DE10004456A1 - Synthetische Peptide als Strukturelemente einer sich durch Anlagerung (Selbst-Anordnung) der Peptide aneinander aufbauenden geordneten Struktur - Google Patents

Abstract

Synthetische Peptide als Strukturelemente einer sich durch Selbst-Anlagerung (Selfassembly) der Peptide aneinander aufbauende geordnete Struktur, wobei die Peptide unterschiedliche erste und zweite Peptide umfassen, in denen jeweils Bindungsbereiche ausgebildet sind, die so aufeinander abgestimmt sind, daß in einem Gemisch beider Peptide eine spontane Anlagerung der unterschiedliche Peptide aneinander über ihre Bindungsbereiche erfolgt, wobei die Peptide jeweils mindestens zwei Bindungsbereiche aufweisen, wobei alle Bindungsbereiche unterschiedlich und so aufeinander abgestimmt ausgebildet sind, daß bei Anwesenheit beider Peptide unter geeigneten Bedingungen eine spontane Bildung von kettenförmigen Hetero-Oligomeren erfolgt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf synthetische Peptide nach dem Oberbegriff des Anspruches 1 sowie auf eine bevorzugte Verwendung der Peptide.

Gattungsgemäße synthetische Peptide finden insbesondere Anwendung als Strukturelemente in Materialien, die sich durch spontane Anlagerung der Struk­ turelemente aneinander aufbauen können.

Das US-Patent 5,712,366 beschreibt die Herstellung synthetischer erster und zweiter Peptide, die jeweils aufeinander abgestimmte Bindungsbereiche aufwei­ sen, mit denen sich die Peptide spontan aneinanderlagern. Die Aneinanderlage­ rung (Selbst-Anordnung) führt zu einer dauerhaften Heterodimerisierung, d. h. einer Verknüpfung jeweils eines ersten Peptids mit einem zweiten Peptid.

Bei den vorbekannten Peptiden sind die Bindungsbereiche als Zipperdomänen ausgebildet, die einem Abschnitt des entsprechenden Peptides mit spezieller α- helikaler Sekundärstruktur (Coiled-Coil-Struktur) entsprechen. Die spezielle Se­ kundärstruktur weist mehrere in Form einer "Wendeltreppe" angeordnete Hepta­ mere mit sich wiederholenden Positionen auf. Üblicherweise sind zwei räumlich benachbarte Positionen mit hydrophoben Aminosäuren (z. B. Valin oder Leucin) belegt. Es bildet sich so eine über die Heptamere der Zipperdomäne verlaufende hydrophobe Kontaktfläche aus, die später mit einer entsprechenden hydrophoben Kontaktfläche einer weiteren Zipperdomäne eines anderen Peptides interagieren kann.

Weitere Positionen der Zipperdomänen werden mit unterschiedlich geladenen Aminosäuren besetzt. Man kann so die Zipperdomänen individuell ausgestalten dergestalt, daß sie bevorzugt an andere Zipperdomänen mit entsprechend entge­ gengesetzten Ladungen in den jeweiligen Positionen binden etc..

Das angesprochene US-Patent 5,712,366 sieht unterschiedliche Möglichkeiten vor, mit Hilfe solcher synthetischen Peptide geordnete 2- bzw. 3-dimensionale Strukturen zu erzeugen. Es kann hierzu z. B. vorgesehen sein, daß abhängig von der gewünschten Struktur zusätzliche C- bzw. N-terminale Erkennungsbereiche an die Peptide synthetisiert werden, über die die gebildeten Heterodimere geord­ net miteinander verknüpft werden können.

Durch die zusätzliche Ausbildung solcher terminalen speziellen Erkennungsbe­ reiche neben den Bindungsbereichen ist das Design geeigneter Peptide relativ aufwendig.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ausgehend vom Stand der Technik, syntheti­ sche Peptide zu schaffen, die sich automatisch zu geordneten heterooligomeren Strukturen aneinander anlagern können und deren Design gegenüber dem Stand der Technik deutlich vereinfacht ist.

Gelöst wird diese Aufgabe mit synthetischen Peptiden, die die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweisen.

Danach ist vorgesehen, daß die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide, wie aus dem Stand der Technik bekannt, erste und zweite Peptide umfassen, die je­ weils mindestens zwei von ihrem Bauprinzip her ähnliche, bezüglich ihrer spezi­ fischen Bindungseigenschaften jedoch unterschiedliche Bindungsbereiche auf­ weisen.

