DE10053251A1 - Epitope von PAI-1 - Google Patents

Abstract

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der kardiovaskulären und thromboembolischen Erkrankungen oder der Krebs- und damit verwandten Erkrankungen. Die Erfindung steht in Beziehung mit Proteinen, mit Peptiden, die bestimmte Epitope des Plasminogenaktivator-Inhibitors vom Typus 1 (PAI-1) umfassen, und mit Nucleinsäuren, welche die genannten Proteine oder Peptide codieren. Des weiteren steht die Erfindung in Beziehung mit Verfahren zum Screening nach Substanzen, die fähig sind, den genannten PAI-1 zu hemmen, mit Substanzen, die mit diesem Verfahren identifizierbar sind, und mit Arzneimittelzusammensetzungen, welche die genannten Substanzen umfassen.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der kardiovaskulären und thromboembolischen Erkrankungen oder der Krebs- und damit verwandten Erkrankungen. Die Erfindung steht in Beziehung mit Proteinen, mit Peptiden, die bestimmte Epitope des Plasminogenaktivator- Inhibitors vom Typus 1 (PAI-1) umfassen, und mit Nucleinsäuren, welche die genannten Proteine oder Peptide codieren. Des weiteren steht die Erfindung in Beziehung mit Verfahren zum Screening nach Substanzen, die fähig sind, den genannten PAI-1 zu hemmen, mit Substanzen, die mit diesem Verfahren identifizierbar sind, und mit Arzneimittelzusammensetzungen, welche die genannten Substanzen umfassen.

Hintergrund der Erfindung

Seit der Identifikation des Plasminogenactivator-Inhibitors vom Typus 1 (PAI-1) im Plasma im Jahre 1984 (1) wurde in zahlreichen Untersuchungen dessen Regulationsrolle bei der Fibrinolyse abgeklärt. Tatsächlich hemmt PAI-1 (2-5) den Gewebe-Typus-Plasminogenactivator (t-PA) durch Bildung eines stabilen kovalenten Komplexes, und er vermindert somit die fibrinolytische Aktivität (6, 7). Die klinische Bedeutung dieser Wechselwirkung ergab sich klar aus verschiedenen Untersuchungen, die den Nachweis der Beziehung zwischen erhöhten PAI-1- Spiegeln und verschiedenen vaskulären Störungen wie venöser Thromboembolie, Koronararterienerkrankung, Myokardinfarkt und Atherosklerose erbrachten (8-10). Ausserdem wurde die Bedeutung von PAI-1 in vivo in Untersuchungen nachgewiesen, in denen transgene Mäuse verwendet wurden, bei denen PAI-1 fehlte (11) oder überexprimiert wurde (12). In Übereinstimmung mit diesen Feststellungen wurde gezeigt, dass monoklonale Antikörper, welche die Aktivität von PAI-1 in vivo hemmen, die Fibrinolyse und die Auflösung von Gerinnseln erhöhen (13-15). Es wurde mehrmals versucht, Mittel zur Modulation von PAI-1 zu entwickeln. Es wurde gezeigt, dass Teilen der Schleife der reaktiven Stelle entsprechende Peptide die Aktivität von PAI-1 neutralisieren (16-18). Zudem wurde berichtet, dass PAI-1 durch verschiedene Verbindungen von niederem Molekulargewicht gehemmt wird (19-25).

Es wurde gezeigt, dass die Neutralisierung der Aktivität von PAI-1 über verschiedene Mechanismen erfolgen kann (26). Mit grosser Wahrscheinlichkeit ist die den verschiedenen Mechanismen zu Grunde liegende molekulare Basis mit der Flexibilität von PAI-1 in bezug auf dessen Funktion und Konformation assoziiert, was innerhalb der Superfamilie der Serin- Proteinase-Inhibitoren ("Serpine") eine einmalige Eigenschaft darstellt (27, 28). Der in einer aktiven Form synthetisierte PAI-1 konvertiert sich spontan zu einer inaktiven, latenten Konformation, die teilweise reaktiviert werden kann (29). Zudem wurde eine nicht-hemmende Substrat-Konformation identifiziert (30-32). Die Abklärung der möglichen Vielfalt von Bindungsbereichen bei verschiedenen hemmenden monoklonalen Antikörpern kann dazu führen, die verschiedenen beteiligten molekularen Mechanismen zu verstehen, und wird die rationelle Gestaltung von PAI-1 neutralisierenden Arzneimitteln unterstützen.

Bisher wurden verschiedene Verfahren verwendet, um den Bindungsbereich von monoklonalen Anti-PAI-1-Antikörpern und von Inhibitoren von niederem Molekulargewicht zu kartieren, einschliesslich der sequentiellen Peptidsynthese (33), der Anzeige von PAI-1-Fragmenten auf fadenförmigen Phagen (34, 35), der Mutanten mit Deletion von PAI-1 (36) und der ortsgerichteten Mutagenese (23, 37).

Zum heutigen Zeitpunkt ist die Homologa suchende Mutagenese, d. h. die Verwendung von chimären Proteinen zur Untersuchung von Funktions- und Bindungsstellen, für verschiedene Proteine einschliesslich PAI-1/PAI-2-Chimären beschrieben worden (38, 39). Letztere ergaben jedoch nicht-funktionsfähige Moleküle, welche für die Prüfung von Funktions- und Bindungsstelle ungeeignet waren (39).

Es stellte sich also das Problem, neue Zielstellen von PAI-1 zu identifizieren.

Kurzfassung der Erfindung

Das vorgenannte technische Problem wird mit den Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen und der Beschreibung gekennzeichnet sind.

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der kardiovaskulären und thromboembolischen Erkrankungen oder der Krebs- und damit verwandten Erkrankungen. Die Erfindung steht in Beziehung mit Proteinen, mit Peptiden, die bestimmte Epitope des Plasminogenaktivator- Inhibitors vom Typus 1 (PAI-1) umfassen, und mit Nucleinsäuren, welche die genannten Proteine oder Peptide codieren. Des weiteren steht die Erfindung in Beziehung mit Verfahren zum Screening nach Substanzen, die fähig sind, den genannten PAI-1 zu hemmen, mit Substanzen, die mit diesem Verfahren identifizierbar sind, und mit Arzneimittelzusammensetzungen, welche die genannten Substanzen umfassen.

LEGENDEN DER FIGUREN

Fig. 1 Human-/Ratten-PAI-1-Chimären. Human-PAI-1 ist in Weiss angegeben, Ratten-PAI-1 ist in Schwarz angegeben. Die Zahl bezieht sich auf die Aminosäure, welche die beiden Spezies voneinander trennt.

Fig. 2 Dosis-Antwort-Kennlinie der Wechselwirkung von MA-33H1F7 (A), MA-33B8F7 (B), MA-8H9D4 (C), MA-42A2F6 (D), MA-44E4 (E) und MA-56A7C10 (F) mit Human-PAI-1 (∎), Ratten-PAI-1 (), hum81rat-PAI-1 (▲), hum187rat-PAI-1 (), hum277rat-PAI-1 (⬩), hum327rat-PAI-1 (⚫), rat26hum-PAI-1 (∆), rat81hum-PAI-1 (∇), rat187hum-PAI-1 (◊) und rat327hum-PAI-1 (○).

Fig. 3 Identifikation, in Human-PAI-1, von vier Bindungsbereichen für PAI-1 hemmende monoklonale Antikörper. (A) Epitop von MA-33H1F7; (B) Bindungsbereich für MA-8H9D4 (AA277-AA327); (C) Bindungsbereich für MA-33B8F7 und MA-44E4 (AA81-AA187); (D) Bindungsbereich für MA-42A2F6 und MA-56A7C10 (AA327-AA379).

