DE10001377A1

DE10001377A1 - New DNA encoding transcription factor ASCL3, useful for treatment, prevention and diagnosis of diseases, e.g. tumors, associated with abnormal gene regulation

Info

Publication number: DE10001377A1
Application number: DE2000101377
Authority: DE
Inventors: Andre Bahr; Thomas Hankeln; Erwin Robert Schmidt; Andreas Winterpacht; Bernhard Zabel
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2001-08-02

Abstract

DNA sequence (I) that encodes the bHLH (basic helix-loop-helix) transcription factor ASCL(achaete-scute-like) 3 from humans or mice (sequences (S2) and (S4), respectively, of 181 and 174 amino acids (aa), defined in the specification). Independent claims are also included for the following: (1) DNA sequence (Ia) that encodes a protein with the biological activity of ASCL3, where the DNA sequence is: (a) is an equivalent of (I) within the degeneracy of the genetic code; (b) hybridizes to (I) or (a); or (c) is a fragment or (allelic) variant of (I) or of (a) or (b); (2) ribozyme or antisense DNA (A) complementary to (I) or (Ia) and able to bind specifically to (and cut in the case of ribozymes) RNA transcripts from them, thus reducing or inhibiting expression of ASCL3; (3) expression vector containing (I) or (Ia), or sequences that encode (A); (4) host cells transformed with the vector of (3); (5) ASCL3, or proteins with same activity, encoded by (I) or (Ia); (6) production of ASCL3, or proteins with the same activity, by culturing cells of (4); (7) antibody (Ab), or its fragments, that bind to ASCL3, or proteins with same activity; (8) pharmaceutical composition containing (I), (Ia), (A), vectors of (3), ASCL3, or proteins with same activity, Ab and its fragments; (9) diagnostic method for detecting abnormal expression of ASCL3; and (10) kit for use in method (9). ACTIVITY : Anticancer; cardiant; metabolic-general; nootropic; neuroprotective. MECHANISM OF ACTION : Regulating synthesis and/or activity of the ASCL3 transcription factor, and therefore expression of genes that are regulated by ASCL3.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen bHLH-Transkriptions faktor ASCL3 und dazu verwandte Proteine, sowie diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner an diesen Transkriptionsfaktor bzw. dazu verwandte Proteine bindende Antikörper sowie gegen die Expression des Transkriptionsfaktors gerichtete Antisense-RNAs bzw. Ribozyme. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und Diagnoseverfahren, bei denen die vorstehenden Verbindungen zur Anwendung kommen.The present invention relates to a bHLH transcription factor ASCL3 and related proteins, as well as these proteins coding DNA sequences. The present invention relates to furthermore to this transcription factor or related to it Protein binding antibodies and against the expression of Transcription factor-directed antisense RNAs or ribozymes. Finally, the present invention relates to pharmaceuticals and diagnostic methods in which the above compounds come into use.

Die terminale Chromosomenregion 15.3 auf dem kurzen Arm des Chromosoms 11 (11p15.3) gilt als genreich und ist gekennzeich net durch eine Vielzahl erblicher Erkrankungen, die hier mit Hilfe genetischer Methoden lokalisiert wurden. Das Spektrum der Erkrankungen beinhaltet Entwicklungsstörungen und Miß bildungen, Dysplasien (Beckwith-Wiedemann-Syndrom, Free man-Sheldon-Syndrom, Atrophia areata), kardiovaskuläre Erkran kungen (Romano-Ward-Syndrom, Jervell-Lange-Nielsen-Syndrom), Stoffwechselstörungen und neurodegenerative Erkrankungen (Dia betes, Hyperinsulinämie, Nesidioblastose, Verstopfung, Nie mann-Pick-Krankheit, Jansky-Bielschowsky-Krankheit), Taubheit und Seh-Defekte (Usher-Syndrom), Hämoglobinopathien etc. Be sonders auffällig ist auch die Assoziation dieser Genomregion mit Tumorerkrankungen. Die Liste umfaßt z. B. Leukämien, Nephroblastome, Rhabdomyosarcome, rhabdoide Tumore, adrenocor ticale Carcinome, Hepatoblastome, Neuroblastome, Blasenkrebs, testikuläre Keimzelltumore, Ovarial-Carcinome, Brustkrebs, Lungen- und Magenkrebs. Allerdings konnten bisher nur wenige Kandidatengene aus 11p15.3 identifiziert und analysiert wer den, so daß ein starker Bedarf an solchen Markergenen besteht, die u. U. mit bestimmten, z. B. den vorstehend diskutierten Erkrankungen, assoziiert und von therapeutischem bzw. diagnostischem Wert sind.The terminal chromosome region 15.3 on the short arm of the Chromosome 11 (11p15.3) is considered gene-rich and is labeled net by a variety of hereditary diseases, which here with Using genetic methods have been localized. The spectrum of diseases includes developmental disorders and miss education, dysplasia (Beckwith-Wiedemann syndrome, Free man-Sheldon syndrome, atrophia areata), cardiovascular disease kungen (Romano-Ward syndrome, Jervell-Lange-Nielsen syndrome), Metabolic disorders and neurodegenerative diseases (Dia betes, hyperinsulinemia, nesidioblastosis, constipation, never mann-Pick disease, Jansky-Bielschowsky disease), deafness and visual defects (Usher syndrome), hemoglobinopathies etc. Be The association of this genome region is also particularly striking with tumor diseases. The list includes e.g. B. leukaemias, Nephroblastoma, rhabdomyosarcome, rhabdoid tumors, adrenocor tical carcinomas, hepatoblastomas, neuroblastomas, bladder cancer, testicular germ cell tumors, ovarian carcinomas, breast cancer, Lung and stomach cancer. However, only a few have so far Candidate genes from 11p15.3 identify and analyze who so that there is a strong need for such marker genes, the u. U. with certain, e.g. B. those discussed above Diseases associated and therapeutic or diagnostic Are worth.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Pro blem zugrunde, Marker bereitzustellen, die mit dem Vorhanden sein oder der möglichen Entwicklung von mit der chromosomalen Region 11p15.3 in Zusammenhang stehenden Erkrankungen korre liert sind und die für eine Diagnose, Prognose und/oder Thera pie dieser Erkrankungen von Nutzen sind.Thus, the invention is essentially the technical pro blem underlying to provide markers that match the existing be or the possible development of using the chromosomal Region 11p15.3 related diseases correct and are for diagnosis, prognosis and / or therapy Pie of these diseases are useful.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereit stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Aus führungsformen erreicht.The solution to this technical problem is provided by the Ready Position of the Aus marked in the claims leadership forms achieved.

