DD238978A1

DD238978A1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF 2-O-ALKYL-I-DES OXY-1 HALOGENGLYCERO-3-PHOSPHO-L-SERINES

Info

Publication number: DD238978A1
Application number: DD27823085A
Authority: DD
Inventors: Hans Brachwitz; Albin Hermatter; Peter Langen; Christine Lehmann; Eckart Matthes; Friedrich Paltauf; Juergen Schildt
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-07-03
Filing date: 1985-07-03
Publication date: 1986-09-10

Abstract

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von 2-0-Alkyl-1-desoxy-1-halogen-3-phospho-L-serinen zu entwickeln. Erfindungsgemaess werden diese Verbindungen durch Umsetzung von 2-0-Alkyl-1-desoxy-1-halogenglycero-3-phosphorsaeurealkylestern bzw. analogen Verbindungen wie 2-0-Alkyl-1-desoxycholin mit L-Serin in Gegenwart von Phospholipase D hergestellt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die chemische bzw. pharmazeutische Industrie.The aim of the invention is to develop a process for the preparation of 2-0-alkyl-1-deoxy-1-halo-3-phospho-L-serines. According to the invention, these compounds are prepared by reacting 2-0-alkyl-1-deoxy-1-halo-glycero-3-phosphoric acid alkyl esters or analogous compounds such as 2-0-alkyl-1-deoxycholine with L-serine in the presence of phospholipase D. Field of application of the invention is the chemical or pharmaceutical industry.

Description

Characteristic of the known technical solutions

Es ist bekannt, daß Glycerophospholipde mit Serinhaltiger Kopfgruppe sich durch Kondensation von Glycerophosphorsäurederivaten mit Serinderivaten herstellen lassen. In diesen Fällen werden die Carboxyl- und die Aminogruppe des Serins durch die Einführung von Schutzgruppen blockiert, um Nebenreaktionen zu vermeiden. Nach erfolgter Kondensation werden diese Schutzgruppen in zusätzlichen Syntheseschritten wieder abgespalten. Nach dieser Methode sind z. B. Diacyl-, Dialkyl- sowie auch Acylalkylglycerophosphoserine synthetisiert worden (A. J. Slotboom et al., Chem. Phys. Lipids, 5 [1970] 301-379; H. Eibl, Chem. Phys. Lipids, 26 [1980] 405-429; A. Hermetter et al., Chem. Phys. Lipids, 30 [1982] 35-45). Phosphatidylserine, die zwei Acylgruppen im Molekül enthalten sind auch durch eine enzymatisch katalysierte Umesterung mit Hilfe der Phospholipase D ausgehend von Phosphatidylcholinen hergestellt worden (P.Comfuriusetal., Biochim.Biophys.Acta, 488 [1977] 36-42). Verfahren zur Synthese von halogenhaltigen O-Alkylglycerophosphoserin-Analogen des Typs I sind bisher nicht beschrieben worden. Andere Phospholipide sind bereits mit Hilfe von Phospholipase D hergestellt worden (H. Eibl et al.. Methods in Enzymology, 72 [1981] 632-639), wobei teilweise auch nicht natürlich vorkommende Glycerophosphorsäurealkylester und Analoge als Substrate in die Reaktion eingesetzt wurden. Über die Synthese von Phosphatidylserinen mit Hilfe von Phospholipase D ist hingegen bisher wenig bekannt. P.Comfuriusetal. (vgl. oben) beschreiben die enzymatische Synthese von Phosphatidylserinen aus natürlichen Phosphatidycholinen, wobei allerdings die Ausbeuten an Phosphatidylserinen vergleichsweise gering waren, und vornehmlich Hydrolyse unter Bildung von Phosphatidsäuren eintrat. Andere als natürliche Substrate sind bisher zur Herstellung von Phosphatidylserinen durch Umesterung mittels Phospholipase D nicht eingesetzt worden.It is known that glycerophospholipde with Serinhaltiger head group can be prepared by condensation of Glycerophosphorsäurederivaten with serine derivatives. In these cases, the carboxyl and amino groups of the serine are blocked by the introduction of protecting groups to avoid side reactions. After condensation, these protective groups are split off again in additional synthesis steps. By this method z. For example, diacyl, dialkyl, and also acylalkylglycerophosphoserins have been synthesized (AJ Slotboom et al., Chem. Phys. Lipids, 5 [1970] 301-379, H. Eibl, Chem. Phys. Lipids, 26 [1980] 405-429 A. Hermetter et al., Chem. Phys. Lipids, 30 [1982] 35-45). Phosphatidylserines containing two acyl groups in the molecule have also been prepared by enzymatically catalyzed transesterification with the aid of phospholipase D starting from phosphatidylcholines (P. Comfurius et al., Biochim. Biophys. Acta, 488 (1977) 36-42). Methods for the synthesis of halogen-containing O-alkyl glycerophosphoserine type I analogues have not previously been described. Other phospholipids have already been prepared with the aid of phospholipase D (H. Eibl et al .. Methods in Enzymology, 72 [1981] 632-639), wherein partially non-naturally occurring Glycerophosphorsäurealkylester and analogues were used as substrates in the reaction. By contrast, little is known about the synthesis of phosphatidylserines with the aid of phospholipase D. P.Comfuriusetal. (see above) describe the enzymatic synthesis of phosphatidylserines from natural phosphatidycholines, although the yields of phosphatidylserines were comparatively low, and predominantly hydrolysis with formation of phosphatidic acids occurred. Other than natural substrates have not been used for the production of phosphatidylserines by transesterification by means of phospholipase D.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem sich die 2-0-Alkyl-1-desoxy-1-halogen-3-phospho-L-serine der allgemeinen Formel I herstellen lassen.The aim of the invention is to develop a process by which the 2-0-alkyl-1-deoxy-1-halo-3-phospho-L-serines of general formula I can be prepared.