Fig. 4 Beispiel eines erfindungsgemässen HTS-Verfahrens (im Beispiel 2 beschrieben).

BESCHREIBUNG

Vor einer Beschreibung der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist zu bemerken, dass die Einzahl-Formen mit vorangestelltem undefiniertem und definiertem Artikel, wie sie im Vorliegenden und in den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, einen Bezug auf die Mehrzahl einschliessen, es sei denn, der Zusammenhang erzwinge klar etwas anderes. So schliesst beispielsweise der Bezug auf "ein Peptid" eine Mehrzahl solcher Peptide ein, der Bezug auf die "Zelle" ist ein Bezug auf eine oder mehrere Zelten und der Fachperson bekannte Äquivalente davon, und so weiter. Sofern sie nicht anders definiert werden, haben alle im Vorliegenden verwendeten technischen und wissenschaftlichen Termini die gleichen Bedeutungen, wie sie herkömmlicherweise von der normalen Fachperson auf dem Gebiet der Erfindung verstanden werden. Obwohl bei der Ausübung oder Untersuchung der Erfindung irgendwelche Verfahren und Materialien verwendbar sind, die denen ähnlich oder äquivalent sind, welche im Vorliegenden beschrieben werden, werden nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben. Alle im Vorliegenden erwähnten Veröffentlichungen werden zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung der Zellinien, Vektoren und Methoden, über die in den Veröffentlichungen berichtet wird und welche im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden könnten, durch den Bezug darauf in das Vorliegende aufgenommen. Nichts ist im Vorliegenden als Zugeständnis auszulegen, dass die Erfindung gegenüber einer solchen Offenbarung kein auf früheres Erfindungsdatum beruhendes Vorrecht haben würde. Die Kürzel der Aminosäuren folgen dem normalen Dreibuchstabencode.

Es wurde ein Verfahren zur Identifikation von neuen Epitopen von PAI-1 erfunden, welches die im vorangehenden erwähnten Nachteile der bekannten Verfahren überwindet, und es wurden neue Epitope von PAI-1 mit überraschenden Eigenschaften und Verwendungen identifiziert. Die Erfindung bezieht sich auf ein Protein oder Peptid, welches das Epitop des Plasminogenaktivator-Inhibitors-1 (PAI-1) umfasst und durch die Aminosäuren 1 bis 26 von PAI-1:

oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon gekennzeichnet ist. Die erfindungsgemässen Proteine oder Peptide umfassen chimäre Human-/Säuger- oder vorzugsweise Human-/Ratten-PAI-1-Proteine, wie im Beispiel 1 veranschaulicht.

Erfindungsgemäss stammen die Proteine oder Peptide vorzugsweise von Säugern wie Nagern (beispielsweise Ratten, Hamstern, Mäusen) oder vom Rind, Pferd, Schwein und am meisten bevorzugt vom Menschen.

"Fragment", wie im Vorliegenden verwendet, ist ein Peptid, das kürzer ist als die angegebene Länge der Aminosäure, beispielsweise von Aminosäure 1 bis 16. "Funktionelles Derivat", wie im Vorliegenden verwendet, ist ein Peptid oder Protein mit einer Modifikation beispielsweise als Punktmutation, wie beispielsweise Deletion, Insertion oder Ersatz einer Aminosäure mit im wesentlichen unveränderten sich daraus ergebenden immunologischen Eigenschaften wie beispielsweise die Antikörperbindung.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein Protein oder Peptid, welches das Epitop von PAI-1 umfasst und durch die Aminosäuren 81-187 von PAI-1:

oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon gekennzeichnet ist.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein Protein oder Peptid, welches das Epitop von PAI-1 umfasst und durch die Aminosäuren 242-327 von PAI-1:

oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon gekennzeichnet ist.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein Protein oder Peptid, welches das Epitop von PAI-1 umfasst und durch die Aminosäuren 327-379 von PAI-1:

oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon gekennzeichnet ist.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein erfindungsgemässes Peptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus den Aminosäuren Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala His Leu Ala Ser Asp Phe Gly Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln Ala (Aminosäuren 1 bis 26 von PAI- 1) besteht.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein erfindungsgemässes Peptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus den Aminosäuren Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp Glu Ile Ser Thr Thr Asp Ala Ile Phe Val Gln Arg Asp Leu Lys Leu Val Gln Gly Phe Met Pro His Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val Lys Gln Val Asp Phe Ser Glu Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn Asp Trp Val Lys Thr His Thr Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Lys Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His Arg Arg (Aminosäuren 81 bis 187 von PAI-1) besteht.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein erfindungsgemässes Peptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus den Aminosäuren Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys Pro Leu Gb Asn Leu Gly Met Thr Asp Met Phe Arg Gin Phe Gln Aia Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu Pro Leu His Val Ala Gin Ala Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu (Aminosäuren 242 bis 327 von PAI-1) besteht.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein erfindungsgemässes Peptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus den Aminosäuren Glu Val Asn Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser Ser Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Val Arg His Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met Glu Pro (Aminosäuren 327 bis 379 von PAI-1) besteht.

Die Erfindung bezieht sich ausserdem auf ein Protein oder Peptid, das zwei oder mehr von den genannten Epitopen von PAI-1 wie im vorangehenden beschrieben oder ein funktionelles Derivat davon umfasst. Das genannte Protein oder Peptid kann die genannten zwei oder mehr Epitope von PAI-1 auf eine solche Weise umfassen, dass sie in Aufeinanderfolge miteinander verbunden sind, oder es kann einen Abstandshalter umfassen, der ein anderes Protein oder Peptid sein kann, oder einen Abstandshalter, der ein von einem Protein verschiedenes chemisches Molekül ist. Human-PAI-1 umfasst selber oder besteht aus der Aminosäuresequenz:

Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist eine Nucleinsäure, welche ein beliebiges der im vorangehenden beschriebenen erfindungsgemässen Proteine oder Peptide codiert. In Kenntnis der erfindungsgemässen Aminosäure kann die Fachperson durch Anwendung von beim Stand der Technik bekannten gängigen Techniken die darunterliegende Nucleinsäuresequenz leicht bestimmen.

Eine geeignete Zelle oder Zellinie, vorzugsweise eine eukaryotische Zelle oder Zellinie, die mit Nucleinsäurekonstrukten zu transformieren ist, um das genannte erfindungsgemässe Peptid oder Protein zu exprimieren, kann eine beliebige der Fachperson bekannte Zelle oder Zellinie sein. Beispiele von solchen Zellen oder Zellinien, die zur Produktion der erfindungsgemässen transformierten Zellinien verwendbar sind, umfassen Säuger-Zellen oder -Zellinien (beispielsweise die Zellinien der humanen Embryo-Niere (HEK) 293, BHK, GH3, H4, U373, NT2, PC12, COS, CHO, Ltk^-, Fibroblaste, Myelome, Neuroblastome, Hybridome, Oozyten, Embryo-Stammzellen), Insekten-Zellinien (beispielsweise die Verwendung von Baculovirus- Vektoren wie pPbac oder pMbac (Stratagene, La Jolla, USA)), Hefe (beispielsweise Pichia pastoris oder die Verwendung von Hefe-Expressionsvektoren wie pYESHIS (Invitrogen, San Diego, USA)), und Pilze.

Eine andere wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Screening nach Substanzen, die fähig sind, PAI-1 zu hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass

• a) ein erfindungsgemässes Peptid oder ein erfindungsgemässes Protein wie im vorangehenden beschrieben oder ein ganzer PAI-1 mit einer Testverbindung in einem geeigneten Puffer inkubiert wird;
• b) tPA oder ein Fragment davon und ein für das Peptid oder Protein wie im vorangehenden beschrieben oder für PAI-1 spezifischer monoklonaler Antikörper und ein für tPA spezifischer monoklonaler Antikörper mit einem Reporter feststellbar markiert werden;
• c) ungebundene Antikörper ausgewaschen werden;
• d) die Menge Reporter gemessen wird; und
• e) der erhaltene Wert mit dem in Abwesenheit der Testverbindung erhaltenen Wert verglichen wird.