Die Bindungsbereiche der erfindungsgemäßen Peptide sind so gewählt, daß eine spontane Hetero-Oligomerisierung zu insbesondere kettenförmigen Strukturen bei Anwesenheit beider Peptide in einem Gemisch gegenüber Homo- Oligomerisierung stark favorisiert wird.

Bei den erfindungsgemäßen synthetischen Peptide handelt es sich zum Beispiel um α-helikale Peptide.

Bevorzugt werden die Bindungsbereiche der Peptide in Form der oben angespro­ chenen Heptamer-Zipperdomänen ausgebildet. Durch entsprechende Verteilung der polaren bzw. geladenen Aminosäuren in den Zipperdomänen werden den je­ weiligen Bindungsbereichen spezifische Bindungseigenschaften verliehen, die die Anlagerung der Bindungsbereiche in definierter Anordnung aneinander be­ wirken.

In einem Gemisch der erfindungsgemäßen Peptide lagern sich jeweils erste und zweite Peptide überlappend aneinander (siehe Fig. 3) an. Jeweils an beiden Enden eines "Dimers" entsteht ein überstehender freier Bindungsbereich, an den sich ein passender freier Bindungsbereich eines weiteren Peptides anlagern kann. Es bildet sich ein kettenförmiges Hetero-Oligomer (siehe z. B. Fig. 3). Die Oli­ gomerisierung kann gestoppt werden durch Zugabe von Peptiden, die nur einen Bindungsbereich aufweisen.

Wie oben angesprochen werden die Bindungsbereiche in den erfindungsgemäßen Peptiden bevorzugt als Zipperdomänen ausgebildet. Grundsätzlich ist es aber auch möglich, sich andere Proteinwechselwirkungen zunutze zu machen, und durch Verteilung entsprechender Bindungsdomainen in den Peptiden die ge­ wünschte Oligomerisierung zu erreichen.

Werden die in den erfindungsgemäßen Peptiden vorgesehenen Bindungsbereiche als Zipperdomänen ausgebildet, so wird diesen Zipperdomänen vorzugsweise die aus dem Stand der Technik bekannte Heptamerstruktur mit Positionen a bis g gegeben (siehe Fig. 1). Die Positionen a und d werden vorzugsweise mit hydro­ phoben Aminosäuren und die Positionen e und g mit polaren bzw. geladenen Aminosäuren besetzt.

Die hydrophoben Aminosäuren a und d (in aller Regel werden in diesen Positio­ nen alternierend Leucin und Valin eingesetzt) bilden eine hydrophobe Kontakt­ fläche der Zipperdomäne aus, die relativ unspezifisch an entsprechende hydro­ phobe Kontaktflächen anderer Zipperdomänen binden kann.

Die Spezifität der Zipperdomänen wird vorwiegend über die angesprochenen Belegungen der Positionen e und g mit polaren bzw. elektrisch geladenen Ami­ nosäuren erreicht. Hier können unterschiedliche Ladungsmuster innerhalb der Zipperdomänen erzeugt werden, die favorisiert an komplementäre Ladungsmuster in anderen Zipperdomänen binden.

Durch entsprechende Belegung der Heptamerpositionen kann man relativ unpro­ blematisch Zipperdomänen erzeugen, an die nur spezifische andere Zipperdomä­ nen in definierter Ausrichtung zu einander binden können. Man kann durch ent­ sprechendes Design eine gewünschte parallele Anordnung der synthetischen Peptide (d. h. es steht jeweils an den Enden des gebildeten Dimers ein freier Bin­ dungsbereich über) gegenüber einer nicht gewünschten anti-parallelen Anord­ nung (es kommt zu einer Heterodimerbildung, in der alle Bindungsbereiche "verbraucht" sind) favorisieren. Besonders bevorzugt werden die Zipperdomänen so ausgebildet, daß ihre Bindung zu einer "treppenförmigen" Anlagerung der Peptide aneinander wie in Fig. 3 gezeigt führt.

Die in den erfindungsgemäßen synthetischen Peptiden vorgesehenen Bindungsbe­ reiche sind über Aminosäuresequenzen verknüpft, die in unterschiedlicher Weise aufgebaut sein können.

Eine Möglichkeit ist, in den die Bindungsbereiche verbindenden Sequenzen, ein Glycin-Gelenk vorzusehen, mit dem die Bindungsbereiche gegeneinander ver­ winkelt werden können.

