DE10065631A1 - Characterizing nucleic acid polymorphisms, useful e.g. for detecting inherited disease, by extension of starter primer then single-molecule detection of incorporated nucleotide - Google Patents

Characterizing nucleic acid polymorphisms, useful e.g. for detecting inherited disease, by extension of starter primer then single-molecule detection of incorporated nucleotide

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DE10065631A1
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Abstract

Characterization of nucleic acid (NA) polymorphisms by: (i) attaching at least one starter primer (I) to test NA so that the 3'-end of (I) is downstream of the polymorphism being tested; (ii) extending (I) with at least one fluorescently labeled nucleotide (fnt); and (iii) detecting incorporated fnt by single-molecule detection. Independent claims are also included for the following: (a) similar method, performed in microwells, in which an NA, consisting of single-stranded matrix and (I), is immobilized on a carrier particle ((I) is extended with a fluorescently labeled chain-breaking molecule (II), the wells are (optionally) washed to remove unbound (II) and the label incorporated into (I) is detected); and (b) method for improving efficiency of detection of fluorescence from individual molecules by using a dispersion element to separate lights of different wavelengths.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von ein­ zelnen oder multiplen Nukleinsäurepolymorphismen durch Detektion einzel­ ner fluoreszenzmarkierter Desoxyribonucleinsäuremoleküle.The present invention relates to a method for the detection of a single or multiple nucleic acid polymorphisms by single detection a fluorescent labeled deoxyribonucleic acid molecule.

Zwischen den Genomen der Individuen einer Spezies gibt es Sequenzab­ weichungen durch Nukleinsäure-Insertionen und Deletionen, Unterschiede in der Zahl der Wiederholungen kurzer, wiederkehrender Sequenzmotive (sogenannte Mikrosatelliten und Minisatelliten) und Abweichungen bei ein­ zelnen Basenpaaren, die als Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, engl. single nucleotide polymorphisms) bezeichnet werden und mit etwa einem Basenpaar pro 1000 Basenpaaren beim Menschen (siehe WO 00/18960) am häufigsten vorkommen.There are sequences between the genomes of the individuals of a species softening due to nucleic acid insertions and deletions, differences in the number of repetitions of short, repeating sequence motifs (so-called microsatellites and mini satellites) and deviations in one individual base pairs, which as single nucleotide polymorphisms (SNPs, engl. single nucleotide polymorphisms) and about one Base pair per 1000 base pairs in humans (see WO 00/18960) most common.

Solche Variationen im Genom können in vielen Fällen mit dem Auftreten erblicher Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Klassische Bei­ spiele sind Huntington, cystische Fibrose, Duchenne muskuläre Dystrophie und bestimmte Formen von Brustkrebs (siehe WO 00/18960). In jüngerer Zeit wurden auch Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson mit einzelnen Mutationen auf molekularer Ebene in Verbindung gebracht.Such variations in the genome can occur in many cases hereditary diseases. Classic case Games include Huntington's, cystic fibrosis, Duchenne muscular dystrophy and certain forms of breast cancer (see WO 00/18960). Younger At the time, diseases such as Alzheimer's and Parkinson's were also common Mutations linked at the molecular level.

In der Regel handelt es sich bei diesen Mutationen um Einzelnukleotid­ polymorphismen (SNPs). Am Auffinden neuer Positionen im Genom, an de­ nen SNPs auftreten, besteht daher ein erhebliches Interesse der medizini­ schen Forschung. An der Untersuchung von SNPs, deren Position im Ge­ nom auf das Nukleotid genau bekannt ist, besteht dagegen vor allem ein Interesse für die Diagnostik von molekular bedingten Krankheiten. As a rule, these mutations are single nucleotides polymorphisms (SNPs). On finding new positions in the genome, at de If SNPs occur, there is therefore a considerable interest of medical professionals research. In the investigation of SNPs, whose position in Ge on the other hand, there is primarily a Interest in the diagnosis of molecular diseases.  

Eine Reihe von Verfahren zur routinemäßigen Untersuchung solcher SNPs an bekannter Position im Genom sind daher in den vergangenen Jahren entwickelt worden.A series of procedures for the routine investigation of such SNPs have been in a known position in the genome in recent years has been developed.

So wurden durch photolitographische Synthese miniaturisierte Oligonukleo­ tidarrays hoher Dichte hergestellt. Auf diesen Arrays existiert für jedes mögliche Allel eine komplementäre Sonde. Mit Prototypen solcher Chips zur Genotypisierung können bis zu 3000 SNPs gleichzeitig untersucht werden (Sapolsky et al. Genet. Anal., 1999, 14: 187-192).Thus, miniaturized oligonucleotides were obtained by photolithographic synthesis high density tidarrays. There exists for everyone on these arrays possible allele a complementary probe. With prototypes of such chips up to 3000 SNPs can be examined simultaneously for genotyping (Sapolsky et al. Genet. Anal., 1999, 14: 187-192).

Ein ähnliches Verfahren, das ebenfalls auf der Hybridisierung des zu unter­ suchenden Allels mit einer komplementären Oligonukleotidsonde basiert, wurde von Axys Pharmaceuticals entwickelt. Dieses Verfahren verwendet Oligonukleotidsonden, die an fluoreszenzmarkierte Mikrokügelchen gekop­ pelt sind. Diese Sonden werden direkt mit ebenfalls fluoreszenzmarkierten Polymerasekettenreaktions(PCR)-Produkten hybridisiert. Die Detektion erfolgt dann in einem üblichen Durchflußzytometer. Auf diese Weise konn­ ten bis zu acht polymorphe Gene gleichzeitig untersucht werden (Arm­ strong et al. Cytometry, 2000, 40: 102-108).A similar process, also based on the hybridization of the under searching allele with a complementary oligonucleotide probe, was developed by Axys Pharmaceuticals. This method is used Oligonucleotide probes that are coupled to fluorescence-labeled microspheres pelt are. These probes are also labeled with fluorescence Polymerase chain reaction (PCR) products hybridized. The detection is then carried out in a conventional flow cytometer. In this way up to eight polymorphic genes can be examined simultaneously (Arm strong et al. Cytometry, 2000, 40: 102-108).

Während bei diesen Verfahren die Hybridisierung nach einem möglichen DNA-Amplifikationsschritt mit PCR erfolgt, gehen See et al. den umgekehr­ ten Weg. Ihr Verfahren verwendet Primer mit verschiedenen Fluorophoren an den 5'-Nukleotiden, deren 3'-Ende bei dem zu untersuchenden Nukleotid liegt. Nur mit dem Primer, der auch am 3'-Ende zu dem zu untersuchenden Nukleotid komplementär ist, entsteht ein PCR-Produkt. Die Proben werden dann durch Elektrophorese nach Größe und Fluoreszenz analysiert (See et al. Biotechniques, 2000, 28: 710-714).While with these methods the hybridization after a possible DNA amplification step done with PCR, See et al. the reverse way. Her method uses primers with different fluorophores at the 5 'nucleotides, the 3' end of which is at the nucleotide to be examined lies. Only with the primer that is also at the 3 'end of the one to be examined If the nucleotide is complementary, a PCR product is formed. The samples will be then analyzed by size and fluorescence by electrophoresis (See et al. Biotechniques, 2000, 28: 710-714).

Ein sehr elegantes Verfahren zur Charakterisierung von SNPs verwendet keine komplette PCR, sondern lediglich die Verlängerung eines Primers um ein einzelnes, fluoreszenzmarkiertes Didesoxyribonucleinsäuremolekül (ddNT'P), das zu dem zu untersuchenden Nukleotid komplementär ist. Durch Detektion des um eine Base verlängerten und damit fluoreszenz­ markierten Primers läßt sich auf das Nukleotid an der polymorphen Stelle schließen (Kobayashi et al. Mol. Cell. Probes, 1995, 9: 175-182). Ein Nach­ teil dieses Verfahrens ist allerdings, dass in einer Reaktion immer nur ein einzelner Polymorphismus untersucht werden kann.A very elegant method used to characterize SNPs no complete PCR, just the extension of one primer a single, fluorescence-labeled dideoxyribonucleic acid molecule  (ddNT'P), which is complementary to the nucleotide to be examined. By detection of the fluorescence, which is extended by one base labeled primer can be placed on the nucleotide at the polymorphic site (Kobayashi et al. Mol. Cell. Probes, 1995, 9: 175-182). A night however, part of this process is that only one in a reaction single polymorphism can be examined.

Eine mögliche Lösung dieses Problems besteht im Einbau einer als ZipCode bezeichneten eindeutig identifizierbaren Sequenz in den Primer. Dieser ZipCode wird von einem komplementären ZipCode (dem cZipCode) erkannt, der kovalent an ein fluoreszierendes Mikrokügelchen gebunden ist. Die Mikrokügelchendecodierung und SNP-Typisierung erfolgt dann in einem üb­ lichen Durchflußzytometer. Das ZipCode System erlaubt die Analyse einer großen Zahl von SNPs mit einer begrenzten Menge an ZipCode gekoppelten Mikrokügelchen (Chen et al. Genome Res., 2000, 10: 549-557).A possible solution to this problem is to install a ZipCode designated clearly identifiable sequence in the primer. This ZipCode is recognized by a complementary ZipCode (the cZipCode), which is covalently bound to a fluorescent microsphere. The Microbead decoding and SNP typing are then carried out in one operation flow cytometer. The ZipCode system allows the analysis of a large number of SNPs with a limited amount of ZipCode coupled Microspheres (Chen et al. Genome Res., 2000, 10: 549-557).

