DD295526A5 - Mikroorganismus und dessen verwendung als mikrobielles pflanzenstaerkungsmittel - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus und dessen Verwendung als mikrobielles Pflanzenstaerkungsmittel. Erfindungsgemaesz ist der Mikroorganismus ein Bac. spec. mit der Bezeichnung Bacillus subtilis A 1/3, der sich durch erweiterte antibakterielle und antivirale sowie auch antifungale Wirkungen auszeichnet. Die spezifischen Eigenschaften seines Wirkstoffes praedestinieren seine Anwendung. Die Applikation des erfindungsgemaeszen Mikroorganismus als Pflanzenstaerkungsmittel kann bevorzugt als Trockenprodukt, insbesondere als Granulat mit lang anhaltender Lebensfaehigkeit der Zellen erfolgen.{mikrobielles Pflanzenstaerkungsmittel; Bac. subtilis A 1/3; Sporen; Zellen; Granulat, antifungal, antiviral, antibakteriell; Gewaechshaus; Hydroponikkulturen; Gemuese; Zierpflanzen}

Description

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

Es gibt bereits mehrere mikrobielle Applikationsformen, die zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen, insbesondere pilzlichen Schaderregern, eingesetzt werden. Sie werden anstelle chemosynthetisch hergestellter Fungizide, die oft einen nachteilig negativen Einfluß auf die Umwelt ausüben, verwendet.

Zur Applikation gelangen lebende Mikrobenzellen in Form von Zellsuspensionen und Kulturlosungen, Trockenpräparate als Pulver oder Granulate mit oder ohne Trägersubstanzen, z. B. DE-OS 3639504 und DE-OS 3324644 sowie ein sich noch im Anmeldestadium befindliches Patent der Anmelderin. Die zur Bekämpfung mikrobieller Schaderreger verwendeten Mikroorganismen erzeugen Wirkstoffe, die entweder unmittelbarzur Unterdrückung der Pflanzenpathogene im Substrat bzw. der Fthizosphäre führen oder darüber hinaus auch krankheitsreduzierende Effekte induzieren, die indirekt über die Pflanze wirksam werden. Daraus leitet sich ab, daß derart wirksame mikrobielle Applikationsformen berechtigterweise als Pflanzenstärkungsmittel bezeichnet werden.

Bekannte mikrobielle Präparate dieser Art sind bevorzugt durch ein antifungales Wirkungsspektrum gekennzeichnet, z. B.

- Pilze des Genus Cercospora und Pseudocercosporella EP032130

WP-DD 258562

- Streptomycesgriseoviridis US-PS 4595589

- Bacillus subtilis T99 DD-WP 250456

- Bacillus subtilis CS-PS 262504

- Bacillus pumilus US-PS4820531

- Streptomyces spec. US-PS4534965

- Streptomyces gram inofaciensmirisus υ. flavescens DD-WP 264940

- Erwiniaspec. DLG-Mitt. 9/1990

Neben ihren antifungalen Wirkstoffen synthetisieren Vertreter der Bacillus-subtilis-Gruppe (B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis) auch antibakteriell wirksame Metabolite (W. Löffler et al., Forum Mikrobiologie 13, [1990], 156). Dazu zählen Bacilysin (Bacillin), Chlorotetain, Fengymycin und Verbindungen aus der Iturin-Klasse. Ihre antibakterielle Wirkung, insbesondere in einer Testung gegen phytopathogene Bakterien, gilt allgemein als begrenzt.

Schließlich wird indem US-PS 3617448 eine wasserlösliche antibiotische Substanz aus Bacillus uniflagellatus ATCC15134 erwähnt, die sowohl antifungal als auch antibakteriell, antiviral und gegen Nematoden wirksam ist. B. uniflagellatus ist eine Species, die weder im Approved List of Bacterial Names (1980) noch im BERGEY'S Manual of Systematic Bacteriology (1984) enthalten ist. Sie ist daher nach den Taxonomie-Regeln nicht existent. Aussagen über die Wirkung von B. uniflagellatus auf Mensch und Tier liegen in o.g. Patentschrift nicht vor.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung und Anwendung eines toxikologisch unbedenklichen mikrobiellen Pflanzenstärkungsmittels mit breitem Wirkungsspektrum.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein applikationsfähiges Pflanzenstärkungsmittel bzw. Pflanzenschutzmittel mit einem speziellen Bakterienstamm, der über ein breites Wirkungsspektrum zur Unterdrückung von bevorzugt bakteriellen, aber auch pilzlichen Schaderregern sowie von Viruskrankheiten in relevanten Pflanzenbereichen verfügt, bereitzustellen.

