DE10065631A1 - Nachweis von Nukleinsäure- Polymorphismen - Google Patents

Abstract

Es werden Verfahren auf Einzelmolekülebene funktionierende Verfahren zur Charakterisierung von Nukleotidpolymorphismen beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von ein­ zelnen oder multiplen Nukleinsäurepolymorphismen durch Detektion einzel­ ner fluoreszenzmarkierter Desoxyribonucleinsäuremoleküle.

Zwischen den Genomen der Individuen einer Spezies gibt es Sequenzab­ weichungen durch Nukleinsäure-Insertionen und Deletionen, Unterschiede in der Zahl der Wiederholungen kurzer, wiederkehrender Sequenzmotive (sogenannte Mikrosatelliten und Minisatelliten) und Abweichungen bei ein­ zelnen Basenpaaren, die als Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, engl. single nucleotide polymorphisms) bezeichnet werden und mit etwa einem Basenpaar pro 1000 Basenpaaren beim Menschen (siehe WO 00/18960) am häufigsten vorkommen.

Solche Variationen im Genom können in vielen Fällen mit dem Auftreten erblicher Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Klassische Bei­ spiele sind Huntington, cystische Fibrose, Duchenne muskuläre Dystrophie und bestimmte Formen von Brustkrebs (siehe WO 00/18960). In jüngerer Zeit wurden auch Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson mit einzelnen Mutationen auf molekularer Ebene in Verbindung gebracht.

In der Regel handelt es sich bei diesen Mutationen um Einzelnukleotid­ polymorphismen (SNPs). Am Auffinden neuer Positionen im Genom, an de­ nen SNPs auftreten, besteht daher ein erhebliches Interesse der medizini­ schen Forschung. An der Untersuchung von SNPs, deren Position im Ge­ nom auf das Nukleotid genau bekannt ist, besteht dagegen vor allem ein Interesse für die Diagnostik von molekular bedingten Krankheiten.

Eine Reihe von Verfahren zur routinemäßigen Untersuchung solcher SNPs an bekannter Position im Genom sind daher in den vergangenen Jahren entwickelt worden.

So wurden durch photolitographische Synthese miniaturisierte Oligonukleo­ tidarrays hoher Dichte hergestellt. Auf diesen Arrays existiert für jedes mögliche Allel eine komplementäre Sonde. Mit Prototypen solcher Chips zur Genotypisierung können bis zu 3000 SNPs gleichzeitig untersucht werden (Sapolsky et al. Genet. Anal., 1999, 14: 187-192).

Ein ähnliches Verfahren, das ebenfalls auf der Hybridisierung des zu unter­ suchenden Allels mit einer komplementären Oligonukleotidsonde basiert, wurde von Axys Pharmaceuticals entwickelt. Dieses Verfahren verwendet Oligonukleotidsonden, die an fluoreszenzmarkierte Mikrokügelchen gekop­ pelt sind. Diese Sonden werden direkt mit ebenfalls fluoreszenzmarkierten Polymerasekettenreaktions(PCR)-Produkten hybridisiert. Die Detektion erfolgt dann in einem üblichen Durchflußzytometer. Auf diese Weise konn­ ten bis zu acht polymorphe Gene gleichzeitig untersucht werden (Arm­ strong et al. Cytometry, 2000, 40: 102-108).

Während bei diesen Verfahren die Hybridisierung nach einem möglichen DNA-Amplifikationsschritt mit PCR erfolgt, gehen See et al. den umgekehr­ ten Weg. Ihr Verfahren verwendet Primer mit verschiedenen Fluorophoren an den 5'-Nukleotiden, deren 3'-Ende bei dem zu untersuchenden Nukleotid liegt. Nur mit dem Primer, der auch am 3'-Ende zu dem zu untersuchenden Nukleotid komplementär ist, entsteht ein PCR-Produkt. Die Proben werden dann durch Elektrophorese nach Größe und Fluoreszenz analysiert (See et al. Biotechniques, 2000, 28: 710-714).

Ein sehr elegantes Verfahren zur Charakterisierung von SNPs verwendet keine komplette PCR, sondern lediglich die Verlängerung eines Primers um ein einzelnes, fluoreszenzmarkiertes Didesoxyribonucleinsäuremolekül (ddNT'P), das zu dem zu untersuchenden Nukleotid komplementär ist. Durch Detektion des um eine Base verlängerten und damit fluoreszenz­ markierten Primers läßt sich auf das Nukleotid an der polymorphen Stelle schließen (Kobayashi et al. Mol. Cell. Probes, 1995, 9: 175-182). Ein Nach­ teil dieses Verfahrens ist allerdings, dass in einer Reaktion immer nur ein einzelner Polymorphismus untersucht werden kann.

Eine mögliche Lösung dieses Problems besteht im Einbau einer als ZipCode bezeichneten eindeutig identifizierbaren Sequenz in den Primer. Dieser ZipCode wird von einem komplementären ZipCode (dem cZipCode) erkannt, der kovalent an ein fluoreszierendes Mikrokügelchen gebunden ist. Die Mikrokügelchendecodierung und SNP-Typisierung erfolgt dann in einem üb­ lichen Durchflußzytometer. Das ZipCode System erlaubt die Analyse einer großen Zahl von SNPs mit einer begrenzten Menge an ZipCode gekoppelten Mikrokügelchen (Chen et al. Genome Res., 2000, 10: 549-557).