Die beiden letztgenannten Verfahren, die auf der Verlängerung eines Pri­ mers mit einem fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotid aufbauen, besit­ zen einen wesentlichen Vorteil: Fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide, die für hohe Fluoreszenzausbeute und für den Einbau in DNA durch natür­ lich vorkommende oder genetisch veränderte Polymerasen optimiert sind, sind wegen ihrer Verwendung für die Sangersche Methode der DNA-Se­ quenzierung durch Kettenabbruch (Sanger et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463) preisgünstig verfügbar.The latter two procedures, which are based on the extension of a Pri build with a fluorescence-labeled dideoxynucleotide, besit essential advantage: fluorescence-labeled dideoxynucleotides, which for high fluorescence yield and for incorporation into DNA by natural occurring or genetically modified polymerases are optimized, are of DNA Se because of their use for the Sangersche method chain termination (Sanger et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463) are available at a reasonable price.

Ebenso wie die übrigen Verfahren sind aber auch die beiden letztgenannten Verfahren, die auf der Verlängerung eines Primers mit einem fluoreszenz­ markierten Didesoxynukleotid aufbauen, in der Durchführung aufwendig.Just like the other methods, the latter two are also Procedure based on the extension of a primer with a fluorescence build labeled dideoxynucleotide, complex to carry out.

Bei dem weiter oben erläuterten Verfahren ohne ZipCode ist es zur Erzie­ lung eines klaren Signals erforderlich, die Probe vor dem Auftrag auf ein de­ naturierendes Gel vorzureinigen. Zur Abtrennung des Überschusses an nicht in den Primer eingebauten Didesoxynukleotid wird empfohlen, die Probe mit alkalischer Phosphatase zu behandeln und den Primer anschlie­ ßend mit Isopropanol zu fällen. Besonders der Fällungsschritt läßt sich schlecht automatisieren.With the procedure without ZipCode explained above, it is an education a clear signal is required, the sample must be applied to a de pre-clean the natural gel. To remove the excess dideoxynucleotide not built into the primer is recommended  Treat the sample with alkaline phosphatase and connect the primer to precipitate with isopropanol. The precipitation step in particular can be poorly automate.

Bei dem Verfahren mit ZipCode entfallen die handarbeitsintensiven Arbeits­ schritte, dafür ist aber ein technisch aufwendiges Durchflußzytometer, das einen großen Wellenlängenbereich abdeckt, erforderlich. Außerdem besteht die Gefahr, Signale falsch zu interpretieren, weil sich die Spektren der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe zumindest teilweise überschneiden.The process with ZipCode eliminates the labor-intensive work steps, but there is a technically complex flow cytometer that covers a large wavelength range. There is also the danger of misinterpreting signals because the spectra of the overlap at least partially different fluorescent dyes.

Außerdem besteht bei der Verwendung von DNA von Spendern, die zwei verschiedene Allele des zu untersuchenden polymorphen DNA-Abschnitts besitzen, die Schwierigkeit, dass die beiden Allele entweder zunächst einzeln isoliert oder selektiv amplifiziert werden müssen.In addition, when using DNA from donors, there are two different alleles of the polymorphic DNA section to be examined possess the difficulty that the two alleles either initially individually isolated or selectively amplified.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen bereitzustellen, die diese Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.The object of the present invention is to provide methods for characterization of nucleic acid polymorphisms to provide these disadvantages of Not have prior art.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen, umfassend die Schritte:
This object is achieved by a method for characterizing nucleic acid polymorphisms, comprising the steps:

  • a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize,a) providing a nucleic acid template to be examined,
  • b) Anlagern von mindestens einem Startprimer an die Nukleinsäure­ matrize, wobei das 3'-Ende des Primers stromaufwärts eines zu untersuchenden Nukleinsäurepolymorphismus liegt,b) attaching at least one start primer to the nucleic acid matrix, with the 3 'end of the primer upstream of one investigating nucleic acid polymorphism,
  • c) Verlängern des Startprimers mit mindestens einem fluoreszenzmar­ kierten Nukleotid undc) Extend the start primer with at least one fluorescence marker labeled nucleotide and
  • d) Nachweisen von in den Startprimer eingebauten Nukleotiden durch Einzelmolekülbestimmung.d) detection of nucleotides built into the start primer by Single molecule determination.

Bei dem Nukleinsäurepolymorphismus handelt es sich im einfachsten Fall um einen Einzelnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP). Der Polymorphismus kann aber auch mehrere Nukleotide, zum Bei­ spiel bis zu 20 aufeinanderfolgende Nukleotide oder sogar mehrere Grup­ pen aus einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden betreffen.The simplest case is the nucleic acid polymorphism a single nucleotide polymorphism (single nucleotide polymorphism,  SNP). However, the polymorphism can also include several nucleotides play up to 20 consecutive nucleotides or even several groups relate to one or more consecutive nucleotides.

Als Nukleinsäurematrize kann DNA beliebiger Herkunft, beipielsweise von Prokaryonten, insbesondere pathogenen Prokaryonten, Archaeaen oder Eu­ karyonten, insbesondere Säugetieren, insbesondere Mensch verwendet werden. Es kann sich aber auch um rekombinant hergestellte DNA oder um synthetische DNA handeln. Die DNA wird bevorzugt in einzelsträngiger Form verwendet. Solche DNA kann beispielsweise durch reverse Trans­ kription eines RNA-Moleküls durch eine Reverse Transkriptase, etwa die Reverse Transkriptase von AMV (Avian Myeloblastosis Virus) oder MMLV (Moloney Murine Leucaemia Virus) hergestellt werden. Es ist aber auch möglich, doppelsträngige DNA, etwa genomische DNA, DNA eines Plas­ mids oder eines episomalen genetischen Elements durch Erhitzen in einzel­ strängige DNA aufzutrennen, gegebenenfalls einen Strang aufzureinigen oder anzureichern, und dann den Primer annealen zu lassen. Bei der RNA oder DNA handelt es sich bevorzugt um eine möglichst homogene Mi­ schung. Da der Startprimer aber Spezifität für die zu untersuchende DNA besitzt, kann auch mit heterogenen Gemischen gearbeitet werden.DNA of any origin can be used as the nucleic acid template, for example from Prokaryotes, especially pathogenic prokaryotes, archaea or Eu caryotes, especially mammals, especially humans become. But it can also be recombinantly produced DNA or act synthetic DNA. The DNA is preferably single stranded Shape used. Such DNA can be, for example, by reverse trans RNA transcription by a reverse transcriptase, such as the Reverse transcriptase from AMV (Avian Myeloblastosis Virus) or MMLV (Moloney Murine Leucemia Virus). It is also possible, double-stranded DNA, such as genomic DNA, DNA of a plasma mids or an episomal genetic element by heating in single to separate stranded DNA, if necessary to purify a strand or enrich, and then anneal the primer. With the RNA or DNA is preferably a Mi that is as homogeneous as possible research. Since the start primer is specificity for the DNA to be examined owns, can also be used with heterogeneous mixtures.

Der Startprimer besteht bevorzugt aus einzelsträngiger DNA. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, mit RNA-Molekülen zu arbeiten. Der Startprimer kann auch ein Nukleinsäureanalog, zum Beispiel eine Peptid­ nukleinsäure sein, wobei das Phosphat-Zucker-Rückgrat der Nukleinsäuren ersetzt wird durch ein peptidartiges Rückgrat, beispielsweise bestehend aus 2-Aminoethylenglycin (Nielsen et al., Science, 254: 1497-1500) als Träger der einzelnen Basen A, T, G, C. Ein solcher Peptidnukleinsäureprimer muss ein 3'-Ende besitzen, das eine Elongation zulässt.The start primer preferably consists of single-stranded DNA. But it is of course also possible to work with RNA molecules. The Start primer can also be a nucleic acid analog, for example a peptide be nucleic acid, the phosphate-sugar backbone of the nucleic acids is replaced by a peptide-like backbone, for example consisting of 2-Aminoethylene glycine (Nielsen et al., Science, 254: 1497-1500) as a carrier of the individual bases A, T, G, C. Such a peptide nucleic acid primer must have a 3 'end that allows elongation.

Bevorzugt bindet der Startprimer unmittelbar stromaufwärts des zu charak­ terisierenden SNPs. Falls mit Desoxynukleotiden und nicht mit Kettenab­ bruchmolekülen gearbeitet wird, ist es aber auch möglich, einen Startprimer zu verwenden, der weiter stromaufwärts, vorzugsweise nicht mehr als 5 Nukleotide stromaufwärts von der zu untersuchenden Polymorphismus­ stelle bindet.The start primer preferably binds directly upstream of the to charak terisizing SNPs. If with deoxynucleotides and not with chainsab  fraction is worked, it is also possible to use a primer to be used which is further upstream, preferably not more than 5 Nucleotides upstream of the polymorphism to be examined job binds.