Es wurde gefunden, daß eine aus Flüssigsubstraten von Tomaten-Hydroponik-Kulturen isolierte Subspecies von Bacillus subtilis mit der Stammbezeichnung A1 /3 die o.g. Aufgabe erfüllt. Das Flüssigsubstrat wurde wie üblich auf die Oberfläche eines Nähragars ausgespatelt Nach einer ßebrütungsdauer der Petrischalen von 12h wurde die Agaroberfläche mit dem Testkeim Clavibacter michiganensis (subsp. michiganensis) besprüht. Nach einer weiteren Inkubation bei 28°C konnte man nach 2-4 Tagen an wenigen Bakterienkolonien deutliche Hemmhöfe erkennen. Sie wurden abgeimpft, reingezüchtet und auf Ihre antimikrobielle Aktivität nach üblichen In-vitro-Testen geprüft, s. u.

Ein Stamm mit einem breiten Wirkungsspektrum wurde ausgewählt und einer taxonomischen Identifizierung zugeführt.*

Der erfmdungsgemäße Stamm kann auf die beschriebene Weise von jedem Durchschnittsfachmann isoliert werden.

Taxonomische Eigenschaften und Identifizierung des isolierten Stammes. Die Identifizierung erfolgte nach BERGEY'S Manual of Systematic Bacteriology, VoI 2 (1986). Morphologische Merkmale und Gramverhalten

Form d. Spore:	oval
Lage d. Spore:	zentral
Sporulationsrate (%):	80
	beweglich
Gramverhalten,
Zellmorphologie:	grampositiv, Lst.

Koloniemorphologie auf unterschiedlichen Nährböden Blutplatte: beige, rauh/matt, gefasert, ß-Hämolyse nach 24h Nähragar(NA): hellbeige, rauh/matt, gelappt Riesenkolonie (NA): rund. Durchmesser 1,5cm, beige, rauh/matt, gelappt Wachstumsverhalten und biochemische Merkmale -' : Wachstum in Nährbouillon: Hautbildg., Trübung, Bodensatz Glukose-Nitrat-Agar: Glukose-Asparagin-Agar: Anaeobes Wachstum in Glukose-Medium: NaCI-Verwertung 3%:

5%:

Nitratreduktion: + Gasbildg. aus Nitrat:' — Biochemische Merkmale Säurebildung aus L-Arabinose: +

D(+)-Xylose: +

d-Mannose: +

Glucose: +

d-Galactose: +

d-Fructose: +

Maltose: +

Trehalose: +

Saccharose; +

Lactose: +

Raffinose: +

L-Rhamnose: -

D-Mannit: + Dulcit:

Aesculin: +

d-Sorbit: +

Ribose: +

Inosit: +

VPR: +

Citratverwertg.: + Stärkehydrolyse: +++HZ 1mm Caseinhydrolyse: +++HZ2mm Gelatinehydrolyse: +++HZ2mm Lecithinase: -

Der isolierte Stamm mit der Bezeichnung A1 /3 war nach BERGEY'S Manual und durch serodiagnostische Untersuchungen der Species Bacillus subtilis zuzuordnen. Die Serodiagnostik basierte auf der Anwendung der Fluoreszenz-Antikörper-Technik, wobei aus Kaninchen gewonnene Antisporenseren benutzt wurden. Der Stamm Bacillus subtilis A1/3 unterscheidet sich von dem Typ-Stamm Bacillus subtilis ATCC 6051 in folgenden Punkten:

- Säurebildung aus: Galactose, Laktose, Raffinose und Ribose

- starkes Wachstum auf: Glucose-Asparigin-Agar und Glucose-Nitrat-Agar

- höhere Sporulationsrate auf Griesagar

- B. subtilis ATCC 6051 besitzt keine Hemmung gegenüber Clavibacter michiganensis

Von Bacillus subtilis T99 gemäß DD-WP-250456 unterscheidet sich der erfindungsgemäße Stamm B. subtilis A1 /3 sowohl durch einige taxonomische Besonderheiten als auch durch ein spezifisches Wirkungsspektrum. Taxonomische Unterschiede:

- Säurebildung aus: d-Galaktose, Laktose, d-Ribose und Raffinose

- Wachstum in 10%iger NaCI-Bouillon

- Koloniemorphologie wie Farbe und gelapptem bzw. gefasertem Kolonierand

Wirkungsspektrum.' B. subtilis T99 hemmt Clavibacter michiganensis nur im geringeren Ausmaß, erwirkt nicht gegenüber Erwinia amylovora und Pseudomonas lachrymans s.Tab. 1. Seine Wirkung gegenüber pflanzenpatogenen Viren ist nicht erwiesen.

