DD289892A7 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF ALKYL PHOSPHONESERINES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Alkylphosphonoserinen der allgemeinen Formel I. Die Verbindungen werden durch Umsetzung von Alkylphosphonsaeuren mit N-substituierten Serinestern und nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppen der Alkylphosphonoserinester sowie durch Phospholipase-D-katalysierte Umesterung von Alkylphosphonsaeureestern mit Serin erhalten.{Alkylphosphonoserine; Alkylphosphonsaeure; Serinester; Phospholipase-D; Umesterung}The invention relates to a process for preparing alkylphosphonoserines of the general formula I. The compounds are obtained by reacting alkylphosphonic acids with N-substituted serine esters and subsequent removal of the protective groups of the alkylphosphonoserine esters and by phospholipase D-catalyzed transesterification of alkylphosphonic acid esters with serine. alkylphosphonic; serine ester; Phospholipase D; transesterification}
Description
O R-P-O-CH9-CH-COOHO RPO-CH 9 -CH-COOH
OH NH2 OH NH 2
in der Rein aliphatischer Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 22 Kohlenstoff-Atomen ist, und von deren Salzen. Diese Verbindungen stellen potentielle Cytcstatica und Virostatica dar. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die chemische sowie die pflanzliche Industrie.in the pure aliphatic hydrocarbon radical having 8 to 22 carbon atoms, and of their salts. These compounds represent potential Cytcstatica and Virostatica. Fields of application of the invention are the chemical and plant industries.
Es ist bekannt, daß sich Phosphatidylserlne durch Kondensation von Phosphatidsäuren mit doppelt geschütztem Serin und anschließender Abspaltung der im Serinteil befindlichen Schutzgruppen der entstandenen doppc't geschützten Phosphatidylserin-Derivate synthetisieren lassen (AJ. Slotboom et al., Chem. Phys. Lipids, 5 [1970] 301-379). Diese Mothode ist auch auf andere serinhaltige Phospholiplde angewendet worden ( H. Brachwitz et al., DDR-Patentschrift DD 238979 A1 [1986]). Es ist weiterhin bekannt, daß sich Phosphatidylserin-Analoge aus Phosphatidsäureester-Analogen und Serin durch eine Phospholipase-D-katalysierte Umesterung herstellen lassen [P.Comfurius et al., Biochem. Biophys. Acta, 488 [1977] 36-42; H. Brachwitz et al., DDR-Patentschriften DD 238978 A1, DD 239208 A1, DD 239209 A1, DD 239405 A1 [alle 1986]). Die erfindungsgemäßen Verbindungen vom Typ 1 sind bisher in der Literatur nicht beschrieben worden. Es handelt sich um neuartige Verbindungen, für die bisher keine Herstellungsmethoden existieren.It is known that phosphatidylserines can be synthesized by condensation of phosphatidic acids with doubly protected serine and subsequent cleavage of the protective groups of the dinucleotide-protected phosphatidylserine derivatives formed in the serine part (AJ Slotboom et al., Chem. Phys. Lipids, 5 1970] 301-379). This Mothode has also been applied to other serine-containing phospholipid (H. Brachwitz et al., DDR patent DD 238979 A1 [1986]). It is also known that phosphatidylserine analogs of phosphatidic acid analogues and serine can be prepared by phospholipase D-catalyzed transesterification [P.Comfurius et al., Biochem. Biophys. Acta, 488 [1977] 36-42; Brachwitz et al., DDR patents DD 238978 A1, DD 239208 A1, DD 239209 A1, DD 239405 A1 [all 1986]). The compounds of the invention of type 1 have not been described in the literature so far. These are novel compounds for which no manufacturing methods exist so far.
Es ist das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung der Alkylphosphonoserine der allgemeinen Formel I zu entwickeln.It is the object of the invention to develop a process for the preparation of the alkylphosphonoserines of general formula I.