Es konnten Nucleinsäuremoleküle (ASCL3 und Ascl3) identifi ziert werden, die für einen bisher nicht bekannten bHLH-Trans kriptionsfaktor ASCL3 codieren. Das Gen ASCL3 wurde im mensch lichen Genom im Bereich 11p15.3 und das Gen Ascl3 im Genom der Maus auf Chromosom 7 identifiziert. Es kann davon ausgegangen werden, daß Störungen bei der Expression dieser Gene bzw. Veränderungen, die zu einem bHLH-Transkriptionsfaktor mit gestörter oder fehlender Funktion führen, in der Störung der Expression der von diesem Transkriptionsfaktor kontrollierten Gene resultieren, was zu eine der vorstehenden Erkrankungen führen kann, beispielsweise zur Entwicklung einer der vor stehenden Tumore, da Transkriptionsfaktoren aufgrund ihrer Regulations-Funktion als Kandidaten für die Auslösung von Tumorerkrankungen gelten. Die identifizierten Gene ASCL3 bzw. Ascl3 weisen eine "helix-loop-helix"-Region und eine DNA-Bin dedomäne auf, die Homologien zu dem "achaete-scute"-Genkomplex von Drosophila melanogaster (vgl. Jimenez und Modolell, Cur rent Biology 3 (1993), 626-632) zeigen. Der "achaete scute(as-c)"-Genkomplex von Drosophila melanogaster enthält vier miteinander verwandte Gene, die für die Ausbildung neura len Gewebes verantwortlich sind und durch ihre zellspezifische Expression die Topologie des Nervensystems der Fliege definie ren. Mutationen der as-c-Gene führen u. a. zu Fehlentwicklungen der kutikulären Sinnesorgane. Auch codieren die as-c-Gene für Transkriptionsfaktoren mit einer basischen helix-loop-helix- (bHLH)-Domäne. "Achaete-scute-like"(ASCL)-Gene konnten auch in Mensch und Maus nachgewiesen werden, nämlich das ASCL1-Gen auf Chromosom 12q22-23 und das ASCL2-Gen auf Chromosom 11p15.5. Beide Gene codieren für einen Transkriptionsfaktor mit einem bHLH-Motiv. Der Transkriptionsfaktor ASCL1 wird als ein Kon trollfaktor bei der Entwicklung neuronaler Vorläuferzellen in bestimmten neuralen Zellinien angesehen. Ferner ist der Transkriptionsfaktor ASCL1 in neuroendokrinen Tumoren, medul lären Thyroid-Tumoren und kleinzelligem Lungenkrebs stark exprimiert. Des weiteren wird der Transkriptionsfaktor ASCL2 als essentiell für die Entwicklung der Plazenta angesehen.Nucleic acid molecules (ASCL3 and Ascl3) could be identified be decorated for a previously unknown bHLH trans encode ASCL3. The ASCL3 gene was found in humans genome in the 11p15.3 range and the Ascl3 gene in the genome of Mouse identified on chromosome 7. It can be assumed be that disturbances in the expression of these genes or Changes leading to a bHLH transcription factor disturbed or missing function, in the disturbance of the Expression of those controlled by this transcription factor Genes result, leading to one of the above diseases can lead, for example, to the development of one of the standing tumors because of transcription factors due to their Regulation function as a candidate for triggering Tumor diseases apply. The identified genes ASCL3 or Ascl3 have a "helix-loop-helix" region and a DNA bin Dedomain on homologies to the "achaete-scute" gene complex by Drosophila melanogaster (cf. Jimenez and Modolell, Cur rent Biology 3 (1993), 626-632). The "achaete scute (as-c) "- gene complex of Drosophila melanogaster contains four related genes that are necessary for training neura len tissue and are responsible for their cell-specific Expression defines the topology of the fly's nervous system ren. Mutations of the as-c genes lead u. a. to undesirable developments of the cuticular sensory organs. The as-c genes also code for Transcription factors with a basic helix-loop-helix- (bHLH) domain. "Achaete-scute-like" (ASCL) genes could also be found in Human and mouse are detected, namely the ASCL1 gene Chromosome 12q22-23 and the ASCL2 gene on chromosome 11p15.5. Both genes code for a transcription factor with one bHLH motif. The transcription factor ASCL1 is called a Kon troll factor in the development of neuronal progenitor cells in certain neural cell lines. Furthermore, the Transcription factor ASCL1 in neuroendocrine tumors, medul strong thyroid tumors and small cell lung cancer expressed. Furthermore, the transcription factor ASCL2 considered essential for the development of the placenta.

Aufgrund der chromosomalen Lokalisation des Gens, das für den erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 codiert, und der Verwandtschaft zu as-c- bzw. ASCL-Genen, die mit bestimm ten Krankheiten assoziiert sind, kann davon ausgegangen wer den, daß der erfindungsgemäße bHLH-Transkriptionsfaktor bei der Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen nützlich ist, bei denen eine pathologische Erhöhung oder Erniedrigung der Expression der von diesem Transkriptionsfaktor kontrol lierten Gene vorliegt.Because of the chromosomal localization of the gene, which is for the bHLH transcription factor ASCL3 according to the invention, and the relationship to as-c or ASCL genes, which with determ associated diseases, it can be assumed who that the bHLH transcription factor according to the invention the prevention and / or treatment of diseases useful is where there is a pathological increase or decrease the expression of the control of this transcription factor genes.