In vivo und z.T. in vitro ermittelte Wirkungsspektren:

- Antibakterielle Wirkung gegen:

• Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

• Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

• Erwinia carotovora

• Erwinia amylovora

• Pseudomonas corugata

• Pseudomonas syringae pv. lachrymans

• Pseudomonas syringae pv. tomato

• Xanthomonas campestris pv. begoniae

• Arthrobacternicotianae u. a.

- Antivirale Wirkung gegen:

• Tomatenmosaikvirus

• Gurkenblattfleckenvirus

• Tabakrattelvirus

• Gerstengelbver2weigungsvirus u.a.

- Antifungale Wirkung gegen:

• Alternaria spec.

• Bortrytis cineria

• einige Fusariumspecies, wie F.avenaceum, F.culmorum, F.oxysproumf.sp.lycopersici

• einige Phytophthoraspecies, wie Ph. nicotianae, Ph.cryptogea

• Curvularia spec. u.a.

• Phythium ultirnum undP.debaryanum u.a.

Der erfindungsgemäße Bacillus subtilis A1/3 kann mit gutem Erfolg in geschlossenen Systemen mit Flüssigsubstraten in Hydroponikkulturen auch in Erdsubstraten mit ausreichendem Feuchtigkeitsgehalt zur Reduzierung von wurzelübertragbaren oder bodenbürtigen Phythophathogenen eingesetzt werden.

Des weiteren kann er dort erfolgreich appliziert werden, wo ein direkter Kontakt mit den Krankheitserregern gewährleistet ist, wie

z. B. zur Eliminierung von an Oberflächen anhaftenden Pathogenen, von holzigen oder krautigen Vermehrungskulturen, an Speicher- oder Vermehrungsorganen ode auch an Lagergut. Die wirkungsvollste Anwendungskonzentration liegtvorzugsweise zwischen 10⁹-10⁶ je ml Applikationslösung, s.u.

Die in Flüssigsubstraten (z.B. in Hydroponikkulturen für Tomaten) eingesetzten Zellen des erfindungsgemäßen Stammes

überleben in der Überzahl im vegetativen Zustand länger als 6 Monate. Nachfolgeapplikationen erübrigen sich dadurch.

Zur Bekämpfung von bakteriellen Erregern wie z. B. von Clavibacter michiganensis (in einer Infektionsdichte von 10⁴ Zellen/ml) in Flüssigsubstraten sind Zellzahlen von 10⁶-10⁷/ml notwendig, s. Beispiel 2.

Zur Bekämpfung von Phytopathogenen in Erdsubstraten sind im allgemeinen etwa 5 x 10⁷ bis 5 x 10⁸ Zellen je m² Bodenfläche erforderlich.

Virusinfektionen können mit etwa 5 χ 10⁹ Zellen des Stammes Bacillus subtilis A1/3 bis zu 95% reduziert werden (s. Beispiel 3).

Eine besonders ausgeprägte antifungale Wirkung ließ sich gegenüber Fusarium oxysporum radicis lycosporsici, Phytophthora nicotianae u. Phythium debaryanum im Plattentest ermitteln.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Bakteriums als Pflanzenstärkungsmittel erfolgt in Form lebender Zellen, die 2. B. als Kulturlösung oder Zellsuspensionen von Emerskulturen oder als Trockenpräparate, wie Pulver oder Granulate zur Anwendung gelangen können.

Als zweckmäßige Handels- und Applikationsformen für Bacillus subtilis A1/3 erweisen sich Granulate mit Trägerstoffen wie Sand, Betonite, Kaolin oder Chemikalien.

Die Granulate werden in bekannter Weise hergestellt.

Dazu wird die Biomasse der Bakterien in sterilisierbaren zwangsbelüfteten Fermentern biotechnisch erzeugt, s. Beispiel 1. Die Zellen werden von der Kultivierung mittels bekannter Trennverfahren abgetrennt und einer üblichen Trocknung, z.B. in einem Wirbelschichtsystem, wie kürzlich von der Anmelderin in einem Patent vorgeschlagen, zugeführt.

