DE10027414A1 - Verfahren zum Peptid-vermittelten Gentransfer in tierische Zellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen. Die Vektor-DNA wird mit Peptiden zur Wechselwirkung gebracht, die aus einem Oligolysin als DNA-Trägersequenz, und einer angefügten "funktionellen" Sequenz einer Länge von bis zu 20 Aminosäuren bestehen. Die angefügte Sequenz kann zyklisch oder linear sein, hat aber keine rezeptorspezifische Funktion. Die Peptide werden vollsynthetisch hergestellt. Die so entstandenen Peptid-DNA-Komplexe erweisen sich in Gegenwart von lysosomolytischen Substanzen als transfektionseffektiv mit hoher Effizienz.

Description

Die Erfindung betrifft ein nichtvirales Verfahren zur Transfektion von Zellkulturen, Gewebe- bzw. Organkulturen und ist unter Einhaltung bestimmter Rahmenbedingungen auch für den Gentransfer in vivo einsetzbar. Sie ist für die medizinische und biologische Grundlagenforschung, besonders im Hinblick auf Vorstudien zur Gentherapie und in der pharmazeutischen Industrie geeignet.

Zum Gentransfer in diesem Sinne (nonviral gene delivery systems) liegen in der Literatur eine Vielzahl von Methoden vor, von denen eine Anzahl Eingang in die kommerzielle Produktion gefunden haben. Man kann diese Methoden gemäß ihrem Wirkungsmechanismus in 3 verschiedene Gruppen einordnen: Lipid-vermittelte Systeme, zu denen z. B. die kationischen Liposomen gehören, Peptid-bzw. Protein-vermittelten Systeme und die Polymer-vermittelten Systeme. Diese Methoden sind weitgehend in einer aktuellen Review dokumentiert (1) und sollen hier nicht im einzelnen zitiert werden. Die vorliegende Erfindung gehört in das Gebiet der Peptid-vermittelten Transfektionssysteme, in die wegen der Möglichkeit eines targetierten Gentransfers hohe Erwartungen gesetzt werden. Nur diese Art von Transfektionssystemen kann hier erwähnt werden.

Peptid-gestützte Transfektionssysteme bestehen häufig aus einem DNA-Trägerpeptid (z. B. Oligolysin), an das ein funktionelles Peptid, das z. B. eine Rezeptorerkennung oder eine lysosomolytische Funktion ausübt, kovalent gekoppelt oder vollsynthetisch angefügt ist. Als Beispiel für derartige Konstrukte seien hier integrinspezifische Peptide genannt, die aus Oligolysin (K₁₆) mit einer angefügten RGD-Sequenz als Integrinligand bestehen (2-4). Andere Rezeptorliganden sind z. B. Transferrin (5, 6), Zucker (7), Insulin (8) und EGF (9). Man erwartet, daß ein rezeptorspezifischer Peptid-DNA-Komplex zelltypspezifisch durch Endozytose aufgenommen wird. Die Größe derartiger Komplexe sollte daher 60 nm nicht überschreiten. Lysosomolytische Peptide sollen den Übergang des Komplexes aus den Endosomen/Lysosomen, in die der Komplex nach der Endozytose gelangt, in das Zytoplasma erleichtern (10, 11). Das DNA-Trägerpeptid hat gleichzeitig die Aufgabe, die DNA in einen für den Gentransfer geeigneten Kondensationszustand zu überführen (6). In der Literatur sind Peptide beschrieben, die eine Integrin-spezifische Erkennungsregion in Form von zyklischen RGD-Peptiden und eine DNA-Trägersequenz von 16 Lysinen besitzen und die eine Anzahl Integrine u. a. der humanen Endothelzellinie ECV304 targetieren sollen (2-4). Als Kontrolle für diesen integrinspezifischen Gentransfer diente ein RGE-Peptid, das nicht integrinspezifisch ist und zu einer weitaus geringeren Transfektionsleistung führte. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit PEI als DNA- Träger beschrieben (12).