Erfindungsgemäß werden die Alkylphosphonoserine der allgemeinen Formel I hergestellt, indem man Alkylphosphonsäuren der allgemeinen Formel II,According to the invention, the alkylphosphonoserines of the general formula I are prepared by reacting alkylphosphonic acids of the general formula II
Q OH Il •Q OH Il •
R-P IlR-P Il
OHOH
in der R die bereits genannte Bedeutung besitzt, mit einem N-substituierten Serinester der allgemeinen Formel III,in which R has the meaning already mentioned, with an N-substituted serin ester of the general formula III,
I ο-χI o-χ
NH-YNH-Y
in der X und Y Schutzgruppen darstellen, deren Bedeutungen bereits genannt wurden, zu den Alkylphosphonoserin-Derivaien der allgemeinen Formel IVin which X and Y are protective groups whose meanings have already been mentioned, to the Alkylphosphonoserin Derivaien the general formula IV
Q OQ O
ItIt ^^
R-P-O-CH31-CH-C I I N RPO-CH 31 -CH-C II N
CIH NH-Y OXCIH NH-Y OX
umsetzt und aus diesen die Schutzgruppen X und Y nach an sich bekannten Methoden wieder abspaltet.converts and from these the protective groups X and Y cleaved again by methods known per se.
IVIV
Die als Ausgangsvorbindungon benutzten Alkylphosplionsäuren Il lassen sich ζ. B. herstellen, indem man aus einem entsprechenden Alkylbromid R-Br und Trimethylphosphit zunächst die Alkylphosphonsäuredimethylester synthetisiert, diese durch Umsetzung mit einem Gemisch von Trimethylsilylchlorid und NaJ In Acetonitril in die Alkylphosphonsäure-bistrimethylsilylester überführt und letztere durch Wassereinwirkung bei Raumtemperatur hydrolysiert. Die erfindungsgemäße Umsetzung der Alkylphosphonsäuren Il mit einem Serin-Derivat der allgemeinen Formel III erfolgt im allgemeinen in der Weise, daß man die Verbindungen Ii In das Salz einer tertiären Base, z. B. Pyridin, überführt und dieses vorzugsweise in Anwesenheit eines Kondensationsmittels, z. B. 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfochlorid, unter wasserfreien Bedingungen, moist in Anwesenheit eines Lösungsmittels, z. B. Pyridin, mit dem Serin-Derivat zur Reaktion bringt. Hierbei ist es zweckmäßig, die Reaktionskomponenten im Molverhältnis 1:1 bis 1:2 zur Reaktion einzusetzen. Die Umsetzung, die im allgemeinen bereits bei Raumtemperatur erfolgt, wird zweckmäßigerweise dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach Beendigung der Reaktion wird zur Entfernung noch vorhandenen SäurechloriJs Wasser zum Reakuu.,jgemisch gegeben, 30 Minuten gerührt, zur Trockne eingeengt, und der ' «fallende Rückstand mit Diethylether erschöpfend extrahiert. Die durch Einengen der Etherextrakte erhaltenen Alkylphosphonsäureserinester IV werden säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt. Die Überführung der Verbindungen IV in die Endstufen I erfolgt erfindungsgemäß in der Weise, daß man in die Lösungen der Verbindungen IV in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Chloroform, unter wasserfreien Bedingungen unter Kühlung, vorzugsweise bei Temperaturen zwischen -5°C bis +D0C, getrocknetes Chlorwasserstoffgas einleitet, dieses etwa 0,5 bis 3 Stunden einwirken läßt und schließlich durch Einleiten von getrocKnetem Stickstoff aus den Lösungen entfernt. Der nach dem Einengen dar Lösung erhaltene Rückstand wird mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol/wäßrigem Ammoniak behandelt, wobei die Diammoniumsalze der Verbindungen I entstehen, die in üblicher Weise isoliert werden. Dieses Verfahren erlaubt die Synthese der L- bzw. D-Serin-Ester I sowie auch der Racemate.The Alkylphosplionsäuren used as Ausgangsvorbindungon II can be ζ. Example, by first synthesizing the Alkylphosphonsäuredimethylester from a corresponding alkyl bromide R-Br and trimethyl phosphite, these converted by reaction with a mixture of trimethylsilyl chloride and NaJ In acetonitrile in the alkylphosphonic acid bistrimethylsilylester and hydrolyzed the latter by water at room temperature. The reaction according to the invention of the alkylphosphonic acids II with a serine derivative of the general formula III is generally carried out in such a way that the compounds Ii In the salt of a tertiary base, for. As pyridine, and this is preferably in the presence of a condensing agent, for. B. 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfochlorid, under anhydrous conditions, moist in the presence of a solvent, for. As pyridine, brings with the serine derivative to the reaction. It is expedient here to use the reaction components in a molar ratio of 1: 1 to 1: 2 for the reaction. The reaction, which generally takes place already at room temperature, is suitably followed by thin-layer chromatography. After the reaction has ended, water is added to the reaction mixture to remove the remaining acid chloride, stirred for 30 minutes, concentrated to dryness, and the residue is extracted exhaustively with diethyl ether. The Alkylphosphonsäureserinester IV obtained by concentration of the ether extracts are purified by column chromatography on silica gel. The conversion of the compounds IV in the final stage I is carried out according to the invention in such a way that in the solutions of the compounds IV in an inert solvent, for. B. chloroform, under anhydrous conditions with cooling, preferably at temperatures between -5 ° C to + D 0 C, dehydrated hydrogen chloride gas, this allowed to act for about 0.5 to 3 hours and finally removed by introducing dried nitrogen from the solutions. The residue obtained after concentration of the solution is treated with a mixture of chloroform / methanol / aqueous ammonia to give the diammonium salts of the compounds I, which are isolated in the usual way. This method allows the synthesis of the L- or D-serine ester I as well as the racemates.