Das fluoreszenzmarkierte Nukleotid kann sowohl ein Desoxynukleotid als auch ein Kettenabbruchmolekül sein. Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus den bekannten zur Markierung von Biopolymeren, z. B. Nuklein­ säuren, verwendeten Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluores­ cein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. ausge­ wählt werden. Die Unterscheidung der Farbstoffe kann über die Wellenlän­ ge, über die Lebensdauer der angeregten Zustände oder über eine Kom­ bination davon erfolgen.The fluorescence-labeled nucleotide can be a deoxynucleotide as well also be a chain termination molecule. The fluorescent label groups can from the known for labeling biopolymers, for. B. Nuklein acids used fluorescent label groups, such as fluorescent cein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3, Cy5 or derivatives thereof etc. be chosen. The differentiation of the dyes can be done via the wavelength ge, over the life of the excited states or via a com a combination of them.

Falls mehrere, mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen versehene Nukleotide verwendet werden, können diese durch die Wellenlänge des anregenden Lichts, des emittierten Lichts oder eine Kombination daraus unterschieden werden. Eine Unterscheidung der Fluorezenzfarbstoffe kann auch durch eine Messung der Lebensdauer des angeregten Zustands erfol­ gen. Es bietet sich an, die Verfahren zu kombinieren. So können beispiels­ weise vier Fluoreszenzmarkierungen für die vier verschiedenen Basen ausge­ wählt werden, die alle bei der gleichen Wellenlänge angeregt werden können, und die bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, wobei sich für die Markierungen, deren Emissionswellenlänge gleich ist, die Le­ bensdauern der angeregten Zustände unterscheiden.If several, with different fluorescent labels Nucleotides are used, these can be determined by the wavelength of the stimulating light, emitted light, or a combination thereof be distinguished. A distinction can be made between the fluorescent dyes also by measuring the life of the excited state It makes sense to combine the procedures. For example identified four fluorescent labels for the four different bases be selected, all of which are excited at the same wavelength can, and which emit at two different wavelengths, wherein Le for the markings whose emission wavelength is the same Differentiate the lifetimes of the excited states.

Die Verlängerung des Primers kann mit Methoden der Nukleinsäurechemie, die aus der Oligonukleotidsynthese bekannt sind, erfolgen. Bevorzugt erfolgt die Verlängerungsreaktion aber durch enzymatische Katalyse. Die Polymerase wird abhängig davon gewählt, ob als Matrize RNA oder DNA verwendet wird. Bevorzugt wird eine Polymerase ohne Exonukleaseaktivität ausgewählt. Beispiele für mögliche Polymerasen sind T7-Polymerase oder thermostabile Polymerasen wie Taq, Pfu, Pwo und Ähnliche, die üblicher­ weise für PCR-Reaktionen Verwendung finden.The primer can be extended using methods of nucleic acid chemistry, which are known from oligonucleotide synthesis. Prefers the extension reaction takes place by enzymatic catalysis. The Polymerase is chosen depending on whether the template is RNA or DNA is used. A polymerase without exonuclease activity is preferred selected. Examples of possible polymerases are T7 polymerase or  thermostable polymerases such as Taq, Pfu, Pwo and the like, the more common be used for PCR reactions.

Der Nachweis der Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls kann mit einer beliebigen Messmethode, z. B. mit orts- oder/und zeitaufgelöster Fluores­ zenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement, wie es in einem Mikrokanal vorliegt, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.The detection of the fluorescence of a single molecule can be done with a any measurement method, e.g. B. with local or / and time-resolved fluorescence zenz spectroscopy, which is capable of in a very small Volume element, as it is in a microchannel, fluorescence signals down to capture single photon count.

Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetek­ tion, wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise ein konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 × 10-15 bis 20 × 10-12 l der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Fluores­ zenzmarkierungen zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Foto­ detektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindig­ keit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994), 259-264) beschrieben.For example, the detection can be carried out by means of confocal single-molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy, with a very small, preferably a confocal volume element, for example 0.1 × 10 -15 to 20 × 10 -12 l, of the sample liquid flowing through the microchannel Excitation light of a laser is exposed, which excites the fluorescent markings located in this measurement volume for the emission of fluorescent light, the emitted fluorescent light from the measurement volume being measured by means of a photo detector, and a correlation between the temporal change in the measured emission and the relative flow rate involved molecules is created so that individual molecules in the measurement volume can be identified with a correspondingly strong dilution. Reference is made to the disclosure of European Patent 0 679 251 for details of the implementation of the method and apparatus details for the devices used for the detection. Confocal single-molecule determination is further described in Rigler and Mets (Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.) And Mets and Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994), 259-264).

Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomena", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend - vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von ≧ 100 ps - das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.Alternatively or additionally, the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating, such as for example by Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids ", in:" Ultrafast Phenomena ", D.H. Auston,  Ed., Springer 1984. The excitation of the Fluorescence molecules within a measurement volume and then - preferably at a time interval of ≧ 100 ps - the opening of a Detection interval at the photo detector. That way, by Raman effects generated background signals kept sufficiently low in order to enable essentially interference-free detection.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kann die Bestimmung auch die Messung eines kreuzkorrellierten Signals umfassen, das von mindestens einem, 2 unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden Nukleinsäuremolekül oder Nukleinsäuremolekül-Komplex stammt, wobei mehrere markierte Nukleotide, Primer oder/und Nukleinsäurematrizen mit jeweils unterschiedlichen Markierungen eingesetzt werden können. Diese Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwille et. al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878-1886) und Rigler et. al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97-109) beschrieben.In a preferred embodiment of the method, the Determination also include measuring a cross-correlated signal, that of at least one, 2 different markings, in particular Fluorescent labels, nucleic acid molecule or Nucleic acid molecule complex originates, with several labeled Nucleotides, primers and / or nucleic acid matrices with each different markings can be used. This Cross correlation determination is for example in Schwille et. al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878-1886) and Rigler et. al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97-109).

Der Nachweis von eingebauten Nukleotiden umfaßt bevorzugt eine Separa­ tion des verlängerten Startprimers von nicht eingebauten Nukleotiden.Detection of incorporated nucleotides preferably comprises a separa tion of the extended start primer of unincorporated nucleotides.

Die Trennung kann beispielsweise wie in der Patentanmeldung DE 102 23 423.2 beschrieben aufgrund der unterschiedlichen Wanderungs­ geschwindigkeit eingebauter und nicht eingebauter Nukleotide im elek­ trischen Feld erfolgen. Auf diese Weise können typischerweise Anreiche­ rungen um drei Zehnerpotenzen oder mehr erreicht werden.The separation can, for example, as in the patent application DE 102 23 423.2 described due to the different migration speed of built-in and non-built-in nucleotides in the elec trical field. In this way, riches can typically three powers of ten or more.

Falls der Primer oder die Nukleinsäurematrize an einem Trägerpartikel immobilisiert ist, kann dieses Partikel beispielsweise mit Hilfe eines In­ frarotlasers eingefangen werden. Anschließend kann dann ein Waschschritt in einem gerichteten Fluss, der elektroosmotisch oder hydrodynamisch sein kann, erfolgen. Wegen des günstigeren Flussprofils und der höheren Fluss­ raten wird hydrodynamischer Fluss bevorzugt.If the primer or the nucleic acid template is on a carrier particle is immobilized, this particle can, for example, with the help of an In infrared lasers are captured. Then a washing step can then in a directional flow that can be electroosmotic or hydrodynamic  may happen. Because of the more favorable flow profile and the higher flow hydrodynamic flow is preferred.

Es ist möglich, bei der Detektion zusätzlich zu prüfen, ob tatsächlich einge­ baute Nukleotide beobachtet werden, oder ob noch kontaminierende, freie Nukleotide vorhanden sind. Dies ist zum Beispiel durch Fluoreszenzkorrela­ tionsspektroskopie möglich. Bei diesem Verfahren nutzt man aus, das der verlängerte Startprimer wesentlich langsamer diffundiert als die freien Kettenabbruchmoleküle und daher länger in dem von einem konfokalen Mikroskop beleuchteten Bereich verweilt, so dass emittiertes Fluoreszenz­ licht vom verlängerten Startprimer eine wesentliche längere Korrelationszeit besitzt als Fluoreszenzlicht von einem freien Kettenabbruchmolekül. Für die Messung der diffusionsbegrenzten Korrelationszeit genügen technisch wenig aufwendige Korrelatoren, da die Korrelationszeiten im Bereich von ms bis einigen 100 ms liegen.It is possible to additionally check during the detection whether it is actually switched on built nucleotides are observed, or whether contaminating, free Nucleotides are present. For example, this is due to fluorescence correla tion spectroscopy possible. With this procedure one takes advantage of the fact that the extended primers diffuse much more slowly than the free ones Chain termination molecules and therefore longer in that of a confocal Microscope illuminated area lingers, so emitted fluorescence light from the extended start primer a significantly longer correlation time possesses as fluorescent light from a free chain termination molecule. For the Measurement of the diffusion-limited correlation time is technically sufficient less complex correlators, since the correlation times in the range of ms to a few 100 ms.