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, auf der Basis des Peptid-vermittelten Gentransfers ein vielseitig anwendbares und hocheffizientes Verfahren zur. Transfektion zu entwickeln, das es gestattet, kultivierte Säugerzellen und Gewebeproben sowie Organe in vitro zu transfizieren. Diese Methode soll sich bei Einhaltung bestimmter Randbedingungen auch für den in vivo Gentransfer eignen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Ansprüche realisiert.

Eigene Untersuchungen ergaben, daß das im Zusammenhang mit den erwähnten Integrin­ spezifischen Peptiden erwähnte RGE-Kontrollpeptid zelltypabhängig eine hohe Transfektions­ leistung aufweisen kann. Die mit diesem Peptid erzeugten Komplexe sind weit besser löslich als diejenigen, die auf der Basis des RGD-Peptids hergestellt wurden. Darüber hinaus nimmt die Transfektionsleistung des RGE-Peptids mit der Zeit und der Anzahl der Frier-Tau-Zyklen ab. Das Peptid besitzt auch eine andere morphologische Konsistenz (amorph) als das RGD-Peptid (kristallin). Es wurden daher weitere zyklische Kontrollpeptide mit zunächst willkürlichen Sequenzen der gleichen Größe eingeführt, was zu sehr hohen Transfektionsleistungen führte, die diejenige des RGD-Peptids bei weitem übertrafen. Aus diesen Experimenten zogen wir die Schlußfolgerung, daß für die Wirkungsweise dieser Peptide physikalische Ursachen, wie eine unterschiedliche DNA-Bindung und Aggregationsneigung der Komplexe bestimmend sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Gentransfer in tierische Zellen ist dadurch gekennzeichnet, daß Vektor-DNA zur Herstellung von transfizierenden Komplexen mit synthetisch hergestellten Peptiden einer DNA-Trägersequenz von 10-20 Lysinen und einer C- terminal angefügten Sequenz von weiteren 5-20 Aminosäuren in Wechselwirkung gebracht wird und die gebildeten Komplexe/Aggregate zu den Zellen hinzugefügt werden. Bevorzugt bestehen die Peptide aus einer DNA-Trägersequenz von 16 Lysinen (K₁₆), an deren C-Terminus eine weitgehend beliebige Sequenz von 11 weiteren Aminosäuren angefügt ist. Die Herstellung erfolgt in einem Schritt durch Peptidsynthese. Dies erlaubt es, mit einem homogenen, gut reproduzierbaren Trägermaterial zu arbeiten. Die angefügte Sequenz kann zyklisch oder linear organisiert sein und muß kein bekanntes Erkennungsmotiv für einen Zelloberflächenrezeptor enthalten. Der Erfindungsanspruch beruht schwerpunktmäßig auf der Beobachtung, daß willkürliche Peptidsequenzen, die keinerlei Bezug zu bekannten Oberflächenrezeptoren der Zelle besitzen, eine starke Zunahme der Transfektionseffizienz gegenüber derjenigen des DNA- Trägerpeptids K₁₆ aufweisen. In der Literatur als rezeptorspezifisch charakterisierte Peptide wie K₁₆-RGD und die zugehörigen Kontrollpeptide K₁₆-RGE werden von der Erfindung ausgenommen.

Die Experimente werden erfindungsgemäß bei einem Masseverhältnis von w/w = 1 ausgeführt, das einem leicht positiven Ladungsüberschuß auf molarer Basis entspricht (± ~1,33). Bei Vorliegen eines deutlich positiven Ladungsüberschusses steigt die Transfektionsleistung weiter an, wodurch eine höhere Effizienz erreicht wird.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide, denen kein rezeptorspezifischer Aufnahmemechanismus zugesprochen werden kann.

Es wird ein Erfindungsanspruch auf Peptide erhoben, deren DNA-Trägersequenz eine Länge < 10 und < 20 Lysinreste (K) besitzt und deren C-terminal angefügte Peptidsequenz eine willkürliche Zahl von Aminosäureresten beträgt. Bevorzugt sind 5-20 Aminosäuren. Nachweislich rezeptorspezifische Sequenzen werden ausgeschlossen. Die DNA-Trägersequenz K₁₆ ohne angefügtes Peptid, die bereits beschrieben wurde, soll nicht geschützt, jedoch andere DNA-Trägersequenzen sollen geschützt sein. Die o. a. Sequenzlängen wurden zufällig für die Experimente ausgewählt.