Eine andere Variante der Erfindung besteht in der enzymatischem Synthese der Alkylphostihonoserine der allgemeinen Formel Hierbei werden Alkylphosphonsäureester der allgemeinen Formel V,Another variant of the invention consists in the enzymatic synthesis of Alkylphostihonoserine the general formula Here are alkylphosphonic the general formula V,
O Ü-ZO Ü-Z
μ y μ y
R-P VR-P V
in der R und Z die bereits genannten Bedeutungen besitzen, mit L-Serin in Gegenwart von Phospholipase D umgeestert und die entstandenen Alkylphosphonoserine I nach üblichen Methoden isoliert. Im einzelnen erfolgt diese Reaktion, indem man eine Lösung oder Suspension des Alkylphosphonsäureesters V, z. B. des Alkylphosphonocholins, in einer möglichst hochkonzentrierten Lösung von L-Serin ·η einem wäßrigen Puffersystem, z. D. Acetat- oder Trispuffer bei pH-Werten zwischen 4,8 und 8,5 in Gegenwart von Calciumionen (0,01 bis 0,1 M) in Anwesenheit von Phospholipase D bei Temperaturen zwischen 100C und 50"C heftig schüttelt, wobei dem Reaktionsgemisch Diethylether oder ein Gemisch des letzteren mit einem weiteren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Choloroform, zugesotzt wird. Im allgemeinen erfolgt die Umesterung in einem Zeitraum von 0,5 bis 24 Stunden. Es ist zweckmäßig, donReaktionsablauf dünnschichtchromatographisch zu kontrollieren. Nach erfolgtem Umsatz wird zur Desaktivierung der Phospholipase D eine 0,1 M EDTA-Lösung zum Reaktionsgemisch gegeben und anschließend das entstandende Endprodukt I auf übliche Weise isoliert.in which R and Z have the meanings already mentioned, transesterified with L-serine in the presence of phospholipase D and the resulting alkylphosphonoserines I isolated by customary methods. In detail, this reaction is carried out by reacting a solution or suspension of Alkylphosphonsäureesters V, z. As the alkylphosphonocholine, in a very highly concentrated solution of L-serine · η an aqueous buffer system, for. D. vigorously shaking acetate or Tris buffer at pH values between 4.8 and 8.5 in the presence of calcium ions (0.01 to 0.1 M) in the presence of phospholipase D at temperatures between 10 ° C. and 50 ° C. diethyl ether or a mixture of the latter with another organic solvent, preferably choloroform, is added to the reaction mixture, in which case the transesterification takes place in a period of from 0.5 to 24 hours to deactivate the phospholipase D, a 0.1 M EDTA solution added to the reaction mixture and then the resulting final product I isolated in the usual manner.
Die erfindungsgemäß hergestellten Phosphonate besitzen eine gewisse strukturolle Beziehung zu den physiologisch aktiven natürlichen Phosphatidylserinen, un° arscheiden sich von diesen jedoch in der Abwesenheit der Glycerokomponenten mit den enzymatisch leicht abspaltbaren Fettsäureresten sowie in dem Vorhandensein einer C-P-Bindung anstelle einer C-O-P-Bindung und damit in einer Erhöhung der Biostabilität.The phosphonates prepared according to the invention have a certain structural relationship with the physiologically active natural phosphatidylserines, but differ from these in the absence of the glycerol components with the enzymatically readily cleavable fatty acid residues and in the presence of a CP bond instead of a COP bond and thus in an increase in biostability.