Eine andere Möglichkeit sieht vor, in der Verbindungssequenz Aminosäuren vor­ zusehen, die die Löslichkeit des Peptides erhöhen. Es hat sich gezeigt, daß eine Serinfolge (d. h. es werden aufeinanderfolgende Positionen der Sequenz mit je­ weils der Aminosäure Serin besetzt) in diesem Bereich die Löslichkeit deutlich verbessert.

Eine weitere Ausgestaltung betrifft die mögliche Vernetzung der aus den synthe­ tischen Peptiden durch Anlagerung entstandenen kettenförmigen Oligomere. Es ist denkbar, in den synthetischen Peptiden spezielle Kopplungsstellen vorzuse­ hen, die eine seitliche Verzweigung ermöglichen.

Konkret könnte dies z. B. dadurch geschehen, daß bei rekombinanter Herstellung anstelle eines üblicherweise vorgesehenen His-Tags ein sogenannter Avi-Tag (Fa. Avidity) in die Peptide eingeführt wird. Avi-Tags lassen sich durch eine Biotin- Ligase biotirtylieren. Die biotinylierten Peptide lagern sich dann in Gegenwart von Streptavidin zu einer Matrix aneinander (siehe Fig. 4). Die Biotynilierung kann natürlich auch auf andere Weise, z. B. chemisch bzw. biochemisch, erfol­ gen.

Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich z. B. mittels rekombinanter Techniken herstellen. In Abhängigkeit von der gewünschten Aminosäuresequenz wird zu­ nächst die zugehörige DNA-Sequenz synthetisiert. Die DNA-Sequenz wird dann z. B. in geeignetes Plasmid inseriert und in einem geeigneten Wirt exprimiert. Denkbar ist natürlich auch, die Peptide direkt in geeigneten Einrichtungen zu synthetisieren.

Wie oben angesprochen, können die sich durch spontane Anlagerung der synthe­ tischen Peptide aneinander gebildeten Strukturen (wie aus dem Stand der Technik bekannt) zu unterschiedlichen Zwecken verwendet werden.

Eine im Rahmen der Erfindung bevorzugte, bislang aus dem Stand der Technik nicht bekannte Verwendung besteht darin, die erfindungsgemäßen synthetischen Peptide zur Signalverstärkung einzusetzen.

Hintergrund ist, daß übliche Markierungen, z. B. Fluoreszenzmarkierungen, von an einem Träger gebundenen Targetmolekülen erst ab einer bestimmten Bele­ gungsdichte detektierbare Signale liefern.

Aus dem Stand der Technik ist in diesem Zusammenhang bekannt, an die Tar­ getmoleküle durch Sebst-Anordnung aufgebaute Strukturen zu koppeln, die z. B. eine Vielzahl von Fluoreszenzmarkierungen tragen und ein entsprechend ver­ stärktes Signal (mehr Farbstoff, Lumineszenz, Fluoreszenz pro Targetmolekül) liefern.

Das US-Patent 4,684,609 beschreibt ein Mehrkomponentensystem, das im we­ sentlichen auf die spezielle Affinität zwischen Biotin und Streptavidin aufbaut. Zunächst wird ein erster Antikörper eingesetzt, der spezifisch an das gebundene Targetmolekül bindet. An diesen Antikörper wird ein zweiter (für den ersten An­ tikörper spezifischer) biotinylierter Antikörper gebunden. An die Biotindomäne des zweiten Antikörpers wird dann eine durch Selbst-Anordnung aufgebaute Struktur aus Avidin und biotinylierten Makromolekülen, die jeweils einen Marker aufweisen, gekoppelt. Auf diese Weise können zur Signalverstärkung an jedes Targetmolekül Strukturen gekoppelt werden, die mehrere Marker enthalten.

Ein Problem bei dem bekannten System ist, daß die eingesetzten Konzentrationen an Avidin und biotinylierten Makromolekül sehr genau aufeinander abgestimmt werden müssen. Ein Überschuß an Avidin kann z. B. dazu führen, daß die freien Bindungsstellen des zweiten Antikörpers abgesättigt werden und nicht mehr für die Bindung der signalverstärkenden Struktur zur Verfügung stehen. Ein Über­ schuß an biotinylierten Makromolekül führt dagegen zu einer unerwünschten Ab­ sättigung des Avidin wiederum mit dem Effekt, daß die spezifische Bindung an dem zweiten Antikörper unterbleibt. Ein weiteres Problem ist, daß Bio­ tin/Streptavidin-Systeme in Folge unspezifischer Bindungen oft ein relativ star­ ken Signal-Hintergrund zeigen.