Durch die Anwesenheit von lysosomolytischen Substanzen wie Chloroquine oder CaCl, im Zellkulturmedium wird erfindungsgemäß die Transfektionsleistung weiter gesteigert. Dieser Effekt wurde bisher in Verbindung mit dem Histon H1 (13) oder kationischen Liposomen (14), aber nicht mit Peptiden beschrieben. Dabei spielt es keine Rolle, ob sich das CaCl₂ im Transfektions-oder Posttransfektionsmedium befindet. Als letzteres wird das Zellkulturmedium bezeichnet, das nach Entfernung des Transfektionsansatzes und Waschen der Zellen zu diesen addiert wird. CaCl, bildet mit den Peptid-DNA-Komplexen Kopräzipitate aus, die von den Zellen leichter aufgenommen werden. Auf ähnliche Weise werden in der Posttransfektionsphase auch Komplexe/­ Aggregate als Kopräzipitate aufgenommen, die an der Zelloberfläche haften und nicht durch Waschen der Zellen entfernt werden können (sticky effect). CaCl₂ bildet aber auch mit Phosphaten des Zellkulturmediums in der Posttransfektionsphase Mikropräzipitate aus, die membrandestabilisierende Wirkung haben und die Freisetzung der Komplexe aus den Lysosomen erleichtern.

Die o. g. Peptide erbringen erfindungsgemäß sehr hohe Transfektionsleistungen in vitro. Sie sind höher, als sie durch integrinspezifische Endozytose mit RGD-Peptiden auf der Basis des DNA-Trägers K₁₆ beschrieben sind. Wegen der weitgehenden Freiheit bei der Wahl der Peptidsequenz ist von einem physikalischen Wirkungsmechanismus auszugehen. Die an das K₁₆ angefügte Sequenz führt zu einer Lockerung der K₁₆-DNA-Bindung und zu einer Abnahme hydrophober Wechselwirkungen zwischen den Komplexen. Die Aggregationsneigung der Komplexe, die bei physiologischer Salzkonzentration ihr Maximum erreicht, nimmt mit zunehmender Salzkonzentration bis zur Abspaltung der Peptide ab.

Messungen der Löslichkeit in Abhängigkeit vom jeweiligen Peptid und der Salzkonzentration deuten daher auf eine erleichterte Freisetzung der DNA aus ihren Komplexen hin. Bezüglich der hohen Transfektionsleistung ist ein erleichtertes Unpackaging der DNA im Zytoplasma beteiligt. Wie mittels AFM gezeigt wurde, liegen unter physiologischen Salzbedingungen die ligandierten Komplexe in locker vernetzter Form vor. Mit Ausnahme von RGE-K₁₆, das kleiner ist, weisen die ligandierten Komplexe einen Durchmesser von < 500 nm auf. Die Größe dieses locker vernetzten Materials hängt weiterhin von der Sequenz der Peptide ab. K₁₆-DNA-Komplexe sind demgegenüber dicht gepackt und besitzen einen Durchmesser von 30 nm. K₁₆-DNA-Komplexe können daher nicht direkt mit denjenigen der ligandierten Trägern verglichen werden. Die in vitro Transfektionsleistung der Komplexe ist direkt mit deren Größe korreliert. Werden die Komplexe bei 6000 Upm für 2 min abzentrifugiert, so besitzt der Überstand, der noch DNA enthält, keine Transfektionsaktivität. Dies gilt auch für das als rezeptorspezifisch charakterisierte RGD-K₁₆. Eine Bedingung für hohe in vitro Transfektionseffizienz ist demnach eine starke Tendenz zur Bildung lockerer Aggregate bei physiologischer Salzkonzentration.