Die erfindungsgemäß hergestellten neuen Verbindungen weisen eine starke antiproliferative Wirkung bei Ehrlich-Ascites-Tumorzellen auf. In Tabelle 1 ist die Wachstumshemmung dieser Tumorzellen unter dem Einfluß unterschiedlicher Konzentrationen aufgeführt.The novel compounds prepared according to the invention have a potent antiproliferative effect on Ehrlich ascites tumor cells. Table 1 shows the growth inhibition of these tumor cells under the influence of different concentrations.
Tabelle 1: Wachstumshemmung (%) von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen unter dem Einfluß unterschiedlicher KonzentrationenTable 1: Growth inhibition (%) of Ehrlich ascites tumor cells under the influence of different concentrations
Verbindung % Hemmung bei einer Konzentration vonCompound% inhibition at a concentration of
1x10"4 3X10"5 !ΧΙΟ"5 3x10"6M1x10 " 4 3X10" 5 ! ΧΙΟ " 5 3x10" 6 M
Diese Erfindung wird an nachstehenden Beispielen erläutert.This invention will be illustrated by the following examples.
n-Hexadecylphosphono-L-serin (I, R = C11H31)n-hexadecylphosphono-L-serine (I, R = C 11 H 31 )
n-Hexadecylphosphonsäure (II, R = C18H33):n-hexadecylphosphonic acid (II, R = C 18 H 33 ):
Eine Mischung aus n-Hexadecylbromid (4,89g, 16mmol) und frisch destilliertem Trime iylphosphit (2,48g, 20mmol) wird für 24 Stunden bei 116°C gerührt. Anschließend wird das überschüssige Trimethylphosphit im Vakuum abdestilliert und der Rückstand 24 Stunden über Phosphorpentoxid im Vakuum aufbewahrt. Der ent' indene n-HexadecylphosphonsäuredimethylesterA mixture of n-hexadecylbromide (4.89g, 16mmol) and freshly distilled trimyl phosphite (2.48g, 20mmol) is stirred for 24 hours at 116 ° C. Subsequently, the excess trimethyl phosphite is distilled off in vacuo and the residue stored for 24 hours over phosphorus pentoxide in vacuo. The ent indene n-Hexadecylphosphonsäuredimethylester
wird aus dem Rückstand durch zweimalige Extraktion mit je 10mt Methanol isoliert. Die beiden Methanolextrakte werden vereinigt und Im Vakuum eingeengt. Der so erhaltene ölige, farblose Rückstand, der neben dem n-Hexadecylphosphonsäuredimethylester noch n-Hexadecylbromid enthalt, wird weiter umgesetzt in 4,7 ml wasserfreiem Acetonitril mitTrimethylsilylchlorid (1,02g,9,4mmol) und Natriumiodid (1,4g,9,4mmol). Die Umsetzung erfolgt unter Rühren bei Raumtemperatur und dauert 15 Minuten,is isolated from the residue by extraction twice with 10mt methanol. The two methanol extracts are combined and concentrated in vacuo. The oily, colorless residue thus obtained, which still contains n-hexadecyl bromide in addition to the n-hexadecylphosphonic acid dimethyl ester, is further reacted in 4.7 ml of anhydrous acetonitrile with trimethylsilyl chloride (1.02 g, 9.4 mmol) and sodium iodide (1.4 g, 9.4 mmol ). The reaction is carried out with stirring at room temperature and lasts 15 minutes,
Das bei dor Reaktion entstandene Natriumchlorid wird abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt, und der resultierende Rückstand wird mit 4 ml Wasser versetzt, wobei durch Hydrolyse n-Hexadecylphosphonsäure entsteht. Um das gleichzeitig gebildete Me3SiOSiMe3 zu entfernen, wird mehrmals mit Ethanol/Wasser (1:1, V/V) im Vakuum nachdestilliert. Nach Behandlung des Rückstandes mit 7 ml getrocknetem Aceton werden 346 mg n-Hexadecylphosphonsäure Il (R = C16H33) orhalten.The sodium chloride formed in the reaction is filtered off. The filtrate is concentrated in vacuo, and the resulting residue is treated with 4 ml of water, whereby n-hexadecylphosphonic acid is formed by hydrolysis. In order to remove the 3 Me simultaneously formed SiOSiMe 3, several times with ethanol / water (1: 1, V / V) is redistilled in vacuo. After treating the residue with 7 ml of dried acetone, 346 mg of n-hexadecylphosphonic acid II (R = C 16 H 33 ) are kept.