Somit kann für eine therapeutische Intervention bei Erkrankun gen, die mit einer zu niedrigen Aktivität des erfindungsgemä ßen bHLH-Transkriptionsfaktors oder einer zu geringen Expres sion der von diesem kontrollierten Gene assoziiert sind, die Verabreichung dieses Faktors oder des für diesen codierenden Gens nützlich sein. Andererseits kann auch die Möglichkeit der Inaktivierung dieses Transkriptionsfaktors bei Erkrankungen, die mit einer zu hohen Aktivität des bHLH-Transkriptionsfak tors oder einer zu hohen Expression der von diesem kontrol lierten Gene einhergehen, therapeutisch sinnvoll sein. Eine solche Inaktivierung kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen, beispielsweise auf genetischer Ebene ("Knock out", Hemmung der Translation durch Antisense-RNAs oder Ribozyme) oder Protein ebene (über den Transkriptionsfaktor hemmende Liganden, bei spielsweise Antikörper oder Antagonisten, Kinase/Phosphatase- Inihibitoren, Hemmung der Bindung des Transkriptionsfaktors an Pol I etc.). Voraussetzung für die vorstehend diskutierten therapeutischen Möglichkeiten ist allerdings, daß der erfin dungsgemäße Transkriptionsfaktor in ausreichenden Mengen und in möglichst reiner Form zur Verfügung steht bzw. das für diesen codierende Gen, was einerseits dessen rekombinante Herstellung ermöglicht, andererseits auch eine auf Gentherapie basierende Behandlung. Die vorliegende Erfindung stellt diese Verbindungen zur Verfügung.Thus, a therapeutic intervention in the case of a disease gene with too low an activity of the invention bHLH transcription factor or a low expression sion of the genes controlled by this, the Administration of this factor or the coding for it Genes may be useful. On the other hand, the possibility of Inactivation of this transcription factor in diseases, those with too high activity of the bHLH transcription factor tors or too high an expression of this control genes, be therapeutically useful. A such inactivation can take place at different levels, for example at the genetic level ("knock out", inhibition of Translation by antisense RNAs or ribozymes) or protein level (ligands that inhibit the transcription factor, at for example antibodies or antagonists, kinase / phosphatase Inhibitors, inhibition of binding of the transcription factor Pol I etc.). Prerequisite for those discussed above therapeutic possibilities is, however, that the invented adequate transcription factor in sufficient quantities and is available in as pure a form as possible or that for this coding gene, on the one hand, its recombinant Production enables, on the other hand also one based on gene therapy based treatment. The present invention provides this Connections available.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-Se quenz, die für einen bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 mit der in Fig. 1 (Mensch) oder Fig. 2 (Maus) gezeigten Aminosäure sequenz codiert, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform die DNA-Sequenz die in Fig. 1 oder Fig. 2 gezeigte Nuclein säuresequenz enthält. Eine die DNA-Sequenz von Fig. 1 umfas sende DNA wurde als LLNLP704J141117Q3 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 21. Dez. 1999 unter DSM 13213 hinterlegt.The present invention thus relates to a DNA sequence which codes for a bHLH transcription factor ASCL3 with the amino acid sequence shown in FIG. 1 (human) or FIG. 2 (mouse), the DNA sequence in a preferred embodiment contains nucleic acid sequence shown in Fig. 1 or Fig. 2. A DNA comprising the DNA sequence of FIG. 1 was deposited as LLNLP704J141117Q3 with the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) on December 21, 1999 under DSM 13213.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines von den vorstehenden erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten bHLH-Transkriptionsfaktors codiert, die sich aber von der DNA- Sequenz von Fig. 1 oder Fig. 2 in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, die mit den vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisiert oder die ein Frag ment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der vorstehenden DNA-Sequenzen ist.The present invention further relates to a DNA sequence which codes for a protein with the biological properties of a bHLH transcription factor coded by the above DNA sequences according to the invention, but which differs from the DNA sequence of FIG. 1 or FIG Codon sequence differs due to the degeneracy of the genetic code, which hybridizes with the above DNA sequences or which is a fragment, an allelic variant or another variant of the above DNA sequences.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridi siert" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedin gungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 6 × SSC, 1% SDS und 1 × Denhardts-Lösung verwendet werden und bei denen die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 45°C liegen. Nach der Hybridi sierung wird vorzugsweise mit 2 × SSC, 1% SDS oder mit 0,2 × SSC (stringente Bedingungen) bei Temperaturen zwischen 40°C und 75°C, vorzugsweise bei 50°C gewaschen (zur Definition von SSC und Denhardts-Lösung vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, oder Current Protocols in Molecu lar Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 beschrieben sind.The term "hybridi" used in the present invention siert "refers to conventional hybridization conditions conditions, preferably on hybridization conditions in which 6 × SSC, 1% SDS and 1 × Denhardts solution used as solution and where the hybridization temperatures between 35 ° C and 70 ° C, preferably 45 ° C. After the hybridi Sation is preferably with 2 × SSC, 1% SDS or with 0.2 × SSC (stringent conditions) at temperatures between 40 ° C and Washed at 75 ° C, preferably at 50 ° C (to define SSC and Denhardt's solution cf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Are particularly preferred stringent hybridization conditions, such as, for example in Sambrook et al., supra, or Current Protocols in Molecu Lar Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) 6.3.1-6.3.6 are described.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Va riante" oder "Fragment" umfassen DNA-Sequenzen, die sich ge genüber den in Fig. 1 oder Fig. 2 angegebenen Sequenzen durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder ande re im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Sequenzen codierte Protein noch die biologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 aufweist und in Säugern bio logisch aktiv ist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäure sequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über die biologischen Eigenschaften des erfin dungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors verfügt.The terms "variant" or "fragment" used in the present invention encompass DNA sequences which differ from the sequences given in FIG. 1 or FIG. 2 by deletion (s), insertion (s), exchange (s). and / or distinguish other modifications known in the prior art or comprise a fragment of the original nucleic acid molecule, the protein encoded by these DNA sequences still having the biological properties of the bHLH transcription factor ASCL3 according to the invention and being biologically active in mammals. This also includes allele variants. Methods for generating the above changes in the nucleic acid sequence are known to the person skilled in the art and are described in standard works in molecular biology, for example in Sambrook et al., Supra. The person skilled in the art is also able to determine whether a protein encoded by a nucleic acid sequence modified in this way still has the biological properties of the bHLH transcription factor according to the invention.

Durch die Erniedrigung oder Hemmung der Expression der vor stehend beschriebenen DNA-Sequenzen kann die Synthese des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors bzw. der verwand ten Proteine verringert oder eliminiert werden, was beispiels weise bei einem Teil der in der Einleitung beschriebenen Er krankungen wünschenswert ist. Daher betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Antisense-RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu den vorstehenden DNA-Sequenzen komplementär ist und die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten bHLH-Transkriptions faktors verringern oder hemmen kann und ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zu den vorstehenden DNA-Se quenzen komplementär ist und an die von diesen DNA-Sequenzen transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten Transkriptionsfaktors ebenfalls verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense-RNAs und Ribozyme zu einer codierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den offenbarten DNA-Sequenzen, ge eignete Antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Geeignete Vorgehensweisen sind beispielsweise in EB-B1 0 223 399 oder EP-A1 0 458 beschrieben. Ribozyme sind RNA-Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang. Sie können andere RNAs inter molekular spalten, beispielsweise die von den erfindungsgemä ßen DNA-Sequenzen transkribierten mRNAs. Die Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen, (1) eine katalytische Domäne und (2) eine Domäne, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel-RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer bestimmten, vorgewählten Stelle schneiden (vgl. beispielsweise Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426).By lowering or inhibiting the expression of the above DNA sequences described above can synthesize the bHLH transcription factor according to the invention or the related ten proteins are reduced or eliminated, which is for example wise in part of the Er described in the introduction diseases is desirable. Hence concerns another preferred embodiment of the present invention Antisense RNA, which is characterized in that it belongs to the above DNA sequences is complementary and the synthesis of the bHLH transcription encoded by these DNA sequences factor can reduce or inhibit and a ribozyme that is characterized in that it belongs to the above DNA Se sequences is complementary and to those of these DNA sequences can specifically bind transcribed RNA and cleave it, whereby the synthesis of the encoded by these DNA sequences Transcription factor is also reduced or inhibited. These antisense RNAs and ribozymes are preferably one complementary coding region of the mRNA. The specialist is in able, starting from the disclosed DNA sequences, ge produce and use suitable antisense RNAs. Suitable Procedures are for example in EB-B1 0 223 399 or EP-A1 0 458. Ribozymes are RNA enzymes and exist from a single strand of RNA. You can interpolate other RNAs cleave molecularly, for example those of the invention DNA sequences of transcribed mRNAs. The ribozymes need principally have two domains, (1) a catalytic one Domain and (2) a domain complementary to the target RNA is and can bind to it, which is the prerequisite for one Cleavage of the target RNA is. Starting from in literature described procedures it is possible to specific To construct ribozymes that have a desired RNA on a cut a certain, pre-selected point (see e.g. Tanner et al., In: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426).