Eine weitere Möglichkeit zur optischen Unterscheidung von eingebauten und nicht eingebauten Kettenmolekülen liegt in der Ausnutzung von Ener­ gietransferprozessen. So wurde beispielsweise von Edman et al (Edman, L., Mets, Ü. und Rigler, R., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, 6710-6715 (1996)) gezeigt, dass die Lebensdauer eines angeregten Zustands von Tetramethyl­ rhodamin durch große räumliche Nähe drastisch verkürzt wird, die bei hoher Verdünnung des Kettenabbruchmoleküls nur dann eintritt, wenn das Molekül tatsächlich kovalent mit dem Startprimer verbunden wurde.Another way to visually differentiate between built-in and unincorporated chain molecules lies in the use of ener gietransferprozessen. For example, Edman et al (Edman, L., Mets, Ü. and Rigler, R., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, 6710-6715 (1996)) demonstrated that the lifetime of an excited state of tetramethyl rhodamine is drastically shortened due to its close proximity, which at high dilution of the chain termination molecule only occurs if that Molecule was actually covalently linked to the start primer.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es aber auch möglich, die eingebauten Nukleotide beispielsweise durch eine Exonuklease wieder abzudauen und einzeln nachzuweisen. In diesem Fall erfolgt eine zumindest teilweise Sequenzbestimmung des verlängerten Startprimers. Dabei können Verfahren verwendet werden, wie sie in der Patentanmel­ dung DE 100 31 840.1 und in der Publikation Dörre et al., Bioimaging 5, 139-152 beschrieben sind. According to a further aspect of the present invention, however, it is also possible, the built-in nucleotides, for example, by an exonuclease to digest again and to prove individually. In this case there is a at least partially sequence determination of the extended start primer. Methods can be used as described in the patent application dung DE 100 31 840.1 and in the publication Dörre et al., Bioimaging 5, 139-152 are described.  

Für die Durchführung der Sequenzierungsreaktion wird die Nukleinsäure­ matrix oder stärker bevorzugt der Startprimer an ein Trägerpartikel gekop­ pelt.The nucleic acid is used to carry out the sequencing reaction matrix or more preferably the start primer is coupled to a carrier particle pelt.

Die Einzelmolekülsequenzbestimmung umfasst vorzugsweise die Schritte:
The single molecule sequence determination preferably comprises the steps:

  • a) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, um­ fassend einen Mikrokanal,a) introducing the carrier particle into a sequencing device in order to holding a microchannel,
  • b) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,b) holding the carrier particle in the sequencing device,
  • c) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,c) progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecule,
  • d) zumindest teilweises Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäure­ moleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbaustei­ ne.d) at least partially determining the base sequence of the nucleic acid molecule due to the sequence of the cleaved nucleotide building block ne.

Die Detektion und Manipulation beladener Trägerpartikel kann beispiels­ weise nach den in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue µTAS 96, 85-87), Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5740-5747) oder Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) beschriebenen Methoden erfolgen, die eine Detektion mit einem konfokalen Mikroskop beinhalten. Die Manipulation der beladenen Trägerpartikel in Mikrokanalstrukturen erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines Einfanglasers, z. B. eines Infrarotlasers. Geeignete Methoden sind zum Beispiel von Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31) und Chu (Science 253 (1991), 861-866) beschrieben.The detection and manipulation of loaded carrier particles can, for example as shown in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue µTAS 96, 85-87), Eigen and Rigler (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5740-5747) or Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) described methods are carried out which involve detection with a confocal Include microscope. The manipulation of the loaded carrier particles in Microchannel structures are preferably made with the help of a capture laser, e.g. B. an infrared laser. Suitable methods are for example from Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31) and Chu (Science 253 (1991), 861-866) described.

Vorzugsweise erfolgt das Festhalten des Trägerpartikels durch einen auto­ matisierten Prozess. Hierzu werden die Trägerpartikel im hydrodynamischen Fluss durch den Mikrokanal geleitet, wobei sie ein Detektionselement passieren. Der Detektor im Detektionsfenster wird so eingestellt, dass er eine markierte Kugel aufgrund der darauf befindlichen fluoreszenzmarkier­ ten DNA und/oder einer zusätzlichen fluoreszenzmarkierten Sonde erkennt, und daraufhin automatisch das Aktivieren des Einfanglasers im Messraum bewirkt.The carrier particle is preferably held in place by an auto automated process. For this purpose, the carrier particles are hydrodynamic Flow passed through the microchannel, being a detection element happen. The detector in the detection window is set so that it a marked sphere due to the fluorescent marker on it recognizes DNA and / or an additional fluorescence-labeled probe,  and then automatically activating the capture laser in the measuring room causes.

Zur Abspaltung einzelner Nukleotide von dem verlängerten Startprimer­ molekül wird eine Exonuklease verwendet, zum Beispiel T7-DNA-Polyme­ rase als Exonuklease, E. coli Exonuklease I oder E. coli Exonuklease III.For splitting off individual nucleotides from the extended start primer An exonuclease is used, for example T7 DNA polymer rase as exonuclease, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III.

Im einfachsten Fall wird nur ein einziger Startprimer für die Verlängerungs­ reaktion eingesetzt. Es ist aber auch möglich, mehrere, an verschiedenen Stellen an die Matrize bindende Startprimer einzusetzen und zu verlängern. Die Startprimer sind dann bevorzugt unterschiedlich kodiert, beispielsweise durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen oder durch unterschied­ liche Kombinationen von Fluoreszenzmarkierungen. Insbesondere können zur Identifikation des Startprimers fluoreszenzmarkierte dNTPs in den Start­ primer eingebaut werden. Wenn für jedes Nukleotid eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung verwendet wird, lassen sich mit n fluoreszenzmar­ kierten Positionen 4n verschiedene Startprimer unterscheiden. Eine noch größere Zahl ergibt sich, wenn an verschiedenen Positionen für das gleiche Nukleotid unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Analoga eingesetzt wer­ den.In the simplest case, only a single start primer is used for the extension reaction. However, it is also possible to use and extend several start primers which bind to the matrix at different points. The start primers are then preferably coded differently, for example by different fluorescent labels or by different combinations of fluorescent labels. In particular, fluorescent-labeled dNTPs can be built into the start primer to identify the start primer. If a different fluorescence label is used for each nucleotide, 4 n different start primers can be distinguished with n fluorescence-marked positions. An even larger number results if different fluorescence-labeled analogs are used at different positions for the same nucleotide.

Gemäß einer ersten Ausführungsform erfolgt die Verlängerungsreaktion durch Anfügen eines einzelnen, fluoreszenzmarkierten Kettenabbruchmole­ küls an den oder die Startprimer (siehe Abb. 1a für ein Beispiel). Als Kettenabbruchmoleküle werden bevorzugt die Didesoxynukleotide ver­ wendet. Es ist aber auch möglich, anders modifizierte Desoxyribonuklein­ säuren zu verwenden, sofern diese noch von den verwendeten Enzymen erkannt werden. Denkbar ist beispielsweise, die 3'-Position des Desox­ yribosemoleküls durch ein Halogenatom oder einen Alkyl- oder Alkoxyrest zu modifizieren. According to a first embodiment, the extension reaction takes place by adding a single, fluorescence-labeled chain termination molecule to the start primer (s) (see Fig. 1a for an example). The dideoxynucleotides are preferably used as chain termination molecules. However, it is also possible to use differently modified deoxyribonucleic acids, provided that these are still recognized by the enzymes used. It is conceivable, for example, to modify the 3'-position of the deoxyribose molecule by a halogen atom or an alkyl or alkoxy radical.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können mehrere hintereinander liegende Nukleotide charakterisiert werden. In diesem Fall wird die Beendigung der Verlängerungsreaktion nicht durch den Einbau eines geeigneten Kettenabbruchmoleküls, sondern durch einen Blockprimer erzwungen (siehe Abb. 1b für ein Beispiel). Der Block­ primer ist stromabwärts des zu untersuchenden Polymorphismus an die Nukleinsäurematrize gebunden und ist selbst gegen Verlängerung an sei­ nem 3'-Ende durch geeignete chemische Modifikation geschützt. Beispiels­ weise kann das am weitesten stromabwärts gelegene Nukleotid des Block­ primers ein Kettenabbruchmolekül sein. Auch bei dieser Ausführungsform ist es möglich, mehrere unterschiedlich kodierte Start/Blockprimerpaare, die an verschiedenen Stellen an die Matrize binden können, einzusetzen (siehe Abb. 1c für ein Beispiel).According to a second embodiment of the present invention, a plurality of nucleotides lying one behind the other can be characterized. In this case, the termination of the extension reaction is not forced by the incorporation of a suitable chain termination molecule, but by a block primer (see Fig. 1b for an example). The block primer is bound to the nucleic acid matrix downstream of the polymorphism to be examined and is itself protected against extension at its 3 'end by suitable chemical modification. For example, the most downstream nucleotide of the block primer can be a chain termination molecule. In this embodiment, too, it is possible to use several differently coded start / block primer pairs which can bind to the matrix at different locations (see Fig. 1c for an example).