DCfKie'selgel 60, Merck-Fertigplatten, Chloroform/Methanol/Wasser, 65:25:4, V/V/V): Rf = 0,15 Elementaranalyse berechnet für C16H33PO3 (306,42): C 62,71, H 11,51; gefunden C 62,81, H 11,89 (%).TLC gel column 60, Merck precast plates, chloroform / methanol / water, 65: 25: 4, v / v / v): R f = 0.15 Elemental analysis calculated for C 16 H 33 PO 3 (306.42): C 62 , 71, H 11,51; found C 62.81, H 11.89 (%).
n-Hexadecylphosphono-N-t-butoxycarbonyl-L-serinbezhydrylesterdV, R = C16H331H = CH(C6H6I2, Y = t-BOC):n-Hexadecylphosphono-Nt-butoxycarbonyl-L-serine benzhydryl ester dV, R = C 16 H 331 H = CH (C 6 H 6 I 2 , Y = t-BOC):
Eine Lösung von 92mg (0,3mmol) n-Hexadecylphosphonsäure (II, R = C16H33) in 1 ml Pyridin wird im Vakuum eingeengt und das so erhaltene Pyridiniumsalz ans fließend über Phosphorpentoxid im Vakuum getrocknet. Danach wird es in 5ml wasserfreiem Pyridingelöst. 356mg (0,96mmol)geschütztes Serin (MI1X = CH(CeH6)2.Y = CO-O-C(CH3I3), über Phosphorpenloxid im Vakuum getrocknet, werden in 4ml wasserfreiem Pyridifi gelöst. Die beiden Lösungen werden vermischt und zum Gemis Ii 581 mg (1,92 mmo!) Triisopropylbenzolsulfochlorid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Danach wird das Gemisch im Vakuum eingeengt, mehrfach mt Toluen nachdestilliert und der Rückstand über Phosphorpentoxid im Vakuum getrocknet. Dieser wird anschließend mit 15ml Diethylether extrahiert und dreimal mit 4ml Diethylether nachgewaschen. Die Etherlösungen werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Aus dem so erhaltenen Rückstand werden durch Umkristallisierung aus Acetonitril 118 mg des n-Hexadecylphosphonoserin-Derivat IV erhalten. Eine weitere Reinigung erfolgt durch Säulenchromatographie an 8g Kieselgel 60 (Korngröße 0,04-0,063 mm, 230 bis 400 mesh, Merck). Das für die Chromatographie verwendete Chloroform und die Lösungsmittelgemische für die Eluierung enthalten 0,5% wäßrigen 25%igen Ammoniak. Eluiert wird mit 50ml Chloroform, 50ml Chloroform/Methanol, 98:2, V/V, 200ml Chloroform/Methanol, 95:5, V/V, 200ml Chloroform/Methanol, 90:10, V/V. Die Fraktionsgröße beträgt 15ml. Die Fraktionen 15-20 enthalten 72mg reinen Hexadecylphosphono-N-t-butoxycarbonyl-L-serinbenzhydrylester.A solution of 92mg (0.3 mmol) of n-hexadecylphosphonic (II, R = C 16 H 33 ) in 1 ml of pyridine is concentrated in vacuo and the pyridinium salt thus obtained is dried in vacuo over phosphorus pentoxide in vacuo. Then it is dissolved in 5ml anhydrous pyridine. 356 mg (0.96 mmol) of protected serine (MI 1 X = CH (C e H 6 ) 2.Y = CO-OC (CH 3 I 3 ), dried over phosphorus pentoxide in vacuo, are dissolved in 4 ml of anhydrous pyridifene The reaction mixture is stirred under anhydrous conditions at room temperature for 24 hours, after which the mixture is concentrated in vacuo, distilled several times with toluene and the residue is dried over phosphorus pentoxide in vacuo The latter is then extracted with 15 ml of diethyl ether and washed three times with 4 ml of diethyl ether The ether solutions are combined and concentrated under reduced pressure 118 mg of n-hexadecylphosphonoserine derivative IV are obtained from the residue thus obtained by recrystallization from acetonitrile Column chromatography on 8 g of silica gel 60 (particle size 0.04-0.063 mm, 230 to 400 mesh, Merck) used chloroform and the solvent mixtures for elution contain 0.5% aqueous 25% ammonia. Elution is with 50ml chloroform, 50ml chloroform / methanol, 98: 2, v / v, 200ml chloroform / methanol, 95: 5, v / v, 200ml chloroform / methanol, 90:10, v / v. The fraction size is 15ml. Fractions 15-20 contain 72mg of pure hexadecylphosphono-Nt-butoxycarbonyl-L-serine benzhydryl ester.