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. die für die vorste hend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme codierenden DNAs können auch in einen Vektor, vorzugsweise einen Expres sionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DNA-Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül in dem Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, welche die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryoten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp- oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryo ten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe und der CMV-, SV40- oder RVS-40-Promotor bzw. CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind außerdem beschrieben in Goeddel: Gene Expres sion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Weitere Beispiele für geeignete Pro motoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Pro motor. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E.coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pY100 und Ycpad1, für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 sowie von pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg stammende Vektoren. Zu den erfindungs gemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Baculovirus abge leitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, bei spielsweise pAcSGHisNT-A.The DNA sequences according to the invention or those for the first described antisense RNAs or ribozymes DNAs can also be expressed in a vector, preferably an express tion vector can be inserted. Thus, the present includes Invention also vectors containing these DNA sequences or Expression vectors. The term "vector" refers to a plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.) for a virus or another suitable vehicle. In a preferred one The embodiment is the DNA molecule according to the invention in which Functionally linked vector with regulatory elements, its expression in prokaryotic or eukaryotic Allow host cells. Such vectors contain in addition to regulatory elements, for example a promoter, typically an origin of replication and specific Genes that transform the phenotypic selection of a Allow host cell. The regulatory elements for the Expression in prokaryotes, for example E. coli, include the lac, trp or T7 promoter, and for expression in eukaryo the AOX1 or GAL1 promoter in yeast and the CMV, SV40 or RVS-40 promoter or CMV or SV40 enhancer for the Expression in animal cells. Appropriate regulatory Sequences are also described in Goeddel: Gene Expres sion Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). More examples of suitable pro motors are the Metallothionein I and the Polyhedrin-Pro engine. Suitable expression vectors for E. coli include for example pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8. Vectors suitable for expression in yeast include pY100 and Ycpad1, for expression in mammalian cells pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 as well as from pcDNAI / amp, pcDNAI / neo, pRc / CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, Vectors derived from pSVT7, pko-neo and pHyg. To the fiction Expression vectors also count from baculovirus derived vectors for expression in insect cells for example pAcSGHisNT-A.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, welche die erfindungs gemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthal ten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispiels weise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfah ren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispiels weise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Die erfin dungsgemäßen DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA inseriert werden, so daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispiels weise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden können.General methods known in the art can be used to Construction of expression vectors, which the Invention contain appropriate DNA sequences and suitable control sequences ten can be used. These methods include, for example wise in vitro recombination techniques, synthetic process ren, as well as in vivo recombination methods, such as as described in Sambrook et al., supra. The invent DNA sequences according to the invention can also be used in conjunction with a for another protein or peptide coding DNA are, so that the DNA sequences according to the invention, for example can be expressed in the form of a fusion protein.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend be schriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirts zellen zählen Bakterien (beispielsweise die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, Insektenzellen, vorzugsweise sf9- Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirts zellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unter Ver wendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind dem Fach mann bekannt.The present invention also relates to the above written vectors containing host cells. To these hosts cells count bacteria (for example the E. coli strains HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 and SG13009), yeast, preferably S. cerevisiae, insect cells, preferably sf9- Cells, and animal cells, preferably mammalian cells. Preferred Mammalian cells are CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 and WI38 cells. Procedures for transforming these hosts cells, for phenotypic selection of transformants and for expression of the DNA sequences according to the invention under Ver Using the vectors described above are the art man known.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen von den erfin dungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 bzw. Proteine mit dessen biologischer Aktivität sowie Verfahren zu deren rekombinanten Herstellung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Das erfindungs gemäße Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend be schriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Expres sion des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugs weise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Dem Fachmann sind Bedin gungen bekannt, um transformierte bzw. transfizierte Wirts zellen zu kultivieren. Geeignete Reinigungsverfahren (bei spielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromato graphie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind ebenfalls allgemein bekannt.The present invention further relates to one of the inventions DNA sequences according to the invention encoded bHLH transcription factor ASCL3 or proteins with its biological activity as well Process for their recombinant production using of the expression vectors according to the invention. The invention according method comprises culturing the above be wrote host cells under conditions that the express allow sion of the protein (or fusion protein) (preferred show stable expression), and the extraction of the protein the culture or from the host cells. Bedin are skilled in the art conditions known to transformed or transfected host to cultivate cells. Suitable cleaning methods (at for example preparative chromatography, affinity chromatography graphie, for example immunoaffinity chromatography, HPLC etc.) are also generally known.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Er findung betrifft Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine (bHLH- Transkriptionsfaktor ASCL3 oder verwandte Proteine). Diese Antikörper können beispielsweise in diagnostischen Assays verwendet werden oder für therapeutische Zwecke, wobei es nach Anlagerung an das Zielmolekül, d. h. den bHLH-Transkriptions faktor, zu dessen Hemmung kommt. Die Antikörper können mono clonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Another preferred embodiment of the present Er The invention relates to antibodies or fragments thereof against the Proteins according to the invention described above (bHLH- ASCL3 transcription factor or related proteins). This Antibodies can be used, for example, in diagnostic assays used or for therapeutic purposes, according to Attachment to the target molecule, d. H. the bHLH transcription factor whose inhibition occurs. The antibodies can be mono be clonal, polyclonal or synthetic antibodies or Fragments of it. In this context, the term means "Fragment" means all parts of the monoclonal antibody (e.g. Fab, Fv or "single chain Fv" fragments), which are the same Have epitope specificity like the full antibody.

Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Anti körpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Anti körper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise der von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierte bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 oder ein syntheti sches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Ge winnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt.The production of such fragments is known to the person skilled in the art. The anti agents according to the invention are preferably bodies around monoclonal antibodies. The anti according to the invention bodies can be made according to standard procedures, preferably that of the DNA sequences according to the invention encoded bHLH transcription factor ASCL3 or a syntheti fragment thereof serve as an immunogen. Procedure for Ge Monoclonal antibodies are known to the person skilled in the art.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genann te monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stam mender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chi märer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, mensch lichen Antikörpern ähnelnde oder humanisierte Antikörper be sitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht vermindert. Die Her stellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde aus führlich beschrieben (vgl. beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Ak zeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinie renden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht mensch lichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Be reich (e) stammt (stammen), falls vorhanden, auch im wesentli chen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabrei chung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das mensch liche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörperantwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell frem den chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, interagiert er besser mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, klei nere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.In a particularly preferred embodiment, the said monoclonal antibody is an antibody derived from an animal (e.g. mouse), a humanized antibody or a chimeric antibody or a fragment thereof. Chimeric, human-like or humanized antibodies have a reduced potential antigenicity, but their affinity for the target is not reduced. The production of chimeric and humanized antibodies or of antibodies similar to human antibodies has been described in detail (see, for example, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, and Verhoeyan et al. , Science 239 (1988), 1534). Humanized immunoglobulins have variable scaffold areas, which essentially come from a human immunoglobulin (called acceptor immunoglobulin) and the complementarity of the determinant areas, essentially from a non-human immunoglobulin (e.g. from the mouse) originate (with the designation donor immunoglobulin). The constant region (s), if present, also derive essentially from a human immunoglobulin. When administered to human patients, humanized (as well as human) antibodies offer a number of advantages over antibodies from mice or other species: (a) the human immune system should not recognize the framework or the constant region of the humanized antibody as foreign and therefore the antibody response against such an injected antibody should be lower than against a completely foreign mouse antibody or a partially foreign chimeric antibody; (b) since the effector area of the humanized antibody is human, it interacts better with other parts of the human immune system, and (c) injected humanized antibodies have a half-life that is substantially equivalent to that of naturally occurring human antibodies, which allows , smaller and less frequent doses compared to antibodies from other species.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können beispielsweise auch zur Immunpräzipitation des erfindungsgemäßen bHLH-Transkrip tionsfaktors ASCL3, zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken oder für diagnostische Zwecke (siehe nachstehend) verwendet werden. Geeignete cDNA-Expressions banken basieren z. B. auf den Expressionsvektoren lambda.gt11, lambda.gt18-23, lambdaZAP und lambda.ORF8. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend be schriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt.The antibodies according to the invention can also, for example for immunoprecipitation of the bHLH transcript according to the invention tion factor ASCL3, for the isolation of related proteins cDNA expression banks or for diagnostic purposes (see below) can be used. Appropriate cDNA expressions banks are based e.g. B. on the expression vectors lambda.gt11, lambda.gt18-23, lambdaZAP and lambda.ORF8. The present The invention also relates to a hybridoma which be the above generated monoclonal antibody.