Die beiden letztgenannten Verfahren, die auf der Verlängerung eines Pri­ mers mit einem fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotid aufbauen, besit­ zen einen wesentlichen Vorteil: Fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide, die für hohe Fluoreszenzausbeute und für den Einbau in DNA durch natür­ lich vorkommende oder genetisch veränderte Polymerasen optimiert sind, sind wegen ihrer Verwendung für die Sangersche Methode der DNA-Se­ quenzierung durch Kettenabbruch (Sanger et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463) preisgünstig verfügbar.

Ebenso wie die übrigen Verfahren sind aber auch die beiden letztgenannten Verfahren, die auf der Verlängerung eines Primers mit einem fluoreszenz­ markierten Didesoxynukleotid aufbauen, in der Durchführung aufwendig.

Bei dem weiter oben erläuterten Verfahren ohne ZipCode ist es zur Erzie­ lung eines klaren Signals erforderlich, die Probe vor dem Auftrag auf ein de­ naturierendes Gel vorzureinigen. Zur Abtrennung des Überschusses an nicht in den Primer eingebauten Didesoxynukleotid wird empfohlen, die Probe mit alkalischer Phosphatase zu behandeln und den Primer anschlie­ ßend mit Isopropanol zu fällen. Besonders der Fällungsschritt läßt sich schlecht automatisieren.

Bei dem Verfahren mit ZipCode entfallen die handarbeitsintensiven Arbeits­ schritte, dafür ist aber ein technisch aufwendiges Durchflußzytometer, das einen großen Wellenlängenbereich abdeckt, erforderlich. Außerdem besteht die Gefahr, Signale falsch zu interpretieren, weil sich die Spektren der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe zumindest teilweise überschneiden.

Außerdem besteht bei der Verwendung von DNA von Spendern, die zwei verschiedene Allele des zu untersuchenden polymorphen DNA-Abschnitts besitzen, die Schwierigkeit, dass die beiden Allele entweder zunächst einzeln isoliert oder selektiv amplifiziert werden müssen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen bereitzustellen, die diese Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize,
• b) Anlagern von mindestens einem Startprimer an die Nukleinsäure­ matrize, wobei das 3'-Ende des Primers stromaufwärts eines zu untersuchenden Nukleinsäurepolymorphismus liegt,
• c) Verlängern des Startprimers mit mindestens einem fluoreszenzmar­ kierten Nukleotid und
• d) Nachweisen von in den Startprimer eingebauten Nukleotiden durch Einzelmolekülbestimmung.

Bei dem Nukleinsäurepolymorphismus handelt es sich im einfachsten Fall um einen Einzelnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP). Der Polymorphismus kann aber auch mehrere Nukleotide, zum Bei­ spiel bis zu 20 aufeinanderfolgende Nukleotide oder sogar mehrere Grup­ pen aus einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden betreffen.

Als Nukleinsäurematrize kann DNA beliebiger Herkunft, beipielsweise von Prokaryonten, insbesondere pathogenen Prokaryonten, Archaeaen oder Eu­ karyonten, insbesondere Säugetieren, insbesondere Mensch verwendet werden. Es kann sich aber auch um rekombinant hergestellte DNA oder um synthetische DNA handeln. Die DNA wird bevorzugt in einzelsträngiger Form verwendet. Solche DNA kann beispielsweise durch reverse Trans­ kription eines RNA-Moleküls durch eine Reverse Transkriptase, etwa die Reverse Transkriptase von AMV (Avian Myeloblastosis Virus) oder MMLV (Moloney Murine Leucaemia Virus) hergestellt werden. Es ist aber auch möglich, doppelsträngige DNA, etwa genomische DNA, DNA eines Plas­ mids oder eines episomalen genetischen Elements durch Erhitzen in einzel­ strängige DNA aufzutrennen, gegebenenfalls einen Strang aufzureinigen oder anzureichern, und dann den Primer annealen zu lassen. Bei der RNA oder DNA handelt es sich bevorzugt um eine möglichst homogene Mi­ schung. Da der Startprimer aber Spezifität für die zu untersuchende DNA besitzt, kann auch mit heterogenen Gemischen gearbeitet werden.

Der Startprimer besteht bevorzugt aus einzelsträngiger DNA. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, mit RNA-Molekülen zu arbeiten. Der Startprimer kann auch ein Nukleinsäureanalog, zum Beispiel eine Peptid­ nukleinsäure sein, wobei das Phosphat-Zucker-Rückgrat der Nukleinsäuren ersetzt wird durch ein peptidartiges Rückgrat, beispielsweise bestehend aus 2-Aminoethylenglycin (Nielsen et al., Science, 254: 1497-1500) als Träger der einzelnen Basen A, T, G, C. Ein solcher Peptidnukleinsäureprimer muss ein 3'-Ende besitzen, das eine Elongation zulässt.

Bevorzugt bindet der Startprimer unmittelbar stromaufwärts des zu charak­ terisierenden SNPs. Falls mit Desoxynukleotiden und nicht mit Kettenab­ bruchmolekülen gearbeitet wird, ist es aber auch möglich, einen Startprimer zu verwenden, der weiter stromaufwärts, vorzugsweise nicht mehr als 5 Nukleotide stromaufwärts von der zu untersuchenden Polymorphismus­ stelle bindet.