Die Blockierung der Blockprimer kann, gegebenfalls mit Ausnahme der Blockierung des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers, reversibel sein. Zur reversiblen Blockierung kann eine abspaltbare Schutz­ gruppe, beispielsweise eine photolabile Schutzgruppe verwendet werden. Besonders bevorzugt tragen die Blockprimer am 3'-Ende eine Phosphat­ gruppe an der 3'-Position des Zuckers. Diese Phosphatgruppe am 3'-Ende verhindert die Elongation durch Polymerase und kann zur Deblockierung ohne weiteres mit einer 3'-Phosphatase abgespalten werden.Blocking of the block primers can, with the exception of the Blocking the most downstream binding primer, be reversible. A removable protection can be used for reversible blocking group, for example a photolabile protecting group can be used. The block primers particularly preferably carry a phosphate at the 3 'end group at the 3 'position of the sugar. This phosphate group at the 3 'end prevents elongation by polymerase and can lead to deblocking can be easily removed with a 3'-phosphatase.

Nach der Verlängerungsreaktion des Startprimers besteht noch keine kova­ lente Bindung zum unmittelbar stromabwärts liegenden Blockprimer. Diese Bindung kann aber geknüpft werden, zum Beispiel enzymatisch mit einer Ligase. Die Ligation läuft wesentlich leichter ab, wenn die Blockprimer an ihrem 5'-Ende eine Phosphatgruppe tragen.There is no kova after the extension reaction of the start primer lent binding to the immediately downstream block primer. This Binding can, however, be made, for example enzymatically with a Ligase. The ligation is much easier when the block primers start carry a phosphate group at their 5 'end.

Gemäß einer dritten Ausführungsform kann/können die Lücke(n) zwischen Paaren aus einem durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimer und dem jeweils stromabwärts liegenden Blockprimer nach Entfernung der 3'-Blockierung der Blockprimer durch Desoxyribonukleotide aufgefüllt werden und kovalente Bindungen zwischen den verlängerten Blockprimern und den unmittelbar stromabwärts liegenden Startprimern geschlossen werden (siehe Abb. 1d für ein Beispiel). Dazu tragen die Blockprimer bevorzugt ein 5'-Phosphat. Bei dieser Ausführungsform ist es nicht unbe­ dingt erforderlich, die verschiedenen Start/Blockprimerpaare mit Kodierun­ gen zu versehen.According to a third embodiment, the gap (s) between pairs of a start primer extended by fluorescent nucleotides and the downstream block primer after removal of the 3 'blockage of the block primers can be filled by deoxyribonucleotides and covalent bonds between the extended block primers and the immediate ones downstream start primers are closed (see Fig. 1d for an example). For this purpose, the block primers preferably carry a 5'-phosphate. In this embodiment, it is not absolutely necessary to provide the various start / block primer pairs with coding.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Kombination der Ketten­ abbruchmarkierung mit einem Nachweis in vollständig oder teilweise trans­ parenten Mikrowells (siehe Patentanmeldung DE 100 23 421.6). Dieses Verfahren umfasst die Schritte:
Another object of the invention is the combination of the chain termination marker with detection in completely or partially transparent microwells (see patent application DE 100 23 421.6). This procedure includes the steps:

  • a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, bestehend aus einer einzelsträngigen Nuklein­ säurematrize und einem Startprimer,a) Providing a carrier particle with an immobilized thereon Nucleic acid molecule consisting of a single-stranded nucleotide acid matrix and a primer,
  • b) Verlängern des Startprimers durch ein fluoreszenzmarkiertes Ketten­ abbruchmolekül,b) Extending the start primer by a fluorescence-labeled chain demolition molecule,
  • c) gegebenenfalls Waschen des Wells zur Abtrennung von nicht einge­ bauten Markierungen undc) optionally washing the well to separate from not built markings and
  • d) Nachweisen der in den Startprimer eingebauten Fluoreszenzmarkie­ rung.d) Detect the fluorescent label built into the start primer tion.

Je nach Anordnung der die Fluoreszenz anregenden Lichtquelle und des Detektors ist die Verwendung ganz oder teilweise transparenter Mikrowells erforderlich. Die Anregung oder/und der Nachweis der Fluoreszenz kann beispielsweise durch einen in den Mikrowell integrierten Halbleiterlaser oder/und Halbleiterdetektor erfolgen (siehe Abb. 2 für ein Beispiel). Die Anregungslichtquelle oder/und der Detektor können aber auch außer­ halb der Mikrostruktur liegen. Das Verfahren eignet sich hervorragend zur Automatisierung, da eine Vielzahl von Reaktionen auf einer Mikrowellplatte parallel oder sequenziell durchgeführt werden können. Depending on the arrangement of the light source that stimulates the fluorescence and the detector, the use of fully or partially transparent microwaves is necessary. The excitation or / and the detection of the fluorescence can take place, for example, by means of a semiconductor laser and / or semiconductor detector integrated in the microwave (see Fig. 2 for an example). However, the excitation light source and / or the detector can also lie outside the microstructure. The method is ideal for automation, since a large number of reactions can be carried out in parallel or sequentially on a microwave plate.

Falls die Menge an Startprimer und die Menge an eingesetztem markiertem Nukleotid gering (nM) gehalten wird, kann die Unterscheidung von einge­ bauten und nicht eingebauten Kettenabbruchmolekülen beispielsweise durch FCS (Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie) wie weiter oben erläutert erfolgen. Alternativ können, wie ebenfalls oben erläutert, Energietrans­ ferprozesse ausgenützt werden.If the amount of start primer and the amount of marked marked Nucleotide is kept low (nM), the distinction from one built and not built chain termination molecules, for example by FCS (fluorescence correlation spectroscopy) as explained above respectively. Alternatively, as also explained above, energy trans processes are exploited.

Alternativ und bevorzugt werden höhere, z. B. µM Konzentrationen an Primer und Kettenabbruchmolekülen eingesetzt, weil die Inkubationszeit dann geringer gehalten werden kann. Zumindest die Kettenabbruchmole­ küle müssen dann allerdings nach der Primerverlängerungsreaktion durch einen Waschschritt wieder entfernt werden. Dazu können Mikrowells mit einem oder mehreren kleinen Löchern oder einer Größenausschlussmem­ bran verwendet werden, welche die markierte, an ein Trägerpartikel gebun­ dene DNA zurückhalten und die unmarkierten Kettenabbruchmoleküle durchlassen (siehe z. B. Abb. 2).Alternatively and preferably, higher, e.g. B. µM concentrations of primer and chain termination molecules used because the incubation time can then be kept shorter. At least the chain termination molecules have to be removed by a washing step after the primer extension reaction. For this purpose, microwells with one or more small holes or a size exclusion membrane can be used, which retain the labeled DNA bound to a carrier particle and allow the unlabelled chain termination molecules to pass through (see e.g. Fig. 2).

Verschiedene Kombinationen von Startprimern und Kettenabbruchmolekü­ len sind denkbar. Im einfachsten Fall werden für die Charakterisierung eines SNPs zwei oder mehr (bis zu vier) Wells mit nur jeweils einem fluoreszenz­ markiertes Kettenabbruchmolekül und dem Startprimer, dessen 3'-Ende unmittelbar vor dem zu untersuchenden Nukleotid hybridisiert, beladen. Nur in einem der Wells kommt es zu einer Elongationsreaktion. Da bekannt ist, welcher Well welches Kettenabbruchmolekül enthält, kann für alle Ketten­ abbruchmoleküle die gleiche Fluoreszenzmarkierung verwendet werden. Da die Verlängerungsreaktion abbricht, wenn nicht das richtige Nukleotid für die Verlängerung vorhanden ist, können in diesem Fall auch Desoxynukleo­ tide verwendet werden. Bevorzugt wird aber ein Kettenabbruchmolekül wie zuvor beschrieben, zum Beispiel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP und ddGTP zur Verfügung gestellt. Bevor­ zugt wird eine Festphase mit einer Vielzahl von Wells wie beispielsweise in Patentanmeldung DE 100 23 421.6 beschrieben verwendet. In einem einzigen Ansatz können auf diese Weise eine Vielzahl von SNPs parallel untersucht werden. Vorzugsweise erfolgt hier eine parallele Detektion von jeweils 4 Wells.Different combinations of start primers and chain termination molecules len are conceivable. In the simplest case, for the characterization of a SNPs two or more (up to four) wells with only one fluorescence each labeled chain termination molecule and the start primer, its 3 'end hybridized immediately before the nucleotide to be examined, loaded. Just An elongation reaction occurs in one of the wells. Since it is known which well contains which chain termination molecule can be used for all chains termination molecules the same fluorescent label can be used. There the extension reaction stops if the correct nucleotide for the extension is present, in this case also deoxynucleo tide can be used. However, a chain termination molecule such as is preferred previously described, for example selected from the group consisting of ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP and ddGTP provided. before a solid phase with a multiplicity of wells, for example in Patent application DE 100 23 421.6 described used. In one  single approach allows multiple SNPs in parallel to be examined. A parallel detection of preferably takes place here 4 wells each.