Erfindungsgemäß haben DNA-Komplexe mit Peptiden einer gleicher Anzahl von Aminosäuren in vitro die höchste Transfektionsleistung, die in einem Salzkonzentrationsbereich von 0.15 M bis 0.6 M NaCl erst unterhalb 0.6 M löslich werden. Peptide, die bereits bei kleinerer Salzkonzentration löslich werden, sind weniger aktiv. Die Unlöslichkeit der Komplexe ist direkt mit ihrer Aggregatgröße korreliert. Es handelt sich hier nicht um echte Löslichkeit, sondern um die Löslichkeit kolloidaler Systeme.

Durch geeignete Wahl der Peptidsequenz können gemäß der Erfindung bei gezielter Ausnutzung derartiger physikalischer Effekte weitere Verbesserungen erzielt werden. In Anlehnung an integrinspezifische RGD-Sequenzen aus der Literatur wurde für die Experimente die o. a. Grundstruktur, bestehend aus K₁₆ und der angefügten Sequenz aus 11 Aminosäuren ausgewählt. Zyklische Peptide bestanden aus 6 Aminosäuren, die von 2 Cytosinen flankiert sind und eine Disulfidbrücke ausgebildet haben. Bei linearen Peptiden waren diese Cytosine durch Alanine ersetzt. Durch die erfindungsgemäße Wahl der Sequenz cKYPKYP, die zwischen die 2 Cytosine eingesetzt wurde, konnte die bisher höchste Transfektionsleistung erzielt werden (c steht für zyklisch). Es ist anzunehmen, daß es sich um eine β-Loop-Struktur mit membrandestabilisierenden Eigenschaften handelt. Auch mit der Sequenz ARGDMFAA konnte erfindungsgemäß eine sehr hohe Effizienz erzielt werden. Es handelt sich um eine ursprünglich zyklische RGD-Sequenz, die zur rezeptorspezifischen Integrinerkennung herangezogen worden war und bei der die Cytosine durch Alanine ersetzt wurden. Demgemäß bewirkt eine Zyklisierung der angefügten Peptide eher eine Hemmung der Transfektion. Daß es sich kaum um eine integrinspezifische Sequenz handelt, wurde dadurch wahrscheinlich gemacht, daß auch die Motive RGE und RAD, die nicht integrinspezifisch sind, eine hohe Transfektionsleistung zeigten.

Erfindungsgemäß kann das dargestellte Verfahren zur Zelltransfektion von verschiedenen kultivierten Zellinien angewandt werden. Die meisten Experimente wurden bisher an der humanen Endothelzellinie ECV 304 und an HeLa-Zellen ausgeführt.

Ein Komplexdurchmesser von ca. 30 nm, wie bei den K₁₆-DNA-Komplexen nachgewiesen, hat die ideale Größe für einen in vivo Gentransfer. Die Transfektionseffizienz dieser Komplexe, bei denen das Peptid völlig an die DNA gebunden ist, ist jedoch gering. Die Größe der Aggregate, die man mit den hier beschriebenen angefügten Peptiden erhält und die eine hohe Transfektionsleistung besitzen, ist wesentlich höher und damit für den in vivo Gentransfer ungeeignet. Angefügte Peptide mit 3-6 Aminosäuren führen erfindungsgemäß zu kleineren Komplexen, aber mit einer noch deutlich höheren Transfektionsleistung, als mit K₁₆ zu erreichen ist. Derartige Komplexe sind erfindungsgemäß für den in vivo Gentransfer geeignet.

Im Einzelnen läuft das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt ab:

• 1. Peptide, bestehend aus der Sequenz K₁₆ und der C-terminal angefügten, im folgenden charakterisierten Aminosäuresequenz werden durch klassische Peptidsynthese hergestellt. Die Peptide, die in TFA anfallen, werden durch Dialyse und Lyophilisierung in HCl überführt. TFA ist toxisch für Zellkulturen.
• 2. Transfizierende Komplexe mit der Vektor-DNA werden durch Mischen der Konstituenten in Gegenwart von 2-8 mM CaCl₂ hergestellt.
• 3. Die Transfektion erfolgt durch Addition der Komplexe zum Zellkulturmedium, das ebenfalls 2-8 mM CaCl₂ und/oder 0.1 mM Chloroquin enthält und weiter durch die Addition dieser Transfektionsmischung zu den Zellen. Die Transfektionsmischung verbleibt für einige Stunden auf den Zellen, wird dann entfernt und die Zellen gewaschen. Nach Wechsel zum normalen Kulturmedium (Posttransfektionsmedium) wird bis zum Fremdgen-Assay bzw. zum Beginn der Selektion inkubiert. Es ist auch möglich, das CaCl, und/oder das Chloroquin zum Posttransfektionsmedium zuzusetzen. Im Fall von CaCl₂ bilden die noch an der Zelloberfläche haftenden Komplexe ebenfalls Ca-Phosphat-Kopräzipitate aus, die von den Zellen aufgenommen werden können.
• 4. Die Transfektionsleistung der Peptide in vitro ist direkt mit der Größe der Komplexe (Aggregate) korreliert. Um in vitro hohe Transfektionsraten zu erzielen, werden Peptide einer Größe ausgewählt, die im Salzkonzentrationsbreich von 0.15 M bis 0.6 M NaCl erst bei höheren Salzkonzentrationen löslich werden.
• 5. Mit dieser Methode lassen sich auch Gewebe-bzw. Organproben (z. B. humanen Ursprungs aus Biopsien oder OP-Material) transfizieren. Diese Materialien, soweit sie ausreichend vital sind, werden mit den beschriebenen Transfektionsmischungen inkubiert und können anschließend auf die Anwesenheit der Fremdgene analysiert werden. Für diese Anwendungen werden Peptide ausgewählt, die bereits bei 0.3-0.4 M NaCl "löslich" werden und eine kleinere Größe, aber eine relativ hohe Transfektionsleistung besitzen.
• 6. Derartige Peptide eignen sich auch für einen in vivo Gentransfer.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen erläutert, auf die sie aber nicht beschränkt sein soll.

Ausführungsbeispiele 1. In vitro-Transfektion von ECV 304-Zellen mit Peptid-DNA-Komplexen a) Herstellung und Charakterisierung von Peptid-DNA-Komplexen für die in vitro Transfektion von Zellkulturen

Vektor-DNA und Peptid werden bei Zimmertemperatur in physiologischem Puffer (0.15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6) und in Gegenwart von 2-6mM CaCl₂, bezogen auf 100 µg Gesamtansatz, gemischt. In Abwesenheit von CaCl₂ erhält man eine etwas geringere Transfektionsleistung. Im allgemeinen wird ein Gewichtsverhältnis Peptid/DNA von 1 bei einem DNA-Einsatz von 2 µg eingestellt, was in etwa einem molaren Lysin/DNA-Phosphat-Verhältnis von 1,33, also leicht positiven Komplexen entspricht. Bei einem Gewichtsverhältnis von 5 erreichen die Komplexe bei einem positiven Ladungsüberschuß die höchste Transfektionseffizienz.

Die Komplexe werden im NaCl-Konzentrationsbereich von 0,15 M-0,6 M NaCl auf ihre Löslichkeit hin untersucht. Wie vorn dargestellt, kann auf Grund der kolloidalen Löslichkeit in diesem Salzbereich eine Voraussage der Transfektionsleistung in vitro gemacht werden. Zu diesem Zweck werden jeweils 100 µl Komplexlösung auf der Basis von 2 µg DNA in steigender NaCl-Konzentration im o. g. Intervall hergestellt. Die Lösungen werden bei 6000 Upm für 2 min abzentrigugiert und die Absorption des Überstands bei 260 nm gemessen. Komplexe, die bei < 0,4 M NaCl löslich werden, zeigen die höchste Transfektionsleistung in vitro.

