DE10017565A1

DE10017565A1 - HST-Rotor-System für die Hochgeschwindigkeits Zentrifugation von Proben mit großem Durchsatz im 8/12-Strip Mikrotiterformat

Info

Publication number: DE10017565A1
Application number: DE2000117565
Authority: DE
Original assignee: Retro-Tech GmbH Gesellschaft fur Retrovirale Technologie; Sigma Laborzentrifugen GmbH
Current assignee: Retro-Tech GmbH Gesellschaft fur Retrovirale Technologie; Sigma Laborzentrifugen GmbH
Priority date: 2000-04-10
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2001-10-18

Abstract

Die Erfindung betrifft die Entwicklung eines Festwinkelrotors, entsprechender Adaptoren und weiteren Zubehörs, die die schnelle und automatisierbare HST-High Speed & Throughput-Zentrifugation von bis zu 3 x 96 Probem im Mikrotiter 8/12-Strip-Format bei hohen Gravitationsfeldern von > 20000 xg ermöglichen. DOLLAR A Im Besonderen wird die Konstruktion des Rotors, die Anordnung der Rotor-Bohrungen und der einsetzbaren Adapter beschrieben, die die Verwendung verschiedener Probenröhrchen im Mikrotiterformat und im Mikrotiter 8/12-Strip-Raster mit unterschiedlicher Probenvolumina (z. B. 100 mul-2,0ml) für HST-Zentrifugation ermöglichen. DOLLAR A Die Anordnung der Bohrungen im Mikrotiter 8/12-Strip-Raster und die Verwendung entsprechender Adapter ermöglicht erstmalig die Kombination automatisierter Probenvorbereitung (Pipettieren) im Mikrotiterformat mit einer schnellen, zeitsparenden und automatisierbaren Rotor Be- und Entladung im Mikrotiter 8/12-Strip-Raster und der simultanen HST-Zentrifugation von bis zu 3 x 96 Proben. DOLLAR A Die Zentrifugation im Winkel bewirkt die Positionierung des Pellets an der Seitenwand des Probenröhrchens und somit eine quantitative Entfernung bzw. kontaminationsfreies Absaugen der Überstände und/oder Weiterprozessierung der Pellets oder Überstände im Mikrotiter 8/12-Strip-Raster und/oder Mikrotiterformat. DOLLAR A Dier Spezial-Rotor inkl. Adaptoren und Zubehör können bei allen Applikationen eingesetzt werden, wo es um HST-High Speed & Throughput-Zentrifugation bzw. ...

Description

Stand der Wissenschaft und Technik

Die Zentrifugation ist eine essentielle Methode zur Trennung oder Isolierung von Molekülen, Mikroorganismen, Zellen aus komplexem biologischem Material wie Körperflüssigkeiten, Gewebe-, Organe-, Zellkulturen-Extrakte & Überstände, Blut, Seren, Liquor etc.

Für die Präparation von Nukleinsäuren (Plasmid-DNA, virale-RNA/DNA) sowie molekulare Virus-Diagnostik (PCR, bDNA, RTA) in Forschung, klinischen Labors und Blutbanken ist eine Probenvorbereitung bzw. Virus oder E.coli Extraktion aus dem biologischen Material mittels Zentrifugation absolut notwendig. Die Pelletierung von Viren, Mikroorganismen und Zell organellen erfordert jedoch auf Grund deren niedrigen Größe/Masse hohe Gravitations felder 10.000-100.000 xg und hohe Probenkapazitäten bzw. Automatisierbarkeit auf Grund der Vielzahl von Proben in der Routine-Analyse.

Kleine Zentrifugen erreichen niedrige Gravitationsfelder (< 20.000 xg) und können somit nur begrenzt oder gar nicht für die Trennung oder Isolierung von Molekülen, Viren oder Mikro organismen eingesetzt werden. Zudem ist die gängige Rotor-Kapazität auf maximal 24-48 Bohrungen/Proben begrenzt, deren Format auch nicht dem Well-Durchmesser und Well- Abständen von Mikrotiterplatten entsprechen. Dieses macht die Probenvorbereitung und deren Übertragung auf Rotoren relativ arbeits- und zeitaufwendig und auch schwer automatisierbar, da nicht im Mikrotiterformat durchführbar.

Mittlerweile gibt es zwar auch spezielle Mikroptiterplatten-Rotoren, die jedoch auf Grund des Mikroplatten-Materials (polystyrol) und der Rotorengröße lediglich bis 1.500 xg zentrifugiert werden können.

High Speed Zentrifugen bzw. Ultrazentrifugen erreichen Gravitationsfelder von bis zu 150.000 xg und sind somit auch für die Trennung oder Isolierung von Molekülen, Viren und Mikroorganismen geeignet. Leider ist deren Rotor-Kapazität bei Verwendung von Adaptoren je nach Probenvolumen auf 6-24 Proben limitiert und somit für den Einsatz in der Routineanalytik bzw. automatisierten Probenvorbereitung nicht geeignet oder mit sehr großem Arbeits- und Zeitaufwand verbunden.