Explanation of the essence of the invention

Erfindungsgemäß werden die Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt, indem man 2-O-Alkyl-1-desoxy-1-halogenglycero-3-phosphorsäurealkylesteroder2-0-Alkyl-1-desoxy-1-halogenglycerophosphocholine, -N-methylalkanolamine, -Ν,Ν-dimethylalkanolamine, O-(2-O-Alkyl-1-desoxy-1-halogenglycer-3-yl)-O'-^-N,N,N-trimethylammonio)alkyl]phosphate der allgemeinen Formel II,According to the invention, the compounds of the general formula I are prepared by reacting alkyl 2-O-alkyl-1-deoxy-1-halogenoglycero-3-phosphorates or 2-O-alkyl-1-deoxy-1-halo-glycerophosphoquines, -N-methylalkanolamines, -Ν, Ν-dimethylalkanolamines, O- (2-O-alkyl-1-deoxy-1-halo-glycer-3-yl) -O '- ^ - N, N, N-trimethylammonio) alkyl] phosphates of the general formula II,

CH₂-HaI CH-O-RCH ₂ -HaI CH-OR

CH₂-O-P(O)-O-R¹6"CH ₂ -OP (O) -OR ¹ 6 "

II .II.

in der Hai und R die bereits genannten Bedeutungen besitzen und R¹ einen Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen, der auch durch OH, Cl oder Br substituiert sein kann, falls 2 bis 6 C-Atome vorliegen, bzw. die Gruppierungin the shark and R have the meanings already mentioned and R ^{1 is} an alkyl radical having 1 to 6 carbon atoms, which may also be substituted by OH, Cl or Br, if 2 to 6 carbon atoms, or the grouping

X ) -U - YX) -U - Y

bedeutet, wobei X, Y und Zfür Methylgruppen oder Wasserstoffatome stehen und η = 1 bis 6 sein kann, mit L-Serin in Gegenwart von Phospholipase D zur Umsetzung bringt und die entstandenen Alkyldesoxyhalogenglycerophosphoserine nach üblichen Verfahren isoliert. Im wesentlichen erfolgt die Herstellung der Verbindungen vom Typ !,indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel Il in wäßriger Lösung oder Suspension unter Zusatz von organischen Lösungsmitteln, z. B. Ether und/oder Chloroform, und eines Puffers, z. B. Natriumacetat- oder Tris-Puffer, bei einem pH-Wert zwischen 4,8 bis 8, in Gegenwart eines Calciumsalzes (Molarität vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,1) mit L-Serin in Anwesenheit von Phospholipase D bei Temperaturen zwischen 10 und 50⁰C reagieren läßt.where X, Y and Z are methyl groups or hydrogen atoms and η = 1 to 6, with L-serine brings in the presence of phospholipase D for reaction and the resulting Alkyldeoxyhalogenglycerophosphoserine isolated by conventional methods. Essentially, the preparation of compounds of the type carried out by reacting a compound of general formula II in aqueous solution or suspension with the addition of organic solvents, for. For example, ether and / or chloroform, and a buffer, for. As sodium acetate or Tris buffer, at a pH of 4.8 to 8, in the presence of a calcium salt (molarity preferably between 0.01 and 0.1) with L-serine in the presence of phospholipase D at temperatures between 10th and 50 ⁰ C react.