DC (Kieselgel 60, Merck-Fertigplatten, Chloroform/Methanol, 80:20, V/V): Rf = 0,2.TLC (Kieselgel 60, Merck precast plates, chloroform / methanol, 80:20, v / v): Rf = 0.2.
Elementaranalyse berechnet für C37H61N2PO7 (NH4-SaIz, 676,87): C 65,65 H 9,08, N 4,14; gefunden C 65,44, H 9,15 N 3,73 (%).Elemental analysis calculated for C 37 H 61 N 2 PO 7 (NH 4 -SaIz, 676.87): C, 65.65; H, 9.08, N, 4.14; found C 65.44, H 9,15 N 3,73 (%).
n-Hexadecylphosphono-L-serin:n-Hexadecylphosphono-L-serine:
69mg (0,1 mmol) der beschriebenen Verbindung IV werden im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet und anschließend in 13ml wasserfreiem Chloroform gelöst. Durch diese Lösung wird für 10 Minuten trockener Stickstoff und anschließend unter wasserfreien Bedingungen bei O0C für 20 Minuten Chlorwassetstoffgas geleitet. Danach wird das Reaktionsgefäß fest verschlossen und 1 Stunde bei 0°C weitergerührt. Zur Entfernung des Chlorwasserstoffgeses wird anschließend 1 Stunde lang bei Raumtemperatur Stickstoff durch das Reaktionsgemisch geleitet. Danach wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingeengt und dor Rückstand mit einer Mischung von 10ml Chloroform/Methanol, 2: i, V/V, 1 ml Wasser und 0,02ml 25%igem wäßrigon Ammoniak versetzt, geschüttelt und nach Phasentrennung die anfallende organische Phase abgetrennt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit je 5ml Chloroform/Methanol/Wasser, 2:1 -.0,18, V/V/V, extrahiert, die organischen Lösungen werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Zur Entfernung von restlichem Wasser wird mehrmals mit 1 ml Benzen/Ethanol, 2:3, V/V nachdestilliert.69 mg (0.1 mmol) of the described compound IV are dried in vacuo over phosphorus pentoxide and then dissolved in 13 ml of anhydrous chloroform. Dry nitrogen is passed through this solution for 10 minutes, followed by hydrogen chloride gas at 0 ° C. for 20 minutes under anhydrous conditions. Thereafter, the reaction vessel is tightly closed and stirred at 0 ° C for 1 hour. To remove the hydrogen chloride, nitrogen is then passed through the reaction mixture for 1 hour at room temperature. Thereafter, the reaction mixture is concentrated in vacuo and the residue is treated with a mixture of 10 ml of chloroform / methanol, 2: 1, v / v, 1 ml of water and 0.02 ml of 25% aqueous ammonia, shaken and separated after phase separation, the resulting organic phase , The aqueous phase is extracted three times with 5 ml of chloroform / methanol / water, 2: 1 -0.18, v / v / v, the organic solutions are combined and concentrated in vacuo. To remove residual water is distilled several times with 1 ml of benzene / ethanol, 2: 3, V / V.
Das erhaltene Produkt, Hexadecylphosphono-L-serin I, wir I über Phosphorpentoxid im Vakuum getrocknet und danach mit Aceton gewaschen.The resulting product, hexadecylphosphono-L-serine I, we I dried over phosphorus pentoxide in vacuo and then washed with acetone.
Ausbeute: 43mg (95%).Yield: 43mg (95%).