Es ist aber auch möglich, einen Startprimer zusammen mit mehreren, vorzugsweise vier verschiedenen Kettenabbruchmolekülen entsprechend den vier Nukleobasen einzusetzen. Die Kettenabbruchmoleküle müssen dann allerdings verschiedene Markierungsgruppen tragen. Eine Unterschei­ dung der Markierungsgruppen ist über die Wellenlänge des anregenden und/oder emittierten Lichts oder über die Lebensdauer des angeregten Zustands möglich. Die Messung der Lebensdauer des angeregten Zustands erfolgt durch Messung der Fluoreszenzabklingzeit (FD, fluorescence decay). Bei dieser Messmethode wird das zu untersuchende Molekül durch einen gepulsten Laser (z. B. einen mode locked laser) angeregt. Die Detektion der emittierten Fluoreszenzphotonen erfolgt als Funktion der Zeit seit dem Abklingen des Laserpulses, dessen zeitliche Dauer klein gegenüber der zeitlichen Lebensdauer des zu untersuchenden angeregten Zustands sein muss.However, it is also possible to use a start primer together with several preferably corresponding to four different chain termination molecules to use the four nucleobases. The chain termination molecules must then wear different marker groups. A difference The marker groups are formed over the wavelength of the stimulating and / or emitted light or over the life of the excited Condition possible. The measurement of the lifetime of the excited state is done by measuring the fluorescence decay time (FD, fluorescence decay). With this measurement method, the molecule to be examined is replaced by a pulsed laser (e.g. a mode locked laser). The detection of the emitted fluorescence photons occurs as a function of time since Decay of the laser pulse, the duration of which is short compared to that the lifetime of the excited state to be examined got to.

In speziellen Fällen ist es möglich, mit mehreren Startprimern und mehreren Kettenabbruchmolekülen im einem Well zu arbeiten. Ist beispielsweise von einem SNP bekannt, dass nur eine der Basen A oder T zu erwarten ist, und ist von einem weiteren SNP bekannt, dass nur entweder G oder C auf­ treten, so können die beiden Polymorphismen parallel untersucht werden. Weitere Situationen, in denen aufgrund zusätzlicher Information über die Polymorphismen mehrere Nukleotidpositionen gleichzeitig untersucht wer­ den können, sind für den Fachmann leicht ersichtlich.In special cases it is possible to use multiple start primers and several Chain termination molecules work in a well. For example, from an SNP knows that only one of bases A or T is expected, and is known from another SNP that only has either G or C on it occur, the two polymorphisms can be examined in parallel. Other situations where additional information about the Polymorphisms of several nucleotide positions are examined simultaneously those who can are readily apparent to those skilled in the art.

Mit noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können auch mehrere SNPs gleichzeitig untersucht werden, selbst wenn an den Polymorphismusstellen mit dem Auftreten aller vier Nukleotide ge­ rechnet werden muss. Dazu wird für jede Polymorphismusstelle ein Start­ primer eingesetzt, dessen 3'-Ende unmittelbar stromaufwärts von dem jeweils zu charakterisierenden Nukleotid liegt. Anschließend erfolgt die Verlängerungsreaktion mit den markierten Kettenabbruchmolekülen. In einem weiteren Schritt werden dann zu ausgewählten Restriktionsschnitt­ stellen komplementäre Startprimer zugegeben, so dass ein Verdau der Nukleinsäurematrix in Fragmente charakteristischer Länge erfolgen kann. Durch Untersuchung des Diffusionsverhaltens der Fragmente mittels FCS können die Fluoreszenzsignale dann den einzelnen polymorphen Nuklein­ säurepositionen zugeordnet werden.With yet another embodiment of the present invention several SNPs can be examined at the same time, even if on the polymorphism sites with the appearance of all four nucleotides must be expected. There is a start for each polymorphism point  primer used, the 3 'end immediately upstream of the lies in each case to be characterized nucleotide. Then the Extension reaction with the labeled chain termination molecules. In a further step then becomes a selected restriction cut make complementary start primers added so that a digestion of the Nucleic acid matrix can be made in fragments of characteristic length. By examining the diffusion behavior of the fragments using FCS the fluorescence signals can then reach the individual polymorphic nucleus acid positions can be assigned.

Ein prinzipiell analoges Vorgehen ist möglich, wenn statt der Restriktase eine sequenzspezifische Ligase verwendet wird. Sequenzspezifische Liga­ tion läßt sich beispielsweise durch "rückwärts" betriebene Restriktasen er­ reichen. Da die Hydrolysereaktion ein Molekül Wasser verbraucht und die Ligationsreaktion ein Molekül Wasser freisetzt, läßt sich das Gleichgewicht in Richtung der Ligation verschieben, indem man ein möglichst wasser­ freies Reaktionsmedium verwendet. Im analogen Fall von Proteasen wurde "Rückwärtsbetrieb" des Enzyms erfolgreich realisiert durch den Zusatz großer Mengen von Polyethylenglycol oder organischen Lösungsmitteln zum Reaktionspuffer.A basically analogous procedure is possible if instead of the restrictase a sequence-specific ligase is used. Sequence specific league tion can, for example, by "reverse" operated restrictases pass. Because the hydrolysis reaction consumes one molecule of water and the Ligation reaction releases a molecule of water, the equilibrium move towards the ligation by using as much water as possible free reaction medium used. In the analogous case of proteases "Reverse operation" of the enzyme successfully accomplished through the addition large amounts of polyethylene glycol or organic solvents to the reaction buffer.

Für alle beschriebenen Ausführungsformen besitzt das Trägerpartikel bevor­ zugt eine Größe im Bereich von 0,5 bis 10 µm und besonders bevorzugt von 1 bis 3 µm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle wie Silicium, Metalloxide wie Siliciumdioxid oder Verbundmaterialien, die meh­ rere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststof­ fen oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt. For all described embodiments, the carrier particle has before adds a size in the range of 0.5 to 10 microns and particularly preferred from 1 to 3 µm. Examples of suitable materials for carrier particles are Plastics such as polystyrene, glass, quartz, metals or semi-metals such as Silicon, metal oxides such as silicon dioxide or composite materials, the meh rere of the aforementioned components included. Particularly preferred become optically transparent carrier particles, for example made of plastic fen or particles with a plastic core and a silicon dioxide shell used.  

Die Immobilisierung an ein Trägerpartikel kann entweder über die Matrize oder über den Startprimer erfolgen. Für das Verfahren ist es dabei unerheb­ lich, zu welchem Zeitpunkt der Immobilisierungsschritt erfolgt. Dieser Schritt ist möglich i) vor dem Hybridisierungsschritt, ii) nach dem Hybridis­ ierungsschritt, aber vor Verlängerung des Startprimers durch das Ketten­ abbruchmolekül, und bevorzugt, iii) nach der Verlängerungsreaktion. Der Vorteil der späten Immobilisierung besteht darin, dass ein möglicherweise störender Einfluss der Trägers auf die Hybridisierungs- und Verlängerungs­ reaktion vermieden wird.Immobilization to a carrier particle can be done either via the template or via the start primer. It is irrelevant to the procedure at what time the immobilization step takes place. This Step is possible i) before the hybridization step, ii) after the hybridis step, but before the start primer is extended by the chain termination molecule, and preferably, iii) after the extension reaction. The The advantage of late immobilization is that one may disruptive influence of the wearer on the hybridization and extension reaction is avoided.

Die Bindung des Startprimers oder der Nukleinsäurematrize an den Träger kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z. B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti-Hapten- Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden. So können biotinylierte Nukleinsäuremoleküle an Streptavidin-beschichtete Träger gekoppelt wer­ den. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv an den Träger gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen modifizierten Nukleinsäuremolekülen an metallische Träger, z. B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive Silangruppen auf einer Silika-Oberfläche vermittelt werden kann. Falls ein Gemisch aus zwei oder mehr an der Stelle des Einzelnukleotidpoly­ morphismus verschiedenen DNA-Molekülen als Matrize vorliegt, ist es wie bei der Einzelmolekülsequenzierung günstig, nur höchstens ein Molekül der Matrize oder des Startprimers an ein einzelnes Trägerpartikel zu binden. Dies läßt sich durch einen hinreichend hohen molaren Überschuß an Träger­ partikel gegenüber der Matrize oder dem Startprimer leicht erreichen.The binding of the start primer or the nucleic acid template to the support can occur through covalent or non-covalent interactions. For example, the binding of the polynucleotides to the carrier can be achieved by high affinity interactions between the partners of a specific Binding pair, e.g. B. biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten Antibodies, sugar / lectin etc. can be conveyed. So biotinylated Nucleic acid molecules coupled to streptavidin-coated supports the. Alternatively, the nucleic acid molecules can also be adsorptively attached to the Carrier be tied. A bond can be made by installing Alkanethiol groups modified nucleic acid molecules on metallic Carrier, e.g. B. gold carrier. Another alternative is that covalent immobilization, the binding of the polynucleotides via reactive silane groups can be mediated on a silica surface. If a mixture of two or more at the site of the single nucleotide poly morphism different DNA molecules as a template, it is like favorable for single molecule sequencing, only one molecule at most To bind the matrix or the primer to a single carrier particle. This can be achieved by using a sufficiently high molar excess of carrier easily reach particles opposite the matrix or the primer.