Erfindungsgemäß ist daher vorgesehen, die oben angesprochenen synthetischen Peptide zur Ausbildung von signalverstärkenden Systemen zu verwenden. Im Prinzip kann dabei wiederum ein System vorgesehen werden, das zunächst eine Koppelstelle über spezifisch an dem Targetmolekül bindende Moleküle, z. B. einen bzw. mehrere Antikörper schafft. Als Koppelstelle kann z. B. auf dem zur spezifi­ schen Bindung des Targetmoleküls eingesetzten Antikörper ein geeigneter Bin­ dungsbereich vorgesehen werden, der eine Bindung an die eingesetzten erfin­ dungsgemäßen Peptide ermöglicht. Denkbar sind aber auch andere Arten der Verknüpfung z. B. über das oben beschriebene Biotin-Streptavidin-System etc. In jedem Fall vermeidet man die oben beschriebenen Probleme, da Konkurrenz­ reaktionen, die zu einer vorzeitigen unerwünschten Absättigung einzelner Kopp­ lungsstellen führen können, bei Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide nicht auftreten.

Zur Markierung können die Peptide, bzw. einige der Peptide, singuläre Cystein- Reste aufweisen, über die in besonders einfacher Weise ein Fluorophor terminal eingeführt werden kann.

Im folgenden soll die Erfindung anhand von mehreren Abbildungen näher erläu­ tert werden.

Fig. 1 zeigt die Heptamerstruktur von den bevorzugt als Zipperdo­ mänen ausgebildeten Bindungsbereichen der erfindungsge­ mäßen Peptide.

Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2) von zwei im Rahmen der Erfindung bevorzugt einge­ setzten synthetischen Peptiden und ihre entsprechenden, die spezifischen Eigenschaften der Bindungsbereiche definie­ renden Ladungsmuster.

Fig. 3 zeigt ein aus synthetischen Peptiden erzeugtes kettenförmi­ ges Oligomer.

Fig. 4 zeigt die Bildung einer Matrix in Gegenwart von Streptavi­ din

Fig. 5 zeigt die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Signalverstärkung

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung von Heptameruntereinheiten 10 und 10' der Zipperdomänen zweier einander zugewandter Bindungsbereiche A, B bzw. C, D (siehe Fig. 2).

Die Heptameruntereinheiten weisen die generellen Positionen a, a' bis g, g' auf, wobei die Positionen a, a' und d, d' mit hydrophoben Aminosäuren und die Posi­ tionen e, f und g mit geladenen oder polaren Aminosäuren belegt sind.

Eine bevorzugte Belegung der Heptamerpositionen könnte z. B. sein: a = Valin; b = Serin; c = Serin; d = Leucin; e = Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin; f = Serin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin und g = Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Arginin.

In Fig. 1 sind durch Pfeile 11 und 12 die hydrophoben (11) bzw. elektrostati­ schen (12) Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Aminosäuren in den Postionen a, a' und d, d' und den geladenen Aminosäuren in den Positionen e, e' und g, g' angedeutet.

Fig. 2 zeigt Sequenzen (SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2) zweier erfindungsgemä­ ßer Peptide 20, 20'. Die ersten 16 Aminosäuren sind jeweils His-Tags. Die ver­ bleibenden 78 Aminosäuren stellen den relevanten Sequenzbereich dar, in dem jeweils zwei als Zipperdomänen ausgebildete Bindungsbereiche A, C und B, D enthalten sind. Die Bindungsbereiche A, C und B, D sind aus jeweils 5 Heptame­ ren 10, 10' aufgebaut und über eine Verbindungssequenz 21, 21' aus sechs Ami­ nosäuren miteinander verbunden.

In Fig. 2 sind die durch die jeweilige Belegung insbesondere der Positionen e, f und g erzeugten Ladungsmuster der Zipperdomänen A, C in 22 und D, B in 22' angedeutet. Die Zipperdomänen sind so ausgebildet, daß A an B und D an C in definierter Ausrichtung binden.

Ein durch selbständige Anlagerung der Peptide 20, 20' gebildetes kettenförmiges Heterooligomer 30 ist in Fig. 3 schematisch mit jeweils den zur Anlage kom­ menden Zipperdomänen dargestellt.