Das fluoreszenzmarkierte Nukleotid kann sowohl ein Desoxynukleotid als auch ein Kettenabbruchmolekül sein. Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus den bekannten zur Markierung von Biopolymeren, z. B. Nuklein­ säuren, verwendeten Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluores­ cein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. ausge­ wählt werden. Die Unterscheidung der Farbstoffe kann über die Wellenlän­ ge, über die Lebensdauer der angeregten Zustände oder über eine Kom­ bination davon erfolgen.

Falls mehrere, mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen versehene Nukleotide verwendet werden, können diese durch die Wellenlänge des anregenden Lichts, des emittierten Lichts oder eine Kombination daraus unterschieden werden. Eine Unterscheidung der Fluorezenzfarbstoffe kann auch durch eine Messung der Lebensdauer des angeregten Zustands erfol­ gen. Es bietet sich an, die Verfahren zu kombinieren. So können beispiels­ weise vier Fluoreszenzmarkierungen für die vier verschiedenen Basen ausge­ wählt werden, die alle bei der gleichen Wellenlänge angeregt werden können, und die bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, wobei sich für die Markierungen, deren Emissionswellenlänge gleich ist, die Le­ bensdauern der angeregten Zustände unterscheiden.

Die Verlängerung des Primers kann mit Methoden der Nukleinsäurechemie, die aus der Oligonukleotidsynthese bekannt sind, erfolgen. Bevorzugt erfolgt die Verlängerungsreaktion aber durch enzymatische Katalyse. Die Polymerase wird abhängig davon gewählt, ob als Matrize RNA oder DNA verwendet wird. Bevorzugt wird eine Polymerase ohne Exonukleaseaktivität ausgewählt. Beispiele für mögliche Polymerasen sind T7-Polymerase oder thermostabile Polymerasen wie Taq, Pfu, Pwo und Ähnliche, die üblicher­ weise für PCR-Reaktionen Verwendung finden.

Der Nachweis der Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls kann mit einer beliebigen Messmethode, z. B. mit orts- oder/und zeitaufgelöster Fluores­ zenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement, wie es in einem Mikrokanal vorliegt, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.

Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetek­ tion, wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise ein konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 × 10^-15 bis 20 × 10^-12 l der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Fluores­ zenzmarkierungen zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Foto­ detektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindig­ keit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994), 259-264) beschrieben.

Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomena", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend - vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von ≧ 100 ps - das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kann die Bestimmung auch die Messung eines kreuzkorrellierten Signals umfassen, das von mindestens einem, 2 unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden Nukleinsäuremolekül oder Nukleinsäuremolekül-Komplex stammt, wobei mehrere markierte Nukleotide, Primer oder/und Nukleinsäurematrizen mit jeweils unterschiedlichen Markierungen eingesetzt werden können. Diese Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwille et. al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878-1886) und Rigler et. al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97-109) beschrieben.

Der Nachweis von eingebauten Nukleotiden umfaßt bevorzugt eine Separa­ tion des verlängerten Startprimers von nicht eingebauten Nukleotiden.

Die Trennung kann beispielsweise wie in der Patentanmeldung DE 102 23 423.2 beschrieben aufgrund der unterschiedlichen Wanderungs­ geschwindigkeit eingebauter und nicht eingebauter Nukleotide im elek­ trischen Feld erfolgen. Auf diese Weise können typischerweise Anreiche­ rungen um drei Zehnerpotenzen oder mehr erreicht werden.

Falls der Primer oder die Nukleinsäurematrize an einem Trägerpartikel immobilisiert ist, kann dieses Partikel beispielsweise mit Hilfe eines In­ frarotlasers eingefangen werden. Anschließend kann dann ein Waschschritt in einem gerichteten Fluss, der elektroosmotisch oder hydrodynamisch sein kann, erfolgen. Wegen des günstigeren Flussprofils und der höheren Fluss­ raten wird hydrodynamischer Fluss bevorzugt.

Es ist möglich, bei der Detektion zusätzlich zu prüfen, ob tatsächlich einge­ baute Nukleotide beobachtet werden, oder ob noch kontaminierende, freie Nukleotide vorhanden sind. Dies ist zum Beispiel durch Fluoreszenzkorrela­ tionsspektroskopie möglich. Bei diesem Verfahren nutzt man aus, das der verlängerte Startprimer wesentlich langsamer diffundiert als die freien Kettenabbruchmoleküle und daher länger in dem von einem konfokalen Mikroskop beleuchteten Bereich verweilt, so dass emittiertes Fluoreszenz­ licht vom verlängerten Startprimer eine wesentliche längere Korrelationszeit besitzt als Fluoreszenzlicht von einem freien Kettenabbruchmolekül. Für die Messung der diffusionsbegrenzten Korrelationszeit genügen technisch wenig aufwendige Korrelatoren, da die Korrelationszeiten im Bereich von ms bis einigen 100 ms liegen.