Das genannte Verfahren wird auf nicht einschränkende Weise im Beispiel 2 und in Fig. 4 veranschaulicht.

Beispiele von geeigneten Reportergenen, welche bei einem erfindungsgemässen Verfahren zu verwendende Reporter codieren, umfassen, jedoch ohne Einschränkung darauf, E. coli β- Galactosidase (β-gal, Luban und Goff, 1995; Curr. Opin. Biotechnol. 6, 59-64), Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase (Chu und Berg, 1985; Nucleic Acids Res. 13, 2921-2930), Galactokinase (Schumperli et al., 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 257-261), Interleukin-2 (Cullen, 1986; Zelle 46, 973-982), Thymidin-Kinase (Searle et al., 1985; Mol. Cell Biol. 5, 1480-­ 1489), alkalische Phosphatase (Toh et al., 1989; Eur. J. Biochem. 182, 231-237; Henthorn et al., 1988; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6342-6346), sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) oder Plazenta-sekretierte alkalische Phosphatase (Berger et al., 1988, Gene 66, 1-10) und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT, Alton und Vapnek, 1979, Nature 282, 864-869; Gorman et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 1044-1051; Tsang et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8598-8602), von der Leuchtqualle produziertes grün fluoreszierendes Protein (GFP) (Chalfie et al., 1994, Science 263, 802-805), Derivate davon wie beispielsweise blau fluoreszierendes Protein (BFP), Leuchtkäfer-Luciferase (deWet et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 725-737; Engebrecht und Silverman, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 4154-4158). Viele dieser und anderer verwendbarer Reportergene sind im Handel erhältlich.

Expressionsprodukte der Reportergene wie beispielsweise Reporterenzyme können unter Verwendung von gängigen Methoden gemessen werden. Beispielsweise können Biountersuchungen nach biologisch aktiven Proteinen wie beispielsweise Interleukin-2 durchgeführt werden. Enzym-Untersuchungen können durchgeführt werden, wenn das Reportergenprodukt ein Reporterenzym wie beispielsweise alkalische Phosphatase oder β- Galactosidase ist. In der Alternative sind verschiedene Typen von Immunountersuchungen wie beispielsweise kompetitive Immunountersuchungen, direkte Immunountersuchungen und indirekte Immunountersuchungen verwendbar. Solche Immunountersuchungen umfassen die Bildung von Immunokomplexen, welche das Reportergenprodukt und einen messbaren "Reporter" oder einen "Marker" enthalten. Der Terminus "Reporter", wie im Vorliegenden verwendet, umfasst Molekülteile, welche direkt feststellbar sind, wie beispielsweise Fluorochrome und Radiomarker, und Molekülteile wie beispielsweise Enzyme, die umgesetzt oder derivatisiert werden müssen, um feststellbar zu sein.

Eine andere, mehr bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemässes Verfahren, bei welchem das erfindungsgemässe Peptid oder Protein wie im vorangehenden beschrieben oder ganzes PAI-1 auf solche Weise oder mit einem geeigneten Marker markiert wird, mit dem Zweck, die Bindung des genannten Peptids oder Proteins oder PAI-1 an tPA von der Nicht-Bindung oder verminderten Bindung zu unterscheiden.

Eine andere, mehr bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemässes Verfahren, bei welchem der genannte, für das genannte erfindungsgemässe Peptid oder Protein (im vorangehenden beschrieben) oder ganze PAI-1 spezifische Antikörper mit Europiumkryptat markiert wird (vgl. Beispiel 2, Fig. 4).

Eine andere, mehr bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein erfindungsgemässes Verfahren, bei welchem der genannte, für tPA oder ein Fragment davon spezifische Antikörper mit XL665 markiert wird (vgl. Beispiel 2, Fig. 4).

Eine andere, mehr bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, bei welchem dieses Verfahren ein Hochdurchsatzscreening (HTS) oder Ultrahochdurchsatzscreening (UHTS) ist. HTS bezieht sich auf eine Experimentierung, bei der eine grossen Anzahl von Verbindungen gleichzeitig untersucht werden. Vorzugsweise kann die genannte HTS-Experimentierung auf Mikroplatten ausgeführt, teilweise oder vollständig automatisiert, und mit elektronischen Einrichtungen verbunden werden, wie beispielsweise Computer zur Speicherung, Analyse und Interpretation von Daten unter Einsatz der Bioinformatik. Vorzugsweise sind an der genannten Automatisierung Roboter mitbeteiligt, die fähig sind, eine grosse Anzahl von Mikroplatten zu behandeln und einige Tausend Untersuchungen pro Tag durchzuführen. Vorzugsweise wird eine zu untersuchende Verbindung, die eine gewünschte Hemmfunktion in einem zellfreien System aufweist, auch in einem auf Zellen basierenden System untersucht, wobei eine Zellinie verwendet wird, die ein erfindungsgemässes Peptid oder Protein exprimiert. Der Terminus HTS umfasst auch Ultrahochdurchsatzscreening(UHTS)-Formate. Vorzugsweise können die genannten UHTS-Formate unter Verwendung von 384- oder 1536-Loch-Mikroplatten, von Submikroliter- oder Subnanoliter-Pipettiergeräten, von verbesserten Plattenlesern und von Methoden zum Berücksichtigen der Verdampfung ausgeführt werden. HTS-Verfahren sind beispielsweise in US- A-5876946 oder US-A-5902732 beschrieben. Die Fachperson kann das nachstehend beschriebene Verfahren an ein HTS- oder UHTS-Format anpassen, ohne dabei eine erfinderische Tätigkeit aufbringen zu müssen.

Ein anderer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines erfindungsgemässen Proteins oder Peptids wie im vorangehenden beschrieben zur Identifikation oder Konstruktion eines Inhibitors von PAI-1.

Ein anderer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines für ein erfindungsgemässes Protein oder Peptid spezifischen Antikörpers oder für ein anderes Epitop von PAI-1 spezifischen Antikörpers bei einem erfindungsgemässen Verfahren. Solche Antikörper zur Verwendung bei einem erfindungsgemässen Verfahren werden in Beispiel 1 und 2 als nicht einschränkende Beispiele offenbart.

Solche Antikörper zur Verwendung bei einem erfindungsgemässen Verfahren werden beispielsweise dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Fab-Fragment ist (Fragment, Antigen bindend = Fab). Diese erfindungsgemässen PAI-1-spezifischen Antikörperproteine bestehen aus variablen Bereichen der beiden Ketten, welche durch den benachbarten konstanten Bereich zusammengehalten werden. Sie können aus herkömmlichen Antikörpern durch Protease- Digestion beispielsweise mit Papain gebildet werden, inzwischen können jedoch ähnliche Fab- Fragmente durch Gentechnik produziert werden. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemässe Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Human- oder humanisierte Antikörperprotein ein F(ab')2-Fragment ist, das durch proteolytische Spaltung mit Pepsin herstellbar ist.