Die vorliegende Erfindung erlaubt ferner die Durchführung therapeutischer Maßnahmen bei den vorstehend beschriebenen Erkrankungen, d. h., die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Anti sense-RNAs, Ribozyme und Antikörper können auch zur Herstel lung eines Arzneimittels, beispielsweise zur Kontrolle der Expression des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors. (oder des damit verwandten Proteins) oder zum Austausch einer mutierten Form des Gens gegen eine funktionelle Form verwendet werden. Ein solches Arzneimittel kann daher zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die entwe der mit einer erhöhten oder erniedrigten Aktivität des erfin dungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 assoziiert sind. Bei Verabreichung des Transkriptionsfaktors selbst kann es günstig sein, diesen an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder Rinderseru malbumin (BSA), zu koppeln. Auch kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, eine Antisense-RNA oder ein Ribozym in Säuger, insbesondere den Menschen, eingebracht und exprimiert werden, vorzugsweise als Insertion in einem der nachstehend beschrie benen Vektoren. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, beispielsweise einem monoclonalen Antikörper, kann die Aktivität des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors bzw. der verwandten Proteine ebenfalls kontrolliert und reguliert wer den.The present invention also allows implementation therapeutic measures in those described above Diseases, d. that is, the DNA sequences of the invention, anti Sense RNAs, ribozymes and antibodies can also be used to manufacture treatment of a drug, for example to control the Expression of the bHLH transcription factor according to the invention. (or the related protein) or to exchange one mutated form of the gene used against a functional form become. Such a drug can therefore be used for prevention or treatment of diseases that either who with an increased or decreased activity of the inventions bHLH transcription factor ASCL3 are associated. If the transcription factor itself is administered, it can be favorable to this not as a by the respective body externally viewed protein, e.g. B. transferrin or beef serum malbumin (BSA), to couple. An inventive can also DNA sequence, an antisense RNA or a ribozyme in mammals, especially the people, are introduced and expressed, preferably as an insertion in one of the described below benen vectors. With an antibody according to the invention, for example a monoclonal antibody, the activity the bHLH transcription factor according to the invention or the related proteins are also controlled and regulated the.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimit tel, das die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, Antisense-RNAs, Ribozyme, Expressionsvektoren, den erfindungs gemäßen bHLH-Transkriptionsfaktor ASCL3 oder ein Protein mit dessen biologischer Aktivität oder Antikörper enthält. Das Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharma zeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formu lierung eines derartigen Arzneimittels sind dem Fachmann be kannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispiels weise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung des Arzneimittels kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subku tane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, in travenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt be stimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.The present invention thus also relates to a medicament tel, the DNA sequences described above, Antisense RNAs, ribozymes, expression vectors, the Invention according to bHLH transcription factor ASCL3 or a protein with which contains biological activity or antibodies. The Medicines may also contain a pharma compatible carrier. Suitable carriers and the formu lation of such a drug are the expert knows. Suitable carriers include, for example, phosphate buffered saline, water, emulsions, for example wise oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions etc. The administration of the drug can be oral or parenteral respectively. The procedures for parenteral administration include the topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous tane, intramedullary, intrathecal, intraventricular, in travenous, intraperitoneal or intranasal administration. The doctor will treat you with the appropriate dosage agrees and depends on various factors, for example on the age, gender, weight of the patient, the Type and stage of the disease, the mode of administration Etc.

Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Pro motors, und in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen DNA-Se quenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Ade novirus, Vaccinia-Virus oder Adeno-assoziiertes Virus. Be sonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für die Gentherapie geeignete Vektoren sind außerdem in WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749 und WO 92/06180 offenbart. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (vgl. Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Die Gentherapie kann sowohl für die Erhöhung der Aktivität des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 (beispielsweise mit einem Expressionsvektor, der das ASCL3-Gen oder Ascl3-Gen enthält) als auch für eine Verringerung der Aktivität (mit einem Vek tor, der ein Gen für ein Ribozym, eine Antisense-RNA oder eine inaktive Form des bHLH-Transkriptionsfaktors ("knock-out") enthält) Anwendung finden.Preferably the DNA sequences described above inserted into a vector suitable for gene therapy, for example, under the control of a tissue-specific pro motors, and smuggled into the cells. In a preferred one The embodiment is the DNA Se described above vector containing sequences a virus, for example an ade novirus, vaccinia virus or adeno-associated virus. Be retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable ones Retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV. For Vectors suitable for gene therapy are also described in WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749 and WO 92/06180 disclosed. For the purposes of gene therapy, the DNA sequences according to the invention also in the form of colloidal Dispersions are transported to the target cells. To count, for example, liposomes or lipoplexes (cf. Mannino et al., Biotechniques 6 (1988) 682). Gene therapy can both for increasing the activity of the invention bHLH transcription factor ASCL3 (for example with a Expression vector containing the ASCL3 gene or Ascl3 gene) as well as for a decrease in activity (with a vek tor, which is a gene for a ribozyme, an antisense RNA or a inactive form of the bHLH transcription factor ("knock-out") contains) find application.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, Störungen der Expression des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 auf genetischer Ebene zu untersuchen. Mit einer erfin dungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. davon abgeleiteten Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, festge stellt werden, ob sie ein verändertes ASCL3-Gen enthalten, das zu einer mutierten Form des Proteins führt, die nicht länger biologisch aktiv ist, oder ob beispielsweise der Trans kriptionsfaktor zu gering oder zu stark exprimiert wird. Dazu kann der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse Transkrip tion, PCR, RT-PCR, LCR, Hybridisierung und Sequenzierung durchführen. Auch die erfindungsgemäßen Antikörper oder Frag mente davon eignen sich für die Diagnostik, d. h. beispiels weise zum Nachweis des Vorhandenseins und/oder der Konzen tration des Transkriptionsfaktors, einer verkürzten oder ver längerten Form dieses Proteins etc., in einer Probe. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüs sigphase vorliegen oder an einen festen Träger gebunden wer den. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für Immunoassays sind ELISA und RIA.The present invention also enables interference with the Expression of the bHLH transcription factor according to the invention To study ASCL3 at the genetic level. With an invented DNA sequence according to the invention or probes derived therefrom or Primers can be fixed in mammals, especially humans whether they contain a modified ASCL3 gene, which leads to a mutated form of the protein that doesn't is longer biologically active, or whether, for example, the trans expression factor is expressed too low or too strong. To the person skilled in the art can use customary methods, such as reverse transcript tion, PCR, RT-PCR, LCR, hybridization and sequencing carry out. The antibodies or Frag elements of these are suitable for diagnostics, d. H. for example as evidence of the existence and / or the concences tration of the transcription factor, a shortened or ver extended form of this protein etc., in a sample. The Antibodies can be used, for example, in immunoassays in rivers sigphase present or bound to a solid support the. The antibodies can be in different ways and Be marked way. Suitable markers and marking methods are known to the person skilled in the art. Examples of immunoassays are ELISA and RIA.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnose verfahren zum Nachweis einer eventuell gestörten Expression des erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3, bei dem man eine Probe mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder einem erfindungsgemäßen Antikörper oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration, Länge und/oder Aminosäure-Sequenz des bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 oder die Konzentration, Länge und/oder Nucleinsäuresequenz der für diesen codierenden DNA bzw. mRNA im Vergleich zu einer Kon trollprobe unterscheiden. Die für dieses Diagnoseverfahren verwendbaren Sonden umfassen auf den erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen basierende Primer, beispielsweise für eine PCR. Vorzugsweise sind die Sonden Oligonucleotide, die einen Nu cleinsäure-Bereich umfassen, der unter stringenten Bedingungen mit mindestens 10 aufeinanderfolgende Nucleotiden der Sequenz von Fig. 1 oder Fig. 2 oder natürlich vorkommenden Varianten bzw. Mutanten davon hybridisiert. Die Sonde kann auch eine Markierung tragen, z. B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor.The present invention thus also relates to a diagnostic method for the detection of a possibly disturbed expression of the bHLH transcription factor ASCL3 according to the invention, in which a sample is brought into contact with a DNA sequence according to the invention or an antibody according to the invention or a fragment thereof and is then determined directly or indirectly whether the concentration, length and / or amino acid sequence of the bHLH transcription factor ASCL3 or the concentration, length and / or nucleic acid sequence of the DNA or mRNA coding for these differ in comparison to a control sample. The probes which can be used for this diagnostic method comprise primers based on the DNA sequences according to the invention, for example for a PCR. Preferably, the probes are oligonucleotides which comprise a nucleic acid region which hybridizes under stringent conditions with at least 10 consecutive nucleotides of the sequence from FIG. 1 or FIG. 2 or naturally occurring variants or mutants thereof. The probe can also carry a label, e.g. B. a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung einen diagno stischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz und/oder einen erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon enthält. Die DNA-Sequenz bzw. der Antikörper oder das Fragment davon können dabei in immobilisierter Form vorliegen. Ferner kann der diagnostische Kit übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Marker, Puffer, Kontrollen, etc., enthalten.Furthermore, the present invention relates to a diagnosis tical kit for performing the above Diagnostic method of a DNA sequence according to the invention and / or an antibody according to the invention or a fragment of which contains. The DNA sequence or the antibody or the Fragments thereof can be in immobilized form. Furthermore, the diagnostic kit can contain customary auxiliaries, such as Carriers, markers, buffers, controls, etc. included.