Eine weitere Möglichkeit zur optischen Unterscheidung von eingebauten und nicht eingebauten Kettenmolekülen liegt in der Ausnutzung von Ener­ gietransferprozessen. So wurde beispielsweise von Edman et al (Edman, L., Mets, Ü. und Rigler, R., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, 6710-6715 (1996)) gezeigt, dass die Lebensdauer eines angeregten Zustands von Tetramethyl­ rhodamin durch große räumliche Nähe drastisch verkürzt wird, die bei hoher Verdünnung des Kettenabbruchmoleküls nur dann eintritt, wenn das Molekül tatsächlich kovalent mit dem Startprimer verbunden wurde.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es aber auch möglich, die eingebauten Nukleotide beispielsweise durch eine Exonuklease wieder abzudauen und einzeln nachzuweisen. In diesem Fall erfolgt eine zumindest teilweise Sequenzbestimmung des verlängerten Startprimers. Dabei können Verfahren verwendet werden, wie sie in der Patentanmel­ dung DE 100 31 840.1 und in der Publikation Dörre et al., Bioimaging 5, 139-152 beschrieben sind.

Für die Durchführung der Sequenzierungsreaktion wird die Nukleinsäure­ matrix oder stärker bevorzugt der Startprimer an ein Trägerpartikel gekop­ pelt.

Die Einzelmolekülsequenzbestimmung umfasst vorzugsweise die Schritte:

• a) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, um­ fassend einen Mikrokanal,
• b) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
• c) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,
• d) zumindest teilweises Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäure­ moleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbaustei­ ne.

Die Detektion und Manipulation beladener Trägerpartikel kann beispiels­ weise nach den in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue µTAS 96, 85-87), Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5740-5747) oder Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) beschriebenen Methoden erfolgen, die eine Detektion mit einem konfokalen Mikroskop beinhalten. Die Manipulation der beladenen Trägerpartikel in Mikrokanalstrukturen erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines Einfanglasers, z. B. eines Infrarotlasers. Geeignete Methoden sind zum Beispiel von Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31) und Chu (Science 253 (1991), 861-866) beschrieben.

Vorzugsweise erfolgt das Festhalten des Trägerpartikels durch einen auto­ matisierten Prozess. Hierzu werden die Trägerpartikel im hydrodynamischen Fluss durch den Mikrokanal geleitet, wobei sie ein Detektionselement passieren. Der Detektor im Detektionsfenster wird so eingestellt, dass er eine markierte Kugel aufgrund der darauf befindlichen fluoreszenzmarkier­ ten DNA und/oder einer zusätzlichen fluoreszenzmarkierten Sonde erkennt, und daraufhin automatisch das Aktivieren des Einfanglasers im Messraum bewirkt.

Zur Abspaltung einzelner Nukleotide von dem verlängerten Startprimer­ molekül wird eine Exonuklease verwendet, zum Beispiel T7-DNA-Polyme­ rase als Exonuklease, E. coli Exonuklease I oder E. coli Exonuklease III.

Im einfachsten Fall wird nur ein einziger Startprimer für die Verlängerungs­ reaktion eingesetzt. Es ist aber auch möglich, mehrere, an verschiedenen Stellen an die Matrize bindende Startprimer einzusetzen und zu verlängern. Die Startprimer sind dann bevorzugt unterschiedlich kodiert, beispielsweise durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen oder durch unterschied­ liche Kombinationen von Fluoreszenzmarkierungen. Insbesondere können zur Identifikation des Startprimers fluoreszenzmarkierte dNTPs in den Start­ primer eingebaut werden. Wenn für jedes Nukleotid eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung verwendet wird, lassen sich mit n fluoreszenzmar­ kierten Positionen 4ⁿ verschiedene Startprimer unterscheiden. Eine noch größere Zahl ergibt sich, wenn an verschiedenen Positionen für das gleiche Nukleotid unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Analoga eingesetzt wer­ den.

Gemäß einer ersten Ausführungsform erfolgt die Verlängerungsreaktion durch Anfügen eines einzelnen, fluoreszenzmarkierten Kettenabbruchmole­ küls an den oder die Startprimer (siehe Abb. 1a für ein Beispiel). Als Kettenabbruchmoleküle werden bevorzugt die Didesoxynukleotide ver­ wendet. Es ist aber auch möglich, anders modifizierte Desoxyribonuklein­ säuren zu verwenden, sofern diese noch von den verwendeten Enzymen erkannt werden. Denkbar ist beispielsweise, die 3'-Position des Desox­ yribosemoleküls durch ein Halogenatom oder einen Alkyl- oder Alkoxyrest zu modifizieren.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können mehrere hintereinander liegende Nukleotide charakterisiert werden. In diesem Fall wird die Beendigung der Verlängerungsreaktion nicht durch den Einbau eines geeigneten Kettenabbruchmoleküls, sondern durch einen Blockprimer erzwungen (siehe Abb. 1b für ein Beispiel). Der Block­ primer ist stromabwärts des zu untersuchenden Polymorphismus an die Nukleinsäurematrize gebunden und ist selbst gegen Verlängerung an sei­ nem 3'-Ende durch geeignete chemische Modifikation geschützt. Beispiels­ weise kann das am weitesten stromabwärts gelegene Nukleotid des Block­ primers ein Kettenabbruchmolekül sein. Auch bei dieser Ausführungsform ist es möglich, mehrere unterschiedlich kodierte Start/Blockprimerpaare, die an verschiedenen Stellen an die Matrize binden können, einzusetzen (siehe Abb. 1c für ein Beispiel).