Durch Verwendung von gentechnischen Verfahren ist es möglich, gekürzte Antikörperfragmente zu produzieren, die nur aus den variablen Bereichen der schweren (VH) und der leichten Kette (VL) bestehen. Diese werden als Fv-Fragmente (Fragment, variabel = Fragment des variablen Teiles) bezeichnet. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemässes PAI-1-spezifisches Antikörpermolekül ein derartiges Fv-Fragment. Da diesen Fv-Fragmenten die kovalente Bindung der beiden Ketten durch die Cysteine der konstanten Ketten fehlt, werden oft die Fv-Fragmente stabilisiert. Es ist vorteilhaft, die variablen Bereiche der schweren und der leichten Kette durch ein kurzes Peptid-Fragment von beispielsweise 10 bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise von 15 Aminosäuren zu verbinden. Auf diese Weise wird ein einzelner Peptidstrang erhalten, der aus den durch ein Peptidverbindungsglied verbundenen VH und VL besteht. Ein Antikörperprotein dieser Art ist als Einzelketten-Fv ("single-chain-Fv" = scFv) bekannt. Beispiele von scFv-Antikörperproteine dieser Art, die beim Stand der Technik bekannt sind, werden in Huston et al. (1988, PNAS 16: 5879-5883) beschrieben. Somit ist bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform das erfindungsgemässe Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Human- oder humanisierte Antikörperprotein ein Einzelkketten-Fv- Protein (scFv) ist.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Strategien entwickelt, um scFv als multimeres Derivat herzustellen. Damit wird insbesondere beabsichtigt, zu rekombinanten Antikörpern mit verbesserten pharmacokinetischen und Bioverteilungs-Eigenschaften wie auch zu erhöhter Bindungsavidität zu gelangen. Um die Multimerisation des scFv zu erreichen wurden scFv als Fusionsproteine mit Multimerisationsdomänen hergestellt. Die Multimerisationsdomänen können beispielsweise der CH3-Bereich eines IgG oder einer Helixstruktur ("coiled coil") wie beispielsweise Leucin-Reissverschluss-("Leucin-zipper")-Domänen sein. Es gibt jedoch auch Strategien, bei denen die Wechselwirkung zwischen den VH/VL-Bereichen der scFv zur Multimerisation verwendet werden (beispielsweise zu Di-, Tri- und Pentakörpern). Demnach ist bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform das erfindungsgemässe Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Human- oder humanisierte Antikörperprotein ein PAI-1-spezifisches Diakörper-Antikörperfragment ist. Als "Diakörper" bezeichnet die Fachperson ein zweiwertiges homodimeres scFv-Derivat (Hu et al. (1996), PNAS 16: 5879-5883). Bei einem scFv-Molekül führt die. Kürzung des Kopplers ("Linker") auf 5-10 Aminosäuren zur Bildung von Homodimeren, bei denen eine zwischenkettige VH/L-Überlagerung stattfindet. Diakörper können zusätzlich durch Einfügung von Disulfidbrücken stabilisiert werden. Beispiele von Diakörper-Antikörperproteinen aus dem Stand der Technik sind in Perisic et al. (1994, Structure 2: 1217-1226) zu finden.

Als "Minikörper" bezeichnet die Fachperson ein zweiwertiges homodimeres scFv-Derivat. Dieses besteht aus einem Fusionsprotein, das als Dimerisationsbereich den CH3-Bereich eines Immunoglobulins, vorzugsweise von IgG, am meisten bevorzugt von IgG1 enthält, der mit dem scFv über einen Gelenk-("Hinge")-Bereich (beispielsweise auch von IgG1) und einen Koppler- ("Linker")-Bereich verbunden ist. Die Disulfidbrücken im Gelenk-("Hinge")-Bereich werden meistens in höheren Zellen und nicht in Prokaryonten gebildet. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemässe Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Human- oder humanisierte Antikörperprotein ein PAI-1-spezifisches Minikörper- Antikörperfragment ist. Beispiele von Minikörper-Antikörperproteinen aus dem Stand der Technik sind in Hu et al. (1996. Cancer Res. 56: 3055-61) zu finden.

Als "Triakörper" bezeichnet die Fachperson ein dreiwertiges homotrimeres scFv-Derivat (Kortt et al. (1997), Protein Engineering 10: 423-433), scFv-Derivate, bei denen VH-VL direkt, ohne Kopplersequenz fusioniert sind, führen zur Bildung von Trimeren.

Die Fachperson wird auch mit sogenannten Miniantikörpern vertraut sein, die eine zwei-, drei- oder vierwertige Struktur aufweisen und von scFv deriviert sind. Die Multimerisation wird mit di-, tri- oder tetrameren Helix-("coiled coil")-Strukturen durchgeführt (Pack et al. (1993), Biotechnology 11:, 1271-1277; Lovejoy et al. (1993) Science 259: 1288-1293; Pack et al. (1995) J. Mol. Biol. 246: 28-34).

Eine noch andere wichtige Ausführungsform ist eine Substanz, die mit einem erfindungsgemässen Verfahren identifizierbar ist, und welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie fähig ist, spezifisch PAI-1 zu hemmen. Die genannte Substanz kann ein Antagonist oder Modulator von PAI-1 sein.

Eine andere wichtige Ausführungsform ist die Verwendung einer Substanz, d. h. eines erfindungsgemässen Antagonisten oder Modulators von PAI-1, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen und kardiovaskulären Erkrankungen, vorzugsweise von Schlaganfall, oder von Krebs- und damit verwandten Erkrankungen. Derartige Erkrankungen umfassen, jedoch ohne Einschränkung darauf, globale und fokale Ischämie, ischämischen und hämorrhagischen Schlaganfall, globale cerebrale Ischämie mit Herzstillstand, post-ischämische neurocytotoxische Zustände, Hypoglykämie, diabetische Polyneuropathie, Hypoxie, Anoxie, Hirnödem, Hirnüberdruck (erhöhter Druck innerhalb des Schädels), Hypertonie, Hypotonie, Herzinfarkt, Brustkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs, Leberkrebs und Krebs im Magen-Darm-Traktus.

Die Erfindung steht auch in Beziehung mit einer Arzneimittelzusammensetzung, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine erfindungsgemässe Substanz und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Träger oder Vehikel umfasst. Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kann physiologisch annehmbare Verbindungen enthalten, die beispielsweise wirken, indem sie die Absorption eines PAI-1-Antagonisten oder -Modulators stabilisieren oder erhöhen. Solche physiologisch annehmbare Verbindungen umfassen beispielsweise Kohlenhydrate wie Glucose, Saccharose oder Dextrane, Antioxidantien wie Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, Proteine von niederem Molekulargewicht oder andere Stabilisatoren oder Corrigenzien (vgl. beispielsweise auch "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990), 18. Ausgabe, Mack Publ., Easton). Eine Fachperson wird wissen, dass die Wahl eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, einschliesslich einer physiologisch annehmbaren Verbindung, beispielsweise von dem Verabreichungsweg der Zusammensetzung abhängig ist. Die nachfolgenden Beispiele sollen als Hilfe zum Verständnis der Erfindung dienen und sind in keiner Weise als Einschränkung des Umfangs der Erfindung zu betrachten.

Beispiel 1 MATERIALIEN UND VERFAHREN Materialien

Restriktionsenzyme wurden von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden), GibcoBRL® (Paisley, Schottland) und Roche Molecular Biochemicals (Brüssel, Belgien) beschafft. Alkalische Phosphatase kam von Roche Molecular Biochemicals (Brüssel, Belgien), und T4 DNA ligase kam von GibcoBRL® (Paisley, Schottland).

DNA-Polymerase AmpliTaq Gold™ wurde bei Perkin Elmer Applied Biosystems (Folter City, CA, USA) beschafft. Synthetische Oligonucleotide (für PCR und DNA-Sequenzierung) wurden durch Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) synthetisiert.

Die einen wärmeinduzierbaren Promotor enthaltenden Expressionsvektoren pIGE20 und pIGE2, das einen thermolabilen Repressor codierende pAcI-Plasmid, wie auch die zur Klonierung bzw. zur Expression verwendeten Escherichia coli Stämme DH1λ und MC1061, wurden freundlicherweise von Innogenetics (Gent, Belgien) zur Verfügung gestellt. Der pIGE20-Human- PAI-1 und der pIGE2-Ratten-PAI-1 wurden konstruiert, wie schon früher beschrieben wurde (40, 41).