Fig. 4 zeigt die Verknüpfung von kettenförmigen Heteroligomeren 30 zu einer Matrix 300. Einige der zur Oligomerisierung eingesetzten Peptide 200, 200' sind hierzu mit einer Biotin-Untereinheit 35 versehen und ermöglichen so in Gegen­ wart von Streptavidin 36 eine seitliche Verzweigung der Ketten 30.

Fig. 5 zeigt eine Variante, bei der ein aus Peptiden 40, 40' gebildetes Heterooli­ gomer 41 über einen Antikörper 42 an ein an einem Träger 44 immobilisiertes Targetmolekül 43 zur Signalverstärkung gebunden ist.

Der Antikörper 42 weist einen für das Targetmolekül spezifischen Bereich 45 sowie eine Zipperdomäne (in diesem Fall z. B. die Domäne C) auf, an die das sich bildende oder gebildete Heterooligomer 41 ankoppeln kann.

Die Peptide 40' sind jeweils mit einem Fluorophor 46 markiert, so daß im ge­ zeigten Fall ein gegenüber einer einfachen Markierung vierfach verstärktes Signal erzeugt werden kann.

Weiterhin zeigt Fig. 5 ein Peptid 48 mit nur einem Bindungsbereich, das für den Kettenabruch eingesetzt werden kann.

Mit Hilfe des dargestellten Heterooligomers 41 kann ein nachzuweisendes Tar­ getmolekül wesentlich deutlicher markiert werden, als dies mit üblichen Markie­ rungen der Fall wäre.

SEQENZPROTOKOLL

Claims (13)

1. Synthetische Peptide als Strukturelemente einer sich durch Selbst- Anlagerung (Selfassembly) der Peptide aneinander aufbauende geordnete Struktur, wobei die Peptide unterschiedliche erste und zweite Peptide um­ fassen, in denen jeweils Bindungsbereiche ausgebildet sind, die so aufein­ ander abgestimmt sind, daß in einem Gemisch beider Peptide eine sponta­ ne Anlagerung der unterschiedliche Peptide aneinander über ihre Bin­ dungsbereiche erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide jeweils mindestens zwei Bindungsbereiche aufweisen, wobei alle Bindungsberei­ che unterschiedlich und so aufeinander abgestimmt ausgebildet sind, daß bei Anwesenheit beider Peptide unter geeigneten Bedingungen eine spon­ tane Bildung von kettenförmigen Hetero-Oligomeren erfolgt.

2. Synthetische Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsbereiche der Peptide so ausgebildet sind, daß jeweils ein Bindungsbereich eines ersten Peptides selektiv in definierter räumlicher Aus­ richtung an einen Bindungsbereich eines zweiten Peptides bindet.

3. Synthetische Peptide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsbereiche so ausgebildet sind, daß jeweils zwei Peptide versetzt unter Ausbildung von Überhängen aneinander gebunden werden.

4. . Synthetische Peptide nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bindungsbereiche als Zipperdomänen ausgebildet sind.

5. Synthetische Peptide nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zipperdomänden aus Heptameruntereinheiten mit den Positionen a bis g aufgebaut sind.

6. Synthetische Peptide nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Positionen a und d der Heptameruntereinheit alternierend mit unterschied­ lichen hydrophoben Aminosäuren, insbesondere Val oder Leu besetzt sind.

7. Synthetische Peptide nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Bereiche e, f, g der Heptamere mit polaren oder geladenen Aminosäuren besetzt sind.

8. Synthetische Peptide nach einem der Anspüche 5 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zwischen den Bindungsbereichen eines Peptides eine Ver­ bindungssequenz vorgesehen ist, in der mehrere aufeinanderfolgende Po­ stionen mit der Aminosäure Serin besetzt sind.

9. Synthetische Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einem Anteil erster und/oder zweiter Peptide Kopplungsbereiche ausgebildet sind, die eine seitliche Verzwei­ gung der sich aus den ersten und zweiten Peptiden aufbauenden Oligomere erlaubt.

10. Synthetisches Peptid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kopplungsbereich als Biotin-Untereinheit ausgebildet ist.

11. Synthetisches Peptid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Biotin-Untereinheit ein spezieller Tag ist, der enzymatisch-biotinylierbar ist.

12. Synthetische Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß an mindestens einem der Peptide eine mit üblichen Methoden nachweisbare Markierung, insbesondere Fluoreszenzmarkie­ rung, vorgesehen ist.

13. Synthetische Peptide nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Markierung eines an einem Träger gebundenen Targetmoleküls ver­ wendet werden.