Die Blockierung der Blockprimer kann, gegebenfalls mit Ausnahme der Blockierung des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers, reversibel sein. Zur reversiblen Blockierung kann eine abspaltbare Schutz­ gruppe, beispielsweise eine photolabile Schutzgruppe verwendet werden. Besonders bevorzugt tragen die Blockprimer am 3'-Ende eine Phosphat­ gruppe an der 3'-Position des Zuckers. Diese Phosphatgruppe am 3'-Ende verhindert die Elongation durch Polymerase und kann zur Deblockierung ohne weiteres mit einer 3'-Phosphatase abgespalten werden.

Nach der Verlängerungsreaktion des Startprimers besteht noch keine kova­ lente Bindung zum unmittelbar stromabwärts liegenden Blockprimer. Diese Bindung kann aber geknüpft werden, zum Beispiel enzymatisch mit einer Ligase. Die Ligation läuft wesentlich leichter ab, wenn die Blockprimer an ihrem 5'-Ende eine Phosphatgruppe tragen.

Gemäß einer dritten Ausführungsform kann/können die Lücke(n) zwischen Paaren aus einem durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimer und dem jeweils stromabwärts liegenden Blockprimer nach Entfernung der 3'-Blockierung der Blockprimer durch Desoxyribonukleotide aufgefüllt werden und kovalente Bindungen zwischen den verlängerten Blockprimern und den unmittelbar stromabwärts liegenden Startprimern geschlossen werden (siehe Abb. 1d für ein Beispiel). Dazu tragen die Blockprimer bevorzugt ein 5'-Phosphat. Bei dieser Ausführungsform ist es nicht unbe­ dingt erforderlich, die verschiedenen Start/Blockprimerpaare mit Kodierun­ gen zu versehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Kombination der Ketten­ abbruchmarkierung mit einem Nachweis in vollständig oder teilweise trans­ parenten Mikrowells (siehe Patentanmeldung DE 100 23 421.6). Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, bestehend aus einer einzelsträngigen Nuklein­ säurematrize und einem Startprimer,
• b) Verlängern des Startprimers durch ein fluoreszenzmarkiertes Ketten­ abbruchmolekül,
• c) gegebenenfalls Waschen des Wells zur Abtrennung von nicht einge­ bauten Markierungen und
• d) Nachweisen der in den Startprimer eingebauten Fluoreszenzmarkie­ rung.

Je nach Anordnung der die Fluoreszenz anregenden Lichtquelle und des Detektors ist die Verwendung ganz oder teilweise transparenter Mikrowells erforderlich. Die Anregung oder/und der Nachweis der Fluoreszenz kann beispielsweise durch einen in den Mikrowell integrierten Halbleiterlaser oder/und Halbleiterdetektor erfolgen (siehe Abb. 2 für ein Beispiel). Die Anregungslichtquelle oder/und der Detektor können aber auch außer­ halb der Mikrostruktur liegen. Das Verfahren eignet sich hervorragend zur Automatisierung, da eine Vielzahl von Reaktionen auf einer Mikrowellplatte parallel oder sequenziell durchgeführt werden können.

Falls die Menge an Startprimer und die Menge an eingesetztem markiertem Nukleotid gering (nM) gehalten wird, kann die Unterscheidung von einge­ bauten und nicht eingebauten Kettenabbruchmolekülen beispielsweise durch FCS (Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie) wie weiter oben erläutert erfolgen. Alternativ können, wie ebenfalls oben erläutert, Energietrans­ ferprozesse ausgenützt werden.

Alternativ und bevorzugt werden höhere, z. B. µM Konzentrationen an Primer und Kettenabbruchmolekülen eingesetzt, weil die Inkubationszeit dann geringer gehalten werden kann. Zumindest die Kettenabbruchmole­ küle müssen dann allerdings nach der Primerverlängerungsreaktion durch einen Waschschritt wieder entfernt werden. Dazu können Mikrowells mit einem oder mehreren kleinen Löchern oder einer Größenausschlussmem­ bran verwendet werden, welche die markierte, an ein Trägerpartikel gebun­ dene DNA zurückhalten und die unmarkierten Kettenabbruchmoleküle durchlassen (siehe z. B. Abb. 2).

Verschiedene Kombinationen von Startprimern und Kettenabbruchmolekü­ len sind denkbar. Im einfachsten Fall werden für die Charakterisierung eines SNPs zwei oder mehr (bis zu vier) Wells mit nur jeweils einem fluoreszenz­ markiertes Kettenabbruchmolekül und dem Startprimer, dessen 3'-Ende unmittelbar vor dem zu untersuchenden Nukleotid hybridisiert, beladen. Nur in einem der Wells kommt es zu einer Elongationsreaktion. Da bekannt ist, welcher Well welches Kettenabbruchmolekül enthält, kann für alle Ketten­ abbruchmoleküle die gleiche Fluoreszenzmarkierung verwendet werden. Da die Verlängerungsreaktion abbricht, wenn nicht das richtige Nukleotid für die Verlängerung vorhanden ist, können in diesem Fall auch Desoxynukleo­ tide verwendet werden. Bevorzugt wird aber ein Kettenabbruchmolekül wie zuvor beschrieben, zum Beispiel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP und ddGTP zur Verfügung gestellt. Bevor­ zugt wird eine Festphase mit einer Vielzahl von Wells wie beispielsweise in Patentanmeldung DE 100 23 421.6 beschrieben verwendet. In einem einzigen Ansatz können auf diese Weise eine Vielzahl von SNPs parallel untersucht werden. Vorzugsweise erfolgt hier eine parallele Detektion von jeweils 4 Wells.