Das Luria-Bouillon-(LB)-Wachstumsmedium wurde bei Life Technologies (Gent, Belgien) beschafft. Plasminogenaktivator vom Gewebe-Typus (Actilyse®) kam von Boehringer Ingelheim. Rekombinanter Human- und Ratten-PAI-1 wurde in Escherichia coli grundsätzlich wie beschrieben (37, 41) exprimiert und produziert. Die meisten chemischen Reagenzien einschliesslich Dithiotreitol und die Proteinase-Inhibitoren Leupeptin, Phenylmethan­ sulfonylfluorid, Pepstatin, Benzamidin-Hydrochlorid und Antipain kamen von Sigma (St. Louis, USA). Das chromogene Substrat S-2403 wurde von Nodia/Chromogenix (Antwerpen, Belgien) beschafft. SP-Sepharose® Fast Flow und Heparin-Sepharose® CL 6B wurden bei Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) beschafft. 96-Loch-Mikrotiterplatten aus Polystyrol wurdn bei Costar (Cambridge, MA) beschafft, und mit Meerrettich-("horseradish")-Peroxidase (HRP) konjugiertes Kaninchen-anti-Maus-Antiserum kam von Nordic (Tilburg, Niederlande)

Die gegen Human-PAI-1 gerichteten monoklonalen Maus-Antikörper MA-8H9D4, MA-31C9, MA-33B8F7, MA-33H1F7, MA-42A2F6, MA-44E4 und MA-56A7C10 wurden hergestellt und gereinigt, wie schon früher beschrieben wurde (26). Alle monoklonalen Antikörper ausser MA- 31C9 weisen gegenüber Human-PAI-1 Hemmeigenschaften auf. Die neutralisierende Wirkung von MA-8H9D4, MA-33B8F7, MA-33H1F7 und MA-56A7C10 auf die Aktivität von PAI-1 wurde schön früher beschrieben (26). MA-42A2F6 und MA-44E4 haben auf die Aktivität von PAI-1 ähnliche Wirkungen wie MA-33B8F7, obschon in geringerem Umfang. MA-33H1F7, für welches das Epitop am Gelenk zwischen der α-helix F und dem Hauptteil des PAI-1-Moleküls geortet worden ist (37) und das in Ratten-PAI-1 aufbewahrt wird, dient als Referenz.

Allgemeine DNA-Techniken

Der Einsatz von Techniken zur DNA-Manipulation erfolgte nach gängigen Methoden und gemäss den Anweisungen der Hersteller. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Patronen "Nucleobond®" (Machery-Nagel, Düren, Deutschland) isoliert, DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines Kits "QIAquick® Gel Extraktion" (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) gereinigt, und zur PCR wurde ein Gerät "Gene Amp® 2400" (Perkin-Elmer) verwendet. DNA wurde mit dem Kit "Autoread Sequencing®" und der Vorrichtung "Automated Laser Fluorescent ALF®" (beide von Amersham Pharmacia Biotech) sequenziert.

Klonierung des Expressionsplasmids für die PAI-1-Chimären

pIGE2-rat26hum-PAI-1, pIGE20-hum81rat-PAI-1 und pIGE2-rat81hum-PAI-1 wurden unter Verwendung einer Kombination von Restriktionsfragmenten aus pIGE20-Human-PAI-1 und pIGE2-Ratten-PAI-1 konstruiert. Ein auf Gel gereinigtes NheI/StuI-Fragment (560 nt) aus pIGE2-Ratten-PAI-1 wurde in mit NheI/StuI digeriertem (4043 nt und 556 nt) und dephosphoryliertem pIGE20-Human-PAI-1 ligiert, um pIGE2-rat26hum-PAI-1 zu erzeugen, das eine PAI-1-Chimäre codiert, die aus den mit dem 27-379 C-terminalen Ende des Human-PAI-1 gekoppelten 26 ersten Aminosäuren des Ratten-PAI-1 besteht. Auf gleiche Weise wurden pIGE20-hum81rat-PAI-1 und pIGE2-rat81hum-PAI-1 durch die Ligation von auf Gel gereinigten Fragmenten aus pIGE2-Ratten-PAI-1 (teilweise mit NheI/SacI digeriert) von 3759 nt bzw. 729 nt in pIGE20-Human-PAI-1 (mit NheI/SacI digeriert (3874 nt und 725 nt) und dephosphoryliert) erzeugt.

Die für hum187rat-PAI-1, rat187hum-PAI-1, hum277rat-PAI-1, hum327rat-PAI-1 und rat187hum-PAI-1 codierende DNA wurde unter Verwendung von Mutagenese durch Erstreckung beim Spleissen mit Überlagerung [("splicing-by-overlap extension" = SOE)-Mutagenese] konstruiert. Dazu wurden DNA-Fragmente aus pIGE20-Human-PAI-1 und pIGE2-Ratten-PAI-1 unter Verwendung der geeigneten Oligonucleotide durch PCR amplifiziert (94°C, 10 min; 30 × (94°C, 1 min; 60°C, 1 min; 72°C, 2 min); 72°C, 8 min). Nach einer Gel-Reinigung wurden die amplifizierten Fragmente reassoziiert, und die reassoziierten Produkte wurden unter Verwendung der geeigneten Primer (94°C, 10 min; 7 × (94°C, 1 min; 60°C/65°C, 4 min); 30 × (94°C, 1 min/1,20 min; 60°C/65°C, 1 min/1,20 min; 72°C, 2 min); 72°C, 8 min) amplifiziert. Nach einer Reinigung und einer Digestion mit NcoI/XbaI oder BsaBI/XbaI wurde die für die Chimären codierende DNA, im Falle der Chimären mit einer N-terminalen Ratten-PAI-1-Sequenz in pIGE2 (mit NcoI/XbaI digeriert und dephosphoryliert), oder im Falle der Chimären mit einer N- terminalen Human-PAI-1-Sequenz in pIGE20 (mit BsaBI/XbaI digeriert und dephosphoryliert), ligiert.

Kompetente Zellen von DH1λ Escherichia coli wurden mit den Ligationsprodukten transformiert, und in kleinen Mengen hergestellte DNA-Präparate aus den pIGE2(0)-Konstrukten wurden durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Für alle Chimären wurden in grossen Mengen hergestellte DNA-Präparate bereitgestellt, und der PAI-1 codierende Bereich wurde vollständig sequenziert. Danach wurden, im Hinblick auf die Expression, kompetente Zellen von MC1061 Escherichia coli mit pAcI und dem einen und anderen der pIGE2(0)-Konstrukte cotransformiert.

Expression und Reinigung von PAI-1-Chimären, Ratten-PAI-1 und Human-PAI-1

PAI-1-Chimären wurden in Escherichia coli exprimiert und im wesentlichen wie beschrieben gereinigt (37, 41). In Kurzfassung dargelegt: Das Zellysat (1 : 4 verdünnt mit 0.15 M KH₂PO₄- Na₂HPO₄, pH-Wert 6 und 2 mM Glutathion (Puffer Pi)) wurde auf eine SP-Sepharose®-Säule gegeben, die Säule wurde mit 0.2 M NaCl enthaltendem Puffer Pi gewaschen, und gebundener PAI-1 wurde mit Puffer Pi unter Verwendung eines 0,2-1,2 M NaCl-Gradienten eluiert. Danach wurden PAI-1 enthaltende Elutionsfraktionen auf eine Heparin-Sepharose®-Säule gegeben. Die Elution des PAI-1 von der Heparin-Sepharose® ergibt eine leicht unterschiedliche Elution von aktivem PAI-1 gegenüber latentem PAI-1. Fraktionen, welche den (gemäss SDS-PAGE) höchsten Anteil an funktionell aktivem PAI-1 enthalten wurden getrennt (Pool A) von den einen höheren Anteil an latentem PAI-1 enthaltenden Fraktionen (Pool B) zusammengelegt. Die Konzentration an PAI-1 in der gereinigten Zusammensetzung wurde spectrophotometrisch bei 280 nm unter Verwendung eines Absorptionskoeffizienten (A^1% _{1 cm}) von 10 bestimmt.