Fall die als Matrize verwendeten DNA-Moleküle dagegen alle einheitlich sind, ist es insbesondere für die Ausführungsform der Erfindung in Mikro­ wells sogar günstig, mehrere Moleküle Matrize oder Startprimer an ein Trägerpartikel zu binden. Der Exonukleaseverdau führt dann zur Abspaltung mehrerer identischer fluoreszenzmarkierter Kettenabbruchmoleküle, so dass sich das Fluoreszenzsignal und damit das Signal- zu Rauschverhältnis verbessert.On the other hand, if the DNA molecules used as a template are all uniform it is particularly for the embodiment of the invention in micro  wells even cheap, multiple molecules of matrix or primer on one Bind carrier particles. The exonuclease digestion then leads to cleavage of several identical fluorescence-labeled chain termination molecules, so that the fluorescence signal and thus the signal to noise ratio improved.

Bei der Verwendung mehrerer fluoreszenzmarkierter Komponenten bei den erfindungsgemäßen Polymorphismuscharakterisierungen entsteht das Prob­ lem, die verschiedenen Markierungen wirksam zu trennen. Wie weiter oben beschrieben kann dies unter anderem durch die Verwendung verschiedener Wellenlängen bei der Anregung und Emission von Fluoreszenzlicht erfolgen. Die spektrale Aufspaltung erfolgt dabei gemäß dem Stand der Technik mit dichroischen Spiegeln. Nachteil bei diesem Vorgehen sind die vergleichs­ weise hohen Verluste, insbesondere bei der spektalen Aufspaltung der vom Fluorophor emittierten Photonen. Überraschend wurde gefunden, dass die Verluste verringert werden können, wenn die spektrale Aufspaltung statt mit einem dichroischen Spiegel mit einem Dispersionselement wie etwa einem Gitter, z. B. einem holographischen oder geritzten Gitter oder einem Prisma erfolgt (siehe Abb. 3). Dabei ist es günstig, die Reflexionen beim Eintritt des Lichts in das Dispersionselement oder/und beim Austritt des Lichts aus dem Dispersionselement z. B. durch geeignete Beschichtung der Glasoberflächen bei einem Prisma möglichst vollständig unterdrückt werden. Die Verwendung eines Dispersionselements statt eines di­ chroischen Spiegels ist nicht auf die Verwendung bei der Charakterisierung von Nukleotidpolymorphismen beschränkt. Sie ist ebenfalls möglich beim direkten Nachweis von Einzelmolekülen (siehe z. B. Anmeldung DE 102 23 423.2), bei Einzelmolekülsequenzierungsverfahren (siehe z. B. Anmeldung DE 100 31 840.1), bei Verfahren zur Selektion von Partikeln (siehe z. B. Anmeldung DE 100 31 842.8), bei Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden (siehe z. B. Anmeldung DE 100 23 421.6), bei Verf­ ahren zur Auftrennung von markierten Biopolymeren (siehe z. B. Anmeldung DE 100 23 422.4) und bei Multiplexsequenzierverfahren (siehe z. B. Anmel­ dung DE 100 31 842.8).If several fluorescence-labeled components are used in the polymorphism characterizations according to the invention, the problem arises of effectively separating the different labels. As described above, this can be done, among other things, by using different wavelengths in the excitation and emission of fluorescent light. The spectral splitting takes place according to the prior art with dichroic mirrors. The disadvantage of this procedure is the comparatively high losses, especially in the spectral splitting of the photons emitted by the fluorophore. Surprisingly, it was found that the losses can be reduced if the spectral splitting instead of using a dichroic mirror with a dispersion element such as a grating, e.g. B. a holographic or scratched grating or a prism (see Fig. 3). It is favorable to the reflections when the light enters the dispersion element and / or when the light exits the dispersion element z. B. be suppressed as completely as possible by suitable coating of the glass surfaces in a prism. The use of a dispersion element instead of a di chroic mirror is not limited to use in the characterization of nucleotide polymorphisms. It is also possible for the direct detection of single molecules (see e.g. application DE 102 23 423.2), for single molecule sequencing methods (see e.g. application DE 100 31 840.1), for methods for selecting particles (see e.g. application DE 100 31 842.8), in methods for the detection of polynucleotides (see e.g. application DE 100 23 421.6), in methods for the separation of labeled biopolymers (see e.g. application DE 100 23 422.4) and in multiplex sequencing methods (see e.g. application DE 100 31 842.8).

Abb. 1 zeigt verschiedene Ausführungsformen der Polymorphismus­ charakterisierung. In (a) erfolgt die Verlängerung des Start­ primers um ein einziges fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruch­ molekül. In (b) wird der Startprimer durch unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Desoxynukleotide bis zum 3'-Ende eines stromabwärts bindenden Blockprimers verlängert. Der Block­ primer selbst ist an seinem 3'-Ende blockiert, so dass er nicht verlängert wird. In (c) werden mehrere Start/Blockprimerpaare eingesetzt. In diesem Fall ist es erforderlich, die Startprimer durch Fluoreszenzmarker zu kodieren. In (d) werden ebenfalls mehrere Start/Blockprimerpaare eingesetzt, zusätzlich ist die Blockierung der Blockprimer (mit Ausnahme der Blockierung des am weitesten stromabwärts gelegenen Blockprimers) am 3'-Ende reversibel, also beispielsweise eine 3'-Phosphatbloc­ kierung. In einem ersten Schritt werden in Gegenwart der 3'- Blockierung fluoreszierende Nukleotide eingebaut. Nach einem Waschschritt zum Entfernen nicht eingebauter Nukleotide wird dann in einem zweiten Schritt nach Entfernung der 3'-Blockie­ rung die Lücke zwischen Blockprimer und folgendem Start­ primer durch unmarkierte Desoxynukleotide aufgefüllt. Die noch fehlenden kovalenten Bindungen aufeinanderfolgender Nukleotide werden durch Ligase geknüpft. Dargestellt ist das Ergebnis dieses Vorgehens. Fig. 1 shows different embodiments of the polymorphism characterization. In (a) the start primer is extended by a single fluorescence-labeled chain termination molecule. In (b), the start primer is extended to the 3 'end of a downstream-binding block primer by differently fluorescently labeled deoxynucleotides. The block primer itself is blocked at its 3 'end so that it is not extended. In (c) several start / block primer pairs are used. In this case it is necessary to encode the start primers using fluorescent markers. In (d) several start / block primer pairs are also used, in addition the blocking of the block primers (with the exception of the blocking of the most downstream block primer) at the 3'-end is reversible, for example a 3'-phosphate block. In a first step, fluorescent nucleotides are incorporated in the presence of the 3 'blocking. After a washing step to remove unincorporated nucleotides, the gap between the block primer and the subsequent start primer is then filled by unlabelled deoxynucleotides in a second step after removal of the 3 'blockage. The missing covalent bonds of successive nucleotides are linked by ligase. The result of this procedure is shown.

Abb. 2 (a) zeigt eine Draufsicht, (b) eine Seitenansicht eines Mikro­ wells, der sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignet. Fig. 2 (a) shows a top view, (b) a side view of a microwell suitable for use in the present invention.

Abb. 3(a) zeigt die zur Einzelmolekülbestimmung bisher verwendete Optik, (b) zeigt die erfindungsgemäße Optik unter Verwen­ dung eines Dispersionselements zur Auftrennung der verschie­ denen Wellenlängen. Fig. 3 (a) shows the optics previously used for single molecule determination, (b) shows the optics according to the invention using a dispersion element to separate the different wavelengths.

Die Bestimmung kann über die Fluoreszenzintensitäten (Δλ) bei verschiedenen Wellenlängen oder/und über Fluoreszenz- Abklingzeiten (τ) bei verschiedenen Wellenlängen unter Ver­ wendung mehrerer Detektoren erfolgen.The determination can be made using the fluorescence intensities (Δλ) at different wavelengths and / or via fluorescence Cooldowns (τ) at different wavelengths under Ver using several detectors.