Es ist aber auch möglich, einen Startprimer zusammen mit mehreren, vorzugsweise vier verschiedenen Kettenabbruchmolekülen entsprechend den vier Nukleobasen einzusetzen. Die Kettenabbruchmoleküle müssen dann allerdings verschiedene Markierungsgruppen tragen. Eine Unterschei­ dung der Markierungsgruppen ist über die Wellenlänge des anregenden und/oder emittierten Lichts oder über die Lebensdauer des angeregten Zustands möglich. Die Messung der Lebensdauer des angeregten Zustands erfolgt durch Messung der Fluoreszenzabklingzeit (FD, fluorescence decay). Bei dieser Messmethode wird das zu untersuchende Molekül durch einen gepulsten Laser (z. B. einen mode locked laser) angeregt. Die Detektion der emittierten Fluoreszenzphotonen erfolgt als Funktion der Zeit seit dem Abklingen des Laserpulses, dessen zeitliche Dauer klein gegenüber der zeitlichen Lebensdauer des zu untersuchenden angeregten Zustands sein muss.

In speziellen Fällen ist es möglich, mit mehreren Startprimern und mehreren Kettenabbruchmolekülen im einem Well zu arbeiten. Ist beispielsweise von einem SNP bekannt, dass nur eine der Basen A oder T zu erwarten ist, und ist von einem weiteren SNP bekannt, dass nur entweder G oder C auf­ treten, so können die beiden Polymorphismen parallel untersucht werden. Weitere Situationen, in denen aufgrund zusätzlicher Information über die Polymorphismen mehrere Nukleotidpositionen gleichzeitig untersucht wer­ den können, sind für den Fachmann leicht ersichtlich.

Mit noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können auch mehrere SNPs gleichzeitig untersucht werden, selbst wenn an den Polymorphismusstellen mit dem Auftreten aller vier Nukleotide ge­ rechnet werden muss. Dazu wird für jede Polymorphismusstelle ein Start­ primer eingesetzt, dessen 3'-Ende unmittelbar stromaufwärts von dem jeweils zu charakterisierenden Nukleotid liegt. Anschließend erfolgt die Verlängerungsreaktion mit den markierten Kettenabbruchmolekülen. In einem weiteren Schritt werden dann zu ausgewählten Restriktionsschnitt­ stellen komplementäre Startprimer zugegeben, so dass ein Verdau der Nukleinsäurematrix in Fragmente charakteristischer Länge erfolgen kann. Durch Untersuchung des Diffusionsverhaltens der Fragmente mittels FCS können die Fluoreszenzsignale dann den einzelnen polymorphen Nuklein­ säurepositionen zugeordnet werden.

Ein prinzipiell analoges Vorgehen ist möglich, wenn statt der Restriktase eine sequenzspezifische Ligase verwendet wird. Sequenzspezifische Liga­ tion läßt sich beispielsweise durch "rückwärts" betriebene Restriktasen er­ reichen. Da die Hydrolysereaktion ein Molekül Wasser verbraucht und die Ligationsreaktion ein Molekül Wasser freisetzt, läßt sich das Gleichgewicht in Richtung der Ligation verschieben, indem man ein möglichst wasser­ freies Reaktionsmedium verwendet. Im analogen Fall von Proteasen wurde "Rückwärtsbetrieb" des Enzyms erfolgreich realisiert durch den Zusatz großer Mengen von Polyethylenglycol oder organischen Lösungsmitteln zum Reaktionspuffer.

Für alle beschriebenen Ausführungsformen besitzt das Trägerpartikel bevor­ zugt eine Größe im Bereich von 0,5 bis 10 µm und besonders bevorzugt von 1 bis 3 µm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle wie Silicium, Metalloxide wie Siliciumdioxid oder Verbundmaterialien, die meh­ rere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststof­ fen oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt.

Die Immobilisierung an ein Trägerpartikel kann entweder über die Matrize oder über den Startprimer erfolgen. Für das Verfahren ist es dabei unerheb­ lich, zu welchem Zeitpunkt der Immobilisierungsschritt erfolgt. Dieser Schritt ist möglich i) vor dem Hybridisierungsschritt, ii) nach dem Hybridis­ ierungsschritt, aber vor Verlängerung des Startprimers durch das Ketten­ abbruchmolekül, und bevorzugt, iii) nach der Verlängerungsreaktion. Der Vorteil der späten Immobilisierung besteht darin, dass ein möglicherweise störender Einfluss der Trägers auf die Hybridisierungs- und Verlängerungs­ reaktion vermieden wird.

Die Bindung des Startprimers oder der Nukleinsäurematrize an den Träger kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z. B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti-Hapten- Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden. So können biotinylierte Nukleinsäuremoleküle an Streptavidin-beschichtete Träger gekoppelt wer­ den. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv an den Träger gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen modifizierten Nukleinsäuremolekülen an metallische Träger, z. B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive Silangruppen auf einer Silika-Oberfläche vermittelt werden kann. Falls ein Gemisch aus zwei oder mehr an der Stelle des Einzelnukleotidpoly­ morphismus verschiedenen DNA-Molekülen als Matrize vorliegt, ist es wie bei der Einzelmolekülsequenzierung günstig, nur höchstens ein Molekül der Matrize oder des Startprimers an ein einzelnes Trägerpartikel zu binden. Dies läßt sich durch einen hinreichend hohen molaren Überschuß an Träger­ partikel gegenüber der Matrize oder dem Startprimer leicht erreichen.