Inzwischen gibt es sogenannte kompakte Tisch High Speed Zentrifugen wie z. B. Sigma 3K30 (Sigma), Avanti T-30 (Beckman) die mit 24-36 Platz Festwinkelrotoren Gravitations felder von bis zu 60.000 xg erreichen und somit für die Isolierung von Zellorganellen, Mikro organismen und Viren aus bis zu 36 Proben a 2 ml ermöglichen.

Trotzdem ist eine schnelle automatisierte Probenprozessierung und Zentrifugation in Routine labors von z. B. 1000 Proben pro Tag immer noch nicht praktikabel bzw. sehr arbeits- und zeitaufwendig. Gleichfalls ist eine automatisierte Beladung von Rotoren mit Proben bislang noch nicht möglich.

Problemlösung

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Rotor-System zu entwickeln, das es ermöglicht, eine möglichst große Menge von Proben mit variablem Volumen schnell, automati sierbar und im Mikrotiter-8/16 Rasterformat in Zentrifugenröhrchen zu dispensieren, in den Rotor zu transferieren und bei hohen Gravitationsfeldern (< als 20.000 g) zu zentrifugieren.

Diese Aufgabe wird erfindungsmäßig dadurch gelöst, daß ein HST-Rotor-System bestehend aus Festwinkelrotor und entsprechende Adaptoren entwickelt wurde, die mit Bohrungen in der Anordnung eines Mikrotiter-8/12-Strip Formats und entsprechend passend zu dem Well-Durchmesser und Well Abstand von Mikrotiterplatten versehen ist. Dazu werden verschließbare Mikrotiter-Röhrchen von unteschiedlichen Probenvolumen (z. B. 100 µl-2 ml) verwendet, die in Mikrotiter-Racks vorbereitet und dann im Mikrotiter 8/12 Strip Raster in die Adaptoren bzw. den Rotor transferiert werden.

Die Kombination der Mikrotiter-Röhrchen mit der Mikrotiter 8/12 Strip-Raster Anordnung, ermöglicht eine automatisierte, kontaminationsfreie Probenvorbereitung im Mikrotiterformat, einen automatisierbaren Transfer in den Rotor sowie automatisierte, kontaminationsfreie Proben-Nachbereitung im Mikrotiterformat.

Somit können bis zu 3 × 96 Proben (entspricht 3 Mikrotiterplatten) von unterschiedlichen Volumina (z. B. 100 µl-2 ml) bei < 20.000 xg pro Lauf zentrifugiert werden und die Probenvorbereitung für verschiedene Applikationen mit einer Zeitersparnis von bis zu 90% beschleunigt, durchsatzmäßig erweitert und automatisiert werden.

Beispiel

Ausgehend vom o. g. Stand der Wissenschaft und Technik wurde das HTS-Rotor-System für die 3K30 Zentrifuge (passend auch zu Avanti-T-30) entwickelt und getestet. Das HTS- Rotor-System besteht aus einem Festwinkel-Rotor und entsprechenden Adaptoren (siehe Abb. 1-7) das bei mittelhohen Gravitationsfeldern bis zu 40.000 xg gefahren werden kann. Die Bohrungen sind in einem Mikrotiter-8/12-Strip-Format angeordnet mit Dimensionen, die dem Well-Durchmesser und Well-Abständen einer Mikrotiterplatte entsprechen und somit für Mikrotiter-Röhrchen (Durchmesser ca. 8 mm) und deren Transfer im 8 Strip-Raster vom Mikrotiter-Rack zum Rotor bzw. Adapter passen.

Das Besondere an dem Mikrotiter-8/12-Strip-Raster ist, daß die Mikrotiter-Röhrchen im Format von Mikrotiter-Racks auf die entsprechenden Adaptoren automatisiert transferiert und mit Probenmaterial beschickt werden können mit einem Probendurchsatz und Zeitaufwand eines gängigen Laborroboters (ca. 20.000 Proben pro Tag).