Ein dabei erhaltenes Granulat, mit Sand als Träger, besitzt 10'"-1O¹¹ lebensfähige Sporen/Zellen je Gramm, es ist staubfrei, toxikologisch unbedenklich und mehr als ein Jahr haltbar.

Die Vorteile in der praktischen Anwendung des Granulates mit B.subtilis A1/3 liegen in:

- dem erweiterten Wirkungsspektrum des Stammes im Vergleich zu anderen Bacillus-Stämmen, s. Tab. 1

- der langen Lebensfähigkeit der Zellen in Hydroponikkulturen, s. Tab. 2 und

- in dem relativ beständigen Wirkstoff, der nach Resuspension der Bakterien von dem Granulat am Applikationsort sofort wirksam wird. Dieser Effekt kann sowohl im Lochtest mit dem Überstand aus 100mg Granulat in 100ml Wasser als auch im Sterilfiltrat einer 24-48h alten wäßrigen Suspension der Bakterienzellen deutlich nachgewiesen werden.

Tabelle 1

Antagonistische Wirkung einiger Bacillus-Stämme im Vergleich zu B.subtilis A1/3. Lochteste mit Clavibacter michigenensis (Cm), Erwinia amylovora (E.a.) und Pseudomonas lachrymans (Ps.I.)

Species/Stamm Hofdurchmesser (mm)

Cm. E.a. Ps.

Bacillus subtilis ATCC 6051	0	0	0
Bacillus subtilisT99	23	0	0
Bacillus pumilus HGB	18	0	0
Bacillus subtilis A1/3	33	27,0	21,0
Streptothrezinderivat 0,01 %ig	24,5	10,8	17,5

Durchführung der Lochteste; Aus 48 h lang geschüttelten Kulturlösungen mit den o. g. Bakterien (Nährbodenzusammensetzung, s. Beispiel 1) wurden Kulturfiltrate hergestellt. Jeweils 100μΙ der Filtrate wurden in Löcher von Nähragarplatten, die o.g. Testkeime enthielten,

eingefüllt.

Nach einer Bebrütungsdauer von 2 bis 3Tagen bei 28°C wurden die Durchmesser der Hemmhöfe ausgemessen. Die Hemmhöfe gelten als Maß für die antibakterielle Wirkung der Bakterien.

Tabelle 2 Lebensfähigkeit der Zellen von B.subtilis A1 /3 in Hydroponikkultur (in Flüssigsubstrat für Tomaten)

Stamm Zellen/ml Flüssigsubstrat nach Wochen C) 5 11 20 26

B.subtilisA1/3 1,7 χ 10^s 2 χ 10⁶ 7 χ 10⁵ 2 x 10⁶ 3 χ Die Zusammensetzung der verwendeten Flüssigsubstate entsprechen den in praxi üblichen Nährlösungen mit folgenden Nährstoffen in bekannten Konzentrationen: Stickstoff, Phosphor, Kalium, Magnesium, Calzium, Eisen, Mangan, Kupfer, Molybdän, Bor. Anwendungsgebiete Beispiel 1 Bacillus subtilis A1/3 wurde in einem 37-l-Rührfermenter mit 20I Füllung vermehrt. Der Stamm wurde als Schrägagarkultur auf Waksman-Agar, nachdem er bei 30°C gewachsen war, bei +4°C aufbewahrt. Zusammensetzung des Waksman-Agars: Bacto-Peptone 5g, Glucose 10g, Fleischextrakt 3g, NaCI 5g, Agar 20g je Liter Leitungswasser, pH 6,8, Sterilisation 30min bei 121⁰C Eine Vorkultur (100ml Nährlösung in 500ml großen Rundstehkolben) wurde nach der Beimpfung auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 30 °C 24h geschüttelt. Mit 200 ml Vorkultur wurde die Nährlösung im Fermenter beimpft. Vorkultur und Produktionsmedium hatten folgende Zusammensetzung: Sojaschrot 20g, Magermilchpulver 15g, losliche Stärke 10g, (NH₄)₂HPO₄1 g, MgSO₄ · 7HjO0,2g, CaCO₃ 5g

je Liter Leitungswasser, pH 6,8, Sterilisation bei 121 °C min.

Fermentationsparameter: Belüftung 0,1 vvm, Umdr. des Rührers 250/min, Temperatur 30⁰C, Schaumbekämpfung mit Poly propy lenglycol. Nach einer Kulturdauer von 45h erreichten die Zellen die stationäre Phase mit einer Keimzahl von 1-2 x 10¹⁰ml. Die Bakterien wurden mittels Separation von der Kulturlösung abgetrennt und einer Granulierung auf einem Wirbelschichtgranulator zugeführt. Das Granulat hatte eine Keimzahl von 10¹⁰ bis 10¹Vg. Als Trägerstoffe können Sand oder andere übliche Stoffe verwendet

werden.