Zur Entfernung von Spuren an Ammoniumchlorid wird die Substanz an 2,2g Kieselgcl 60 (Korngröße 0,04-0,063mm, 230 bis 400mesh, Merck) Chromatographien. Die Säule wird mit Chloroform/Methanol/wäßrigem 25%igem Ammoniak, 80:20:0,5, V/V/V äquilibriert. Eluiert wird mit 20ml Chloroform/Methanol/wäßrigem 25%igen Ammoniak, 80:20:0,5, V/V/V, 20ml Chloroform/Methanol/wäßrigem 25%igem Ammoniak, 75:25:0,5, V/V/V, 20ml Chloroform/Methanol/wäßrigem 25%igem Ammoniak, 70:30:0,5, V/V/V, 20ml Chloroform/Methanol/wäßrigem 25%igem Ammoniak, 65:35:0,5, V/V/V, 200ml Chloroform/Methanol/wäßrigem 25%igen Ammoniak, 60:40:0,5, V/V/V. Die Verbindung wird aus den Fraktionen 7-19 durch Einengen erhalten. (Fraktionsgröße 20ml).To remove traces of ammonium chloride, the substance is chromatographed on 2.2 g Kieselgcl 60 (particle size 0.04-0.063 mm, 230 to 400 mesh, Merck). The column is equilibrated with chloroform / methanol / aqueous 25% ammonia, 80: 20: 0.5, v / v / v. Elution is with 20ml chloroform / methanol / aqueous 25% ammonia, 80: 20: 0.5, v / v / v, 20ml chloroform / methanol / aqueous 25% ammonia, 75: 25: 0.5, v / v / V, 20ml chloroform / methanol / aqueous 25% ammonia, 70: 30: 0.5, v / v / v, 20ml chloroform / methanol / aqueous 25% ammonia, 65: 35: 0.5, v / v / V, 200ml chloroform / methanol / aqueous 25% ammonia, 60: 40: 0.5, v / v / v. The compound is obtained from fractions 7-19 by concentration. (Fraction size 20ml).
DC (Kieselgel 60, Merck-Fertigplatten, Chloroform/Methanol/Aceton/Essigsäure/Wasser, 10:2:4:2:1, V/V/V/V/V: Rf = 0,1.TLC (Kieselgel 60, Merck precast plates, chloroform / methanol / acetone / acetic acid / water, 10: 2: 4: 2: 1, V / V / V / V / V: Rf = 0.1.
Die Sichtbarmachung erfolgt mit Molybdatreagenz und mit Ninhydrinreagenz.Visualization is with molybdate reagent and with ninhydrin reagent.
Elementaranalyse berechnet für Ci9H46N2PO6 (NH4-SaIz, Monohydrat, 428,55): C 53,24, H 10,58, N 6,54; gefunden C 53,80, H10,55,N5,73(%).Elemental analysis calculated for Ci 9 H 46 N 2 PO 6 (NH 4 -SaIz, monohydrate, 428.55): C, 53.24, H, 10.58, N, 6.54; found C 53.80, H 10.55, N 5.73 (%).
FAB-Massenspektrometrie(Anionenspektrum): m/z414, (M - 2H + Na)+; m/z 392, (M - H)+; m/z 305 (M - CH2CH[NH2]COOH)+; Kaiionenspektrum: m/z416, (M + Na)+; m/z438, (M -t- 2Na)+.FAB mass spectrometry (anion spectrum): m / z414, (M - 2H + Na) + ; m / z 392, (M - H) + ; m / z 305 (M - CH 2 CH [NH 2 ] COOH) + ; Scale spectrum: m / z416, (M + Na) + ; m / z438, (M -t-2Na) + .
Enzymatische Synthese des n-Hexadecylphosphono-L-serins (I, R = C16H33)Enzymatic Synthesis of n-Hexadecylphosphono-L-serine (I, R = C 16 H 33 )
0.8g L-Serin (7,6mmol) werden in 1,52 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,6), der 0,09M an CaCI2 ist, bei 450C gelöst. Zu dieser Lösung werden 31 mg (0,075mmol) n-Hexadecylphosphonocholin, 1,6ml Diethylether/Chloroform (9:1, V/V, ethanolfrei) und 209mg eines Phospholipase-D-Enzympräparates, das aus Weißkohl hergestellt, eine Aktivität von 0,9 U/ml (1 Unit [U] setzt bei 270C 1 μΜοΙ Substrat pro Minute um) im Reaktionsgemisch aufweist. Das Gemisch wird 2,2 Stunden bei 450C gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 3,31 ml 0,1 M EDTA-Lösung zugesetzt l nd durch Einleiten von Stickstoff die organischen Lösungsmittel entfernt. Die zurückbleibei Je wäßrige Phase wird mit dem 4,3fachen Volumen Chloroform/Methanol (5:8, V/V) 30 Minuten gerührt und vom Ungelösten (L-Serin) abgesaugt. Das Filtrat wird mit 1 Volumen Wasser und 3,7 