Fall die als Matrize verwendeten DNA-Moleküle dagegen alle einheitlich sind, ist es insbesondere für die Ausführungsform der Erfindung in Mikro­ wells sogar günstig, mehrere Moleküle Matrize oder Startprimer an ein Trägerpartikel zu binden. Der Exonukleaseverdau führt dann zur Abspaltung mehrerer identischer fluoreszenzmarkierter Kettenabbruchmoleküle, so dass sich das Fluoreszenzsignal und damit das Signal- zu Rauschverhältnis verbessert.

Bei der Verwendung mehrerer fluoreszenzmarkierter Komponenten bei den erfindungsgemäßen Polymorphismuscharakterisierungen entsteht das Prob­ lem, die verschiedenen Markierungen wirksam zu trennen. Wie weiter oben beschrieben kann dies unter anderem durch die Verwendung verschiedener Wellenlängen bei der Anregung und Emission von Fluoreszenzlicht erfolgen. Die spektrale Aufspaltung erfolgt dabei gemäß dem Stand der Technik mit dichroischen Spiegeln. Nachteil bei diesem Vorgehen sind die vergleichs­ weise hohen Verluste, insbesondere bei der spektalen Aufspaltung der vom Fluorophor emittierten Photonen. Überraschend wurde gefunden, dass die Verluste verringert werden können, wenn die spektrale Aufspaltung statt mit einem dichroischen Spiegel mit einem Dispersionselement wie etwa einem Gitter, z. B. einem holographischen oder geritzten Gitter oder einem Prisma erfolgt (siehe Abb. 3). Dabei ist es günstig, die Reflexionen beim Eintritt des Lichts in das Dispersionselement oder/und beim Austritt des Lichts aus dem Dispersionselement z. B. durch geeignete Beschichtung der Glasoberflächen bei einem Prisma möglichst vollständig unterdrückt werden. Die Verwendung eines Dispersionselements statt eines di­ chroischen Spiegels ist nicht auf die Verwendung bei der Charakterisierung von Nukleotidpolymorphismen beschränkt. Sie ist ebenfalls möglich beim direkten Nachweis von Einzelmolekülen (siehe z. B. Anmeldung DE 102 23 423.2), bei Einzelmolekülsequenzierungsverfahren (siehe z. B. Anmeldung DE 100 31 840.1), bei Verfahren zur Selektion von Partikeln (siehe z. B. Anmeldung DE 100 31 842.8), bei Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden (siehe z. B. Anmeldung DE 100 23 421.6), bei Verf­ ahren zur Auftrennung von markierten Biopolymeren (siehe z. B. Anmeldung DE 100 23 422.4) und bei Multiplexsequenzierverfahren (siehe z. B. Anmel­ dung DE 100 31 842.8).

Abb. 1 zeigt verschiedene Ausführungsformen der Polymorphismus­ charakterisierung. In (a) erfolgt die Verlängerung des Start­ primers um ein einziges fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruch­ molekül. In (b) wird der Startprimer durch unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Desoxynukleotide bis zum 3'-Ende eines stromabwärts bindenden Blockprimers verlängert. Der Block­ primer selbst ist an seinem 3'-Ende blockiert, so dass er nicht verlängert wird. In (c) werden mehrere Start/Blockprimerpaare eingesetzt. In diesem Fall ist es erforderlich, die Startprimer durch Fluoreszenzmarker zu kodieren. In (d) werden ebenfalls mehrere Start/Blockprimerpaare eingesetzt, zusätzlich ist die Blockierung der Blockprimer (mit Ausnahme der Blockierung des am weitesten stromabwärts gelegenen Blockprimers) am 3'-Ende reversibel, also beispielsweise eine 3'-Phosphatbloc­ kierung. In einem ersten Schritt werden in Gegenwart der 3'- Blockierung fluoreszierende Nukleotide eingebaut. Nach einem Waschschritt zum Entfernen nicht eingebauter Nukleotide wird dann in einem zweiten Schritt nach Entfernung der 3'-Blockie­ rung die Lücke zwischen Blockprimer und folgendem Start­ primer durch unmarkierte Desoxynukleotide aufgefüllt. Die noch fehlenden kovalenten Bindungen aufeinanderfolgender Nukleotide werden durch Ligase geknüpft. Dargestellt ist das Ergebnis dieses Vorgehens.

Abb. 2 (a) zeigt eine Draufsicht, (b) eine Seitenansicht eines Mikro­ wells, der sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignet.

Abb. 3(a) zeigt die zur Einzelmolekülbestimmung bisher verwendete Optik, (b) zeigt die erfindungsgemäße Optik unter Verwen­ dung eines Dispersionselements zur Auftrennung der verschie­ denen Wellenlängen.

Die Bestimmung kann über die Fluoreszenzintensitäten (Δλ) bei verschiedenen Wellenlängen oder/und über Fluoreszenz- Abklingzeiten (τ) bei verschiedenen Wellenlängen unter Ver­ wendung mehrerer Detektoren erfolgen.