Es ist ein besonderer Vorteil dieses Verfahren, daß man das Serin ohne Schutzgruppen, deren Einführung oft präparativ aufwendig ist, zur Reaktion einsetzen kann. Nach erfolgtem Umsatz, der dünnschichtchromatographisch verfolgt wird, wird zur Inaktivierung des Enzyms eine 0,1 M EDTA-Lösung zum Reaktionsgemisch zugesetzt und anschließend das entstandene Phosphatidylserin-Analoge auf üblichem Wege, z. B. mit Hilfe chromatographischer Methoden, isoliert und gereinigt. Es war überraschend und keineswegs vorauszusehen, daß sich die halogenhaltigen synthetischen Phospholipide vom Typ II, die keine natürlichen Verbindungen darstellen, für die enzymatisch katalysierte Synthese der Verbindungen I eignen.It is a particular advantage of this process that one can use the serine without protecting groups, the introduction of which is often preparatively expensive to react. After the conversion, which is monitored by thin layer chromatography, a 0.1 M EDTA solution is added to the reaction mixture to inactivate the enzyme and then the resulting phosphatidylserine analogues in the usual way, for. B. using chromatographic methods, isolated and purified. It was surprising and by no means foreseeable that the halogen-containing synthetic phospholipids of type II, which are not natural compounds, are suitable for the enzymatically catalyzed synthesis of the compounds I.

Das Verfahren erlaubt die Herstellung sowohl der Recemate als auch der optischen Stereoisomeren.The method allows the preparation of both the recemates and the optical stereoisomers.

Die verwendete Phospholipase D wird in Anlehnung an bereits bekannte Methoden in einfacher Weise aus Weißkohl erhalten, indem man diesen homogenisiert, das Homogenisat filtriert und die wäßrige Phase 45 Minuten bei 25000g zentrifugiert. Der klare Überstand wird mit 2 Volumen Aceton versetzt. Vom entstandenen Niederschlag wird unter Benutzung einer Tauchfritte dekantiert und der Rückstand 20 Minuten bei 13000g (5°C) zentrifugiert. Dasacetonfeuchteenzymhaltige Präparat wird über Phosphorpentoxid im Vakuum getrocknet.The phospholipase D used is obtained in a simple manner from white cabbage, based on previously known methods, by homogenizing it, filtering the homogenate and centrifuging the aqueous phase at 25,000 g for 45 minutes. The clear supernatant is mixed with 2 volumes of acetone. The resulting precipitate is decanted using a dip frit and the residue is centrifuged for 20 minutes at 13000g (5 ° C). Dasacetonfeuchteenzymhaltige preparation is dried over phosphorus pentoxide in a vacuum.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Verbindungen stellen physiologisch hochaktive Verbindungen dar. Sie besitzen z. B. eine ausgeprägte cytostatische Wirksamkeit. So bewirkt das i-ChloM-desoxy^-O-hexadecylglycero-S-phospho-L-serin bei Konzentrationen <10~⁴M eine mehr als 50%ige Hemmung des Zellwachstums von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen in vitro.The compounds obtained according to the invention are physiologically highly active compounds. B. a pronounced cytostatic activity. Thus, the i-ChloM-deoxy ^ -O-hexadecylglycero-S-phospho-L-serine at concentrations <10 ~ ⁴ M causes more than 50% inhibition of the cell growth of Ehrlich ascites tumor cells in vitro.

Die Erfindung wird an nachstehendem Beispiel erläutert:The invention is illustrated by the following example:

Beispiel 1 i-Chlor-i-desoxy^-O-hexadecylglycero-S-phospho-L-serinExample 1 i-Chloro-i-deoxy ^ -O-hexadecylglycero-S-phospho-L-serine

(Formel I : R = C₁₆H₃₃, Hai = Cl)(Formula I: R = C ₁₆ H ₃₃ , Hai = Cl)