Zu ähnlichen Schlußfolgerungen kann man durch eine Analyse der CD-Spektren kommen.

b) Transfektion und Erhöhung der Transfektionsleistung durch CaCl₂ und Chloroquin

Die fertigen Komplexe (wie oben) in 100 µl Puffer werden mit 0,9 ml Zellkulturmedium, vorzugsweise mit Optimem aufgefüllt und zu den gewaschenen Zellen gegeben. Optimem wird dann eingesetzt, wenn ohne Zugabe von CaCl₂ gearbeiteit wird. Die Transfektionsmischung bleibt 4 Std auf den Zellen, die Zellen werden dann mit RPMI gewaschen, frisches Kulturmedium (RPMI, 10% FKS) als Posttransfektionsmedium hinzugefügt und ca. 24 Std in einer 5% CO₂-Atmosphäre inkubiert. Anschließend wird mit dem Assay bzw. bei stabiler Expression mit der Selektion begonnen.

Die Transfektionsleistung kann erheblich gesteigert werden, wenn das Transfektionsmedium oder das Posttransfektionsmedium mit 2-6 mM CaCl₂ oder/und 0,1 mM Chloroquine versetzt wird. In diesem Fall wird RPMI als Zellkulturmedium eingesetzt. Beim Posttransfektionsansatz verbleiben das CaCl₂ und Chloroquin für 24 Std auf den Zellen. In diesem Fall ist die Toxizität des Ansatzes erheblich geringer, als wenn die DNA für die ganze Zeit anwesend wäre.

c) Ergebnisse

Die Abb. 1 zeigt Löslichkeitsmessungen von Peptid-DNA-Komplexen in Abhängigkeit von der NaCl-Konzentration. Es wird der nach Lockerung der Peptid-DNA-Bindung oder der salzinduzierten Abspaltung der Peptide resultierende Zerfall der Aggregate in Form der solubilisierten DNA-Konzentration gemessen. Die Aggregatgröße und damit die in vitro Transfektionsaktivität steigt mit zunehmender Salzkonzentration an. Dieser Zusammenhang konnte anhand von AFM-Messungen der Komplexe verifiziert werden (nicht gezeigt).

Die Ergebnisse von Transfektionsversuchen an ECV 304-Zellen, die mittels des Luciferasesystems (Vektor pCMV Luc) und einer Reihe verschiedener Peptide erhalten wurden, sind in Abb. 2 dargestellt. Alle getesteten Peptide wurden im gleichen Gewichtsverhältnis zur DNA von 1 eingesetzt. Die Experimente wurden in Gegenwart von 2 mM CaCl₂ im Transfektionsmedium durchgeführt. Bei 2 mM CaCl₂ im Transfektionsmedium erhält man speziell bei RGD-K₁₆ und RGE-K₁₆ eine weitere Steigerung der Transfektionseffizienz. Das übertragene Gen induziert in Gegenwart von Luciferin eine Lichtemission. Meßparameter ist die relative Zahl von Lichtimpulsen RLU/mg exprimiertes Protein. Transfiziert werden jeweils 2.10⁵ Zellen, die in 24er Mikrotiterplatten ausgesät wurden.

Die Abb. 2 zeigt, daß bei einem Zugabeverhältnis Peptid/DNA r_i (w/w) von 1 die höchsten Transfektionsleistungen mit Peptiden erhalten wurden, die in keinem Bezug zu bekannten Rezeptoren stehen. Auch eine Zyklisierung der Peptide erbringt keinen positiven Effekt auf die Transfektionseffizienz. Die folgende Reihenfolge wurde ermittelt: K₁₆- GGCKYPKYPCA < K₁₆-GGCRADMFGCA < K₁₆-GGARGDMFGAA-< K₁₆-GGCRGDMFGCA < K₁₆-GGCRGEMFGCA. Zum Vergleich sind auch die Transfektionsleistungen von K₁₆ bei r_i = 1 und r_i = 0,4 dargestellt. Die Werte der ligandierten Peptide bei r_i = 1 und von K₁₆ bei r_i = 0,4 können direkt verglichen werden. Bei r_i = 5, d. h. positivem Ladungsüberschuß der Komplexe steigen die Transfektionsleistungen weiter an, wobei jedoch die oben erhaltenen Unterschiede verloren gehen. In dem gezeigten Experiment wurden 2 mM CaCl₂ zum Posttransfektionsmedium hinzugesetzt. In Abwesenheit von CaCl₂ waren die erhaltenen Transfektionseffizienzen etwa 1 Zehnerpotenz kleiner (nicht gezeigt).