Brief description of the figures

Fig. 1: Nucleinsäure-Sequenz des für den humanen bHLH-Trans kriptionsfaktor ASCL3 codierenden Gens und davon abgeleitete Aminosäuresequenz
Die Exon-Sequenzen sind einfach unterstrichen, Translations start- und stopkodon sind doppelt unterstrichen. Die Aminosäu resequenz ist unterhalb der Basensequenz gezeigt. Fig. 1: nucleic acid sequence of the kriptionsfaktor for the human bHLH-Trans AsCl3 encoding gene and deduced amino acid sequence
The exon sequences are underlined, translations start and stop codons are underlined. The amino acid sequence is shown below the base sequence.

Fig. 2: Nucleinsäure-Sequenz der für den murinen bHLH-Trans kriptionsfaktor ASCL3 codierenden cDNA und davon abgeleitete Aminosäuresequenz Fig. 2: the nucleic acid sequence for the murine bHLH-Trans kriptionsfaktor AsCl3 encoding cDNA and deduced amino acid sequence

Fig. 3: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenzen der humanen und murinen bHLH-Transkriptionsfaktoren ASCL3
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 68,4%. Die vor hergesagten "helix-loop-helix"-Domänen sind unterstrichen, die basische DNA-Bindedomäne ist doppelt unterstrichen. Fig. 3: GAP comparison of the amino acid sequences of human and murine bHLH transcription factors AsCl3
The proteins show an agreement of 68.4%. The "helix-loop-helix" domains predicted are underlined, the basic DNA binding domain is underlined twice.

Fig. 4: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenz des humanen bHLH- Transkriptionsfaktors ASCL3 mit einem Protein unbekannter Funktion aus C.elegans.
Die beiden Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 33%. Die größte Übereinstimmung ergibt sich dabei im Bereich der "helix-loop-helix"-Domäne (unterstrichen) und der basischen DNA-Bindedomäne (doppelt unterstrichen). Fig. 4: GAP comparison of the amino acid sequence of the human bHLH transcription factor AsCl3 with a protein of unknown function from C.elegans.
The two proteins show a 33% agreement. The greatest agreement is found in the area of the "helix-loop-helix" domain (underlined) and the basic DNA binding domain (double underlined).

Fig. 5: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden humanen bHLH-Transkriptionsfaktoren ASCL3 und ASCL1 (Ver gleichsprotein)
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 25%. Diese be schränkt sich fast ausschließlich auf die "helix-loop-helix"- Domäne (unterstrichen) und die basische DNA-Bindedomäne (dop pelt unterstrichen). Fig. 5: GAP comparison of the amino acid sequences of both human (equal protein Ver) bHLH transcription factors AsCl3 and ASCL1
The proteins show a 25% agreement. This is almost exclusively limited to the "helix-loop-helix" domain (underlined) and the basic DNA binding domain (double underlined).

Fig. 6: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden humanen bHLH-Transkriptionsfaktoren ASCL3 und ASCL2 (Ver gleichsprotein)
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 35,1%. Auch hier beschränkt sich diese im wesentlichen auf die "helix-loop- helix"-Domäne (unterstrichen) und die basische DNA-Bindedomäne (doppelt unterstrichen). Fig. 6: GAP comparison of the amino acid sequences of both human (equal protein Ver) bHLH transcription factors AsCl3 and ASCL2
The proteins show an agreement of 35.1%. Here too, this is essentially limited to the "helix-loop-helix" domain (underlined) and the basic DNA binding domain (double underlined).

Fig. 7: GAP-Vergleich der Aminosäuresequenz des humanen bHLH- Transkriptionsfaktors ASCL3 mit dem T3-Protein des D.melano gaster "Achaete scute"-Komplexes
Die Proteine zeigen eine Übereinstimmung von 24,5%. Diese beschränkt sich auch hier im wesentlichen auf die "helix-loop helix"-Domäne (unterstrichen) und die basische DNA-Bindungs domäne (doppelt unterstrichen). Fig. 7: GAP comparison of the amino acid sequence of the human bHLH transcription factor AsCl3 with the T3 protein of D.melano gaster "Achaete scute" complex
The proteins show an agreement of 24.5%. Here, too, this is essentially limited to the "helix-loop helix" domain (underlined) and the basic DNA-binding domain (double underlined).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.