Bestimmung der Hemmaktivität, der Konformationsverteilung und der funktionellen Stabiliät von PAI-1 und PAI-1-Chimären

Die Aktivität von PAI-1 (pool A) wurde unter Verwendung des von Verheijen (42) beschriebenen Verfahrens bestimmt. Alle Aktivitätsdaten werden, unter Verwendung von t-PA as Target-Proteinase (40), als prozentuales Verhältnis zur theoretischen maximalen Aktivität d. h. ±745000 U/mg ausgedrückt.

Zur Evaluation der Konformationsverteilung wurden Proben (pool A) mit dem geeigneten Verdünnungsmittel bis auf eine Endkonzentration an PAI-1-Protein zwischen 7 µg/ml und 200 µg/ml verdünnt, was eine gepufferte Lösung mit 0,045 M KH₂PO₄-Na₂HPO₄, 70 mM NaCl, pH- Wert 7,2-7,4 ergab. Danach wurden Proben während 30 min bei 37°C mit einem zweifach­ molaren Überschuss an t-PA inkubiert, und die Reaktionsprodukte wurden durch SDS-PAGE unter Verwendung von 10-15%igen Gelen und anschliessender Färbung mit "Coomassie Brilliant Blue" oder "Coomassie Brilliant Silver" analysiert. Eine Mengenmessung an den gebildeten Reaktionsprodukten (komplexiert, nicht-reaktiv und gespalten, entsprechend dem Vorhandensein von aktiven, latenten bzw. Substrat-Konformationen (40)) erfolgte durch densitometrisches Scanning der Gele unter Verwendung des Imagemaster®-Systems (Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden).

Zur Bestimmung der funktionellen Stabilität wurden wie im vorangehenden beschrieben verdünnte PAI-1-Proben bei 37°C inkubiert, und es wurden zu verschiedenen Zeiten Teilmengen entnommen und durch SDS-PAGE wie im vorangehenden beschrieben auf deren Hemmaktivität gegenüber t-PA untersucht. Die Halbwertszeiten für die Inaktivierung wurden mit dem Programm Graph Pad Prism™ unter Verwendung von "einphasigem exponentiellem Abfall" nach der Gleichung: Y = Spanne.e^-K.X + Plateau berechnet. Die Halbwertszeit des Abfalls ist dann gleich 0,693/K.

Immunologische Reaktionsfähigkeit von monoklonalen Antikörpern gegenüber Human-PAI-1, Ratten-PAI-1 und PAI-1-Chimären

Die immunologische Reaktionsfähigkeit der monoklonalen Antikörper mit Human-PAI-1, Ratten-PAI-1 und PAI-1-Chimären wurde in einem ELISA-System evaluiert (26). In Kurzfassung dargelegt: Mikrotiterplatten wurden mit den gereinigten PAI-1-Varianten (4 µg/ml) beschichtet, und es wurden serielle zweifache Verdünnungen (100 ng/ml bis 1,56 ng/ml) der gereinigten monoklonalen Antikörper in die Löcher angesetzt und während 18 Stunden bei 4°C inkubiert. Gebundene monoklonale Antikörper wurden unter Verwendung von mit Meerrettich- ("horseradish")-Peroxidase (HRP) konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Antiserum (RAM-HRP) und anschliessender Peroxidase-Umsetzung und Absorptionsmessung bei 492 nm festgestellt.

Affinität von monoklonalen Antikörpern für Human-PAI-1, Ratten-PAI-1 und PAI-1-Chimären

Affinitätskonstanten für die Bindung zwischen monoklonalen Antikörpern und Human-PAI-1, Ratten-PAI-1 und PAI-1-Chimären wurden wie schon früher beschrieben (37) unter Verwendung des mit dem CM5-Sensorchip (BIAcore AB) ausgerüsteten BIAcore™ 3000 Analysesystems bestimmt. In Kurzfassung dargelegt: Die monoklonalen Antikörper wurden mit 2000 Resonanzeinheiten (unter Verwendung einer Konzentration von 10 µg/ml in 10 mM Acetatpuffer, pH-Wert 4,5) unter Verwendung des automatischen "Wizard"-Modus kovalent gekoppelt. Danach wurden in 0.01 M Hepes, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Tween 20, pH-Wert 7,4 bis zu einer Endkonzentration an PAI-1-Antigen im Bereich von 18 bis 1152 nM verdünnte PAI-1-Varianten mit einer Flussgeschwindigkeit von 20 µl/min (Injektionsvolumen 40 µl) injiziert. Nach jedem Zyklus wurde der Chip unter Verwendung von 10 µl einer 15 mM HCl- Lösung regeneriert. Die Analyse der Assoziations- und Dissoziationsphasen erfolgte mit der Software von BIAcore™ 3000 (Langmuir-Bindung, lokale oder globale Anpassung).

RESULTATE Klonierung von Human-/Ratten-PAI-1-Chimären

Für jede Chimäre ist deren Zusammensetzung in Fig. 1 dargestellt. In vier Chimären ist ein Teil des N-terminalen Bereiches des Human-PAI-1 durch den entsprechenden Teil des Ratten-PAI-1 ersetzt, in den anderen Chimären ist es ein Teil des C-terminalen Bereiches, der ersetzt ist. Die Spleissstellen zwischen den beiden Spezies befinden sich jeweils bei Aminosäure 26, 81, 187, 277 und 327. Die Sequenzierung des Protein codierenden Bereiches zeigte auf, dass in vier Chimären während der DNA-Manipulation eine oder zwei zusätzliche Aminosäuren mutiert wurden: Ala(26)Pro in rat81hum-PAI-1, Pro(200)Ser in hum187rat-PAI-1, Gln(301)Arg in rat187hum-PAI-1 sowie Leu(48)Arg und Arg(76)Gln in rat327hum-PAI-1. Es ist zu bemerken, dass nur eine der Mutationen die Sequenz des Human-PAI-1 (d. h. in rat187hum-PAI-1) betraf, und dies sollte berücksichtigt werden, wenn die differentielle Kreuzreaktionsfähigkeit evaluiert wird. Anfänglich wurden auch die geeigneten genetischen Konstrukte zur Expression von rat277hum-PAI-1, hum236rat-PAI-1 und rat236hum-PAI-1 hergestellt. Aus unbekanntem Grund waren jedoch die Expressionsspiegel dieser Chimären zu niedrig, um eine geeignete Reinigung zu ermöglichen. Die Expression der anderen PAI-1-Chimären ergab Mengen an gereinigtem PAI-1 Protein, die von 0,2 bis 3 mg pro Liter kultivierter Zellen variierten.