Claims (33)

1. Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen, umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize,
  • b) Anlagern von mindestens einem Startprimer an die Nuklein­ säurematrize, wobei das 3'-Ende des Startprimers stromauf­ wärts eines zu untersuchenden Nukleinsäurepolymorphismus liegt,
  • c) Verlängern des Startprimers mit mindestens einem fluores­ zenzmarkierten Nukleotid und
  • d) Nachweisen von in den Startprimer eingebauten Nukleotiden durch Einzelmolekülbestimmung.
1. A method for characterizing nucleic acid polymorphisms, comprising the steps:
  • a) providing a nucleic acid template to be examined,
  • b) attaching at least one start primer to the nucleic acid matrix, the 3 'end of the start primer being upstream of a nucleic acid polymorphism to be examined,
  • c) extending the start primer with at least one fluorescence-labeled nucleotide and
  • d) Detection of nucleotides built into the start primer by single-molecule determination.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis von eingebauten Nukleotiden eine Separation des verlängerten Startprimers von nicht eingebauten Nukleotiden umfasst.2. The method according to claim 1, characterized, that the detection of incorporated nucleotides is a separation of the extended primers of unincorporated nucleotides includes. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des eingebauten Nukleotids eine zumindest teilweise Sequenzbestimmung des verlängerten Startprimers umfasst.3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that the detection of the built-in nucleotide is at least one partial sequence determination of the extended start primer includes. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung der Einzelmolekülbestimmung der Startprimer an ein Trägerpartikel gekoppelt wird. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that to carry out the single-molecule determination of the start primer is coupled to a carrier particle.   5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelmolekülsequenzbestimmung die Schritte umfasst:
  • a) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
  • b) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
  • c) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,
  • d) zumindest teilweises Bestimmen der Basenfolge des Nuklein­ säuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nu­ kleotidbausteine.
5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that the single molecule sequence determination comprises the steps:
  • a) introducing the carrier particle into a sequencing device comprising a microchannel,
  • b) holding the carrier particle in the sequencing device,
  • c) progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecule,
  • d) at least partially determining the base sequence of the nucleic acid molecule on the basis of the sequence of the cleaved nucleotide building blocks.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Abspaltung von an den Startprimer angehängten Nukleotiden durch eine Exonuklease, insbesondere durch T7-DNA-Polymerase als Exonuklease, E. coli Exonuklease I oder E. coli Exonuklease III erfolgt.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that an enzymatic cleavage of the start primer attached nucleotides by an exonuclease, in particular by T7 DNA polymerase as exonuclease, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein einziger Startprimer verwendet wird.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that a single primer is used. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Startprimer verwendet werden.8. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized, that multiple start primers are used. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verlängerungsreaktion das Anfügen eines einzigen fluoreszenzmarkierten Kettenabbruchmoleküls umfasst. 9. The method according to any one of claims 7 or 8, characterized, that the extension reaction is adding a single one fluorescence-labeled chain termination molecule.   10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Kettenabbruchmolekül um ein Didesoxynukleotid handelt.10. The method according to claim 9, characterized, that the chain termination molecule is a Dideoxynucleotide. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verlängerungsreaktion das Anfügen mehrerer fluoreszenzmarkierter Nukleinsäurebausteine umfasst.11. The method according to any one of claims 7 or 8, characterized, that the extension reaction is adding several fluorescence-labeled nucleic acid building blocks. 12. Verfahren nach Anspruch 1 l, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Paare von Start- und Blockprimern eingesetzt werden, wobei das 5'-Ende jedes Blockprimers in einem vorbestimmten Abstand stromabwärts des 3'-Endes des zugehörigen Startprimers an die Nukleinsäurematrize bindet, wobei das 3'-Ende des Blockprimers blockiert ist.12. The method according to claim 1 l, characterized, that one or more pairs of start and block primers are used with the 5 'end of each block primer in one predetermined distance downstream of the 3 'end of the associated one Start primer binds to the nucleic acid template, the 3 'end of the block primer is blocked. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Paare von Start- und Blockprimern eingesetzt werden und die Start/Blockprimerpaare anhand unterschiedlicher Kodierungen identifiziert werden können.13. The method according to claim 12, characterized, that several pairs of start and block primers are used and the start / block primer pairs using different ones Codings can be identified. 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Blockierung des 3'-Endes der Blockprimer, gegebenenfalls mit Ausnahme des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers reversibel ist. 14. The method according to claim 12 or 13, characterized, that blocking the 3 'end of the block primer, if necessary with the exception of the most downstream binding Block primer is reversible.   15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Blockprimer verwendet werden, die eine 3'-Phosphatgruppe tragen.15. The method according to any one of claims 12 to 14, characterized, that block primers are used that have a 3'-phosphate group wear. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine kovalente Bindung zwischen dem durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimer und dem Blockprimer geschlossen wird.16. The method according to any one of claims 12 to 15, characterized, that a covalent bond between that by fluorescent Nucleotides extended start primer and the block primer is closed. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung enzymatisch, zum Beispiel unter Verwendung einer Ligase geschlossen wird.17. The method according to any one of claims 12 to 16, characterized, that the covalent bond is enzymatic, for example under Closed using a ligase. 18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Blockprimer eine 5'-Phosphatgruppe trägt.18. The method according to claim 16 or 17, characterized, that at least one block primer carries a 5'-phosphate group. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lücke(n) zwischen den durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimern und den jeweils stromabwärts liegenden Blockprimern nach Entfernung der 3'-Blockierung der Blockprimer durch Desoxyribonukleotide aufgefüllt werden und kovalente Bindungen zwischen den verlängerten Blockprimern und den unmittelbar stromabwärts liegenden Startprimern geschlossen werden. 19. The method according to any one of claims 14 to 18, characterized, that the gap (s) between by fluorescent nucleotides extended start primers and the downstream ones Block primers after removal of the 3 'blockage of the block primers be filled up by deoxyribonucleotides and covalent Bonds between the extended block primers and the Start primers immediately downstream become.   20. Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen in einem Mikrowell, umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immo­ bilisierten Nukleinsäuremolekül, bestehend aus einer einsträn­ gigen Nukleinsäurematrize und einem Startprimer,
  • b) Verlängern des Startprimers durch ein fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruchmolekül,
  • c) gegebenenfalls Waschen des Wells zur Abtrennung von nicht eingebauten Markierungen und
  • d) Nachweisen der in den Startprimer eingebauten Fluoreszenz­ markierung.
20. A method for characterizing nucleic acid polymorphisms in a microwave, comprising the steps:
  • a) providing a carrier particle with a nucleic acid molecule immobilized thereon, consisting of a single-stranded nucleic acid matrix and a start primer,
  • b) extension of the start primer by a fluorescence-labeled chain termination molecule,
  • c) optionally washing the well to separate non-installed markings and
  • d) Detect the fluorescent label built into the start primer.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Anregung oder/und zum Nachweis der Fluoreszenz ein in den Mikrowell integrierter Halbleiterlaser oder/und Halbleiterdetektor verwendet wird.21. The method according to claim 20, characterized, that for excitation and / or detection of fluorescence an in the microwave integrated semiconductor laser and / or semiconductor detector is used. 22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Reaktionen auf einer Mikrowellplatte parallel oder sequenziell durchgeführt wird.22. The method according to claim 20 or 21, characterized, that a variety of reactions on a microwave plate in parallel or is performed sequentially. 23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verlängerung des Startprimers nur eine Art von markiertem Nukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP, ddGTP zur Verfügung steht. 23. The method according to any one of claims 20 to 22, characterized, that to extend the start primer only one kind of marked Nucleotide selected from the group consisting of ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP, ddGTP is available.   24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verlängerung des Startprimers mehrere, durch ihre Fluoreszenzmarkierung unterscheidbare Kettenabbruchmoleküle zur Verfügung stehen.24. The method according to any one of claims 20 to 22, characterized, that to extend the start primer several, by their Fluorescent labeling distinguishable chain termination molecules for To be available. 25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägerpartikel aus Kunststoff, Glas, Quarz, Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden oder aus einem Verbundmaterial verwendet.25. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that a carrier particle made of plastic, glass, quartz, metals, Semi-metals, metal oxides or from a composite material used. 26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpartikel einen Durchmesser von 1 nm bis 10 µm aufweist.26. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the carrier particle has a diameter of 1 nm to 10 µm having. 27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäurematrix auf dem Trägerpartikel über ihren 5'-Terminus oder der Startprimer über seinen 3'-Terminus mittels bioaffiner Wechselwirkungen immobilisiert wird.27. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the nucleic acid matrix on the carrier particle over their 5'-terminus or the start primer via its 3'-terminus using bioaffinic interactions are immobilized. 28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein biotinyliertes Nukleinsäuremolekül an ein Avidin- oder Streptavidin-beschichtetes Trägerpartikel immobilisiert wird. 28. The method according to claim 1, characterized, that a biotinylated nucleic acid molecule to an avidin or Streptavidin-coated carrier particle is immobilized.   29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterscheidung verschiedener Fluoreszenzmarkierungen aufgrund der Wellenlänge, der Lebensdauer des angeregten Zustands oder einer Kombination daraus erfolgt.29. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that differentiating different fluorescent labels due to the wavelength, the lifetime of the excited State or a combination thereof. 30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch konfokale Einzelmoleküldetektion oder/und durch zeitaufgelöste Abklingmessung erfolgt.30. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that determination by confocal single molecule detection or / and by time-resolved decay measurement. 31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Messung eines kreuzkorrelierten Signals umfasst, das von einem, mindestens 2 unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden Nukleinsäuremolekül oder Nukleinsäuremolekül-Komplex stammt.31. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the determination is the measurement of a cross-correlated signal includes that of one, at least 2 different Containing markings, in particular fluorescent markings Nucleic acid molecule or nucleic acid molecule complex. 32. Verfahren zur Steigerung der Detektionseffizienz beim Nachweis der Fluoreszenz von Einzelmolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass zur Trennung des Lichts verschiedener Wellenlängen ein Dispersionselement verwendet wird.32. Method for increasing the detection efficiency in the detection of Fluorescence of single molecules, characterized, that to separate the light of different wavelengths Dispersion element is used. 33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Dispersionselement ein Prisma oder Gitter verwendet wird.33. The method according to claim 32, characterized, that a prism or grating is used as the dispersion element.
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