Volumen Chloroform versetzt, die Mischung 10 Minuten geschüttelt, die organische Phase abgetrennt, im Vakuum eingeengt und der0.8g L-serine (7,6mmol) are dissolved in 1.52 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 5.6) containing 0.09 M of CaCl 2 is dissolved at 45 0 C. To this solution are added 31 mg (0.075 mmol) of n-hexadecylphosphonocholine, 1.6 ml of diethyl ether / chloroform (9: 1, v / v, ethanol free) and 209 mg of a phospholipase D enzyme preparation prepared from white cabbage, having an activity of 0, 9 U / ml (1 unit [U] sets at 27 0 C 1 μΜοΙ substrate per minute) in the reaction mixture. The mixture is stirred at 45 ° C. for 2.2 hours. After cooling to room temperature, 3.31 ml of 0.1 M EDTA solution are added and the organic solvents are removed by passing in nitrogen. The residue left In the aqueous phase is stirred with 4.3 times the volume of chloroform / methanol (5: 8, V / V) for 30 minutes and sucked from the insoluble (L-serine). The filtrate is treated with 1 volume of water and 3.7 volumes of chloroform, the mixture shaken for 10 minutes, the organic phase separated, concentrated in vacuo and the
erhaltene Rückstand an Carboxymethylcellulose (CM52 Whatman, Na*-Form) säulenchromatographisch getrennt. Die Elution erfolgt nacheinander mit 75ml Chloroform, je 300ml Chloroform/Methanol, 9:1,8:2,7:3, anschließend 1750ml Chloroform/ Methanol, 1:1 (jeweils V/V). Die Fraktionsgröße beträgt 60 ml. Aus Fraktionen 20-39 werden 6 mg reines n-Hexadecylphosphono-L-Serin (I, R " C18H33) erhaltenresidue obtained on carboxymethyl cellulose (CM52 Whatman, Na * form) separated by column chromatography. The elution is carried out successively with 75 ml of chloroform, 300 ml of chloroform / methanol, 9: 1.8: 2.7: 3, then 1750 ml of chloroform / methanol, 1: 1 (each v / v). The fraction size is 60 ml. From fractions 20-39, 6 mg of pure n-hexadecylphosphono-L-serine (I, R "C 18 H 33 ) are obtained
DC (Kieselgel 60, Merck-Fertigplatte, CHCI3/CH3OH/Aceton/Essigsäure/H20,50:10:20:10:5, V/V/V/V/V): Rf = 0,1.TLC (Kieselgel 60, Merck precast plate, CHCl 3 / CH 3 OH / acetone / acetic acid / H 2 0.50: 10: 20: 10: 5, v / v / v / v / v): R f = 0.1 ,
n-Decylphosphono-L-serlnn-Decylphosphono-L-serln
(Kieselgel 60, Merck-Fertigplatten, Chloroform/Methanol/Aceton/Essigsäure/Wasser 10:2:4:2:1; v/v/v/v/v): Rf = 0,1Ausbeute: 28,7%(Silica gel 60, Merck precast plates, chloroform / methanol / acetone / acetic acid / water 10: 2: 4: 2: 1, v / v / v / v / v): Rf = 0.1 Yield: 28.7%
n-Octadocylphosphono-L-serlnn-Octadocylphosphono-L-serln
Ausbeute: 31,8%Yield: 31.8%
(Kieselgel 60, Me-ck-Ferticplatten, Chloroform/Methanol/Aceton/Essigsäure/Wassor 10:2:4:2:1 v/v/v/v/v): Rf = 0,1Ausbeute: 26,0%(Silica gel 60, Meck-Fertic® plates, chloroform / methanol / acetone / acetic acid / Wassor 10: 2: 4: 2: 1 v / v / v / v / v): Rf = 0.1 Yield: 26.0%
Claims (5)
R-P-O-CH.-CH-COOH ,O
RPO-CH.-CH-COOH,
a) eine Alkylphosphonsäure der allgemeinen Formel II,in which the radical R is an aliphatic hydrocarbon radical having 8 to 22 carbon atoms, and salts thereof, characterized in that
a) an alkylphosphonic acid of the general formula II,
" / O.OH
" /
b) daß man einen Alkylphosphonsäureester der allgemeinen Formel V,splits off in a conventional manner and the resulting alkylphosphoserines optionally subsequently converted into their salts or
b) that an alkylphosphonic ester of the general formula V,
R-P V0 0-Z
RP V
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