Charakterisierung von PAI-1-Chimären

Alle PAI-1-Chimären wiesen eine Hemmaktivität gegenüber t-PA auf, einige davon jedoch nur in sehr beschränktem Umfang (Tabelle 1). Diese stark verminderten Aktivitäten waren mit einer stark verminderten funktionellen Stabiliät assoziiert (Tabelle 1; jeweils 1,4 min bis 13 min gegenüber 42 bis 83 min), was aufzeigte, dass die niedrige Aktivität nicht auf fehlerhafte Faltung der Chimären, sondern auf eine beschleunigte Transition zur latenten Konformation zurückzuführen ist. Eine Evaluation der Konformationsverteilung ergab Daten (Tabelle 2), die mit den Daten der Hemmaktivität kompatibel sind. Aus diesen Daten ist auch abzuleiten, dass für einige der Chimären (d. h. rat26hum-PAI-1, rat187hum-PAI-1 und rat327hum-PAI-1) die verminderte Menge des aktiven PAI-1 (zwischen 29% und 40% gemäss SDS-PAGE) mit einer erhöhten Menge von Substrat-Konformation (zwischen 14% und 29%) assoziiert war, was einen weiteren Nachweis ergab, dass diese Chimären eine richtige Faltung hatten. Für die anderen PAI-1-Chimären lagen die Aktivität von PAI-1 wie auch die Stabiliät von PAI-1 im gleichen Bereich wie bei den Human- und Ratten-PAI-1.

Affinität und immunologische Reaktionsfähigkeit von monoklonalen Antikörpern für bzw. gegenüber Human-PAI-1, Ratten-PAI-1 und PAI-1-Chimären

Die monoklonalen Antikörper MA-8H9D4, MA-31C9, MA-42A2F6, MA-44E4 und MA- 56A7C10 wiesen eine hohe Affinität für Human-PAI-1 auf (K_A zwischen 2,2 × 10⁸ M^-1 und 3,7 × 10⁹ M^-1), gingen aber mit Ratten-PAI-1 keine Kreuzreaktionen ein.

Das schon früher eingehend untersuchte MA-33H1F7 (37) reagierte im gleichen Umfang mit Human- und Ratten-PAI-1 (K_A 4,9 × 10⁹ M^-1 bzw. 2,7 × 10⁹ M^-1) und wurde deshalb als positive Referenz verwendet. Der Ersatz der N-terminalen oder C-terminalen Teile des Human-PAI-1 mit dem entsprechenden Teil von Ratten-PAI-1 hatte auf die immunologische Reaktionsfähigkeit (Fig. 2, A) und Affinität (K_A zwischen 2,0 × 10⁹ M^-1 und 8,5 × 10⁹ M^-1) von MA-33H1F7 keinen Einfluss, was zusätzliche Beweise dafür ergibt, dass alle Chimären eine richtige Faltung hatten. Gemäss den ELISA-Resultaten fehlte dem MA-33B8F7 die Kreuzreaktionsfähigkeit mit Ratten- PAI-1 (Fig. 2, B) (keine Reaktionsfähigkeit mit Ratten-PAI-1 bei Konzentrationen bis zu 10 µg/ml, Daten nicht dargestellt), Affinitätsdaten zeigten jedoch ein nur 15fachen Abfallen der Reaktionsfähigkeit mit Ratten-PAI-1 im Vergleich zu Human-PAI-1 auf. Während dieser scheinbare Gegensatz die Interpretation der Resultate teilweise beeinträchtigt, kann er nahelegen, dass (zwischen Ratten- und Human-PAI-1) konservierte Reste wie auch nichtkonservierte Reste dem Epitop beitragen. Bezüglich der anderen monoklonalen Antikörper wurde eine auf deutlichere Weise verminderte differentielle Affinität für die Chimären beobachtet.

Bezüglich MA-8H9D4 wurde die Bindung bei Ersatz der ersten 26, 81 oder 187 Aminosäuren nur mässig beeinträchtigt (d. h. K_A 7- bis 16fach niedriger im Vergleich zu derjenigen für Human- PAI-1), während der Ersatz der Reste 1 bis 327 einen vollständigen Verlust der Bindung verursachte. Somit ist anzunehmen, dass die Hauptinteraktionsstelle für MA-8H9D4 zwischen den Aminosäuren 187 und 327 angeordnet ist. Eine Evaluation der Daten der Affinität von MA- 8H9D4 für die Chimäre mit einem C-terminalen Ende von Ratten-PAI-1 zeigte auf, dass diese fehlenden Reste 277-327 des Human-PAI-1 nicht oder fast nicht binden (K_A zumindest 120fach vermindert), während hum327rat-PAI-1 (dem die Reste 327 bis 379 des Human-PAI-1 fehlen) mit einer ähnlichen Affinität wie der Human-PAI-1 zu binden vermochte. Dies zeigt auf, dass der Bereich zwischen den Resten 277 und 327 Aminosäuren enthält, die zur Bindung von MA- 8H9D4 an PAI-1 entscheidend sind, aber auch, dass Reste in anderen Segmenten von PAI-1 mitbeteiligt sein können. Wie aus Fig. 2. C hervorgeht, führt die Interpretation der Dosis- Antwort-Kennlinien der ELISAs für MA-8H9D4 und für die Chimären zu den gleichen Schlussfolgerungen.

Die Bindung von MA-42A2F6 wurde in der Untermenge von PAI-1-Chimären mit einem C- terminalen Ende von Ratten-PAI-1 vollständig unterbunden, was aufzeigt, dass die am C- terminalen Ende gelegenen Reste (AA327-AA379) des Human-PAI-1 Reste enthalten, die zur Bindung dieses Antikörpers unerlässlich sind. Insgesamt können ähnliche Schlussfolgerungen aus den ELISA-Daten (Fig. 2, D) gezogen werden. Obwohl jedoch die Affinitätsdaten einen möglichen Beitrag von Resten im Bereich 187-327 nahelegen, wird dies von den ELISA-Daten nicht bestätigt.

Bezüglich MA-44E4 legen alle Daten (Fig. 2, E) eindeutig nahe, dass sich die bedeutendsten das Epitop enthaltenden Reste im Bereich 81-187 befinden.

Die Reaktionsfähigkeit von MA-56A7C10 blieb für eine beliebige Chimäre die gleiche, solange die zwischen AA327 und AA379 befindlichen C-terminalen Reste des Human-PAI-1 vorhanden waren (KA im Vergleich zum KA für Human-PAI-1 höchstens 2fach vermindert). Eine Entfernung der C-terminalen Reste (AA327-AA379) führt zu einem vollständigen Verlust oder einer starken Verminderung der Affinität (K_A zumindest 92fach vermindert). Ähnliche Schlussfolgerungen können für die ELISA-Daten (Fig. 2, F) gezogen werden, was aufzeigt, dass sich die Hauptdeterminanten des Epitops zwischen den Resten 327 und 379 befinden.

Die für MA-31C9, einen nicht-hemmenden Antikörper, erhaltenen Daten zeigten auf, dass sich sein Epitop in dem N-terminalen Ende (AA1-AA26) von PAI-1 befinden muss.

Beispiel 2

Vgl. auch Fig. 4

Materialien

Die 384-Loch-Platten wurden bei Canberra Packard, Dreieich, Deutschland (Optiplate für HTRF; Kat.-Nr. 6005256) beschafft. Der monoklonale Anti-PAI-1-Antikörper MA-45C12, der monoklonale Anti-tPA-Antikörper MA-51H8 und der Human-Wildtyp-PAI-1 (2,35 mg/ml; 60% Aktivität; 1,1 Mio U/ml) wurden bei Prof. Declerck, Universität Löwen, beschafft. Der tPA (580000 U/mg Protein; 1 mg/ml) kam von der Abteilung für Biopharmazeutische Produktion, ist jedoch auch im Handel erhältlich. Alle anderen Materialien waren vom höchsten im Handel erhältlichen Grad. Die Markierung von MA-45C12 mit XL665 bei einem Molverhältnis von etwa 1,5 XL/Ab und die Markierung von MA-51H8 mit Europiumkryptat bei einem Molverhältnis von etwa 5-6 K/Ab erfolgten bei CIS bio international (Bagnols-sur-Cèze, Frankreich).

