen als Vesikel in den Poren (8) angeordnet werden, welche in Kanälen (14), die zwischen den Poren (8) in dem Siebelement (6) angeordnet sind, ein neuronales Wachstum ausbilden.

18. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem die Poren (8; 28) eine Größe aufweisen, welche geringer als die Größe der zu manipulierenden oder zu positionierenden Vesikel (10) ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem das Siebelement (16) an einer Pipette (18) angeordnet wird und durch die Pipette (18) eine Lösung mit Vesikeln (10) aufgenommen wird, wobei Vesikel (10) mit einer vorgegebenen Mindestgröße an den Poren (8) des Siebelementes (16) fixiert werden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem die Poren (8) in einem vorbestimmten Raster angeordnet sind, welches einer Anordnung von Poren (8) an einem zweiten Siebelement (6) entspricht, wobei die Poren (8) in dem zweiten Siebelement (6) größer sind als die Poren (8) in dem ersten Siebelement (16).

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, bei welchem die Poren (28) als Durchgangslöcher ausgebildet sind, deren eines Ende sich jeweils konisch erweitert und welche einen Querschnitt aufweisen, welcher kleiner ist als die zu positionierenden Vesikel (10), und die Vesikel (10) im Bereich der konischen Erweiterung positioniert und vorzugsweise durch Unterdruck an den Durchgangslöchern (28) fixiert werden.