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Legenden zu den Abbildungen
Abb. 1
Solubilisierung der DNA (Zunahme der DNA-Absorption) nach NaCl-abhängiger Lockerung oder Abspaltung der Peptide K₁₆-cRGE-K₁₆ (∎), K₁₆-cRGD(•), K₁₆-cRAD-K₁₆ (▲), K₁₆-RGD (⬩) und K₁₆-cKYP () aus den bei 0.15 M NaCl unlöslichen Peptid-DNA-Aggregaten. c soll zyklische Peptide symbolisieren.
Abb. 2
Vergleich der Transfektionseffizienzen von Peptid-DNA-Komplexen bei r_i = 1 (a) und r_i = 5 (b). 2 × 10⁵ ECV304-Zellen wurden mit Komplexen von 2 µg pCMV Luc und 2 µg (A) und 10 µg Peptid transfiziert, 2 mM Ca²⁺ im Posttransfektionsansatz. Die Werte von K₁₆-DNA-Komplexen bei r_i = 0.4 entsprechen den gezeigten Komplexen bei r_i = 1. Um die Meßwerte auf 1 mg exprimiertes Protein zu beziehen, sind die RLU-Werte mit dem Faktor 100 zu multiplizieren.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (9)

1. Peptide für den Gentransfer, bestehend aus einer DNA-Trägersequenz von 10-20 Lysinen, an deren C-Terminus 5-20 weitere Aminosäuren angefügt sind.

2. Peptide für den Gentransfer nach Anspruch 1, bestehend aus einer DNA-Trägersequenz von 16 Lysinen (K₁₆), an deren C-Terminus 11 weitere Aminosäuren in linearer Anordnung angefügt sind, ausgenommen RGD- und RGE-Sequenzen, die für die Erkennung von Integrinen der Zelloberfläche beschrieben wurden.

3. Peptide für den Gentransfer nach Anspruch 1 und 2, gekenzeichnet durch die Trägersequenz K₁₆ und eine C-terminal angefügte cyclisierte Aminosäuresequenz von 11 Aminosäuren, die durch eine Disulfidbrücke zwischen den 2 die Sequenz flankierenden Cytosinen hergestellt worden ist, ausgenommen RGD-und RGE-Sequenzen, die für die Erkennung von Integrinen der Zelloberfläche beschrieben wurden.

4. Peptide für den Gentransfer nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch die Sequenz
mit Disulfidbrücke.

5. Peptide für den Gentransfer nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet durch die Sequenz
mit Disulfidbrücke.

6. Peptide für den Gentransfer nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet durch die Sequenz N-(K₁₆)-GGARGDMFGAA-OH.

7. Peptid-DNA-Komplexe mit Peptiden nach Anspruch 1-2 gekennzeichnet dadurch, daß zum Erreichen hoher Transfektionseffizienzen solche Peptide verwendet werden, deren Komplexe mit Vektor-DNA im Salzkonzentrationsbereich von 0,15 M-0,6 M NaCl erst bei höheren Salzkonzentrationen solubilisiert werden.

8. Verfahren zum Peptid-vermittelten Gentransfer, gekennzeichnet dadurch, daß
die Peptide nach Anspruch 1-6 mit der zu transfizierenden Vektor-DNA in Gegenwart von CaCl₂
vermischt werden,
der gebildete Komplex mit einem Zellkulturmedium (Transfektionsmedium), bevorzugt RPMI, das CaCl₂ und/oder Chloroquin enthält, gemischt und zu den Zellen addiert wird,
das CaCl₂ zum Posttransfektionsmedium addiert wird, das nach Entfernen des Transfektionsansatzes von den Zellen und Waschen der Zellen für 24 Std. zwecks Inkubation auf den Zellen verbleibt.

9. Verfahren nach 8, gekennzeichnet dadurch, daß zum Erreichen hoher in vitro Transfektionseffizienzen Peptide eingesetzt werden, deren Komplexe mit Vektor-DNA im Salzkonzentrationsbereich von 0,15-0,6 M NaCl erst bei höheren Salzkonzentrationen löslich werden.