Beispiel 2 Zur Bekämpfung der bakteriellen Welke an Tomatenpflanzen, hervorgerufen durch Clavibacter michiganensis

subsp. michiganensis (C. m.) wurden wäßrige Suspensionen des nach Beispiel 1 erzeugten Granulates mit B. subtilis A1 /3verwendet.

Die Versuchsdurchführung erfolgte in Hydroponikkultur mit zirkulierendem Nährstoffstom (NFT-Kultur) mit o.g. Flüssigsubstrai

für Tomaten.

Die Versuchsdauer belief sich auf 4 Monate. Tomatensorte: Counter. Es wurden mehrere Parallelen mit und ohne den Testkeim Cm. und den antagonistisch wirkenden B.subtilis A1/3 angesetzt. Parallelen:

- Kulturlösung ohne Zusatzkeime

- Kulturlösung mit dem Welkerreger Cm. in einer Konzentration von etwa 10^eZellen/ml

- Kulturlösung mit C. m. und 10* Zellen des Stammes B. subtilis A1/3 mit prophylaktischer und kurativer Anwendung

- bei prophylaktischer Applikation wird der Stamm A1/3 3 Tage vor der Erregerzugabe zudosiert

- bei kurativer Versuchsführung wird der Stamm A1/3 3 Tage nach der Erregerzugabe appliziert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 enthalten.

Unterdrückung der Welkeentwicklung (hervorgerufen durch C. m.) an Tomaten pflanzen in NFT-Kultur durch Applikation von B.subtilisAI/3.

darchschn. Boniturnote

August September Oktober November Dezember

Monat

Zeichenerklärung:

+ : Kulturlösung mit Cm.

-: Kulturlösung ohne Zugaben von Cm. und B. subtilis A1/3

bzw.

bei prophylaktischer Anwendung des Stammes A1/3 in C. m.-haltiger Kulturlösung *: Kulturlösung mit C. m. bei kurativem Einsatz des Stammes A1 /3

Boniturnoten: 9 = alle Pflanzen gesund

5 = 50% der Pflanzen welken1 - Pflanzen abgestorben

Beispiel 3

Zur Hemmung von Virus-Infektionen an entsprechenden Wirtspflanzen werden wäßrige Suspensionen des nach Beispiel 1 erzeugten Granulates mit B. subtilis A1 /3 verwendet. Als Testpflanzen dienten

- fürdasTabakrattelvirus: Chenopodium quinoa

- für das Tomatenmosaikvirus: Tomate -Sorte „Harzfeuer"

Aus verseuchten Wirktspflanzen wurden Preßsäfte als Inocula gewonnen. Sie gelangten mit unterschiedlichem Virustitergehalt zur Anwendung.

Die Inocula wurden vor ihrer Applikation mit unterschiedlich hohen Keimzahlen des Stammes A1/3 versetzt.

Das Ergebnis der Applikation wurde anhand der ausgebildeten Virus-Lokalläsionen an den Blättern der Testpflanzen ermittelt.

Ergebnis:

Der Krankheitsbefall nach Inoculation mit den o.g. Viren kann bei einer Keimdichte des Stammes A 1/3/ml Inoculum von

- 5 x 10⁹ um etwa 95% reduziert werden,

- 5 x 10⁸ um etwa 70% reduziert werden,

- 5 x 10⁷ um etwa 25-30% reduziert werden.

Claims (2)

1. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er einer Subspecies von Bacillus subtilis mit der Bezeichnung Bacillus subtilis A1 /3 zugeordnet ist, der sich durch seine erweiterte antivirale, antibakterielle und antifungale Wirkung auszeichnet.

2. Verwendung des Mikroorganismus erfolgte mit den spezifischen Eigenschaften seines Wirkstoffes nach Anspruch 1 als Pflanzenstärkungsmittel.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Das mikrobielle Pflanzenstärkungsmittel kann im Gemüse- und Zierpflanzenbau sowie in landwirtschaftlichen und forstwirtschaftlichen Bereichen 2ur Erhöhung der Widerstandskraft der Pflanzen gegen ein breites Spektrum von Viren und mikrowellen Schaderregern eingesetzt werden.