In den 384-Loch-Platten werden 15 µl Testverbindung in Untersuchungspuffer (Endkonzentra­ tion 5 µg/ml; 1% DMSO) mit 10 µl PAI-1 (3 U/Loch) in mit 0,025% HSA ergänztem Unter­ suchungspuffer gemischt; Endkonzentration an HSA 0,01%). Die Platten werden dann bei Raumtemperatur während 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubationsdauer wurden 20 µl Detektionsmischung für aktives PAI-1 zugegeben, und die Platten wurden für weitere 30 Minuten inkubiert. Nach dieser zweiten Inkubationsdauer wurden jedem Loch 25 µl KF (1400 mM) zugegeben. Die zeitaufgelöste Fluoreszenz der Löcher wird dann in einem Packard Discovery Fluoreszenzleser gemessen (Ex 335 nm; Em 620 nm und 665 nm) (Canberra Packard, Dreieich, Deutschland). Das Signal ist während zumindest 10 Stunden stabil. Das Verhältnis der beiden Emissionssignale wird dann berechnet (Em665.10000/Em620).

Das langlebige Signal bei 620 nm stammt vom Europiumkryptat-Marker. Das langlebige Signal bei 665 nm stammt vom XL665-Marker und von der Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung ("Fluorescence Resonance Energy Transfer" = FRET), die stattfindet, wenn die beiden Marker eng benachbart sind. FRET findet nur dann statt, wenn aktiver PAI-1 an in der Detektionsmischung vorhandenen tPA bindet.

Untersuchungspuffer

50 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Tween 80, mit HCl auf pH-Wert 7,5 eingestellt.

Detektionsmischung für aktiven PAI-1

150 U/ml tPA, 312 ng/ml MA-51H8-K, 1875 ng/ml MA-45C12-XL in Untersuchungspuffer.

Jede Untersuchungs-Mikrotiterplatte enthält Löcher mit Vehikel-Referenzen (nämlich 1% DMSO in Untersuchungspuffer) als Referenz für den gesamten aktiven PAI-1 (100% CTL; hohe Werte) und Löcher mit Vehikel-Referenzen und Untersuchungspuffer/HSA anstelle von PAI-1 als Referenzen für nicht-aktiven PAI-1 (0% CTL; niedere Werte). Jede Untersuchungs- Mikrotiterplatte enthält auch Löcher mit 10 µM BIBT2809BS als Referenz-Hemmung, die einen Wert von etwa 30% CTL ergeben sollte.

Die Analyse der Daten erfolgt durch Berechnung des prozentualen Verhältnisses 665/620 in Gegenwart der Testverbindung zum Verhältnis 665/620 bei hohen Referenzwerten:
(Verhältnis(Probe) - Verhältnis(niedrig)).100/(Verhältnis(hoch) - Verhältnis(niedrig)).

Ein Inhibitor des Ziel-Proteins ergibt Werte zwischen 100% CTL (keine Hemmung) und 0% CTL (vollständige Hemmung). Werte von mehr als 100% CTL stehen normalerweise mit verbindungsspezifischen physikochemischen Eigenschaften (beispielsweise Löslichkeit, Absorption, Fluoreszenz) oder indirekten biochemischen Wirkungen wie beispielsweise allosterischer Regulation in Verbindung.

LITERATURNACHWEIS

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Tabelle 1

Hemmaktivität und funktionelle Stabilität

Tabelle 2

Konformationsverteilung

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (21)

1. Protein oder Peptid, welches das Epitop des Plasminogenaktivator-Inhibitors-1 (PAI-1) umfasst, gekennzeichnet durch die Aminosäuren Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala His Leu Ala Ser Asp Phe Gly Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln Ala oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon.

2. Protein oder Peptid, welches das Epitop von PAI-1 umfasst, gekennzeichnet durch die Aminosäuren Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp Glu Ile Ser Thr Thr Asp Ala Ile Phe Val Gln Arg Asp Leu Lys Leu Val Gln Gly Phe Met Pro His Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val Lys Gln Val Asp Phe Ser Glu Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn Asp Trp Val Lys Thr His Thr Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Lys Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His Arg Arg oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon.

3. Protein oder Peptid, welches das Epitop von PAI-1 umfasst, gekennzeichnet durch die Aminosäuren Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp Met Phe Arg Gln Phe Gln Ala Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu Pro Leu His Val Ala Gln Ala Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon.

4. Protein oder Peptid, welches das Epitop von PAI-1 umfasst, gekennzeichnet durch die Aminosäuren Glu Val Asn Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser Ser Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Val Arg His Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Met Gly Gin Val Met Glu Pro oder ein Fragment oder ein funktionelles Derivat davon.

5. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Aminosäuren Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala His Leu Ala Ser Asp Phe Gly Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln Ala besteht.

6. Peptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Aminosäuren Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp Glu Ile Ser Thr Thr Asp Ala Ile Phe Val Gln Arg Asp Leu Lys Leu Val Gln Gly Phe Met Pro His Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val Lys Gln Val Asp Phe Ser Glu Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn Asp Trp Val Lys Thr His Thr Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Lys Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His Arg Arg besteht.

7. Peptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Aminosäuren Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp Met Phe Arg Gln Phe Gln Ala Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu Pro Leu His Val Ala Gln Ala Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu besteht.

8. Peptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es aus den Aminosäuren Glu Val Asn Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser Ser Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Val Arg His Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met Glu Pro besteht.

9. Protein oder Peptid, das zwei oder mehr von den genannten Epitopen von PAI-1 nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8 oder ein funktionelles Derivat davon umfasst.

10. Nucleinsäure, welche ein beliebiges der Proteine oder Peptide nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 codiert.

11. Verfahren zum Screening nach Substanzen, die fähig sind, PAI-1 zu hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass

• a) ein Peptid oder ein Protein nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 oder ein ganzer PAI- 1 mit einer Testverbindung in einem geeigneten Puffer inkubiert wird;
• b) tPA oder ein Fragment davon und ein für das Peptid oder Protein oder PAI-1 spezifischer monoklonaler Antikörper und ein für tPA spezifischer monoklonaler Antikörper mit einem Reporter feststellbar markiert werden;
• c) ungebundene Antikörper ausgewaschen werden;
• d) die Menge Reporter gemessen wird; und
• e) der erhaltene Wert mit dem in Abwesenheit der Testverbindung erhaltenen Wert verglichen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem das Peptid oder Protein nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5 oder ganzes PAI-1 auf solche Weise oder mit einem geeigneten Marker markiert wird, mit dem Zweck, die Bindung des genannten Peptids oder Proteins oder PAI-1 an tPA von der Nicht-Bindung oder verminderten Bindung zu unterscheiden.

13. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 12, bei welchem der genannte, für das genannte Peptid oder Protein nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 oder der ganze PAI-1 spezifische Antikörper mit Europiumkryptat markiert wird.

14. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 13, bei welchem der genannte, für tPA oder ein Fragment davon spezifische Antikörper mit XL665 markiert wird.

15. Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, bei welchem das genannte Verfahren ein Hochdurchsatzscreening (HTS) oder Ultrahochdurchsatzscreening (UHTS) ist.

16. Verwendung eines Proteins oder Peptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 zur Identifikation eines Inhibitors von PAI-1.

17. Verwendung eines für ein Protein oder Peptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9 spezifischen Antikörpers oder für ein anderes Epitop von PAI-1 spezifischen Antikörpers bei einem Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 15.

18. Substanz, die mit einem Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 15 identifizierbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie fähig ist, spezifisch PAI-1 zu hemmen.

19. Verwendung einer Substanz nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von thromboembolischen und kardiovaskulären Erkrankungen, vorzugsweise von Schlaganfall.

20. Verwendung einer Substanz nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von von Krebs- und damit verwandten Erkrankungen.

21. Arzneimittelzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Substanz nach Anspruch 18 und gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Träger oder Vehikel umfasst.