Die Vorteile des neuen Rotors sollen am Beispiel der Probenvorbereitung in Blutbanken für die Virus-Testung von Blutkonserven auf HCV/HIV/HBV mittels PCR erläutert werden:

1. Die leeren Mikrotiter-Röhrchen werden aus ihren Mikrotiter-Racks auf die Rotor-Adapter im Mikrotiter 8/12 Strip Raster verteilt.
2. Anschließend wird das Spenderblut als Einzelprobe zu je 1.2 ml per Roboter auf Mikrotiter-Röhrchen verteilt. Die Röhrchen werden dann manuell oder automatisch mit sogenannten 8/12-seal strips verschlossen und im Adapter manuell oder automatisch in den Rotor transferiert.
Vorteil: die Mikrotiter-Röhrchen lassen sich durch das Mikrotiter-8/12-Strip-Raster in Labor-Roboter integrieren und automatisiert im Mikrotiterformat beladen, unterschichten etc.; weiterhin gewährleistet der Transfer der Mikrotiter-Röhrchen in den Adaptern eine sichere (kontaminationsfreie), einfache, schnelle und automatisierbare Übertragung der Proben in Rotor und Zentrifuge.
3. Die Zentrifugation, bei der z. B. Viren pelletiert werden, erfolgt bei 40.000 xg, 90 min. und 4°C. Dabei können simultan bis zu 3 × 96 Proben pro Lauf und somit pro Tag ca. 1800 Proben (6 Läufe) zentrifugiert werden.
Vorteil: für die Pelletierung von Viren aus 192 Proben benötigt man ca. 3 Tage bei Ultrazentrifugation (6-24 Platz-Rotor, 100.000 xg), ca. 2 Tage bei Kleinzentrifugen (24-36 Platz-Rotoren, 20.000 xg) und ca. 2 Stunden im HTS-Rotor-System (192 Platz-Rotor, 40.000 xg), was eine Zeitersparnis von ca. 90% ausmacht.
4. Die Adapter werden mit den Röhrchen manuell oder automatisch aus dem Rotor entnommen im Mikrotiter 8/12 Strip Raster auf die Mikrotiter-Racks übertragen. Anschließend werden die Verschluss-Strips von den Röhrchen entfernt und die Überstände quantitativ und kontaminationsfrei automatisch im Mikrotiterformat abgesaugt und weiterprozessiert.
Vorteil: die Mikrotiter-Röhrchen lassen sich durch das Mikrotiter-8/12-Strip-Raster in Labor-Roboter integrieren und automatisiert im Mikrotiterformat weiterbearbeiten etc.; weiterhin gewährleistet der Transfer der Mikrotiter-Röhrchen in den Adaptern eine sichere (kontaminationsfreie), einfache, schnelle und automatisierbare Übertragung der Proben auf die Mikrotiter-Racks.

Zusammenfassend liegen die Vorteile des HST-Rotor-Systems in der neugeschaffenen Möglichkeit einer schnelleren und automatisierbaren HST-Zentrifugation von Proben durch

a) einzigartiges Mikrotiter 8/12-Stripformat und Anordnung der Rotor & Adapter Bohrungen
b) Integrierbarkeit der Adapter in die gängige Laborautomation auf Mikrotiterbasis
c) die einzigartig hohe Rotorkapazität von bis zu 3 × 96 Proben pro Lauf
d) die zeitsparende Zentrifugation bei mittelhohen Gravitationsfeldern von <20.000 xg

Claims

1. Rotor-System bestehend aus Festwinkelrotor, Adaptoren und weiterem Zubehör dadurch gekennzeichnet daß sie gem. Abb. 1-7 mit Bohrungen in der Anordnung eines Mikrotiter 8/12-Strip-Formats und entsprechend passend zu dem Well-Durch messer und Well-Abstand von Mikrotiterplatten versehen sind und bei der automatisierbaren Be- und Entladung von Probenröhrchen in Rotoren sowie der HST-High Speed von Mikrotiter-Proben-Röhrchen verwendet werden.

2. Rotor-System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bohrungen direkt im Rotor als Mikrotiter 8/12-Strip-Raster gem. Abb. 2 oder indirekt in entsprechenden Adaptoren als Mikrotiter 8/12-Strip-Format gem. Abb. 3-7 angeordnet sind.

3. Rotor-System nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rotor-Bohrungen bzw. Adapter im Mikrotiter 8/12 Stripformat uzw. im Rotor vertikal bzw. vom Außen- hin zum Innenradius positioniert sind und somit eine Rotor & Probenkapazität von bis zu 3 × 96 Proben ermöglichen.

4. Rotor-System nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die HST-High Speed von Mikrotiter-Proben-Röhrchen im Mikrotiter 8/12- Strip-Format bei mittelhohen Gravitationsfeldern < 20.000 xg in entsprechend aus_ gestatteten Zentrifugen ermöglicht und durchgeführt wird.

5. Festwinkelrotor nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Be- und Entladung des Rotors sowie für die HST-High Speed Proben von unterschiedlichen Volumina in entsprechenden Mikrotiter-Röhrchen und -Racks und Verschluss-Strips im Mikrotiter 8/12-Strip-Format verwendet werden.

6. Rotor-System nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß letzteres bei der HST- High Speed Isolierung von Zellorganellen, Mikroorganismen, Viren und Nukleinsäuren mittels HST-High Speed eingesetzt wird.