example 1 Determination of the murine Ascl3 cDNA sequence

Das murine Gen AscL3 erstreckt sich über einen Bereich von 4,2 kb auf Chromosom 7 der Maus. Zu seiner Bestimmung wurde von einem cDNA-Clon (IMAGp998L19858; BAC-Clon 42H1, Genome Systems Inc.) ausgegangen. Durch Sequenzierung dieses Clons konnten 677 bp der cDNA-Sequenz ermittelt werden. Weitere 29 bp aus dem 5'-Bereich konnten durch Sequenzierung von RT-PCR-Produkt en bestimmt werden. Der 5'-nicht-translatierte Bereich hat eine Länge von mindestens 60 bp, der 3'-nicht translatierte Bereich erstreckt sich über 124 bp. Die mRNA besitzt einen offenen Leserahmen von 522 bp, der für ein Protein von 174 Aminosäuren kodiert. An Position 192 der mRNA war bei RT-PCR Experimenten ein Polymorphismus zu beobachten, hier wurde sowohl die Base A (wie in der genomischen Sequenz) als auch die Base G bestimmt. Dieser Polymorphismus führt nicht zum Austausch einer Aminosäure. Der cDNA-Clon IMAGp998L19858 stammt aus 13,5 und 14,5 Tage alten Mäuseembryonen. Durch RT-PCR konnte das Transkript zusätzlich in 17,5 Tage alten Embryonen nachgewiesen werden, nicht jedoch in 11,5 Tage alten Embryonen. Diese Daten deuten daraufhin, daß das Gen in spä tembryonalen Stadien exprimiert wird.The murine gene AscL3 extends over a range of 4.2 kb on mouse chromosome 7. It was determined by a cDNA clone (IMAGp998L19858; BAC clone 42H1, Genome Systems Inc.). By sequencing this clone 677 bp of the cDNA sequence can be determined. Another 29 bp the 5 'region could be determined by sequencing RT-PCR product s can be determined. The 5 'non-translated area has a length of at least 60 bp that 3'-untranslated The area spans 124 bp. The mRNA has one open reading frame of 522 bp, which for a protein of 174 Amino acids encoded. At position 192 of the mRNA was in RT-PCR Experiments to observe a polymorphism was here both base A (as in the genomic sequence) and the base G determines. This polymorphism does not lead to Exchange of an amino acid. The cDNA clone IMAGp998L19858 comes from 13.5 and 14.5 day old mouse embryos. By RT-PCR was also able to transcript the transcript in 17.5 days old Embryos are detected, but not in 11.5 days old Embryos. These data indicate that the gene in late tembryonic stages is expressed.

Example 2 Determination of the human ASCL3 sequence

Das orthologe humane Gen ASCl3 erstreckt sich über einen ge nomischen Bereich von 5,4 kb und ist auf dem chromosomalen Bereich 11p15.3 lokalisiert. Die Genstruktur wurde durch den Vergleich mit dem murinen ASCL3 Gen ermittelt, da keinerlei EST-Daten oder cDNA-Clone beim Menschen vorliegen; zur Auf findung diese Gens wurde der PAC-Clon LLNLP704J141117Q3 (Res sourcenzentrum RZPD, Berlin) verwendet. Das Gen ASCL3 codiert für eine aus 2 Exons bestehende mRNA von etwa 650 bp Länge (Fig. 1). Der 5'-nicht-translatierte Bereich hat eine Länge von mindestens 30 bp, der 3'-nicht-translatierte Bereich um faßt 47 bp. Aus dem offenen Leserahmen der mRNA läßt sich ein Protein von 181 Aminosäuren ableiten.The orthologous human gene ASCl3 stretches over a 5.4 kb genomic region and is located on the chromosomal region 11p15.3. The gene structure was determined by comparison with the murine ASCL3 gene since there are no EST data or cDNA clones in humans; The PAC clone LLNLP704J141117Q3 (Res sourcenzentrum RZPD, Berlin) was used to find this gene. The ASCL3 gene codes for a mRNA consisting of 2 exons and approximately 650 bp in length ( FIG. 1). The 5'-untranslated region has a length of at least 30 bp, the 3'-untranslated region comprises 47 bp. A protein of 181 amino acids can be derived from the open reading frame of the mRNA.

Example 3 Comparison of the amino acid sequences of the ASCL3 gene (Human) with the gene Ascl3 (mouse) and other relatives Genes

Ein Vergleich der Proteine aus Mensch und Maus ergab eine Übereinstimmung von 68,4% (Fig. 3). Das Programm PSORT2 sagte mit einer Wahrscheinlichkeit von 94% eine Lokalisation beider Proteine im Zellkern voraus. Die Analyse mit verschiedenen Programmen identifizierte beide Proteine als Mitglieder der Familie der basischen "helix-loop-helix"-Proteine (bHLH). Die "helix-loop-helix"-Domäne erstreckt sich bei beiden Proteinen auf die Aminosäurepositionen 103-145, die basische Bindungs domäne wird von 10 davorliegenden Aminosäuren gebildet (Fig. 3). Eine Datenbanksuche mit den Proteinen ergaben Ähnlich keiten zu zahlreichen anderen "helix-loop-helix"-Proteinen. Die größten Übereinstimmungen zeigen dabei ein "helix-loop-he lix"-Protein aus C. elegans mit unbekannter Funktion (33%, Acc. Nr. 2498011; Figur. 4), sowie Mitglieder der "achaete scute complex (Drosophila) homologue-like" Gene der Verte braten. Die humanen Gene ASCL1 und ASCL2 zeigen eine Überein stimmung von 25,1 bzw. 35,1% zum ASCL3 Gen auf Aminosäure- Ebene (Fig. 5 und 6). Die größten Ähnlichkeiten von ASCL3 zu einem Gen des D. melanogaster "Achaete scute"-Komplexes ergeben sich zu dem T3 Gen mit 24,6% übereinstimmenden Amino säuren (Fig. 7). A comparison of the proteins from humans and mice showed an agreement of 68.4% ( FIG. 3). The PSORT2 program predicted a localization of both proteins in the cell nucleus with a probability of 94%. Analysis with different programs identified both proteins as members of the family of basic "helix-loop-helix" proteins (bHLH). The "helix-loop-helix" domain extends to amino acid positions 103-145 in both proteins, and the basic binding domain is formed by 10 amino acids located in front of it ( FIG. 3). A database search with the proteins showed similarities to numerous other "helix-loop-helix" proteins. The largest matches show a "helix-loop-he lix" protein from C. elegans with unknown function (33%, acc. No. 2498011; FIG. 4), as well as members of the "achaete scute complex (Drosophila) homologue- like "Verte genes fry. The human genes ASCL1 and ASCL2 show a match of 25.1 and 35.1% respectively to the ASCL3 gene at the amino acid level (FIGS . 5 and 6). The greatest similarities of ASCL3 to a gene of the D. melanogaster "Achaete scute" complex result to the T3 gene with 24.6% matching amino acids ( Fig. 7).

Tabelle 1 Table 1

Daten der Gene ASCL3 (H. sapiens) und Asc13 (M. musculus) Data of the genes ASCL3 (H. sapiens) and Asc13 (M. musculus)

ks: Transkriptionsstartpunkt (experimentell oder durch Homolo gievergleich bestimmt); Poly A: Anzahl der Polyadenylierungs stellen; alternat. Spleiß.: Alternative Spleißformen vorhan den; % As: Übereinstimmung zwischen beiden Proteinen in %; % Cds: Übereinstimmung zwischen den translatierten DNA-Sequenzen der mRNA in %; HLH: "helix-loop-helix"-Domäne.ks: starting point of transcription (experimental or by homolo gie comparison determined); Poly A: number of polyadenylation put; alternate Splice .: Alternative splice forms available the; % As: agreement between the two proteins in%; % Cds: agreement between the translated DNA sequences the mRNA in%; HLH: "helix-loop-helix" domain.