Claims (33)

1. Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize,
• b) Anlagern von mindestens einem Startprimer an die Nuklein­ säurematrize, wobei das 3'-Ende des Startprimers stromauf­ wärts eines zu untersuchenden Nukleinsäurepolymorphismus liegt,
• c) Verlängern des Startprimers mit mindestens einem fluores­ zenzmarkierten Nukleotid und
• d) Nachweisen von in den Startprimer eingebauten Nukleotiden durch Einzelmolekülbestimmung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis von eingebauten Nukleotiden eine Separation des verlängerten Startprimers von nicht eingebauten Nukleotiden umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des eingebauten Nukleotids eine zumindest teilweise Sequenzbestimmung des verlängerten Startprimers umfasst.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung der Einzelmolekülbestimmung der Startprimer an ein Trägerpartikel gekoppelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelmolekülsequenzbestimmung die Schritte umfasst:

• a) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
• b) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
• c) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,
• d) zumindest teilweises Bestimmen der Basenfolge des Nuklein­ säuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nu­ kleotidbausteine.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Abspaltung von an den Startprimer angehängten Nukleotiden durch eine Exonuklease, insbesondere durch T7-DNA-Polymerase als Exonuklease, E. coli Exonuklease I oder E. coli Exonuklease III erfolgt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein einziger Startprimer verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Startprimer verwendet werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verlängerungsreaktion das Anfügen eines einzigen fluoreszenzmarkierten Kettenabbruchmoleküls umfasst.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Kettenabbruchmolekül um ein Didesoxynukleotid handelt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verlängerungsreaktion das Anfügen mehrerer fluoreszenzmarkierter Nukleinsäurebausteine umfasst.

12. Verfahren nach Anspruch 1 l, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Paare von Start- und Blockprimern eingesetzt werden, wobei das 5'-Ende jedes Blockprimers in einem vorbestimmten Abstand stromabwärts des 3'-Endes des zugehörigen Startprimers an die Nukleinsäurematrize bindet, wobei das 3'-Ende des Blockprimers blockiert ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Paare von Start- und Blockprimern eingesetzt werden und die Start/Blockprimerpaare anhand unterschiedlicher Kodierungen identifiziert werden können.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockierung des 3'-Endes der Blockprimer, gegebenenfalls mit Ausnahme des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers reversibel ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Blockprimer verwendet werden, die eine 3'-Phosphatgruppe tragen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine kovalente Bindung zwischen dem durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimer und dem Blockprimer geschlossen wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung enzymatisch, zum Beispiel unter Verwendung einer Ligase geschlossen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Blockprimer eine 5'-Phosphatgruppe trägt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lücke(n) zwischen den durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimern und den jeweils stromabwärts liegenden Blockprimern nach Entfernung der 3'-Blockierung der Blockprimer durch Desoxyribonukleotide aufgefüllt werden und kovalente Bindungen zwischen den verlängerten Blockprimern und den unmittelbar stromabwärts liegenden Startprimern geschlossen werden.

20. Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen in einem Mikrowell, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immo­ bilisierten Nukleinsäuremolekül, bestehend aus einer einsträn­ gigen Nukleinsäurematrize und einem Startprimer,
• b) Verlängern des Startprimers durch ein fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruchmolekül,
• c) gegebenenfalls Waschen des Wells zur Abtrennung von nicht eingebauten Markierungen und
• d) Nachweisen der in den Startprimer eingebauten Fluoreszenz­ markierung.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Anregung oder/und zum Nachweis der Fluoreszenz ein in den Mikrowell integrierter Halbleiterlaser oder/und Halbleiterdetektor verwendet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Reaktionen auf einer Mikrowellplatte parallel oder sequenziell durchgeführt wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verlängerung des Startprimers nur eine Art von markiertem Nukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP, ddGTP zur Verfügung steht.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verlängerung des Startprimers mehrere, durch ihre Fluoreszenzmarkierung unterscheidbare Kettenabbruchmoleküle zur Verfügung stehen.

25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägerpartikel aus Kunststoff, Glas, Quarz, Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden oder aus einem Verbundmaterial verwendet.

26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpartikel einen Durchmesser von 1 nm bis 10 µm aufweist.

27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäurematrix auf dem Trägerpartikel über ihren 5'-Terminus oder der Startprimer über seinen 3'-Terminus mittels bioaffiner Wechselwirkungen immobilisiert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein biotinyliertes Nukleinsäuremolekül an ein Avidin- oder Streptavidin-beschichtetes Trägerpartikel immobilisiert wird.

29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterscheidung verschiedener Fluoreszenzmarkierungen aufgrund der Wellenlänge, der Lebensdauer des angeregten Zustands oder einer Kombination daraus erfolgt.

30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch konfokale Einzelmoleküldetektion oder/und durch zeitaufgelöste Abklingmessung erfolgt.

31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Messung eines kreuzkorrelierten Signals umfasst, das von einem, mindestens 2 unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden Nukleinsäuremolekül oder Nukleinsäuremolekül-Komplex stammt.

32. Verfahren zur Steigerung der Detektionseffizienz beim Nachweis der Fluoreszenz von Einzelmolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass zur Trennung des Lichts verschiedener Wellenlängen ein Dispersionselement verwendet wird.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Dispersionselement ein Prisma oder Gitter verwendet wird.