1 g L-Serin wird in 1,9ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,6), der 0,1 M an CaCI₂ ist, bei 45⁰C gelöst. Zu dieser Lösung werden 40mg i-Chlor-i-desoxy^-O-hexadecylglycero-S-phosphocholin (Il : R = C₁₆H₃₃, Hai = Cl, X = Y = Z = CH₃, η = 2), 2ml Ether/ Chloroform (9:1, v/v, ethanolfrei) und 100mg des Enzympräparates (erhalten aus etwa 500g Weißkohl) gegeben. Das Gemisch wird unter starkem Rühren 4 Stunden auf 40⁰C gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 4,35 ml 0,1 M EDTA-Lösung hinzugegeben und die organischen Lösungsmittel durch Ein leiten von Stickstoff entfernt. Die zurückbleibende wäßrige Phase wird mit dem 4,3fachen Volumen Chloroform/Methanol (5:8, v/v) 30 Minuten gerührt und darauf vom Ungelösten (L-Serin) abgesaugt. Das Filtrat wird mit 1 Volumen Wasser und 3,7 Volumen Chloroform versetzt, die Mischung 10 Minuten gerührt, die organische Phase abgetrennt, im Vakuum eingeengt und der erhaltene Rückstand an Carboxymethylcellulose (Servacel CM52) säulenchromatographisch getrennt. Die Elution erfolgt nacheinander mit 75ml Chloroform (Fraktion 1), je 500ml Chloroform/Methanol, 9:1,8:2,7:3,1:1, v/v (Fraktionen 2 bis 5). Aus Fraktion 5 werden 15mg reines i-Chlor-i-desoxy-2-O-hexadecylglycero-3-phospho-L-serin erhalten. DC (Merck Kieselgel 60, Fertigplatte): Rf 0,13 (CHCIg/CHaOH/HjO, 50:25:4, v/v/v); Rf 0,04 (CHCI₃ZCH₃OHZ25% NH₃, 65:25:4, \/NN). 1 g L-serine is dissolved in 1,9ml 0.1 M acetate buffer (pH 5.6) containing 0.1 M of CaCl ₂ at 45 ⁰ C. To this solution, 40 mg of i-chloro-i-deoxy ^ -O-hexadecylglycero-S-phosphocholine (II: R = C ₁₆ H ₃₃ , Hai = Cl, X = Y = Z = CH ₃ , η = 2), 2ml Ether / chloroform (9: 1, v / v, ethanol free) and 100 mg of the enzyme preparation (obtained from about 500 g of white cabbage). The mixture is kept at 40 ^° C. with vigorous stirring for 4 hours. After cooling to room temperature, 4.35 ml of 0.1 M EDTA solution are added and the organic solvents are removed by introducing nitrogen. The remaining aqueous phase is stirred with 4.3 times the volume of chloroform / methanol (5: 8, v / v) for 30 minutes and then aspirated from the undissolved (L-serine). The filtrate is treated with 1 volume of water and 3.7 volumes of chloroform, the mixture stirred for 10 minutes, the organic phase separated, concentrated in vacuo and the residue obtained on carboxymethylcellulose (Servacel CM52) separated by column chromatography. The elution is carried out successively with 75 ml of chloroform (fraction 1), 500 ml of chloroform / methanol, 9: 1.8: 2.7: 3.1: 1, v / v (fractions 2 to 5). From fraction 5, 15 mg of pure i-chloro-i-deoxy-2-O-hexadecylglycero-3-phospho-L-serine are obtained. TLC (Merck Kieselgel 60, finished plate): Rf 0.13 (CHClg / CHaOH / HjO, 50: 25: 4, v / v / v); Rf 0.04 (CHCl ₃ ZCH ₃ OH 25% NH ₃ , 65: 25: 4, \ / NN).

Claims

Invention claim:

1. A process for the preparation of 2-0-alkyl-1-deoxy-1-halo-glycero-3-phospho-L-serines of general formula I, in the shark

CH ₂ -HaI

i
CHOIR

i
CH ₀ -OP (O) -O-CH ₀ -CH-COOH

OH

F, bromine or preferably Cl and R is an alkyl radical having 5 to 30 carbon atoms, which may also be substituted, and of their salts, characterized in that

2-O-alkyl-1-deoxy-1-halo-glycero-3-phosphoric acid alkyl esters or 2-0-alkyl-1-desoxycholines, -N-methylalkanolamines, -Ν, Ν-dimethylalkanolamines, O- (2-O-alkyl-1 -deoxy-1-halo-glycer-3-yl) -O '- ^ - N, N, N-trimethylammonio) alkyl] phosphates of the general formula II, in the shark

CHp-Hal
CHOIR

CH ₀ -OP (O) -OR ¹
0 "

II

and R have the meanings already mentioned and R ^{1 is} an alkyl radical having 1 to 6 C atoms, which may also be substituted by OH, Cl or Br, if there are 2 to 6 C atoms, or the grouping

- (CH ₂ JK - Y
^N Z

b, where X, Y and Z are methyl groups or hydrogen atoms and η = 1 to 6, with L-serine brings in the presence of phospholipase D for the reaction and the resulting Alkyldeoxyhalogenglycerophosphoserine or salts thereof by conventional methods per se.

Field of application of the invention

A process for the preparation of 2-O-alkyl-1-deoxy-1-halo-glycero-3-phospho-L-serines of the general formula I in which haem fluorine, bromine or preferably chlorine and R is an alkyl radical having 5 to 30 carbon atoms which can also be substituted mean, and of their salts.

CH ₂ -HaI
CHOIR

CH ₂ -OP (O) -O-GH ₂ -CH-COOH
OH

The compounds have a close structural relationship with naturally occurring phosphatidylserines, which are very important in biological processes.
Field of application of the invention is the chemical or pharmaceutical industry.