Example 4 Production of the murine bHLH transcription factor ASCL3

Die DNA von Fig. 2 wird mit BAMHI-Linkern versehen, mit BamHI nachgespalten und in den mit BamHI gespaltenen Expressions vektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expres sionsplasmid pQE-8/ASCL3 erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen bHLH-Transkriptionsfaktors ASCL3 von Fig. 2 (C-Terminuspartner). pQE-8/ASCL3 wird zur Transforma tion von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacte riol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Qia gen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie- Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).The DNA of FIG. 2 is provided with BAMHI linkers, cleaved with BamHI and inserted into the expression vector pQE-8 (Qiagen) cleaved with BamHI. The expression plasmid pQE-8 / ASCL3 is obtained. Such a code for a fusion protein of 6 histidine residues (N-terminus partner) and the bHLH transcription factor ASCL3 from FIG. 2 (C-terminus partner) according to the invention. pQE-8 / ASCL3 is used to transform E.coli SG 13009 (see. Gottesman, S. et al., J. Bacte riol. 148, (1981), 265-273). The bacteria are cultivated in an LB medium with 100 μg / ml ampicillin and 25 μg / ml kanamycin and induced for 4 h with 60 μM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Lysis of the bacteria is achieved by adding 6 M guanidine hydrochloride, then chromatography (Ni-NTA resin) is carried out with the lysate in the presence of 8 M urea according to the manufacturer's (Qia gen) instructions for the chromatography material. The bound fusion protein is eluted in a pH 3.5 buffer. After neutralization, the fusion protein is subjected to 18% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie blue (cf. Thomas, JO and Kornberg, RD, J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form hergestellt werden kann.It turns out that a (fusion) protein according to the invention in highly pure form can be produced.

Example 5 Production and detection of an inventive Antibody

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 2 wird einer 18% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach An färbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 21 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepuffer ter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Fär bung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusions protein werden Tiere wie folgt immunisiert:A fusion protein of Example 2 according to the invention becomes one Subjected to 18% SDS polyacrylamide gel electrophoresis. According to staining of the gel with 4 M sodium acetate is approximately 21 kD Cut the band out of the gel and buffer in phosphate incubated with saline. Pieces of gel are sedimented, before the protein concentration of the supernatant by SDS Polyacrylamide gel electrophoresis, which is a Coomassie blue stain exercise follows, is determined. With the gel-cleaned fusion animals are immunized with protein as follows:

Immunization protocol for polyclonal antibodies in rabbit chen

Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung (kom plettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkom plettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten35 µg of gel-purified fusion protein in 0.7 ml PBS and 0.7 ml complete or incomplete Freund's adjuvant are used per immunization.
Day O: 1st immunization (complete Freund's adjuvant)
Day 14: 2nd immunization (inkom plettes Freund's adjuvant; icFA)
Day 28: 3rd immunization (icFA)
Day 56: 4th immunization (icFA)
Day 80: bleeding

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phospha tase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Anti körper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwickler lösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 W Nitro blau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.The rabbit's serum is tested in an immunoblot. For this purpose, a fusion protein according to the invention from Example 1 is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229. For this purpose, the nitrocellulose filter is incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody is rabbit serum (1: 10000 in PBS). After several washing steps with PBS, the nitrocellulose filter is incubated with a second antibody. This antibody is a monoclonal goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) coupled with alkaline phosphate in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, there are several washing steps with PBS and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 µM 5 'bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 400 W nitro blue tetrazolium, 100 mM Tris HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ ) at room temperature until bands become visible.

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.It is found that polyclonal antibodies according to the invention can be produced.

Immunization protocol for chicken polyclonal antibodies

Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag O. 1. Immunisierung (kom plettes Freund's Adju vans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkom plettes Freund's Adju vans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)40 µg of gel-purified fusion protein in 0.8 ml of PBS and 0.8 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant are used per immunization.
Day 01. Immunization (complete Freund's Adju vans)
Day 28: 2nd immunization (inkom plettes Freund's Adju vans; icFA)
Day 50: 3rd immunization (icFA)

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.Antibodies are extracted from egg yolk and Western blotted tested. There are polyclonal antibodies according to the invention proven.

Immunization protocol for mouse monoclonal antibodies

Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O. 1. Immunisierung (kom plettes Freunds Adju vans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkom plettes Freund s Adju vans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: FusionFor each immunization, 12 µg gel-purified fusion protein in 0.25 ml PBS and 0.25 ml complete or incomplete Freund's adjuvant are used; at the 4th immunization the fusion protein is dissolved in 0.5 ml (without adjuvant).
Day 01. Immunization (complete friend's adju vans)
Day 28: 2nd immunization (inkom plette Freund s Adju vans; icFA)
Day 56: 3rd immunization (icFA)
Day 84: 4th immunization (PBS)
Day 87: fusion

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen. Supernatants from hybridomas are tested in a Western blot. Monoclonal antibodies according to the invention are detected.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. DNA sequence coding for a bHLH transcription factor ASCL3 with the amino acid sequence shown in FIG. 1 (human) or FIG. 2 (mouse).

2. DNA sequence according to claim 1, comprising the nucleic acid sequence shown in Fig. 1 or Fig. 2.

3. DNA sequence coding for a protein with the biological properties of a transcription factor encoded by the DNA sequences according to claim 1 or 2, wherein the DNA sequence

a) differs from the DNA sequence according to claim 2 in the codon sequence due to the degeneration of the genetic code;
b) hybridized with the DNA sequence according to claim 2 or 3 (a); or
c) is a fragment, an allelic variant or another variant of the DNA sequence according to claim 2, 3 (a) or 3 (b).

4. Ribozyme, characterized in that it is a DNA Se quenz according to one of claims 1 to 3 is complementary and specifically the mRNA transcribed from this DNA sequence bind and cleave them, thereby synthesizing the from this DNA sequence encoded protein reduced or inhibited becomes.

5. Antisense RNA, characterized in that it becomes a DNA sequence according to one of claims 1 to 3 is complementary and to the mRNA transcribed by this DNA sequence can bind fish, thereby the synthesis of the DNA Sequence encoded protein is reduced or inhibited.

6. Expression vector containing a DNA sequence after a of claims 1 to 3 or one for the ribozyme according to claim 4 or the DNA Se coding for the antisense RNA according to claim 5 quenz.

7. Host cell, transformed with the expression vector Claim 6.

8. bHLH transcription factor ASCL3 or protein with it biological activity based on the DNA sequence one of claims 1 to 3 is encoded.

9. Method for producing a bHLH transcription factor ASCL3 or a protein with its biological activity according to claim 8, comprising culturing the host cell after Claim 7 under suitable conditions and the extraction of Proteins from the cell or the culture medium.

10. Antibody targeting the bHLH transcription factor ASCL3 or a protein with its biological activity according to An saying 8 binds, or a fragment thereof.

11. Medicament which has a DNA sequence according to one of claims che 1 to 3, the ribozyme according to claim 4, the antisense RNA according to claim 5, the expression vector according to claim 6, the bHLH transcription factor ASCL3 or a protein with it biological activity according to claim 8, or the antibody according to claim 10 or the fragment thereof.

12. Diagnostic procedure for the detection of a possibly disturbed Expression of the bHLH transcription factor, in which one Sample with the DNA sequence according to one of claims 1 to 3 or the antibody of claim 10 or the fragment thereof in contact and then determined directly or indirectly, whether the concentration, length and / or sequence of the bHLH- Transcription factor ASCL3 or the coding for this Differentiate DNA or mRNA compared to a control sample the.

13. Diagnostic kit for performing the procedure according to Claim 12, the DNA sequence according to any one of claims 1 to 3 and / or the antibody according to claim 10 or the question ment of it contains.